CN103756972B - 来自半片藻属的脂肪酸脱饱和酶的利用 - Google Patents

来自半片藻属的脂肪酸脱饱和酶的利用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及与脱饱和酶有关的方法和组合物，所述脱饱和酶调节长链多不饱和脂肪酸(LC‑PUFA)中双键的数量和位置。特别地，本发明涉及利用外源的脱饱和酶和编码这样的酶的核酸，来改善植物产品和部分中ω‑3脂肪酸分布的方法和组合物。在特定的实施方式中，利用的外源脱饱和酶是半片藻属物种Δ5脱饱和酶。还提供的是改善的大豆油组合物，其具有衍生自带有感兴趣基因的植物的EPA。

Description

来自半片藻属的脂肪酸脱饱和酶的利用
本申请是申请日为2009年10月14日和发明名称为“来自半片藻属的脂肪酸脱饱和酶的利用”的200980140691.2号发明专利申请的分案申请。
对相关申请的引用
本申请要求2008年10月14日提交的美国临时申请NO.61／105,316的优先权，通过引用将其完全合并在本文中。
序列表的引入
作为当前的公开的一部分的序列表包括标题为“MONS219WO_ST25.txt”的36KB计算机可读文件，其包含通过EFS-Web提交的本发明的核苷酸和／或氨基酸序列。序列表的内容通过完全引用合并在本文中。
发明背景
1.发明领域
本发明一般地涉及脱饱和酶，其调节长链多不饱和脂肪酸(LC-PUFA)中双键的数量和位置。特别地，本发明涉及利用Δ5脱饱和酶和编码这样的脱饱和酶的核酸来改变脂肪酸分布。
2.相关技术的说明
在大多数生物体中脂肪酸生物合成的主要产物是16-碳和18-碳化合物。这些脂肪酸的链长度与不饱和度的相对比例在物种之中广泛地变化。例如，哺乳动物主要产生饱和脂肪酸和单不饱和脂肪酸，而大多数高等植物生产具有一个、两个或三个双键的脂肪酸，后两者包括多不饱和脂肪酸(PUFA)。
两种主要的PUFA家族是ω-3脂肪酸(也称为“n-3”脂肪酸)，例子是二十碳五烯酸(EPA，20∶5，n-3)，以及ω-6脂肪酸(也称为“n-6”脂肪酸)，例子是花生四烯酸(ARA，20∶4，n-6)。PUFA是细胞的质膜和脂肪组织的主要成分，在其中它们可以分别以磷脂和甘油三酯的形式存在。PUFA是哺乳动物中适当的发育所必需的，特别是在婴儿脑部的发育中，以及对于组织形成和修复是必需的。花生四烯酸是类花生酸类物质的合成的主要前体，类花生酸类物质包括白细胞三烯、前列腺素和凝血噁烷，其也在炎症过程中起到重要作用。
几种失调响应于脂肪酸的治疗。补充PUFA已经显示了降低血管成形术后再狭窄的几率。证据表明，PUFA可能涉及钙代谢，表明PUFA可能在骨质疏松症的治疗或预防以及肾脏或泌尿道结石的治疗或预防中是有用的。健康效益的大部分证据适用于长链ω-3脂肪、二十碳五烯酸和二十二碳六烯酸(DHA，22∶6，n-3)，它们在鱼类和鱼油中存在。
PUFA，例如，亚油酸(LA，18∶2，Δ9，12)和α-亚麻酸(ALA，18∶3，Δ9，12，15)被认为是膳食中的必需脂肪酸，因为哺乳动物缺乏合成这些酸的能力。LA通过Δ12-脱饱和酶从油酸(OA，18∶1，Δ9)产生，而ALA通过Δ15-脱饱和酶从LA产生。然而，当摄食时，哺乳动物具有代谢LA和ALA以形成长链多不饱和脂肪酸(LC-PUFA)的n-6和n-3家族的能力。在哺乳动物中，LC-PUFA的形成由Δ6脱饱和的步骤限速，这个步骤将LA转化成GLA，将ALA转化成SDA。许多生理学和病理学的状况已经显示了甚至进一步地降低这种代谢步骤，因而，降低LC-PUFA的产生。为了克服限速步骤和提高EPA的组织水平，人们可以消费大量的ALA。作为选择，通过饮食补充EPA或DHA来绕过Δ6-脱饱和可以有效地减轻许多与低水平的PUFA相关的病理性疾病。然而，如以下更详细地阐述的，PUFA的当前可用的来源不是理想的。
主要的重要长链PUFA包括DHA和EPA，其主要在不同类型的鱼油中存在，以及ARA，其在丝状真菌例如被孢霉属(Mortierella)中发现。对于DHA，存在着商业生产的许多来源，包括多种海洋生物、从冷水海洋鱼类获得的油、以及蛋黄级分。然而，从天然来源商业生产PUFA存在几个缺点。PUFA的天然来源倾向于具有高度异质的油组成。因而从这些来源获得的油可能需要大量的纯化来分离出一种或多种期望的PUFA，或来产生富集了一种或多种PUFA的油。
其他天然的限制也希望获得生产PUFA的新方法。天气和疾病可以导致来自鱼类和其他海洋来源的产量的变动。生物体例如被孢霉属的大规模的发酵是昂贵的。天然的动物组织含有很低数量的ARA，并且难以被加工。
发明概述
本发明的一个方面提供了编码多肽的分离的核酸，所述多肽能够在碳5使脂肪酸分子脱饱和。这些核酸可以用于转化细胞或修饰植物的脂肪酸组成或植物产生的油。本发明的某些实施方式提供了分离自具有独特的脱饱和酶活性的半片藻属物种(Hemiselmisspp.)的分离的多核苷酸序列。在本发明的某些进一步的实施方式中，所述多核苷酸编码与SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4的多肽序列具有至少75％的序列同一性、包括与这些序列具有至少约80％、82％、85％、87％、90％、92％、95％、98％和99％同一性的多肽。本领域技术人员将认识到，由于这些序列是相关的，给定的序列可能同时与这些多肽序列的超过一种享有75％或更高的序列同一性。在某些实施方式中，本发明的半片藻属物种的脱饱和酶进一步被限定为ω-3Δ5脱饱和酶(即，具有ω-3底物偏爱的脱饱和酶)。
在另一个方面，本发明提供了编码多肽的分离的多核苷酸，所述多肽具有在碳5使脂肪酸分子脱饱和的脱饱和酶活性，所述多核苷酸包含选自以下的序列：(a)编码SEQ IDNO：2或SEQ ID NO：4的多肽的多核苷酸；(b)包含SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3的核酸序列的多核苷酸；(c)在5×SSC、50％甲酰胺和42℃的条件下与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3或其互补物杂交的多核苷酸；(d)编码与SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4的多肽序列具有至少75％、85％、95％、98％或99％的序列同一性的多肽的多核苷酸；和e)编码具有至少一种以下氨基酸基序的多肽的多核苷酸：
LeuPheGlyGlyAsnAspValSerValGlnTyrArgMetIle
(LFGGNDVSVQYRMI)(SEQ ID NO：15)；
IleAlaIleGlyMetSerGlnAlaSerIleGlyLeuAsnValGln
(IAIGMSQASIGLNVQ)(SEQ ID NO：16)；
GlyAlaAspMetIleGlyGlyCysLysTyrLeuTrpLeuGln
(GADMIGGCKYLWLQ)(SEQ ID NO：17)；
AlaSerSerThrAspProPhePheLeuPheHisAspTyrGlyLys
(ASSTDPFFLFHDYGK)(SEQ ID NO：18)；
LeuAlaMetTyrTrpAlaSerSerIlePheAsnThrAsnValValThrLeuGlnHis
(LAMYWASSIFNTNVVTLQH)(SEQ ID NO：19)；
AsnSerTyrArgGluAlaHisArgProIleSerIle
(NSYREAHRPISI)(SEQ ID NO：20)；
HisValTrpThrMetAlaValSerGluSerLeuThr
(HVWTMAVSESLT)(SEQ ID NO：21)；
LeuAlaIleProPheAlaLeuSerHisAsnPhe
(LAIPFALSHNF)(SEQ ID NO：22)；或
GlnProAlaValArgGluValCysLysLysHisGlyValAsnTyrVal
(QPAVREVCKKHGVNYV)(SEQ ID NO：23)。
在另一个方面，本发明提供了包含SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4的多肽序列或其片段、具有在碳5使脂肪酸分子脱饱和的脱饱和酶活性的分离的多肽。
在又一个方面，本发明提供了包含分离的多核苷酸的DNA构建体，所述分离的多核苷酸编码具有在碳5使脂肪酸分子脱饱和的脱饱和酶活性的多肽，所述DNA构建体包含选自以下的序列：(a)编码SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4的多肽的多核苷酸；(b)包含SEQ ID NO：l或SEQ ID NO：3的核酸序列的多核苷酸；(c)在5×SSC、50％甲酰胺和42℃的条件下与SEQID NO：1或SEQ ID NO：3或其互补物杂交的多核苷酸；和(d)编码与SEQ ID NO：2或SEQ IDNO：4的多肽序列具有至少75％、85％、95％、98％或99％的序列同一性的多肽的多核苷酸。在进一步的实施方式中，所述DNA构建体进一步包含与如上所述的分离的多核苷酸可操作地连接的异源启动子。在其他实施方式中，所述启动子是在原核细胞或真核细胞中有功能的。在某些实施方式中，在其中启动子有功能的真核细胞是植物细胞。在进一步的实施方式中，所述启动子是种子增强的启动子。种子增强的启动子的实例包括，但不限于，USP88启动子、7Sα启动子、7Sα’启动子、Arcelin-5启动子、napin启动子和油质蛋白启动子。在又一个实施方式中，所述DNA构建体进一步包含编码脂肪酸延伸酶(elongase)的至少一种其他的多核苷酸序列。
在再又一个方面中，本发明提供了用包含分离的多核苷酸的DNA构建体转化的宿主细胞，所述分离的多核苷酸编码本发明提供的具有在碳5使脂肪酸分子脱饱和的脱饱和酶活性的多肽。所述宿主细胞可以是植物、动物、真菌或细菌细胞。在进一步的实施方式中，本发明的宿主细胞提供了相对于与所述宿主细胞相同基因型、但是缺乏所述DNA构建体的细胞展现了改变的脂肪酸生物合成的宿主细胞。例如，本发明的转化的宿主细胞可以包含相对于AA含量提高的EPA水平，例如，为AA的约2或约3倍的EPA。在又一个方面中，所述宿主细胞从所述细胞的祖代遗传了所述DNA构建体。
在再又一个方面中，本发明提供了植物和它的子代，其包含用本发明的DNA构建体转化的宿主细胞。这样的植物可以被限定为，相对于缺乏所述DNA构建体的相同基因型的植物，包含改变的脂肪酸新陈代谢。在一个实施方式中，本发明提供了包含ω-3Δ5脱饱和酶(即，具有ω-3底物偏爱的脱饱和酶)的转基因植物或其部分。在又一个方面中，这样的植物可以进一步包含至少一种编码脂肪酸延伸酶的其他的多核苷酸序列。在一个实施方式中，所述植物选自芥花(canola)、菜苔(Brassica campestris)、含油种子油菜(oilseedrape)、油菜籽、大豆、海甘蓝、芥菜、蓖麻子、花生、芝麻、棉籽、亚麻子、红花、油棕、亚麻、葵花、玉米、水稻、大麦、粟、黑麦、小麦、燕麦、苜蓿和高粱。本发明还提供了本发明的植物的种子，例如，相对于不包含本发明的DNA构建体的种子、具有改变的脂肪酸含量的种子。例如，本发明的种子可以包含相对于AA含量提高的EPA水平，例如，为AA的约2或约3倍的EPA。
在更进一步的方面中，提供了包含多核苷酸分子的转化的细胞、转基因植物或其部分，所述多核苷酸分子编码本发明的Δ5脱饱和酶，并可操作地连接到异源启动子和编码脂肪酸延伸酶或脱饱和酶的至少一种其他的多核苷酸分子。在某些实施方式中，所述其他的脂肪酸延伸酶或脱饱和酶可以是Δ6脱饱和酶、Δ6延伸酶(例如，高山被孢霉(Mortierella alpina)Δ6延伸酶)、Δ18延伸酶、Δ15脱饱和酶、Δ9延伸酶、Δ8脱饱和酶、Δ17脱饱和酶(例如，异枝水霉(Saprolegnia diclina)Δ17脱饱和酶)、Δ4脱饱和酶和／或C20延伸酶。例如，Δ15脱饱和酶可以是构巢曲霉(Aspergillus nidulans)Δ15脱饱和酶、串珠镰刀菌(Fusarium moniliforme)Δ12／Δ15脱饱和酶、拟南芥(Arabidopsisthaliana)Δ15脱饱和酶或高山被孢霉Δ15脱饱和酶。在某些实施方式中，Δ6脱饱和酶可以是ω-6特异性Δ6脱饱和酶(例如，亚心形扁藻(T.suecica)Δ6脱饱和酶，或高山被孢霉Δ6脱饱和酶)或ω-3特异性Δ6脱饱和酶(例如，九莱报春(Primula juliae)Δ6脱饱和酶)。Δ9延伸酶的某些实例包括，但不限于，纤细裸藻(Euglena gracilis)Δ9延伸酶和球等鞭金藻(Isochrysis galbana)Δ9延伸酶。在某些实施方式中，Δ8脱饱和酶可以是Tetruepretia pomquetensisΔ8脱饱和酶或纤细裸藻Δ8脱饱和酶。在再进一步的实施方式中，所述其他脂肪酸延伸酶或脱饱和酶可操作地连接到种子增强启动子。
在又进一步的方面中，本发明提供了提高宿主细胞或植物中的EPA的方法。在一个实施方式中，提高EPA含量的方法包括在宿主细胞或植物中表达根据本发明的Δ5脱饱和酶和Δ6脱饱和酶(例如，ω-3特异性Δ6脱饱和酶)。在进一步的实施方式中，提高EPA含量的方法进一步涉及在宿主细胞或植物中表达Δ15脱饱和酶。在另一个实施方式中，提高植物中EPA含量的方法包括在宿主细胞或植物中表达根据本发明的Δ5脱饱和酶、Δ9延伸酶、Δ8脱饱和酶，以及Δ15脱饱和酶或Δ17脱饱和酶之一。
