KR100606612B1 - 녹차 어린잎 유래 델타-6 불포화효소 유전자, 이 유전자를포함하는 발현벡터, 이 발현벡터로 형질전환된 형질전환체및 이 형질전환체의 제조방법 - Google Patents

녹차 어린잎 유래 델타-6 불포화효소 유전자, 이 유전자를포함하는 발현벡터, 이 발현벡터로 형질전환된 형질전환체및 이 형질전환체의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 녹차 어린잎 유래 델타-6 불포화효소 유전자, 이 유전자를 포함하는 발현벡터, 이 발현벡터로 형질전환된 형질전환체 및 이 형질전환체의 제조방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는, 서열번호 1로 기재되는 염기서열로 이루어지는, 녹차 어린잎 유래 델타-6 불포화효소를 코딩하는 유전자, 이 유전자를 포함하는 발현벡터 pYES2/CT-D6DES, 이 발현벡터로 형질전환된 효모(Saccharomyces cerevisiae) 형질전환체(수탁번호: KACC 93021) 및 이 형질전환체의 제조방법에 관한 것이다.
델타-6 불포화효소, pYES2/CT, Saccharomyces cerevisiae

Description

녹차 어린잎 유래 델타-6 불포화효소 유전자, 이 유전자를 포함하는 발현벡터, 이 발현벡터로 형질전환된 형질전환체 및 이 형질전환체의 제조방법{DELTA-6 DESATURASE GENE FROM CAMELLIA CHINENSIS, EXPRESSION VECTOR COMPRISING THE GENE, TRANSFORMANTS TRANSFORMED WITH THE VECTOR AND PRODUCTION METHOD OF THE TRANSFORMANTS}
도 1은 본 발명의, 녹차 어린 잎에서 분리한 델타-6 불포화효소를 코딩하는 유전자 cDNA의 오픈 리딩 플레임(ORF)의 염기서열과 이로부터 번역된 아미노산 서열을 나타낸다.
도 2a는 본 발명의, 델타-6 불포화효소를 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터 pYES2/CT-D6DES의 개열지도를 나타내는 개략도이다.
도 2b는 델타-6 불포화효소를 코딩하는 유전자의 존재를 확인하기 위한, 형질전환된 효모에서의 서던 블랏 결과를 나타내는 사진이다.
도 3은 델타-6 불포화효소를 코딩하는 유전자로 형질전환된 효모에서의 감마 리놀렌산 생성을 확인하는 피딩 테스트(feeding test) 결과 그래프이다.
본 발명은 신규한 녹차 어린잎 유래 델타-6 불포화효소 유전자, 이 유전자를 포함하는 발현벡터, 이 발현벡터로 형질전환된 형질전환체 및 이 형질전환체의 제조방법에 관한 것이다.
리놀레산과 감마-리놀렌산은 하루에 일정량을 섭취해야 하는 필수지방산이다. 인간의 몸 속에는 여러 가지 불포화지방산이 있는데 그 중의 하나가 감마-리놀렌산(GLA)이다. 이것은 체내에서 합성이 불가능한 불포화지방산으로 외부에서 식물로서 섭취해야만 하는데, 천연에서는 달맞이꽃이나 모유 등에만 극히 제한적으로 함유되어 있다. 감마-리놀렌산은 프로스타글란딘의 생체내 합성에 없어서는 안될 필수적인 물질이며, 프로스타글란딘은 혈압, 혈당, 혈중 콜레스테롤의 수치를 낮추는데 효과가 있음은 이미 노벨 생리의학상을 수상한 박사들에 의해 1982년에 증명되었다. 즉, 감마-리놀렌산은 인체 내에서 식물유 성분의 필수 지방산인 리놀레산으로부터 합성되어 프로스타글란딘의 원료가 되는 것이다. 따라서, 감마-리놀렌산이 부족하면 리놀레산→감마-리놀렌산→프로스타글란딘의 흐름이 원활하게 이루어지지 않게 되고, 그 결과 혈압이나 콜레스테롤의 수치가 올라가고, 천식 증상 등의 질환이 나타날 수 있다.