在再又一个方面中，本发明提供了生产商业产品例如食物或饲料的方法，包括步骤(a)获得本发明的转基因植物；和(b)从该转基因植物的组织、种子、果实和／或油生产商业产品。例如，所述商业产品可以是食物或饲料组合物，例如油、青贮饲料、粗粉、谷粒、淀粉、细粉或蛋白质。食物或饲料组合物被限定为包含本发明提供的可检测的多核苷酸序列或可检测的多肽。另外，本发明提供了包含EPA、ARA或DHA的动物饲料和人类食品组合物(参见附图4)。
在再又一个方面中，本发明提供了提高用于人类或动物消费的可食用产品的营养价值的方法，包括向可食用产品添加本发明提供的转化的植物或植物部分或其衍生物。在某些实施方式中，所述产品是人类和／或动物食品。所述可食用产品还可以是动物饲料和／或食品增补剂。
在再又一个方面，本发明提供了制造食物或饲料的方法，包括向起始的食物或饲料成分添加本发明提供的转化的植物或植物部分或其衍生物来生产所述食物或饲料。在某些实施方式中，所述方法进一步限定为制造食物和／或饲料的方法。本发明还提供通过所述方法制得的食物或饲料。
特别地，本发明涉及以下各项：
1.一种多核苷酸分子，包含选自以下的核酸序列：
a)编码SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4的多肽序列的核酸序列；
b)SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3的核酸序列；
c)在5×SSC、50％甲酰胺和42℃的条件下与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3或其互补物杂交，且编码具有在碳5使脂肪酸分子脱饱和的脱饱和酶活性的多肽的核酸序列；和
d)编码与SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4的多肽序列具有至少75％的序列同一性、具有在碳5使脂肪酸分子脱饱和的脱饱和酶活性的多肽的核酸序列，
其中所述多核苷酸分子与异源启动子可操作地连接。
2.如第1项的多核苷酸分子，包含编码SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4的多肽序列的核酸序列。
3.如第1项的多核苷酸分子，包含SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3的核酸序列。
4.如第1项的多核苷酸分子，包含在5×SCC、50％甲酰胺和42℃下与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3或其互补物杂交、且编码具有在碳5使脂肪酸分子脱饱和的脱饱和酶活性的多肽的核酸序列。
5.如第1项的多核苷酸分子，包含编码与SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4的多肽序列具有至少75％的序列同一性、具有在碳5使脂肪酸分子脱饱和的脱饱和酶活性的多肽的核酸序列。
6.如第1项的多核苷酸分子，包含编码具有选自以下的至少一种氨基酸基序的多肽的核酸序列：SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22和SEQ ID NO：23。
7.如第1项的多核苷酸分子，进一步包含编码脂肪酸延伸酶或脱饱和酶的至少一种另外的多核苷酸序列。
8.如第1项的多核苷酸分子，其中异源启动子是种子增强的启动子。
9.一种用第1项的多核苷酸分子转化的宿主细胞。
10.如第9项的宿主细胞，其中所述宿主细胞是植物细胞、真菌细胞或细菌细胞。
11.如第9项的宿主细胞，其中所述宿主细胞展现改变的脂肪酸生物合成，这是相对于与所述宿主细胞相同基因型、但是缺少所述多核苷酸分子的细胞而言的。
12.如第9项的宿主细胞，其中所述细胞从所述细胞的祖代遗传了所述多核苷酸分子。
13.一种用第1项的多核苷酸分子转化的转基因植物或植物部分。
14.如第13项的转基因植物或植物部分，所述植物选自芥花、菜苔、含油种子油菜、油菜籽、大豆、海甘蓝、芥菜、蓖麻子、花生、芝麻、棉籽、亚麻子、红花、油棕、亚麻、葵花、玉米、水稻、大麦、粟、黑麦、小麦、燕麦、苜蓿和高粱。
15.如第13项的转基因植物或植物部分，进一步包含编码脂肪酸脱饱和酶或延伸酶的至少一种另外的多核苷酸。
16.如第15项的转基因植物或植物部分，进一步包含编码Δ6脱饱和酶、Δ6延伸酶、Δ18延伸酶、Δ15脱饱和酶、Δ9延伸酶、Δ8脱饱和酶、Δ17脱饱和酶、Δ4脱饱和酶或C20延伸酶的多核苷酸。
17.如第13项的转基因植物的子代植物，其中所述子代植物包含所述多核苷酸分子。
18.如第13项的转基因植物的种子，其中所述种子包含所述多核苷酸分子。
19.从第13项的植物或植物部分获得的商业产品，其中所述产品包含所述多核苷酸分子或由所述多核苷酸分子编码的多肽。
20.如第19项的商业产品，其中所述商业产品是食物或饲料。
21.如第20项的商业产品，其中所述食物或饲料是油、青贮饲料、粗粉、谷粒、淀粉、细粉或蛋白质。
22.如第19项的商业产品，其中所述商业产品包含EPA、ARA如/或DHA。
23.一种生产食物或饲料组合物的方法，包括步骤：
(a)获得根据第13项的转基因植物或植物部分；和
(b)生产所述食物或饲料组合物。
24.如第23项的方法，其中所述食物或饲料是油、青贮饲料、粗粉、谷粒、淀粉、细粉或蛋白质。
附图的简要说明
以下附图形成了本说明书的部分，被包括在内以进一步说明本发明的某些方面。通过参考一个或多个这些附图并结合在此呈现的具体实施方式的详细说明，可以更好地理解本发明。
附图1说明了来自Hemiselmisrufescens HrD5D(SEQ ID NO：4)、Hemiselmisvirescens HvD5D(SEQ ID NO：2)、畸雌腐霉(Pythium irregulare)PiD5D(SEQ ID NO：10)、高山被孢霉D5D(SEQ ID NO：11)、假微型海链藻(Thalassiosira pseudonana)TpD5D(SEQID NO：13)、多甲藻属物种(Peridiniumsp.)CCMP626PD5D(SEQ ID NO：14)的D5脱饱和酶和来自高山被孢霉D6D(SEQ ID NO：12)的D6脱饱和酶的氨基酸比对。
附图2说明了质粒载体pMON67056的图谱。
附图3说明了质粒载体pMON104220的图谱。
附图4数目了PUFA生物合成的路径图。
发明的详细说明
本发明通过提供方法和组合物用于创造具有增强的PUFA含量的植物来克服了现有技术的限制。生物体例如植物的脂肪酸含量的修饰具有许多优点，包括对于人类和／或动物消费的改善的营养和健康效益。脂肪酸含量的修饰可以用于实现植物、植物部分和植物产品(包括植物种子油)中期望的PUFA的有益水平或分布。例如，当期望的PUFA在植物的种子组织中产生时，所述油可以从种子中分离，一般产生期望的PUFA方面很高的油或具有期望的脂肪酸含量或分布的油，其随后可以用于提供食物和其他产品中的有益特征。
本发明的各种方面包括用于细胞的PUFA含量的修饰(例如，植物细胞的PUFA含量的修饰)的方法和组合物。与本发明相关的组合物包括新的分离的多核苷酸序列、多核苷酸构建体，和通过本发明的多核苷酸转化的植物和／或植物部分。根据本发明，分离的多核苷酸可以编码半片藻属物种D5脱饱和酶。宿主细胞可以被操纵来表达编码Δ5脱饱和酶多肽的多核苷酸，所述多肽催化脂肪酸的脱饱和。
提供了以下定义作为对理解本发明的帮助。用语“DNA序列”、“核酸序列”、“核酸分子”、“多核苷酸”和“核酸片段”是指包含核苷酸的有序排列的物理结构。DNA片段、序列或核苷酸序列可以含有在较大核苷酸分子、载体等等之内。此外，在这些序列中核酸的有序排列可以以序列表、附图、表格、电子媒体等等的形式描绘。
用语“编码序列”、“编码区”、“结构序列”和“结构核酸序列”是指其中核苷酸以各自形成密码子的一系列三联体排列的DNA序列、核酸序列、核酸分子的全部或片段。每个密码子编码特定的氨基酸。因而，编码序列、编码区、结构序列和结构核酸序列编码形成蛋白、多肽、基序或肽序列的一系列氨基酸。编码序列、编码区、结构序列和结构核酸序列可以含有在较大的核酸分子、载体等等之内。此外，在这些序列中核苷酸的排列可以以序列表、附图、表格、电子媒体等等的形式描绘。
术语“cDNA”是指互补于并来自mRNA的双链DNA。
“脱饱和酶”是指一种多肽，其可以脱饱和或催化一个或更多个脂肪酸的连续的碳之间双键的形成，来产生单-或多-不饱和脂肪酸或其前体。特别感兴趣的是可以通过在自脂肪酸的羧基端第5个碳之处脱饱和来催化DGLA向ARA或ETA向EPA的转化的多肽。选择具有脱饱和酶活性的特定多肽的考虑包括，但不限于，多肽的最佳pH值，多肽是否是限速酶或其部分，使用的脱饱和酶对于理想的PUFA的合成是否是必需的，和／或所述多肽是否需要辅助因子。表达的多肽优选地具有与它在宿主细胞中的位置的生物化学环境相容的特征。例如，所述多肽可以不得不竞争底物。
“延伸酶”是指一种多肽，其通过向脂肪酸的羧酸末端添加两个碳原子来延长脂肪酸。选择具有延伸酶活性的特定多肽的考虑包括，但不限于，多肽的最佳pH值，多肽是否是限速酶或其部分，使用的延伸酶是否是期望的PUFA的合成所必需的，和／或所述多肽是否需要辅助因子。表达的多肽优选地具有与它在宿主细胞中的位置的生物化学环境相容的特征。例如，所述多肽可以不得不竞争底物。
“表达”是指一种过程，基因的编码信息通过它被转变为在细胞中存在并运作的结构。表达的基因包括被转录成RNA、然后被翻译成蛋白质的那些，以及被转录成RNA但不翻译成蛋白质的那些(例如，转运RNA和核糖体RNA)。
如在此使用的，“基因”是指表达特定蛋白质的核酸片段，包括在编码序列之前(5’非编码序列)和之后(3’非编码序列)的调节序列。“天然基因”是指在自然中存在的、具有其自身的调节序列的基因。“嵌合基因”是指其不是天然基因的任何基因，包含在自然中不在一起存在的调节和编码序列。因而，嵌合基因可以包含来自不同来源的调节序列和编码序列，或来自相同来源但以不同于自然中存在的方式排列的调节序列和编码序列。“内源”基因是指在生物体的基因组中在其自然位置的天然基因。“外源”基因或“转基因”是指通过转化过程导入到基因组中的基因。转基因包括通过转化过程导入的基因组DNA(例如，与其活性启动子连接的基因组DNA)。
“异源”是指来自不同来源的2或多种核酸或蛋白序列之间的关系。例如，如果这样的组合不是自然中通常存在的，启动子对于编码序列是异源的。此外，如果在特定的细胞或生物体中不会天然发生，特定的核酸序列对于它所插入的细胞或生物体可以是“异源的”。
“序列相似性”是指在两个或更多核酸或氨基酸序列之间就位置同一性的百分比而言的相似性水平。术语“同源性”被用于指出不同的核酸或蛋白质之间，例如，由于共有的进化起源，相似的功能性质的概念。
“杂交”是指当核酸链具有充分的序列互补性时核酸的第一链与第二链经由氢键碱基配对结合的能力。如在此使用的，如果核酸分子显示出完全的互补性，则称核酸分子是另一个核酸分子的“互补物”。如此处使用的，当一个分子的每一个核苷酸与另一个分子的核苷酸互补时，称为分子显示出“完全的互补性”。因而，当它们的相互杂交具有足够的稳定性以允许它们在合适的条件下保持相互的退火时，称两个核酸链具有充分的互补性。
术语“杂交”一般涉及核酸分子通过互补碱基链配对来接合的能力。当核酸分子在合适的条件下接触时，可以发生这样的杂交。“特异性杂交”是指两个核酸分子形成反平行的、双链的核酸结构的能力。如果核酸分子展现了“完全的互补性”，即一个分子中的每个核苷酸与另一个分子中它的碱基配对配体核苷酸互补，核酸分子被称作是另一个核酸分子的“互补物”。如果它们的相互杂交具有足够的稳定性以允许它们在至少常规的“低严格”条件下保持相互的退火，称两个分子是“最低度互补的”。类似地，如果分子的相互杂交具有足够的稳定性以允许它们在常规的“高严格”条件下保持相互的退火，称所述分子是“互补的”。
“杂交严格度”是指核酸分子之间氢键键合的条件。“高严格”条件耐受核酸和目标链之间很小的错配。这样的条件是本领域技术人员公知的，优选的用于需要高度选择性的应用。中度严格条件可以包括相对低的盐和／或相对高温度的条件，例如，由约1×SSC和65℃提供的。高严格度可以是例如定义为0.02M到0.10M NaCl和50℃到70℃；5×SSC，50％甲酰胺和42℃；或0.2×SSC和65℃。这样的条件的具体实例包括0.02M NaCl和50℃；0.02MNaCl和60℃；以及0.02M NaCl和70℃。与其他核酸分子杂交的核酸分子(例如，至少在低严格条件下)，被称为是另一个核酸分子的“可杂交的同类”。在此和由Sambrook等人(Molecular Cloning：ALaboratory Manual2ndEd.，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，1989)(在此称为Sambrook等人，1989))以及由Haymes等人，1985描述了常规的低严格和高严格条件。因而从完全互补的偏离是可允许的，只要这种偏离没有完全地排除了分子形成双链结构的能力。