감마-리놀렌산은 리놀레산이 체내에 들어가고 나서 여러 가지 화합물로 변화되어 가는 그 최초의 합성물질이다. 리놀레산에서 감마-리놀렌산으로 변화하기 위해서는 그것을 중개하는 물질(효소)이 필요한데, 그 효소를 델타-6 불포화효소라고 한다. 델타-6 불포화효소는 사람에 따라서 제기능을 못하거나 혹은 결핍될 수도 있다. 왜냐하면 이 효소는 어떤 저해인자에 의해 리놀레산이 감마-리놀렌산으로 변화 하는데 방해를 받음으로 작용이 일어나지 않을 수도 있기 때문이다. 이는 아무리 리놀레산을 섭취해도 체내에서 감마-리놀렌산으로 합성되지 않을 수도 있다는 의미이다. 따라서 이러한 사람은 감마-리놀렌산이 직접 들어 있는 식물을 섭취해야 되는데, 감마-리놀렌산을 자연 그대로의 형태로 함유하고 있는 유지는 모유와 달맞이꽃의 종자유 외에 지금으로서는 발견되지 않고 있다.
리놀레산 그 자체는 인체에서 합성되지 않는 불포화 필수지방산이지만, 콩, 현미, 밀, 목화씨, 해바라기, 옥수수, 들깨 등의 식물성 유지에 풍부하게 들어있다.
본 발명의 델타-6 불포화효소(delta-6 desaturase)는 리놀레산(18:2)(LA)을 기질로 하여, 감마-리놀렌산(18:3)(GLA) 산물을 생성하는 효소로서, 이것을 암호화하는 핵산이 LA-생산 세포내로 전달되면 GLA가 생산된다. 약 359개의 아미노산으로 된 효소인 델타-6 불포화효소는 막-결합 부위와 지방산의 불포화를 촉매하는 활성 부위를 갖는다.
지방산과 지방산 관련 공동인자는 영양과 관련된 질병에 주요한 역할을 하는 것으로 보인다. 상기 효소가 GLA가 아닌 리놀레산을 고유하게 생산하는 들깨 등의 세포내로 전달되면, 대량의 GLA가 생산될 수 있으며, 그 결과, 콜레스테롤 수치와 혈압을 낮추고, 혈전증을 억제하고, 관절염과 다른 형태의 염증을 조절하고, 습진을 치료할 수 있는 GLA에 의한 유익한 효과를 얻을 수 있는, 고부가 가치의 유지작물의 생산이 가능하다.
현재까지는 동물, 효모, 박테리아에서 분리된 델타-6 불포화효소의 염기서열 등의 기능 분석이 다수 있었으나, 식물에서는 서양지치(borage), 달맞이꽃, 아주까리, 까치밥나무에서 분리된 델타-6 불포화효소 이외에는 다른 보고가 없었다.
본 발명의 목적은 지금까지 보고된 바 없는, 녹차 어린잎 유래의 델타-6 불포화효소 유전자 및 그 염기서열을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 유전자를 포함하는 발현벡터를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 발현벡터로 형질전환된 형질전환체를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 형질전환체의 제조방법을 제공하는 것이다.
따라서, 본 발명에 의하면, 녹차 어린잎 유래의 델타-6 불포화효소를 코딩하는 유전자를 대량 제공하므로써, 이를 리놀레산이 풍부한 들깨 등 유지작물에 이용, GLA의 새로운 섭취 공급원이 되는 고부가의 농작물 소재를 제공할 수 있다.
본 명세서에 기재된 용어, 기술 등은 특별한 한정이 없는 한, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 일반적으로 사용되는 의미로 사용된다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명의 하나의 측면에 따르면, 녹차 어린잎 유래 델타-6 불포화효소를 코딩하는 유전자 및 그 염기서열이 제공된다.
본 발명의 상기 유전자는 서열번호 1(도 1)로 기재되는 염기서열 전체 또는 그것의 일부로 이루어지며, 약 1.34kb의 오픈 리딩 프레임(ORF)을 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 상기 유전자에 의해 번역되는 녹차 어린잎 유래 델타-6 불포화효소 단백질은 리놀레산(18:2)(LA)을 기질로 하여, 감마-리놀렌산(18:3)(GLA) 산물을 생성하는 효소로서, 448개의 아미노산으로 구성되며, 막-결합 부위와 지방산의 불포화를 촉매하는 활성 부위를 갖는다. 또한, 아미노산 서열 분석 결과(도 1), 서양지치 유래 델타-6 불포화효소와 67%, 아주까리 유래 델타-6 불포화효소와 74%의 상동성을 나타낸다.
본 발명의 다른 측면에 따르면, 녹차 어린잎 유래 델타-6 불포화효소를 코딩하는 유전자를 포함하는 발현벡터가 제공된다.
본 발명의 상기 유전자를 공지의 적절한 발현벡터에 삽입하여, 이 유전자를 포함하는 발현벡터를 얻을 수 있다. 상기 발현벡터의 예로써는 대장균 발현벡터 pQE30 시리즈, 효모 발현벡터 pYES2/CT가 있으며, 특히 피딩 테스트(feeding test)를 위하여 숙주로서 효모를 사용하고, 갈락토스에 의해 단백질 발현을 유도할 수 있는 효모 유래의 발현벡터인 pYES2/CT를 사용하는 것이 바람직하다. 본 발명의 상기 유전자를 포함하는 효모 유래 발현벡터를 pYES2/CT-D6DES(7.23Kb)(도 2a)라고 명명하였다.
본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 녹차 어린잎 유래 델타-6 불포화효소를 코딩하는 유전자를 포함하는 발현벡터로 형질전환된 형질전환체(transformants)가 제공된다.
본 발명의 상기 형질전환에 사용할 수 있는 숙주세포로는 본 발명의 상기 유전자의 발현에 적합한 것이면 어느 것이라도 좋고, 세포배양 및 구입의 용이 등의 측면에서 특히 효모(Saccharomyces cerevisiae)가 바람직하다.
여기서, '형질전환체'란 프로모터와 작동가능하게 연결되며, 유용물질을 코딩하는 DNA 서열로 이루어지는 DNA 구조물(DNA construct)에 의해 형질전환된 세포 또는 식물체를 의미한다. 본 발명에서 형질전환체는 형질전환된 미생물, 동물세포, 식물세포, 형질전환된 동물 또는 식물체 및 이들로부터 유래된 배양세포 등을 포함하는 의미이다.
본 발명자들은 본 발명의 상기 유전자를 포함하는 발현벡터 pYES2/CT-D6DES를 제작한 후, 이 발현벡터를 효모(Saccharomyces cerevisiae)에 형질전환시켜 안정적인 효모 형질전환체를 확립하였으며, 이를 형질전환체 "Saccharomyces cerevisiae JBK1"라고 명명하였다. 이 형질전환체 Saccharomyces cerevisiae JBK1을 농촌진흥청 부설 농업생명공학연구원 한국농용미생물보존센터에 2004년 12월 29일에 수탁번호 KACC 93021로 기탁하였다.
이렇게 얻어진 효모 형질전환체는 델타-6 불포화효소 단백질을 발현하여, 18:2(Δ9, 12)인 리놀레산의 C6위치에 정확히 불포화 형성을 촉매하여 감마-리놀렌산을 생성한다.
따라서, 본 발명에 의하면, 녹차 어린잎 유래의 델타-6 불포화효소를 코딩하는 신규 유전자를 대량 제공하므로써, 이를 리놀레산이 풍부한 들깨 등 유지작물에 이용할 수 있게되어, 감마-리놀렌산의 공급원이 되는 고부가의 농작물 소재를 제공 할 수 있다.
본 발명의 상기 형질전환체의 제조방법은 다음 단계들을 포함하는 것을 특징으로 한다:
1) 프로모터 활성을 나타내는 DNA 서열과 작동가능하게 연결되며, 서열번호 1의 염기서열 또는 그것의 일부로 이루어지는 델타-6 불포화효소를 코딩하는 DNA 서열을 포함하는 발현벡터를 제조하는 단계;
2) 숙주세포에 상기 발현벡터를 도입하는 단계; 및
3) 상기 발현벡터가 도입된 형질전환체를 선별하는 단계.
상기 발현벡터를 제조하는 단계 1)에 있어서, 녹차 어린잎에서 특이적으로 발현되는 유전자 풀(pool)을 얻기 위하여, 서브트랙티브 cDNA 라이브러리(subtractive cDNA library)를 제작한 후, ESTs 분석을 실시하고, 이를 통하여 녹차 어린잎 유래 델타-6 불포화효소 유전자의 부분 단편을 포함하는 클론을 선별할 수 있다. 이 클론의 유전자 단편을 3'-연장 및 5'-연장하므로써 전장(full length) DNA를 획득하고, 얻어진 전장 DNA를 효모 유래 발현벡터인 pYES2/CT에 삽입하여 재조합 발현벡터인 pYES2/CT-D6DES를 제작할 수 있다.