低严格条件可以用于选择与目标核酸序列具有较低序列同一性的核酸序列。人们可能希望采用条件例如约0.15M到约0.9M氯化钠，约20℃到约55℃的温度范围。高严格条件可以用于选择与公开的核酸序列具有更高程度同一性的核酸序列(Sambrook等人，1989)。高严格条件一般地涉及在约2×到约10×SSC(从含有3M氯化钠和0.3M柠檬酸钠、pH7.0的20×SSC贮备溶液在蒸馏水中稀释的)，约2.5×到约5×Denhardt’s溶液(从含有1％(w／v)牛血清白蛋白、1％(w／v)Ficoll和1％(w／v)聚乙烯吡咯烷酮的50×储备溶液在蒸馏水中稀释的)，约10mg／mL到约100mg／mL鱼精子DNA，和约0.02％(w／v)到约0.1％(w／v)SDS中，在约50℃到约70℃孵育几小时到过夜的核酸杂交。杂交之后一般跟随着几个洗涤步骤。洗涤组合物一般包含0.5×到约10×SSC，和0.01％(w／v)到约0.5％(w／v)SDS，在约20℃到约70℃孵育15分钟。优选的，在0.1×SSC中在65℃洗涤至少一次之后核酸片段保持杂交。
用语“分离的”意指已经从其自然环境移除，不考虑它的最终分布。例如，“分离”自水稻的核酸序列，例如通过从水稻细胞克隆，当被插入到玉米细胞的基因组时保持了“分离的”。
用语“可操作地连接”是指两种或多种核酸区域或核酸序列的空间排列，从而它们发挥它们相互的合适效果。例如，启动子区域可以相对于核酸序列放置，从而所述核酸序列的转录被所述启动子区域指导。启动子区域和核酸序列是“可操作地连接的”。
“上游”和“下游”是对于核苷酸序列的位置以及编码序列的转录或翻译方向所使用的位置术语，其通常在5’到3’方向上进行。
术语“启动子”或“启动子区域”是指核酸序列，通常存在于编码序列的上游(5’)，其能够指导核酸序列成为RNA分子的转录。启动子或启动子区域一般提供了RNA聚合酶的识别位点以及适当的转录起始所必需的其他因素。如在此期待的，启动子或启动子区域包括通过插入或删除调节区、使启动子经历随机或定点诱变等等所衍生的启动子变体。启动子的活性或强度可以通过就它产生的RNA数量、或在细胞或组织中积累的蛋白质数量，相对于类似地测量的第二启动子来定量。
用语“3’非编码序列”是指位于编码序列的下游的核苷酸序列，包括多聚腺苷酸化识别序列和编码能够影响mRNA加工或基因表达的调节信号其他序列。这些通常被称为3’非翻译区域或3’UTR。多腺苷酸化信号通常以影响多聚腺苷酸束向mRNA前体的3’末端的添加为特征。不同的3’非编码序列的用途由Ingelbrecht等人(1989)例证。
“翻译前导序列”或“5’非翻译区”或“5’UTR”都是指位于基因的启动子序列和编码序列之间的核苷酸序列。5’-UTR存在于翻译起始序列上游的完整加工的mRNA中。5’-UTR可以影响向mRNA的主要转录本的加工、mRNA稳定性或翻译效力。已经描述了翻译前导序列的实例(Turner和Foster，1995)。
“RNA转录本”是指由RNA聚合酶催化的DNA序列转录产生的产物。当RNA转录本是DNA序列的理想互补拷贝时，它被称为原始转录本。来自原始转录本的转录后加工的RNA序列被称为成熟RNA。“信使RNA”(mRNA)是指没有内含子并且可以被细胞翻译成多肽的RNA。
“DNA构建体”是指相互可操作地连接的、构成重组DNA分子的异源遗传元件，可以包含提供DNA多核苷酸分子在宿主细胞中表达的元件，以及提供维持构建体的元件。植物表达盒包含遗传元件的可操作的连接，当转移到植物细胞中时提供期望的基因产物的表达。
“重组载体”是指这样的任何试剂，通过它或在它之中，目标核酸被扩增、表达或保存，例如质粒、粘粒、病毒、自主复制序列、噬菌体或线性单链的、环形单链的、线性双链的或环形双链的DNA或RNA核苷酸序列。重组载体可以被合成，或来自于任何来源，并能够基因组整合或自主复制。
“调节序列”是指位于编码序列或内含子的上游(5’)、之中或下游(3’)的核苷酸序列，它的存在或缺乏影响所述编码序列的转录和表达。
“基本上同源的”是指在序列上至少约90％相同的两个序列，如通过例如DNAStar(DNAStar，Madison，WI)中的CLUSTAL W算法所测量的。
“基本上纯化的”是指从在其天然状态通常与其相关的基本上所有其他分子分离的分子。更优选的，基本上纯化的分子是在制品中存在的优势种类。基本上纯化的分子可以是大于约60％地没有、优选的约75％地没有、更优选的约90％地没有、以及最优选的约95％地没有天然混合物中存在的其他分子(不包括溶剂)。用语“基本上纯化的”不意图涵盖以它们的天然状态存在的分子。优选的，本发明的核酸分子和多肽是基本上纯化的。
术语“转化”是指核酸导入接受者宿主中。术语“宿主”是指细菌细胞、真菌、动物或动物细胞、植物或种子、或任何植物部分或组织，包括植物细胞、原生质体、愈伤组织、根、块茎、种子、茎、叶、幼苗、胚芽和花粉。
如在此使用的，“转基因植物”是具有被稳定导入其基因组，例如核或质体基因组中的外源核酸的植物。
术语“同基因的”作为具有或缺乏转基因的植物或植物系之间的比较性术语，是指除了所讨论的转基因之外植物或株系具有相同或相似的遗传背景。例如，代表来自相同亲本F2群体的表型相似或相同选集的所谓的姐妹系被认为是“同基因的”。当使用未转化的亲本作为回交亲本、使稳定的转化植物的子代与未转化的亲本株系杂交或回交3至6代(或更多代)，同时针对类型(通过分子标记物分析的基因型，或通过田间观察的表型，或两种)和转基因来选择时，产生的转基因株系被认为是与其未转化的亲本系是高度“同基因的”。
术语“种子”、“籽粒”和“谷粒”被理解为在含义上是等价。术语籽粒通常用于描述玉米或水稻植物的种子。在所有植物中，种子是由种皮、胚芽、糊粉和胚乳组成的成熟的胚珠。
编码Δ5脱饱和酶的核酸
在一个实施方式中，本发明提供了编码来自半片藻属物种的Δ5脱饱和酶的新的核酸。在特定的实施方式中，所述核酸分离自Hemiselmis virescens.株CCMP442和Hemiselmis rufescens株CCMP439(可从CCMP，海洋浮游植物培养中心；West BoothbayHarbor，Maine，USA获得)。在某些实施方式中，所述核酸包含SEQ ID NO：1或3。本发明还提供了使用这样的核酸(包括SEQ ID NO：1和3)的方法。在一个实施方式中，这些核酸分子在本发明的环境中被用于改变来自植物的种子中的油组成。
这些核酸分子可以使用cDNA、mRNA或基因组DNA作为模板和合适的寡核苷酸引物根据标准PCRTM扩增技术来扩增。作为选择，它们可以使用标准的合成技术，例如自动化的DNA合成仪来合成。编码期望的Δ5脱饱和酶的多核苷酸可以以多种方式鉴定。举例来说，期望的Δ5脱饱和酶的来源，例如，来自半片藻属物种的文库，用可检测的酶或化学合成的探针来筛选，所述探针可以从DNA、RNA或非天然发生的核苷酸，或其混合物制成。探针可以从已知的Δ5脱饱和酶的多核苷酸酶合成，用于正常的或降低严格度的杂交方法。寡核苷酸探针还可以用于筛选来源，并可以基于已知的Δ5脱饱和酶的序列(包括在已知的Δ脱饱和酶之中保守的序列)或基于获自期望的纯化的蛋白质的肽序列。基于氨基酸序列的寡核苷酸探针可以是简并的，以涵盖遗传密码的简并性，或可以是对于来源生物体中优选的密码子偏爱性的。寡核苷酸还可以用作引物用于来自已知或疑似来源的逆转录的mRNA的PCRTM；PCRTM产物可以是全长的cDNA，或可以用于产生探针来获得期望的全长cDNA。作为选择，期望的蛋白质可以被完全测序，进行编码该多肽的DNA的完全合成。
一旦分离了期望的基因组或cDNA，可以通过已知的方法来测序。本领域公认的是，这样的方法具有误差，因而同一区域的多次测序是常规的，并且仍然预计在产生的推定序列中产生可测量的错误率，特别是在具有重复结构域、广泛的二级结构或异常碱基组成的区域中，例如，具有高GC碱基含量的区域。当偏差出现时，可以进行重新测序，可以采用专门的方法。专门方法可以包括通过利用如下方式来改变测序条件：不同温度；不同的酶；改变寡核苷酸形成更高级结构的能力的蛋白质；改变的核苷酸，例如ITP或甲基化的dGTP；不同的凝胶组成，例如，添加甲酰胺；不同的引物或位于与问题区域不同距离处的引物；或不同的模板，例如单链DNA。也可以采用mRNA的测序。
如果希望，编码Δ5脱饱和酶的核酸的序列可以被修饰而不改变表达的蛋白质的最终氨基酸序列，使得所述序列在植物宿主或其他宿主细胞中更易于表达。编码序列可以是人工的DNA。如在此使用的人工DNA是指非天然发生的DNA多核苷酸分子。人工DNA分子可以通过各种方法来设计，例如，基于取代第一多核苷酸的密码子来产生等效的、乃至改进的第二代人工多核苷酸的本领域中已知的方法，其中这种新的人工多核苷酸对于转基因植物中增强的表达是有用的。设计方面通常采用密码子使用频率表(codon usage table)，该表格通过编选分离自植物、植物型、科或属的编码序列集合中密码子出现频率来产生。其他设计方案包括降低多腺苷酸化信号、内含子剪接位点、或序列的长的AT或GC延伸的出现(美国专利5,500,365)。全长编码序列或其片段可以使用本领域技术人员已知的方法从人工DNA产生。维持此处期待的功能的、在此公开的核苷酸序列或调节元件的修饰处在本发明的范围之内。这样的修饰包括插入、取代和删除，特别是反映遗传密码的简并性的取代。
发明人分离了产生具有Δ5脱饱和酶活性的多肽、来自半片藻属物种的DNA序列。编码Δ5脱饱和酶的序列可以在转基因植物、微生物或动物中表达来修饰脂肪酸含量。也可以使用基本上相同于在此提供的Δ5脱饱和酶多核苷酸其他多核苷酸、或编码基本上相同于Δ5脱饱和酶多肽的多肽的其他多核苷酸。“基本上相同于”是指氨基酸序列或核酸序列展现了按照递增的优先度的、与SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4中的Δ5脱饱和酶多肽序列、或编码这些多肽的序列的至少75％、80％、82％、85％、87％、90％、92％、95％、98或99％的同一性。多肽或多核苷酸比较可以利用序列分析软件进行，例如，GCG Wisconsin Package的序列分析软件包(Accelrys，San Diego，CA)和MEGAlign(DNAStar，Inc.，1228S.Park St.，Madison，Wis.53715)。这样的软件通过指定相似性或同一性的程度来匹配相似的序列。
DNA构建体
本发明提供了DNA构建体，其包含与此处描述的核酸可操作地连接的异源启动子。启动子的选择，例如，可被描述为强表达、弱表达、可诱导表达、组织增强表达(即，在组织中特异地或优先地表达)、器官增强表达(即，在器官中特异地或优先地表达)和发育增强表达(即，在发育的特定阶段特异地或优先地表达)的启动子，是在本领域技术人员的能力范围内。类似地，如上所述的核酸分子与启动子的组合也在本领域技术人员能力范围内(参见，例如Sambrook等人，2001)。
用于本发明的启动子包括但不限于，在细菌、噬菌体、真菌或植物细胞中有功能的启动子。用于细菌表达的有用启动子有lacZ、Sp6、T7、T5或大肠杆菌glgC启动子。对真菌有用的启动子包括酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)gall(West等人，1984)、裂殖性酵母菌(Saccharomyces pombe)nmtl(Maundrell，1990)、粗糙链孢菌(Neurospora crassa)ccg-1(Freitag和Selker，2005)和甲醇毕赤酵母(Pichia methanolica)AUG1(Invitrogen)。对植物细胞有用的启动子包括γ玉米醇溶蛋白(gamma zein)Z27启动子(参见，例如，Prem Das等人，1991)、L3油质蛋白(oleosin)启动子(美国专利No.6,433，252，Kriz等人)、大麦PER1启动子(Stacey等人，1996)、CaMV35S启动子(美国专利No.5,530,196(Fraley等人))、nos启动子(Ebert等人，1987)、水稻肌动蛋白启动子(美国专利No.5,641,876)和PEPCase启动子(Hudspeth等人，1989)。玄参花叶病毒(FMV)启动子(美国专利NO.6,051,753(Comai等人))、arcelin、番茄E8、patatin、遍在蛋白、甘露碱合酶(mas)和微管蛋白启动子是有用启动子的其他实例。
存在着各种各样的植物启动子序列，其可以用于驱动编码Δ5脱饱和酶和其他脱饱和酶的多核苷酸在转基因植物中的组织特异性表达。实际上，在本发明的特定实施方式中，使用的启动子是种子增强启动子。这样的启动子的实例包括来自这样的基因的5’调节区域，如napin(Kridl等人，1991)、菜豆蛋白(Bustos等人，1989)、大豆β-伴球蛋白的α’亚基(P-Gm7Sα’，参见，例如，Chen等人，1986)、蚕豆(Vicia faba)USP(P-Vf.Usp，参见，例如，美国专利公开20030229918的SEQ ID NO：1、2和3)、球蛋白启动子(参见，例如Belanger和Kriz，1991)和大豆β-伴球蛋白的α亚基(7Sα)(美国专利公开20030093828，通过引用来合并)。