상기 숙주세포에 상기 발현벡터를 도입하는 단계 2)에 있어서, 얻어진 pYES2/CT-D6DES를 효모에 도입하는 방법은 당업자에게 공지이며, 예를 들면, 입자 충격법(particle bombardment), 일렉트로포레이션법(electroporation), 형질감염법(transfection) 등이 있으며, 효모를 숙주로 하는 경우, 리튬아세테이법(lithium acetate method)이 가장 바람직하다.
상기 발현벡터가 도입된 형질전환체를 선별하는 단계 3)에 있어서, 선별방법은 숙주세포의 우라실(uracil) 영양 요구성을 이용하여 선별할 수 있는 데, 즉 선별마커로서 우라실 생합성 유전자를 포함하는 상기 발현벡터 pYES2/CT-D6DES가 도입된 숙주세포만이 우라실 결핍 배지에서 생존함을 이용하여 선별할 수 있다.
이하 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세하게 설명하지만, 본 발명이 이에 제한되는 것은 아니다.
[실시예]
본 발명의 형질전환체를 다음과 같이 제작하였다.
단계 1 : 녹차 어린잎 유래 델타-6 불포화효소를 코딩하는 유전자의 분리 및 그 염기서열 분석
녹차 어린잎과 오래된 잎(노엽)에서 발현되는 mRNA를 각각 분리하여 역전사에 의해 cDNA를 합성한 다음, 녹차 어린잎 유래 cDNA로부터 노엽에서 공통적으로 생성되는 cDNA를 제거하는 방법(PCR-select cDNA subtraction)을 이용하여, 녹차 어린잎에서 특이적으로 발현되는 서브트랙티브 cDNA 라이브러리를 작성하였다.
그 다음, 상기 라이브러리의 각 클론에서 cDNA를 추출하고, 자동염기서열분석기(ABI DNA sequencer 9600)를 이용하여 염기서열 분석을 행하였다. 상기 클론들중 델타-6 불포화효소를 코딩하는 유전자 클론을 선별하기 위하여, BLASTX 프로그램을 이용하여 공지의 델타-6 불포화효소를 코딩하는 유전자의 염기서열과 상동성 분석을 실시하였다.
상기의 상동성 분석 결과, 공지의 서양지치의 델타-6 불포화효소를 코딩하는 유전자의 염기서열과 상동성이 있는 유전자 클론을 선별하였으며, 상기 유전자내의 염기서열에 기초하여, 프라이머 5'-TGGATTCAGAGTGGTTGGGCAGGG-3' 및 5'-GAAAGGCATGTGTTGGAGATCCGG-3'를 합성한 후, 5'- 및 3'- RACE PCR 방법(SMART RACE cDNA Amplification)을 이용하여, 델타-6 불포화효소를 코딩하는 유전자의 ORF를 합성하였고, 그 염기서열 및 이로부터 번역되는 아미노산 서열을 도 1에 나타내었다.
단계 2 : 녹차 어린잎 유래 델타-6 불포화효소를 코딩하는 유전자를 포함하는 발현벡터의 제작
효모 형질전환용 발현벡터의 백본(backbone)으로는, 대장균 및 효모 선별 마커로 암피실린(ampicillin) 저항성 유전자와 우라실(uracil) 생합성 유전자를 각각 가지고 있는 pYES2/CT(invitrogen)를 사용하였다.
상기 pYES2/CT와 상기 1단계에서 얻은 본 발명의 델타-6 불포화효소 유전자의 DNA 단편을 각각 HindIII와 XbaI으로 절단하고, DNA 연결효소로 연결하여, 상기 pYES2/CT의 GAL1 프로모터와 CYC1 터미네이터(terminator) 사이에 본 발명의 DNA 단편을 삽입하므로써, 발현벡터 pYES2/CT-D6DES를 제작하였다(도2a).
단계 3 : 형질전환체의 제작 및 확인
상기 2단계에서 얻은 발현벡터 pYES2/CT-D6DES를 효모(Saccharomyces cerevisiae)를 숙주로 하여, 공지의 리튬아세테이트법에 의해 형질전환시켰다. 그 다음, 상기 효모들을 우라실 결핍 최소배지에 배양하여, 상기 발현벡터 pYES2/CT-D6DES가 도입된 효모를 선별하였다.