已知在玉米中和在其他植物中起作用的其他种子表达增强启动子包括以下基因的启动子：Waxy(微粒结合的淀粉合酶)、Brittle和Shrunken2(ADP葡萄糖焦磷酸化酶)、Shrunken1(蔗糖合酶)、分支酶I和II、淀粉合成酶、脱支酶、油质蛋白、谷蛋白和Betll(基础胚乳转移层)。本领域技术人员已知的在本发明的实践中有用的其他启动子也是本发明预期的。
此外，转录增强子或增强子的复制可以用于提高来自特定启动子的表达。这种增强子的实例包括但不限于Adh内含子1(Callis等人，1987)、水稻肌动蛋白内含子(McElroy等人，1991，U.S.Patent No.5,641，876)、蔗糖合酶内含子(Vasil等人，1989)、玉米HSP70内含子(也称为Zm.DnaK)(美国专利5,424，412，Brown等人)TMVω元件(Gallie等人，1999)、CaMV35S增强子(美国专利5,359,142&5,196,525，McPherson等人)或章鱼碱合成酶增强子(美国专利5,290,924，Last等人)。由于转录起始位点和编码序列的起点之间的DNA序列(即，非翻译的前导序列)可以影响基因表达，人们也可以希望采用特定的前导序列。可以采用本领域技术人员可获得的任何前导序列。优选的前导序列指导连接的基因的最佳表达水平，例如，通过提高或维持mRNA稳定性和／或通过防止不适当的翻译起始(Joshi，1987)。这种序列的选择处于本领域技术人员的处理能力之内。
本发明的DNA构建体可以包括靠近所述盒的3’末端的序列，其充当信号来终止异源核酸的转录，并指导产生的mRNA的多聚腺苷酸化。这些通常被称为3’非翻译区域或3’UTR。一些可以作为转录终止信号的3’元件包括来自以下的那些，根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)的胭脂碱合成酶基因(nos)(Bevan等人，1983)、napin3’非翻译区(Kridl等人，1991)、球蛋白3’非翻译区(Belanger和Kriz，1991)、来自大豆的Adr12基因的3’非翻译区(生长素减量调节的)(Wang等人，PCT Publication WO200250295)或来自玉米醇溶蛋白基因的，例如Z27(Lopes等人，1995)。本领域已知的其他3’调节元件也可以用于本发明的载体中。
此处描述的核酸分子可以被克隆到任何适合的载体中，并可以用于转化或转染任何适合的宿主。载体的选择和构建它们的方法是本领域熟知的，在技术文献中一般地描述了(一般参见，Recombinant DNA Part D；Meth.Enzymol.153：1-622，1987)。所述载体将优选地包含调节序列，例如转录和翻译起始密码子以及终止密码子，其特异于载体将要导入其中的宿主类型(例如，细菌、真菌或植物)，视情况地并考虑该载体是DNA还是RNA。
可以制备环形或线形的载体，含有连接到在原核或真核宿主细胞中有功能的复制系统的如上所述的完整核酸序列或其部分。复制系统可以来自ColE1、2mμ质粒、λ噬菌体，f1丝状噬菌体、土壤杆菌属物种(例如，农杆菌(A.tumefaciens)和发根植物单胞菌(A.rhizogenes))等等。
除了复制系统和插入的核酸序列之外，所述载体可以包括容许选择转化或转染的宿主的一种或多种标记基因。标记基因包括杀生体抗性(例如对抗生素、重金属、除草剂等等的抗性)、营养缺陷的宿主中的互补物来提供原养，等等。
本发明提供了包含任选地以载体形式的此处描述的核酸分子的宿主细胞。适合的宿主包括植物、细菌和真菌细胞，包括大肠杆菌、枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)、根癌土壤杆菌、酿酒酵母和粗糙链孢霉。大肠杆菌宿主包括TB-1、TG-2、DH5α、XL-Blue MRF’(Stratagene，Austin，TX)、SA2821、Y1090和TG02。植物细胞包括但不限于，大豆、菜苔、芥花、含油种子油菜、油菜籽、海甘蓝、芥菜、蓖麻子、花生、芝麻、棉籽、亚麻子、红花、油棕、亚麻、葵花、苜蓿、玉米、小麦、大麦、燕麦、黑麦、粟、高粱和水稻。
宿主细胞中的表达可以以短暂的或稳定的方式实现。短暂的表达可以从导入的构建体发生，所述构建体含有在宿主细胞中有功能的表达信号，但是所述构建体不能复制和很少整合到宿主细胞中，或其中所述宿主细胞不能增殖。短暂的表达还可以通过诱导与感兴趣的基因可操作地连接的可调节的启动子的活性来实现，虽然这样的可诱导系统常常展现低基础水平的表达。稳定的表达可以通过可以整合到宿主基因组中或在宿主细胞中自主复制的构建体的导入来实现。感兴趣基因的稳定表达可以通过使用位于表达构建体上或用表达构建体转染的选择性标记、随后选择表达所述标记的细胞来选择。当稳定的表达来自整合时，构建体的整合可以在宿主基因组内随机地发生，或可以通过使用含有与宿主基因组同源的区域的构建体被靶向，其足以将重组靶向宿主基因座。当构建体被靶向内源基因座时，全部或某些转录和翻译调节区域可以由内源基因座提供。
宿主细胞中的表达可以涉及本领域技术人员已知的发酵技术。发酵的宿主细胞可以是原核生物(例如，大肠杆菌)、或真核生物(例如，酵母菌酿酒酵母或粗糙链孢霉)、丝状真菌。通过发酵生产PUFA的实例包括被孢霉属(美国专利6,319,698)和Thraustrochytriales(美国专利6,451,567)。
期待的是，通过使用游离的或整合的表达载体，超过一种基因可以被导入宿主细胞中并在宿主细胞中增殖。当两种或更多种基因从独立的复制载体表达时，期望的是每个载体具有不同的复制方式。每个导入的构建体，无论是否是整合的，应当具有不同的选择方式，并且应当缺乏与另一个构建体的同源性，以维持稳定的表达和防止构建体之间元件的重配。导入的构建体的调节区域、选择方式和增殖方法的明智选择可以实验地确定，从而所有导入的多核苷酸以必需的水平表达以提供期望的产物的合成。
多肽
本发明提供了由此处描述的核酸分子编码的Δ5脱饱和酶。Δ5脱饱和酶是可以脱饱和或催化一个或更多个脂肪酸的5位置处连续的碳之间双键形成、来产生单不饱和脂肪酸或多不饱和脂肪酸或其前体的酶。所述多肽可以包含D-氨基酸、L-氨基酸，或D-与L-氨基酸的混合物。
天然氨基酸序列产生变体多肽的改变可以通过本领域普通技术人员已知的各种方法来制备。例如，通过在合成时改变核酸分子的序列可以方便地将氨基酸替换引入所述多肽中。通过将包含修饰的序列的合成寡核苷酸连接到表达载体中，也可以引入位点特异性突变。作为选择，可以使用寡核苷酸指导的、位点特异性诱变步骤，例如在Walder等人(1986)；Bauer等人(1985)；和美国专利4,518,584和4,737,462中公开的。
在本领域普通技术人员能力范围内的是选择合成的和天然发生的氨基酸，其作为对任何特定的天然发生氨基酸的保守性或中性替换。普通技术人员理想地将考虑进行任何特定氨基酸替换的环境，还考虑侧链的疏水性或极性、侧链的一般大小，和在生理条件下具有酸性或碱性的侧链的pK值。例如，赖氨酸、精氨酸和组氨酸通常适合相互替换，更通常地是精氨酸和组氨酸。本领域已知的是，这是因为所有三个氨基酸都具有碱性侧链，而赖氨酸和精氨酸的侧链的pK值相互之间比与组氨酸(约6)更接近(约10和12)。类似地，甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸通常适当地相互取代，条件是甘氨酸通常不适合替代该组的其他成员。这是因为当掺入到多肽中时这些氨基酸的每一个都是相对疏水性的，但是甘氨酸缺乏α碳容许了旋转的phi和psi角(在α碳周围)有这样大的构象自由度，从而甘氨酸残基可能触发在其他氨基酸相互替换时通常不发生的构象或二级结构中的改变。通常适合相互替换的其他氨基酸组包括但不限于，由谷氨酸和天冬氨酸构成的组；由苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸构成的组；以及由丝氨酸、苏氨酸和任选的酪氨酸构成的组。另外，普通技术人员可以容易地分类合成氨基酸和天然发生的氨基酸。
如果期望，所述多肽可以被修饰，例如，通过糖基化、酰胺化、羧化作用或磷酸化，或通过加酸盐、酰胺、酯、特别是C-末端酯以及本发明的多肽的N-酰基衍生物的生成。通过根据本领域已知的方法与其他部分形成共价或非共价复合物，所述多肽还可以被修饰来产生蛋白衍生物。共价结合的复合物可以通过将化学部分连接到包括多肽的氨基酸的侧链的功能基团上，或连接到N-或C-末端来制备。理想地，这种修饰和结合不会有害地影响多肽(和其变体)的活性。虽然这种修饰和结合可能具有更大或更小的活性，所述活性期望地不是消极的，并且是未改变的多肽的特征。
所述多肽(和片段、变体和融合蛋白)可以通过多种常规技术的任何一种来制备。所述多肽可以是从天然发生的来源或从重组来源分离的或基本上纯化的。例如，对于重组蛋白来说，编码期望的蛋白质的DNA片段可以使用公知的分子遗传技术(参见，例如，Maniatis等人，1989，和在此处的“实施例”中引用的其他参考文献)亚克隆到合适的载体中。片段可以被转录，蛋白随后在体外翻译。也可以采用商业上可获得的试剂盒(例如，由Clontech，Mountain View，CA；Amersham Life Sciences，Inc.，Arlington Heights，IL；Invitrogen，Carlsbad，CA等等生产的)。任选的，可以在核酸的操作中采用聚合酶链式反应。
多肽也可以根据本领域已知的方法使用自动化肽合成仪来合成。作为选择，所述多肽(和片段、变体和融合蛋白)可以使用本领域普通技术人员公知的标准肽合成技术(例如，如Bodanszky，1984中概述的)来合成。特别地，所述多肽可以使用固相合成的步骤来合成(参见，例如，Merrifield，1963；Barany等人，1987和美国专利5,424,398)。如果期望，这可以使用自动化肽合成仪来进行。t-丁氧羰基(t-BOC)或9-茐甲氧羰基(Fmoc)氨基酸保护基团的去除和蛋白质从树脂上分离可以通过例如在降低的温度下的酸处理进行。含多肽的混合物任何可以被提取，例如，使用二乙醚，来除去非肽有机化合物，合成的蛋白质可以从树脂粉未中提取(例如，使用约25％w／v乙酸)。在多肽的合成之后，任选地可以进行进一步的纯化(例如，使用HPLC)来消除任何不完整的蛋白质、多肽、肽或游离氨基酸。氨基酸和／或HPLC分析可以对合成的多肽进行来验证其身份。对于根据本发明的其他应用，优选的是通过化学结合，或通过本领域已知的遗传学方法，来产生所述多肽来作为更大的融合蛋白的部分。就此来说，本发明还提供了包含所述多肽(或其片段)或其变体以及具有任何期望的性质或效应物功能的一种或多种其他多肽／蛋白的融合蛋白。
对于特定蛋白质的生产和鉴定的分析是基于各种物理-化学的、结构的、功能的，或蛋白质的其他性质。独特的物理-化学或结构性质容许通过电泳步骤，例如天然或变性凝胶电泳或等电聚焦，或者通过色谱技术，例如离子交换或凝胶排阻色谱法来分离和鉴定。单独蛋白质的独特结构提供了使用特异性抗体来以例如ELISA分析的形式检测它们存在的机会。方法的组合可以用于实现更高的特异性，例如Western印迹，其中抗体被用于定位已经通过电泳技术分离的单独基因产物。其他技术可以用于确切地确认目标产物的身份，例如通过纯化后的氨基酸测序来评估。虽然这些是最常见的，也可以使用其他步骤。
分析过程可以通过蛋白质的功能来鉴定蛋白质的表达，特别是当表达的蛋白质是能够催化涉及特定底物和产物的化学反应的酶时。例如，在植物提取物中，这些反应可以通过物理和／或化学过程通过提供和测定反应的底物损失或产物生成来测量。
在很多情况下，基因产物的表达通过评估其表达的表型结果来确定。这种评估可以仅仅是视觉观察，或可以包括分析。这种分析可以采取许多形式，例如，分析植物的化学成分、形态学或生理性质方面的改变。通过表达编码酶或改变氨基酸组成的储存蛋白质的基因可以改变化学组成，且这些改变可以通过氨基酸分析或通过改变淀粉数量的酶来检测，其可通过近红外的反射光谱学或通过改变油组成的酶来分析，可通过气相色谱法来检测。形态改变可以包括更大的身材或更厚的茎杆。
本发明的核酸分子、DNA构建体和多肽可以用于农业方法和各种筛选分析中。例如，核酸分子可以用于在宿主细胞中经由载体表达Δ5脱饱和酶，用于检测生物样品中编码Δ5脱饱和酶的mRNA转录本，用于经由Southern印迹来检测编码Δ5脱饱和酶的基因中的遗传改变，用于抑制Δ5脱饱和酶，或用于增量调节Δ5脱饱和酶。所述多肽可以用于在植物中补偿Δ5脱饱和酶的缺失，或补偿具有降低的活性或无活性的突变Δ5脱饱和酶的存在，或用于在植物中处理Δ5脱饱和酶的过多的底物水平，不管是直接还是间接的。作为选择，所述多肽可以用于根据调节它们活性的能力来筛选试剂。抗体可以用于检测和分离相应的多肽，以及降低这些多肽在体内的可用性。
植物转化
在本发明的优选的实施方式中，产生表达期望的蛋白质的转基因植物。向植物细胞中导入编码期望的蛋白质的期望的多核苷酸序列的各种方法是本领域已知的，包括(1)物理方法，例如显微注射、电穿孔和微粒介导的递送(生物射弹(biolistics)或基因枪技术)；(2)病毒介导的递送；或(3)根瘤菌介导的(例如，土壤杆菌属介导的)转化。
植物细胞转化的最常用的方法是土壤杆菌介导的DNA转移方法，以及生物射弹或微注射微粒轰击介导的方法。一般地，核转化是期望的，但当专门地转化质体(例如叶绿体或淀粉体)是期望的时，可以利用期望的多核苷酸的微粒介导的递送来转化植物质体。
土壤杆菌介导的转化通过使用属于土壤杆菌属的遗传工程化的土壤细菌来实现。带有Ti或Ri质粒的根癌土壤杆菌和根花土壤杆菌(Agrobacterium rhizogenes)的许多野生型和去攻击的菌株可以用于植物的基因转移。通过称为“T-DNA”的特定DNA的转移来进行向许多植物品种中的基因转移，所述特定DNA可以被遗传工程化来携带任何期望的DNA片段，如在例如Bidney等人的美国专利6,265,638中进一步详细描述的，通过引用将其公开内容合并在此。
土壤杆菌介导的植物的遗传转化涉及几个步骤。第一步一般称为“接种”，其中强毒土壤杆菌和植物细胞首先相互接触。接种优选地伴随着某些对一些植物细胞的损伤方法，其释放植物细胞成分，例如豆香醇类(coumaryl alcohol)、sinapinate(其被还原为乙酰丁香酮)、芥子醇和松柏醇，它们活化土壤杆菌属中的致病因子。在接种之后，允许土壤杆菌和植物细胞／组织在适合生长和T-DNA转移的条件下一起生长几小时到几天或更久的一段时间。这个步骤称为“共培养”。在共培养和T-DNA递送之后，用杀细菌或抑细菌试剂处理植物细胞来杀死保持与外植体接触的和／或在含有外植体的器皿中的土壤杆菌。如果在缺乏任何选择性试剂的情况下进行这个步骤，以促进转基因植物细胞相对于非转基因植物细胞的优势生长，则这一般称为“延迟”步骤。如果在存在偏爱转基因植物细胞的选择压力的情况下进行这个步骤，则它被称为“选择”步骤。当使用“延迟”时，一般跟随着一个或多个“选择”步骤。
对于微粒轰击(美国专利No.5,550,318(Adams等人)；美国专利No.5,538,880(Lundquist等人)、美国专利No.5,610,042(Chang等人)；和PCT公开WO95／06128(Adams等人)；通过完全引用将它们每一个特别地合并在此)，用核酸包被微粒子，并通过推力递送到细胞中。示范性的颗粒包括由钨、铂和优选的金组成的那些。
通过加速将DNA递送到植物细胞中的方法的说明性实施方式是颗粒递送系统(BioRad，Hercules，CA)，其可以用于将包被有DNA或细胞的颗粒通过筛子(例如不锈钢筛或Nytex筛)推进到用悬浮液中培养的单子叶植物细胞覆盖的过滤器表面上。
微粒轰击技术是广泛可用的，可以用于转化实际上任何植物物种。已经通过微粒轰击转化的物种的实例包括单子叶植物物种，例如玉米(国际公开NO.WO95／06128(Adams等人))、大麦、小麦(美国专利NO.5,563,055(Townsend等人，通过完全引用合并在此)、水稻、燕麦、黑麦、甘蔗和高粱；以及许多双子叶植物，包括烟草、大豆(美国专利NO.5,322,783(Tomes等人)，通过完全引用合并在此)、葵花、花生、棉花、番茄和一般的豆荚(美国专利No.5,563,055(Townsend等人)，通过完全引用合并在此)。.
为了对转化的植物细胞进行选择或记分而不考虑转化方法，被导入细胞中的DNA含有基因，其在可再生的植物组织中起作用来产生为植物组织赋予对其他有毒化合物的抗性的化合物。用作可选择、可筛选或可记分标记物的感兴趣的基因将包括但不限于β-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)、绿色荧光蛋白(GFP)、荧光素酶(LUX)、抗生素或除草剂耐受性基因。抗生素抗性基因的实例包括青霉素、卡那霉素(和新霉素、G418、博来霉素)；氨甲蝶呤(和三甲氧苄二氨嘧啶)；氯霉素；卡那霉素和四环素。编码涉及除草剂耐受性的蛋白质的多核苷酸分子是本领域已知的，包括但不限于关于草甘膦耐受性的美国专利No.5,627,061(Barry,等人)、美国专利No5,633,435(Barry，等人)和美国专利No6,040,497(Spencer,等人)中描述的编码5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶(EPSPS)的多核苷酸分子和美国专利No.5,094,945(Comai)中描述的aroA；关于溴苯腈耐受性的美国专利No.4,810,648(Duerrschnabel等人)中描述的编码溴苯腈腈水解酶(Bxn)的多核苷酸分子；关于达草灭耐受性的在Misawa等人(1993)和Misawa等人(1994)中描述的编码八氢番茄红素脱饱和酶(crtI)的多核苷酸分子；关于对磺酰脲除草剂的耐受性在Sathasiivan等人(1990)中描述的编码乙酰羟基酸合成酶(AHAS，aka ALS)的多核苷酸分子；以及各自提供了草铵膦和双丙氨瞵耐受性的Wohlleben等人(1988)中描述的pat基因和DeBlock等人(1987)中描述的bar基因。
来自各种转化的外植体的植物的再生、发育和培养是本领域中充分记载了的。这种再生和生长过程一般包括选择转化的细胞和培养那些个体化的细胞的步骤，从一般的胚胎发育阶段到生根的植物苗阶段。类似地再生转基因胚芽和种子。然后将产生的转基因的生根的芽种植到合适的植物生长培养基，例如土壤中。在对选择性试剂的暴露下幸存的细胞，或在筛选分析中记分为阳性的细胞，可以在支持植物再生的培养基中培养。在转移到温室或生长箱发育成熟之前，将发育的植物苗转移到少土的植物生长混合物中，并锻炼得耐寒。
本发明可以使用任何可转化的细胞或组织。在此使用的可转化是指细胞或组织能够进一步增殖来产生植物。本领域技术人员认识到，许多植物细胞或组织是可转化的，其中在外源DNA的插入和合适的培养条件之后，植物细胞或组织可以形成分化的植物。适合于这些目的的组织可以包括但不限于不成熟的胚芽、鳞片组织、悬浮细胞培养物、不成熟的花序、芽分生组织、结节外植体、愈伤组织、胚轴组织、籽叶、根和叶。以上引述的Tomes等人‘783专利描述了一种方法，用细胞分裂素处理、随后孵育一段时期，足以允许子叶节组织中的未分化细胞分化成分生组织细胞，并允许细胞进入发育的G1和分裂期之间的阶段，声称其改善了转化的敏感性。
根据本发明，可以使用任何适合的植物培养基。适合的培养基包括但不限于，基于MS的培养基(Murashige和Skoog，1962)或基于N6的培养基(Chu等人，1975)，其补充有植物生长调节剂，该植物生长调节剂包括但不限于发育素、细胞分裂素、ABA和赤霉素。本领域技术人员熟悉组织培养基的品种，当适当地补充时，其支持了植物组织生长和发育，并适合于植物转化和再生。这些组织培养基可以作为商业产品购买，或常规地制备和修改。本领域技术人员知道，用于转化和再生的培养基和培养基添加剂例如营养物和生长调节剂，以及其他培养条件，例如孵育期间的光强度、pH值和孵育温度，可以根据特定的感兴趣的品种来优化。
在DNA构建体被稳定地掺入到转基因植物中并被确认是可操作的之后，它可以通过有性杂交导入到相同或另一种有性相容物种的其他植物中。取决于要杂交的物种，可以使用许多标准育种技术的任一种。因而，本发明不仅涵盖直接转化的植物或从根据本发明转化的细胞再生的植物，还涵盖这样的植物的子代。如在此使用的，术语“子代”是指根据本发明制备的亲本植物的任何世代的后代，其中所述子代包含根据本发明制备的选定的DNA构建体。如在此公开的，“杂交”植物来提供具有与起始植物系相对的一个或更多个添加的转基因或等位基因的植物系，被定义为一类技术，通过将起始系与包含本发明的转基因或等位基因的供体植物系杂交，其使得特定的序列被导入到植物系中。为了实现这一点，例如，人们可以进行如下步骤：(a)种植第一(起始系)和第二(包含期望的转基因或等位基因的供体植物系)亲本植物的种子；(b)将所述第一和第二亲本植物的种子生长成带有花的植物；(c)用来自第二亲本植物的花粉给来自第一亲本植物的花授粉；和(d)收获在带有授粉的花的亲本植物上产生的种子。
回交在此被定义为包括以下步骤的过程：(a)将含有期望的基因、DNA序列或元件的第一基因型的植物与缺乏所述期望的基因、DNA序列或元件的第二基因型的植物杂交；(b)选择含有所述期望的基因型、DNA序列或元件的一个或更多个子代植物；(c)将所述子代植物与所述第二基因型的植物杂交；和(d)重复步骤(b)和(c)以将来自第一基因型的植物的期望的DNA序列转移到第二基因型的植物中。
DNA元件向植物基因型的基因渗入被定义为回交转化过程的结果。其中DNA序列已经基因渗入的植物基因型可以称为回交转化的基因型、系、近交种或杂交种。类似地，缺乏所述期望的DNA序列的植物基因型可以被称为未转化的基因型、系、近交种或杂交种。
种子、粗粉、油和包含种子、粗粉和油的产品
本发明还提供了超过约1000、更优选的约20,000、再更优选的约40,000个种子的容器，其中超过约10％、更优选的约25％、更优选的约50％、再更优选的约75％，或更优选的约90％的种子是来自本发明的植物的种子。
本发明还提供了超过约10kg、更优选的约25kg、再更优选的约50kg种子的容器，其中超过约10％、更优选的约25％、更优选的约50％、再更优选的约75％，或更优选的约90％的种子是来自本发明的植物的种子。
本发明的任何植物或其部分可以被收获，以及任选的被加工来产生饲料、粗粉或油产品。为这个目的的特别优选的植物部分是收获的种子，但可以收获植物的其他部分并用于干草或青贮饲料。产生饲料、粗粉和油产品的方法是本领域已知的。参见，例如，美国专利4,957,748；5,100,679；5,219,596；5,936,069；6,005,076；6,146,669；和6,156,227。本发明的谷粒或粗粉可以与其他谷粒或粗粉混合。
方法
本发明提供了用于提供具有提高的EPA或ARA含量的转基因植物的方法。这种方法可以包括，例如，将编码Δ5脱饱和酶和任选地至少一种其他脱饱和酶的DNA导入到植物细胞中，并从所述转基因细胞再生具有提高的EPA或ARA含量的植物。
更具体地，本发明提供了生产食物或饲料的方法，包括步骤(a)获得本发明的转基因植物；和(b)产生所述食物或饲料。所述食物或饲料可以是油、青贮饲料、粗粉、谷粒、淀粉、细粉或蛋白质。食物或饲料组合物被定义为包含本发明提供的可检测的多核苷酸序列或可检测的多肽。另外，本发明提供了包含EPA或ARA的动物饲料和人类食品组合物。
对于膳食增补，纯化的PUFA、转化的植物或植物部分、或其衍生物，可被掺入到配制的烹调油、脂肪或人造黄油中，从而在正常使用中接受者将接受期望的数量。PUFA也可被掺入婴儿配制食品、营养增补剂或其他食物产品中，并可以用作抗炎试剂或胆固醇降低试剂。
如在此使用的，“可食用的组合物”被定义为可以由哺乳动物摄食的组合物，例如，粮食、营养物质和药物组合物。如在此使用的，“粮食”是指可以用作或制备用作哺乳动物的食物的物质，包括可以在食物(例如，油炸油)或食品添加剂的制备中使用的物质。例如，粮食包括用于人类消费的动物，或由此产生的任何产品，例如，蛋。典型的粮食包括但不限于，饮料(例如，软饮料、碳酸饮料、即混(ready to mix)饮料)、婴儿配制食品、泡制的食物(例如，果实和蔬菜)、调味汁、调味品、色拉料、果汁、糖浆、甜品(例如，布丁、胶冻、糖霜和馅料、烤制食物和冷冻甜品，例如冰淇淋和冰糕)、软冷冻产品(例如，软冻奶油、软冻冰淇淋和酸奶酪、软冻配料，例如乳制或非乳制的人造稠黄油)、油和乳化的产品(例如，起酥油、人造黄油、蛋黄酱、黄油、食油和色拉料)以及半干食品(例如，米饭和狗食)。
此外，此处描述的可食用的组合物也可以作为食物和饮料中含有的添加剂或补充物来摄食。这些可以与营养物质，例如各种维生素和矿物质一起配制，并掺入到基本上液体的组合物中，例如，营养饮料、豆奶和汤；基本上固体的组合物中；以及凝胶中，或以待掺入各种食物的粉剂形式使用。这样的功能性或健康食品中有效成分的含量可以类似于典型的药物制剂中含有的剂量。
纯化的PUFA、转化的植物或植物部分也可以掺入到动物、特别是家畜饲料中。这样，动物自己可以受益于富含PUFA的膳食，而从人类消费这样的家畜产生的食物产品也同样有益。
对于药物用途(人类或兽医学)，所述组合物一般可以口服施用，但是也可以通过它们可以被成功地吸收的任何途径来施用，例如胃肠外地(即，皮下地、肌肉内或静脉内地)、直肠地、阴道地或局部地，例如，皮肤软膏剂或洗液。本发明的PUFA、转化的植物或植物部分可以单独施用，或与药学上可接受的载体或赋形剂组合地施用。当可用时，胶囊是优选的口服施用形式。如以上阐述的膳食添加剂也可以提供口服的施用途径。本发明的不饱和酸可以以偶联的形式，或者以脂肪酸盐、酯、酰胺或前药的形式来施用。任何药学上可接受盐均包括在本发明内，特别优选的是钠、钾或锂盐。还包括的是N-烷基多羟基胺盐，例如N-甲基葡糖胺，可参见在PCT公开WO96／33155。优选的酯是乙酯。对于固体盐，PUFA也可以以片剂形式施用。对于静脉内的施用，PUFA或其衍生物可以掺入到商售制剂中，例如Intralipids(Pharmacia-Upjohn，Peapack，N.J.)。
实施例
包括以下实例来说明本发明的实施方式。本领域的技术人员应当理解，在根据本发明人公开的当前技术的实施例中所公开的技术在本发明的实践中良好地运作。然而，本领域的技术人员根据当前公开的内容应当理解，可以在公开的特定的方案中进行许多变化，在不离开本发明的概念、精神和范围的情况下仍获得相同的或类似的结果。更具体地，显而易见的是，可以用化学上和生理学上都相关的某些试剂替换在此描述的试剂，而达到相同的或相似的结果。对于本领域的技术人员显而易见的，所有这种相似的替换和修改都认为处在由附随的权利要求所定义的本发明的精神、范围和概念之内。