상기의 선별된 효모 형질전환체가 델타-6 불포화효소를 코딩하는 유전자를 포함하고 있는지 확인하기 위하여, 서던블랏을 실시하였다. 즉, 비형질전환 효모와 형질전환 효모로부터 전체 게놈 DNA를 각각 분리하여 HindIII와 XbaI으로 절단하고, 이를 1% 아가로스 겔 전기영동한 후, 나일론막(nylon membrane)에 블랏팅하였다. 32P로 표지된 델타-6 불포화효소 유전자 단편을 프로브로 하여, 상기 나일론막에 혼성화(hybridization)하여, X선-자동방사법(autoradiography)에 의해 확인한 결과, 본 발명의 형질전환체에서만 특이적으로 약 1.4kb 크기의 델타-6 불포화효소 유전자가 정확하게 확인되었다(도 2b). 따라서, 본 발명의 상기 효모 형질전환체는 델타-6 불포화효소 유전자를 포함하는 pYES2/CT-D6DES를 함유하고 있음을 확인할 수 있었다.
[비교예]
상기 실시예의 1단계를 생략하고, 2단계에서 pYES2/CT에 본 발명의 델타-6 불포화효소 유전자의 DNA 단편을 삽입하는 대신, lacZ 유전자를 삽입한 pYES2/CT-lacZ로 효모를 형질전환시킨 것을 제외하고는, 상기 실시예와 동일한 방법으로 형질전환체를 제작하였다.
형질전환체의 감마-리놀렌산 생합성 분석
기질인 0.5mM의 리놀레산과 1% tergitol type NP-40을 효모 배지에 혼합하여 유화시킨후, 유도체(inducer)로서 최종 농도가 2%가 되도록 갈락토스를 상기 배지에 첨가하고, 여기에 상기 실시예의 효모 형질전환체와 상기 비교예의 효모 형질전환체를 각각 배양하여, 델타-6 불포화효소 단백질의 발현을 유도하였다.
상기 실시예 및 비교예의 효모 형질전환체의 델타-6 불포화효소의 활성을 측정하기 위하여, 기질인 리놀레산(18:2, Δ9,12)의 6번째 탄소에 이중결합을 형성할 수 있는지를 확인하였으며, 그 피딩 테스트 결과를 도 3에 나타내었다.
도 3에서 확인할 수 있는 바와 같이, 알파-리놀렌산(18:3, Δ9,12,15)은 상기 실시예 및 비교예의 효모 형질전환체 모두에서 검출되었으나, 감마-리놀렌산(18:3, Δ6,9,12)은 실시예의 효모 형질전환체에서만 검출되었다.
따라서, 본 발명의 녹차 어린잎에서 분리된 델타-6 불포화효소 유전자 산물은 감마-리놀렌산을 생합성할 수 있음을 알 수 있다.
인체에 유익한 생리활성 기능이 많이 알려져 있는 감마-리놀렌산은 현재 고부가 건강식품으로 시판되고 있는 바, 따라서 본 발명의 녹차 어린잎 유래 델타-6 불포화효소 유전자를 분리하여 그 기능을 확인하고, 리놀레산을 함유하는 들깨 등 유지작물에 이용할 경우, 고부가의 기능성 감마-리놀렌산을 생산하는 유지작물을 제공할 수 있다.
서열목록 전자파일 첨부

Claims (5)

  1. 서열번호 1로 기재되는 염기서열로 이루어지는, 녹차 어린잎 유래 델타-6 불포화효소를 코딩하는 유전자.
  2. 제1항의 유전자를 포함하는 도 2a에 기재된 개열지도를 갖는 발현벡터 pYES2/CT-D6DES.
  3. 제2항의 발현벡터로 형질전환된 효모(Saccharomyces cerevisiae) 형질전환체(수탁번호: KACC 93021).
  4. 다음 단계들을 포함하는 것을 특징으로 하는 형질전환체의 제조방법:
    1) 프로모터 활성을 나타내는 DNA 서열과 작동가능하게 연결되며, 서열번호 1의 염기서열로 이루어지는 델타-6 불포화효소를 코딩하는 DNA 서열을 포함하는 발현벡터를 제조하는 단계;
    2) 숙주세포에 상기 발현벡터를 도입하는 단계; 및
    3) 상기 발현벡터가 도입된 형질전환체를 선별하는 단계.
  5. 제4항에 있어서, 상기 숙주세포는 효모(Saccharomyces cerevisiae)인 것을 특징으로 하는 형질전환체의 제조방법.
KR1020040117577A 2004-12-31 2004-12-31 녹차 어린잎 유래 델타-6 불포화효소 유전자, 이 유전자를포함하는 발현벡터, 이 발현벡터로 형질전환된 형질전환체및 이 형질전환체의 제조방법 KR100606612B1 (ko)

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