实施例1
半片藻属Δ5脱饱和酶序列的克隆
本发明的Δ5脱饱和酶克隆自Hemiselmis virescens和Hemiselmis rufescens。为了克隆Hemiselmis virescensΔ5脱饱和酶(HvD5D)，RNA从H. virescens CCMP442(CCMP，West Boothbay Harbor，ME，USA)分离，随后构建cDNA库。测序了大约20,000个独立的克隆。对脱饱和酶相关序列的检索得到了推定的Δ5脱饱和酶编码克隆LIB5446-048-A1-M1-G2。
LIB5446-048-A1-M1-G2的克隆的插入物的DNA序列(SEQ ID NO：5)长度是1613bp，含有1326bp的开放阅读框(ORF)(SEQ ID NO：1)，编码441个氨基酸的推断的氨基酸序列(SEQ ID NO：2)。蛋白质的计算的大小是48.9Kdal，具有估计的7.1的pI。称为HvD5D的ORF含有保守的氨基酸序列HPGG(SEQ ID NO：24)，其是融合到前端脱饱和酶的N-末端的细胞色素b5(cytb5)结构域的一部分。所有特征的前端脱饱和酶，包括Δ4-、Δ5-、Δ6-和Δ8-脱饱和酶都具有这个N-末端cytb5结构域。此外，LIB5446-048-A1-M1-G2的推断的氨基酸序列具有三个保守的组氨酸框；最特别的是QXXHH(SEQ ID NO：25)序列，其在第三个组氨酸框中存在，也是前端脱饱和酶的判断特征(Napier等人，1997，Napier等人，2003，Sperling和Heinz，2001)。三个保守的组氨酸框是活性位点的一部分，被认为是结合活性所需要的二铁辅助因子所需的。
含有来自LIB5446-048-A1-M1-G2的推定的Δ5脱饱和酶编码区域的1326bp区域通过PCR扩增，并连接到酵母菌表达载体pYES2.1-TOPO(Invitrogen，Carlsbad CA)，得到pMON67056(附图2)。用于扩增的引物显示如下：
Hv D5M1G2F1：5’-GTCGACAAACAATGCCTCCCAACAGTGGCG-3’(SEQ ID NO：6)
Hv D5M1G2R1：5’-CCTGCAGGTCAGGCCGCCTTGACCCTC-3’(SEQID NO：7)
SalI限制性位点和Kozak序列被添加到Hv D5M1G2F1寡核苷酸的5’末端，Sse8387I限制性位点被添加到Hv D5M1G2R1寡核苷酸的5’末端。
为了克隆Hemiselmis rufescensΔ5脱饱和酶(HrD5D)，RNA从H. rufescensCCMP439(CCMP，West Boothbay Harbor，ME，USA)分离，随后构建cDNA库。筛选由～23,790个克隆组成的EST文库中含有如上所述的共有前端脱饱和酶的序列。鉴定了部分克隆，LIB5445-223-A1-M1-D4，其含有除cytb5区域(HPGG)之外的所有早先描述的保守序列。利用5’RACE反应来完成这种推定的前端脱饱和酶的ORF，其随后连接到pYES2.1／V5-His-(Invitrogen，Carlsbad，CA)来得到pMON104220(附图3)。用于PCR扩增全长ORF的引物是：
H.ruf223
5’-CAGTCGACAAACAATGCCCCCCAACAGCGGCGCGGGAG-3’
(SEQ ID NO：8)和
3’revH.Ruf223
5’-CACCTGCAGGTCAGTCGGCTTTGACCTTCCCTTCG-3’(SEQ ID NO：9).
这个克隆的ORF是1323bp(SEQ ID NO：3；不包括终止密码子)，编码441个氨基酸的推断的氨基酸序列(SEQ ID NO：4)。这个蛋白质具有49Kdal的估计的大小，pI为8.2。
来自Hemiselmis rufescens、Hemiselmis virescens、畸雌腐霉、高山被孢霉、假微型海链藻和多甲藻属物种CCMP626的Δ5脱饱和酶以及来自高山被孢霉的Δ6脱饱和酶的成对的比对在表1中显示。两种半片藻属Δ5脱饱和酶是最相似的，显示了86.9％的同一性。比较起来，来自浮游植物假微型海链藻和多甲藻属物种CCMP626的两种其他Δ5脱饱和酶的同一性为48.5％到50.9％。半片藻属Δ5脱饱和酶与来自水霉-畸雌腐霉(卵菌)和产油真菌-高山被孢霉的Δ5脱饱和酶享有更少的同一性，为21.9％到23.4％。同源性的最高水平在cytb5结构域的两个组氨酸框、Q框和保守的HPGG盒附近的区域中找到(附图1)。
表1：Δ5和Δ6脱饱和酶的推断的氨基酸序列的成对比对的同一性百分比。
畸雌腐霉Δ5脱饱和酶(GenBank登录号AAL13311)。
高山被孢霉Δ5脱饱和酶(登录号AAC72755)。
高山被孢霉Δ6脱饱和酶(登录号AAF08685)。
假微型海链藻Δ5脱饱和酶(登录号DJ418329)。
多甲藻属物种CCMP626Δ5脱饱和酶(US20070271632的SEQ ID NO：2)。
实施例2
酵母菌转化和表达
利用S.C.EasyCompTM转化试剂盒(Invitrogen)将含有HvD5D和HrD5D的pYES2.1／V5-His-克隆导入宿主菌株酿酒酵母INVSc1(尿嘧啶营养缺陷的)(Invitrogen)中。在减去尿嘧啶的、具有2％葡萄糖的SC最小培养基制成的平板上选择转化体。转化体的克隆用于接种减去尿嘧啶、2％葡萄糖的2ml SC最小培养基，在30℃生长过夜。用于诱导，将稳定期的酵母细胞沉淀，以0.4O.D.A600重悬浮在补充有2％半乳糖和任选的外源的脂肪酸、减去尿嘧啶的SC最小培养基中，在15℃生长3天。当向培养物提供外源脂肪酸时，与0.1％的乳化剂Tergitol一起添加0.01％DGLA(18∶2Δ8,11，14)或0.01％ETA(20∶4Δ8，11，14，17)。在与这些脂肪酸孵育3天后，通过离心收获培养物。细胞沉淀物用无菌的TE缓冲液pH7.5洗涤一次，来除去培养基，冻干到干燥。空的载体pYES2／CT转化的宿主菌株在所有实验中用作阴性对照。
通过添加0.1mL甲苯和在室温下孵育过夜来从冻干的酵母菌沉淀物提取脂质。提取的脂质通过添加0.5mL的甲醇中的0.6N甲醇钠和在室温下孵育45分钟原位地转化为脂肪酸甲基酯(FAME)。通过添加0.8mL10％(w／v)NaCl和0.15mL庚烷来提取FAME。在强有力的摇晃和相分离之后，取出含有FAME的庚烷层并直接用于气相色谱法(GC)。FAME在装备有火焰离子化探测器和毛细管柱(Omegawax250TM；30m x0.25mm i.d.x0.25m；Supelco，Bellefonte，PA)的Hewlett-Packard5890II Plus GC(Hewlett-Packard，Palo Alto，CA)上鉴定。注入器维持在250℃，火焰电离检测器维持在270℃。柱温在注射后维持在180℃15分钟，以40℃／分钟提高到240℃，在245℃保持3.38分钟。
表2中显示的结果展现了，半片藻属克隆HvD5D和HrD5D在酵母菌表达系统中展现Δ5脱饱和酶活性。从酵母菌诱导分析推断出酶活性，通过所述诱导分析，被诱导以表达重组脱饱和酶的酵母培养物被饲喂DGLA或ETA。酵母菌将这些脂肪酸掺入到它们的膜中，在此处这些脂肪酸变成重组脱饱和酶的底物。DGLA和ETA脱饱和的产物分别是ARA(20∶4Δ5，8，11，14)和EPA(20∶5Δ5，8，11，14，17)。对每个载体选择两个单独的酵母菌菌落，一式三份地生长。值显示为6个分析的平均值。两个半片藻属克隆都展现了对ETA和DGLA的酶活性。
表2：酵母菌表达系统中半片藻属物种HvD5D和HrD5D的Δ5脱饱和酶活性
实施例3
半片藻属物种的Δ5脱饱和酶在大豆和芥花中的表达
Hemiselmis virescens或Hemiselmis rufescensΔ5脱饱和酶的活性通过在大豆背景中在种子增强启动子的控制下表达它来在大豆中评估，所述大豆背景含有其他脂肪酸脱饱和酶的表达盒，所述其他脂肪酸脱饱和酶产生二高-γ-亚麻酸(DGLA)和／或二十碳四烯酸(ETA)底物脂肪酸分子，Δ5脱饱和酶分别将所述底物脂肪酸分子转化成花生四烯酸(ARA)或二十碳五烯酸(EPA)。一般在植物中、特别是在大豆中转基因的种子增强表达是本领域中充分建立的。利用标准的分子克隆技术，作为野生型序列、或作为种子增强启动子下游的用于感兴趣植物表达而密码子增强的序列，来克隆感兴趣的基因。双子叶植物例如大豆或芥花的种子增强启动子的实例是7Sα启动子、7Sα’启动子、Arcelin-5启动子、napin启动子和油质蛋白启动子。在启动子序列和感兴趣基因的编码区域之间，插入5’-非翻译区域(5’-UTR)来稳定mRNA。这个序列一般包括转录起始位点。在翻译的终止密码子下游，添加3’-非翻译区域(3’-UTR)来稳定mRNA和终止转录。在植物中，任一Δ5脱饱和酶的ETA或DGLA底物可以通过Δ6途径或通过Δ8途径产生。为了通过Δ6途径产生DGLA，用H.virescens或H.rufescensΔ5脱饱和酶的表达盒转化的植物背景必需含有Δ6脱饱和酶的种子增强的表达盒，优选的为ω-6特异性Δ6脱饱和酶，例如，亚心形扁藻Δ6脱饱和酶，或高山被孢霉Δ6脱饱和酶和Δ6或C18延伸酶，例如，高山被孢霉Δ6延伸酶。对于通过Δ6途径的ETA产生，Δ6脱饱和酶表达盒优选地含有编码ω-3优先酶的基因，例如九莱报春Δ6脱饱和酶。另外，植物背景优选地还含有Δ15脱饱和酶的种子增强的表达盒，例如，构巢曲霉Δ15脱饱和酶、串珠镰刀菌Δ12／Δ15脱饱和酶、拟南芥Δ15脱饱和酶或高山被孢霉Δ15脱饱和酶。作为植物背景的一部分描述的其他表达盒可以单独地转化，和杂交进入，或通过选定的系的重新转化来与感兴趣的基因组合，或者它们可以在共同轰击中、作为多个T-DNA的部分在土壤杆菌介导的共同转化中、或在单个DNA构建体的转化(例如通过土壤杆菌介导的转化)中与感兴趣的基因共同转化。所有这些方法是本领域中充分建立的。
为了通过Δ8途径产生DGLA或ETA底物，Δ5脱饱和酶表达构建体必需转化到植物背景中，所述植物背景含有Δ9延伸酶(例如纤细裸藻Δ9延伸酶或球等鞭金藻Δ9延伸酶)的种子增强的表达盒，以及Δ8脱饱和酶(例如巴夫藻属物种的Δ8脱饱和酶、TetruepretiapomquetensisΔ8脱饱和酶或纤细裸藻Δ8脱饱和酶)的种子增强的表达盒。为了通过Δ8途径主要产生ETA底物，带有Δ9延伸酶表达构建体和Δ8脱饱和酶表达构建体的植物背景还应当含有Δ15脱饱和酶(例如构巢曲霉Δ15脱饱和酶、串珠镰刀菌Δ12／Δ15脱饱和酶、拟南芥Δ15脱饱和酶或高山被孢霉Δ15脱饱和酶)的种子增强的表达构建体。作为对包括Δ15脱饱和酶的表达构建体的替代，可以使用Δ17脱饱和酶(例如，异枝水霉Δ17脱饱和酶)的种子增强的表达构建体。后一途径主要通过DGLA中间产物产生ETA，而前一途径可以被设计以主要通过十八碳四烯酸(SDA)中间产物产生ETA。
当Δ5脱饱和酶在通过上述途径之一产生DGLA底物的植物背景中表达时，产生ARA。为了产生EPA、DPA(n-3)、或DHA，需要其他的脱饱和酶和延伸酶。ω-3脱饱和酶例如Δ17脱饱和酶的补充表达，例如表达异枝水霉Δ17脱饱和酶的种子，特异性地将DGLA转化成ETA，以及将ARA转化成EPA。
为了产生DGLA底物同时保持低ETA水平，细胞的Δ-15脱饱和酶的表达可以通过RNAi构建体的种子增强的表达来降低或完全抑制，而同时C18延伸酶与Δ-8脱饱和酶共同表达。在这样的背景中，Δ-5脱饱和酶的种子增强的表达引起ARA的优势性形成。
另外含有含C20延伸酶如纤细裸藻C20延伸酶的种子增强表达盒、或C20延伸酶和Δ-4脱饱和酶表达构建体的植物背景分别积累DPA或DPA／DHA。本发明的Δ-4脱饱和酶的实例是裂壶藻(Schizochytrium aggregatum)Δ4脱饱和酶。
在芥花中表达H.virescens或H. rufescensΔ5脱饱和酶的策略与在大豆或其他双子叶植物中的策略是相同的。
含有如上所述的构建体的转化的双子叶外植体通过根癌土壤杆菌介导的转化来获得。从转化的组织再生植物。然后分析温室生长的植物的油组成。
例如，H. virescens或H.rufescensΔ5脱饱和酶的活性在也用PUFA生产所必需的其他基因转化的大豆中测定。这些盒包括由USP88启动子驱动的粗糙链孢菌Δ15脱饱和酶、由7Sα'启动子驱动的高山被孢霉Δ6脱饱和酶和由7Sα启动子驱动的高山被孢霉Δ6延伸酶。含有如上所述的3个盒的植物将被称为对照。用于对比，来自异枝水霉和球等鞭金藻的Δ5脱饱和酶也转化到相同的背景中。每个Δ5脱饱和酶在USP88启动子的控制下表达。含有如上所述的构建体的转化的大豆外植体通过根癌土壤杆菌介导的转化来获得。从转化的组织再生植物。然后分析温室生长的植物的油组成。示出了每种Δ5脱饱和酶和对照的多个转化事件。
表3：在大豆中半片藻属物种HvD5D和HrD5D的Δ5脱饱和酶活性(脂肪酸18∶1到18∶2)。
元件 油酸 18∶2D5，9 18∶2D6，9
对照 21.45 0.00 0.25
对照 25.30 0.05 0.56
对照 26.11 0.00 0.55
对照 17.06 0.00 0.32
对照 13.97 0.00 0.11
对照 16.69 0.00 0.18
对照 25.10 0.00 0.64
对照 16.01 0.00 0.17
对照 18.07 0.00 0.24
对照 16.85 0.00 0.16
对照 19.09 0.00 0.32
对照 16.02 0.01 0.15
对照 26.77 0.00 0.89
对照 18.59 0.00 0.23
对照 20.69 0.00 0.32
对照 33.35 0.00 1.26
对照 20.30 0.00 0.33
对照 18.75 0.00 0.30
对照 17.60 0.00 0.21
对照 18.66 0.01 0.30
对照 27.01 0.01 0.48
对照 18.84 0.00 0.37
对照 16.40 0.00 0.24
HvD5d 29.48 0.15 0.77
HvD5d 18.84 0.16 0.25
HvD5d 30.02 0.11 0.75
HvD5d 23.67 0.00 1.67
HvD5d 19.46 0.10 0.28
HvD5d 22.45 0.12 0.39
HvD5d 23.56 0.08 0.39
HvD5d 17.60 0.02 0.42
HvD5d 20.86 0.11 0.35
HvD5d 16.23 0.01 0.15
HvD5d 20.36 0.06 0.22
HvD5d 23.09 0.00 0.25
元件 油酸 18∶2D5，9 18∶2D6，9
HvD5d 17.18 0.06 0.19
HvD5d 20.89 0.06 0.44
HvD5d 14.30 0.12 0.14
HvD5d 18.67 0.08 0.22
HvD5d 17.32 0.05 0.23
HrD5D 33.77 0.27 0.69
HrD5D 34.96 0.38 1.35
HrD5D 32.17 0.29 0.76
HrD5D 33.11 0.48 0.60
HrD5D 28.29 0.21 0.53
HrD5D 25.28 0.21 0.38
HrD5D 24.69 0.33 0.60
HrD5D 30.52 0.22 0.68
HrD5D 15.29 0.11 0.10
HrD5D 33.60 0.34 0.95
HrD5D 20.36 0.18 0.42
HrD5D 23.02 0.18 0.30
HrD5D 18.64 0.16 0.22
HrD5D 23.85 0.18 0.38
HrD5D 18.92 0.17 0.17
HrD5D 42.04 0.17 1.03
HrD5D 30.66 0.23 0.87
HrD5D 20.47 0.01 0.45
HrD5D 20.09 0.06 0.24
HrD5D 17.22 0.02 0.20
HrD5D 22.06 0.06 0.42
HrD5D 20.13 0.00 0.94
SdD5D 31.92 4.48 0.95
SdD5D 28.14 3.34 0.55
SdD5D 17.89 2.00 0.11
SdD5D 40.70 6.81 1.50
SdD5D 19.05 1.68 0.26
SdD5D 35.14 5.01 1.03
SdD5D 28.02 3.57 0.38
SdD5D 30.57 3.34 0.85
SdD5D 27.84 2.60 0.96
SdD5D 26.63 2.87 0.54
SdD5D 22.45 0.00 0.47
SdD5D 18.41 1.71 0.21
SdD5D 37.35 5.42 1.06
SdD5D 24.61 3.45 0.50
SdD5D 21.24 0.16 0.40
SdD5D 25.79 3.67 0.47
SdD5D 27.36 0.10 0.58
SdD5D 24.47 1.68 0.38
SdD5D 20.00 0.08 0.36
SdD5D 33.69 4.46 1.07
元件 油酸 18∶2D5，9 18∶2D6，9
SdD5D 35.88 2.02 1.80
SdD5D 18.75 0.05 0.30
SdD5D 14.49 0.11 0.05
SdD5D 15.65 0.08 0.19
SdD5D 13.83 0.05 0.17
IgD5D 21.72 0.04 0.45
IgD5D 21.45 0.03 0.45
IgD5D 19.44 0.04 0.51
IgD5D 23.26 0.06 0.48
IgD5D 26.69 0.09 0.86
IgD5D 17.03 0.00 0.31
IgD5D 18.02 0.00 0.24
IgD5D 42.95 0.08 1.83
IgD5D 20.32 0.02 0.32
IgD5D 18.35 0.03 0.35
IgD5D 19.44 0.02 0.32
IgD5D 17.48 0.00 0.22
IgD5D 21.69 0.07 0.48
IgD5D 18.27 0.02 0.25
IgD5D 20.08 0.07 0.19
IgD5D 16.68 0.03 0.26
IgD5D 40.86 0.09 0.96
IgD5D 19.19 0.02 0.38
表4：在大豆中半片藻属物种HvD5D和HrD5D的Δ5脱饱和酶活性(脂肪酸18∶3和更高的)。
元件 LA GLA DGLA EDA AA ALA SDA ETA EtrA JA EPA DPA
对照 9.24 5.14 4.57 2.37 0.0 17.60 6.59 7.52 4.82 0.00 0.0 0.00
对照 6.79 6.19 3.76 1.23 0.0 16.21 8.67 6.81 3.29 0.00 0.0 0.00
对照 7.27 3.78 2.97 1.77 0.0 18.77 6.69 6.77 5.33 0.00 0.0 0.00
对照 9.56 8.43 4.50 1.26 0.0 20.41 10.58 6.47 2.80 0.00 0.0 0.00
对照 9.73 6.90 4.10 1.38 0.0 23.05 10.31 6.36 3.23 0.00 0.0 0.00
对照 10.48 8.10 4.02 1.33 0.0 21.11 10.16 5.81 2.88 0.01 0.0 0.00
对照 8.98 7.04 4.62 1.68 0.0 16.24 7.79 5.71 3.31 0.00 0.0 0.00
对照 9.15 7.59 3.57 1.12 0.0 22.65 12.01 5.47 2.79 0.00 0.0 0.00
对照 10.87 9.27 3.92 1.03 0.0 20.84 10.87 4.99 2.08 0.01 0.0 0.00
对照 9.82 7.66 3.01 0.99 0.0 23.38 10.94 4.98 2.47 0.00 0.0 0.00
对照 11.93 7.66 4.76 2.37 0.0 17.53 6.77 4.96 3.53 0.00 0.0 0.00
对照 8.66 7.54 2.64 1.01 0.0 23.90 12.48 4.86 2.80 0.00 0.0 0.00
对照 7.00 8.70 3.67 0.91 0.0 15.37 11.81 4.77 1.76 0.00 0.0 0.00
对照 10.24 8.92 3.26 1.23 0.0 20.37 10.61 4.33 2.58 0.00 0.0 0.00
对照 12.07 8.93 3.96 1.41 0.0 18.41 8.93 4.19 2.09 0.00 0.0 0.00
对照 8.90 8.42 3.20 0.77 0.0 13.80 8.65 4.02 1.59 0.01 0.0 0.00
元件 LA GLA DGLA EDA AA ALA SDA ETA EtrA JA EPA DPA
对照 11.37 8.76 3.56 1.39 0.0 19.37 9.62 3.99 2.30 0.00 0.0 0.00
对照 10.23 9.74 2.76 0.90 0.0 20.84 12.84 3.33 1.56 0.00 0.0 0.00
对照 14.17 9.61 3.16 1.29 0.0 20.73 9.03 3.20 1.91 0.00 0.0 0.00
对照 14.11 10.82 2.46 0.91 0.0 20.39 10.06 2.48 1.21 0.00 0.0 0.00
对照 10.11 10.60 0.02 0.00 0.0 19.95 15.42 0.02 0.01 0.00 0.0 0.00
对照 11.64 10.76 0.00 0.00 0.0 24.88 15.57 0.00 0.00 0.00 0.0 0.00
对照 11.43 11.89 0.00 0.00 0.0 25.18 17.02 0.00 0.00 0.00 0.0 0.00
HvD5D 5.71 5.01 2.83 1.40 0.0 15.03 7.34 4.07 3.20 1.42 3.4 1.29
HvD5D 10.52 5.56 3.00 2.52 1.3 19.41 6.31 2.75 3.82 1.64 2.6 0.04
HvD5D 7.51 6.45 3.53 1.70 1.1 14.56 7.00 2.94 2.39 0.90 2.2 0.04
HvD5D 9.53 8.39 2.66 1.05 0.9 16.56 10.11 2.49 1.43 0.51 2.2 0.97
HvD5D 12.25 8.54 2.96 1.98 1.1 19.02 7.64 2.14 2.23 1.03 1.8 0.00
HvD5D 11.28 8.47 2.49 1.51 0.9 18.19 9.43 1.96 1.87 0.95 1.8 0.00
HvD5D 12.14 8.61 2.66 1.54 0.3 17.67 8.73 1.92 1.50 0.90 1.8 0.10
HvD5D 14.85 8.32 3.06 2.04 1.3 19.43 6.83 1.86 1.90 0.78 1.7 0.00
HvD5D 12.14 8.17 2.36 1.92 0.9 18.60 8.52 1.76 2.26 1.11 1.7 0.00
HvD5D 13.54 9.42 2.11 1.16 0.8 22.28 10.22 1.68 1.36 0.83 1.6 0.68
HvD5D 14.32 9.81 2.44 1.16 0.0 19.88 9.11 1.56 1.11 0.50 1.2 0.06
HvD5D 12.80 10.49 1.25 0.67 0.5 20.34 10.80 0.97 0.82 0.45 0.9 0.07
HvD5D 15.29 10.28 1.76 1.04 0.6 21.88 10.44 1.01 0.91 0.39 0.9 0.21
HvD5D 15.57 11.80 0.89 0.65 0.3 20.09 10.62 0.56 0.58 0.24 0.5 0.22
HvD5D 17.79 8.54 6.97 4.27 0.1 14.59 5.59 3.82 3.11 0.02 0.2 0.01
HvD5D 15.67 12.64 0.02 0.13 0.0 23.43 13.04 0.01 0.02 0.00 0.0 0.00
HvD5D 14.16 12.37 0.02 0.03 0.0 24.59 14.39 0.02 0.01 0.00 0.0 0.00
HrD5d 4.69 4.60 2.79 1.39 1.2 12.39 6.24 3.24 2.53 1.64 3.1 0.00
HrD5d 4.00 5.65 2.45 0.90 1.1 10.63 8.15 3.03 1.51 1.41 3.0 1.06
HrD5d 6.37 6.68 2.39 1.18 1.0 13.37 8.42 2.28 1.53 1.28 2.3 0.20
HrD5d 9.02 6.23 3.15 1.86 1.4 12.87 5.69 2.05 1.47 1.37 2.1 0.15
HrD5d 9.63 8.07 2.87 1.14 1.0 15.84 8.25 2.26 1.19 0.92 2.0 0.15
HrD5d 10.62 8.29 3.12 1.48 1.2 15.86 7.66 215 1.44 1.12 2.0 0.00
HrD5d 9.85 7.65 2.95 2.01 1.4 15.98 7.75 1.92 1.81 1.55 2.0 0.00
HrD5d 8.17 8.05 2.84 1.19 1.1 13.95 8.91 214 1.12 0.96 1.9 0.65
HrD5d 13.13 7.86 2.55 1.90 1.2 21.98 8.66 1.80 2.10 1.46 1.9 0.66
HrD5d 6.22 7.49 2.40 0.96 1.0 13.28 9.74 1.96 1.01 0.96 1.9 0.64
HrD5d 11.08 8.29 2.90 1.71 1.2 18.65 8.55 2.01 1.81 1.31 1.9 0.00
HrD5d 12.24 8.35 2.58 1.35 1.0 18.18 8.00 1.83 1.43 1.02 1.8 0.00
HrD5d 11.39 8.38 2.22 1.20 0.9 21.05 10.50 1.83 1.42 1.03 1.7 0.02
HrD5d 10.67 8.89 2.48 1.19 0.9 17.80 9.64 1.69 1.18 0.87 1.6 0.00
HrD5d 13.14 9.44 2.75 1.73 1.2 18.87 8.66 1.58 1.54 1.11 1.5 0.23
HrD5d 7.49 5.37 1.61 1.25 0.8 11.21 5.31 1.24 1.39 0.73 1.5 0.00
HrD5d 8.82 8.59 1.90 0.95 0.7 15.75 9.98 1.40 1.02 0.64 1.2 1.07
HrD5d 8.67 5.32 2.90 2.06 0.0 17.32 9.66 6.49 4.21 0.00 0.8 0.22
HrD5d 9.67 6.29 4.11 2.49 0.1 19.35 7.47 4.78 4.53 0.01 0.6 0.50
HrD5d 12.15 10.89 0.23 0.16 0.1 25.44 15.22 0.21 0.21 0.19 0.2 0.19
HrD5d 10.99 12.81 0.01 0.02 0.0 21.15 16.46 0.01 0.01 0.00 0.0 0.49
HrD5d 10.80 12.61 0.00 0.00 0.0 22.06 17.22 0.00 0.00 0.00 0.0 0.29
元件 LA GLA DGLA EDA AA ALA SDA ETA EtrA JA EPA DPA
SdD5D 6.60 5.43 1.78 1.17 0.6 13.68 7.32 2.02 1.99 1.19 1.5 0.23
SdD5D 12.21 8.00 2.23 0.42 0.8 17.20 7.45 1.89 0.42 0.26 1.4
SdD5D 13.42 7.88 2.63 1.55 0.9 20.56 7.70 2.01 1.67 0.72 1.4
SdD5D 4.78 4.22 1.82 0.96 0.7 9.45 4.95 1.46 1.11 0.94 1.3 0.21
SdD5D 13.80 8.38 1.97 1.26 0.8 21.02 7.40 1.74 1.77 0.81 1.3
SdD5D 8.53 6.32 1.80 1.00 0.7 11.95 5.73 1.47 1.12 0.84 1.1 0.18
SdD5D 8.97 6.49 1.95 1.76 0.7 14.44 7.23 1.59 2.22 1.17 1.1 0.27
SdD5D 10.79 7.86 2.16 1.02 0.7 14.12 6.75 1.52 1.03 0.69 1.0 0.00
SdD5D 9.97 8.26 1.67 0.87 0.6 15.95 9.49 1.47 1.04 0.67 1.0 0.29
SdD5D 11.74 7.90 2.31 1.41 0.8 15.54 7.60 1.52 1.26 0.74 1.0 0.00
SdD5D 10.14 6.60 3.52 2.45 0.6 17.21 7.45 3.80 3.79 0.25 1.0 0.07
SdD5D 14.47 8.99 1.87 1.34 0.6 20.24 8.57 1.33 1.42 0.76 0.9
SdD5D 7.12 5.77 1.75 1.33 0.6 10.82 5.21 1.24 1.28 0.91 0.9 0.12
SdD5D 11.56 8.11 1.76 1.55 0.6 16.70 7.63 1.05 1.41 0.90 0.8 0.00
SdD5D 11.29 8.28 2.70 1.12 0.3 19.81 10.54 3.05 2.00 0.14 0.7 0.22
SdD5D 12.68 8.86 1.22 1.27 0.5 14.48 7.39 0.81 1.19 0.79 0.7 0.25
SdD5D 9.49 7.11 2.05 1.39 0.3 17.21 9.63 3.14 2.50 0.01 0.6 0.00
SdD5D 13.22 9.18 1.54 0.97 0.5 18.75 8.41 0.88 0.84 0.41 0.6 0.00
SdD5D 12.13 9.46 2.06 1.28 0.2 19.45 11.20 2.24 2.01 0.12 0.6 0.00
SdD5D 8.53 7.40 1.49 0.62 0.4 13.52 7.75 1.03 0.69 0.47 0.5
SdD5D 7.82 9.32 0.50 0.32 0.2 14.56 9.62 0.45 0.37 0.00 0.4 0.19
SdD5D 13.65 12.00 0.44 0.28 0.2 22.20 14.32 0.37 0.35 0.18 0.3
SdD5D 32.50 3.67 1.65 6.99 0.3 11.88 2.60 1.07 2.44 0.05 0.2
SdD5D 14.53 10.71 3.32 1.17 0.0 21.25 9.46 3.16 1.69 0.02 0.0 0.30
SdD5D 15.47 13.31 0.00 0.07 0.0 25.00 13.74 0.00 0.00 0.00 0.0 0.12
IgD5D 10.26 7.52 0.64 1.67 3.0 18.27 8.04 1.31 3.16 0.00 3.1
IgD5D 11.88 8.04 0.85 1.83 3.7 17.40 6.53 1.20 2.76 0.00 2.9
IgD5D 12.35 9.90 0.39 1.14 3.0 19.15 9.90 0.76 1.70 0.00 2.7
IgD5D 10.76 6.76 0.61 2.43 2.4 17.37 7.17 1.27 3.88 0.00 2.6
IgD5D 9.23 8.57 0.50 0.74 2.5 17.26 10.46 1.02 1.29 0.00 2.6
IgD5D 12.04 9.80 0.25 1.05 2.8 21.77 9.66 0.86 1.98 0.00 2.6
IgD5D 14.29 9.96 0.47 1.22 2.9 20.20 8.03 0.83 1.85 0.00 2.3
IgD5D 5.01 3.35 1.15 1.51 2.0 9.62 4.62 2.63 2.52 0.00 2.3
IgD5D 14.52 9.96 0.67 1.18 2.7 18.26 8.32 0.83 1.52 0.00 2.2
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IgD5D 16.82 9.91 0.66 1.16 2.5 18.54 7.47 0.74 1.33 0.00 1.8
IgD5D 16.22 11.17 0.37 1.07 2.4 19.85 9.13 0.41 1.40 0.00 1.7
IgD5D 11.72 10.05 0.39 0.67 1.8 20.12 10.56 0.75 1.20 0.00 1.7
IgD5D 10.83 7.99 2.48 1.56 0.4 20.94 10.26 3.79 2.90 0.02 0.3
IgD5D 12.64 6.44 2.45 2.32 0.3 19.38 8.14 4.14 3.80 0.00 0.2
IgD5D 15.94 4.43 2.51 4.11 0.2 17.48 5.61 4.56 5.22 0.00 0.1
IgD5D 17.93 3.31 0.72 3.22 0.0 8.02 5.05 0.69 0.99 0.00 0.0
IgD5D 15.45 12.73 0.00 0.01 0.0 21.43 13.30 0.00 0.00 0.00 0.0
Hvirescens和H.rufescensΔ5脱饱和酶都产生了平均起来与AA相比大约3倍多的EPA，表明了ω-3底物偏爱性。18∶2D5，9和18∶2D6，9脂肪酸处在或低于0.5％。相比之下，与EPA水平相比，球等鞭金藻Δ5脱饱和酶产生稍微更高的AA水平，表明对ω-6脂肪酸的轻微的偏爱。异枝水霉Δ5脱饱和酶生产平均2.5％的18∶2D5，9，同时产生平均起来小于1％的EPA。
实施例4
半片藻属物种Δ5-脱饱和酶在玉米中的表达
在许多单子叶植物例如玉米(Zea mays)中，大部分的油在胚芽中积累。这些植物中工程化的多不饱和脂肪酸生物合成因而通过表达处在胚芽特异性启动子(例如油质蛋白启动子、glob启动子或Hordeum vulgare PERl启动子)控制下的Δ5脱饱和酶、以及补充的脱饱和酶和延伸酶(背景酶)来有效地实现。此外，内含子例如HSP70内含子，或水稻肌动蛋白内含子经常添加在5’-UTR序列中，以增强单子叶植物中的基因表达。此外，Kozak序列可以稍微修饰来反映在单子叶植物中表达的偏爱。植物背景和感兴趣的表达盒的所有其他方面保持与实施例3相同。
含有如上所述的构建体的转化的玉米外植体通过根癌土壤杆菌介导的转化来获得。从转化的组织再生植物。然后分析温室生长的植物的油组成。
***********************
根据本发明公开和要求保护的所有组合物和方法可以根据当前的公开来制造和执行而不需过度的实验。虽然已经就优选的实施方式描述了本发明的组合物或方法，对本领域的技术人员显而易见的是，可以将各种变化应用于在此描述的组合物或方法以及步骤或步骤的川页序中，而不背离本发明的概念、精神或范围。更具体地，显而易见的是，可以用化学上和生理学上都相关的某些试剂替换在此描述的试剂，而达到相同的或相似的结果。对于本领域的技术人员显而易见的是，所有这种相似的替换和修改都认为处在由附随的权利要求所定义的本发明的精神、范围和概念之内。
参考文献
以下列出的参考文献通过引用合并在此，达到它们补充、说明、提供背景、教导方法、技术和／或在此采用的组合物的程度。
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Claims (19)

1.一种包含含有多核苷酸分子的转基因植物或植物部分的细胞的商业产品，所述多核苷酸分子由编码源自半片藻属的与SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4的多肽序列具有至少95％的序列同一性、具有在碳5使脂肪酸分子脱饱和的脱饱和酶活性的多肽的核酸序列组成，
其中所述多核苷酸分子与异源启动子可操作地连接；和
其中所述产品包含所述多核苷酸分子或由所述多核苷酸分子编码的多肽，且其中所述商业产品是食物或饲料，其中所述食物或饲料是油、青贮饲料、粗粉或细粉。
2.权利要求1的商业产品，其中所述核酸序列编码SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4的多肽序列。
3.权利要求1的商业产品，其中所述核酸序列是SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3。
4.权利要求3的商业产品，其中所述核酸序列是SEQ ID NO：3。
5.权利要求2的商业产品，其中所述多肽是序列SEQ ID NO：4的多肽。
6.权利要求1的商业产品，其中所述植物或植物部分选自芥花、菜苔、含油种子油菜、油菜籽、大豆、海甘蓝、芥菜、蓖麻子、花生、芝麻、棉籽、亚麻子、红花、油棕、亚麻、葵花、玉米、水稻、大麦、粟、黑麦、小麦、燕麦、苜蓿和高粱。
7.权利要求1的商业产品，其中所述细胞进一步包含编码脂肪酸脱饱和酶或延伸酶的至少一种另外的多核苷酸。
8.权利要求7的商业产品，其中所述细胞进一步包含编码Δ6脱饱和酶、Δ6延伸酶、Δ18延伸酶、Δ15脱饱和酶、Δ9延伸酶、Δ8脱饱和酶、Δ17脱饱和酶、Δ4脱饱和酶或C20延伸酶的多核苷酸。
9.权利要求1的商业产品，其中所述商业产品包含EPA、ARA和/或DHA。
10.一种生产食物或饲料组合物的方法，包括步骤：
(a)获得包含含有多核苷酸分子的转基因植物或植物部分的细胞的转基因植物或植物部分，所述多核苷酸分子由编码源自半片藻属的与SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4的多肽序列具有至少95％的序列同一性、具有在碳5使脂肪酸分子脱饱和的脱饱和酶活性的多肽的核酸序列组成，
其中所述多核苷酸分子与异源启动子可操作地连接；和
(b)生产所述食物或饲料组合物，其中所述食物或饲料是油、青贮饲料、粗粉、谷粒或细粉。
11.权利要求10的方法，其中所述核酸序列编码SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4的多肽序列。
12.权利要求10的方法，其中所述核酸序列是SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3。
13.权利要求12的方法，其中所述核酸序列是SEQ ID NO：3。
14.权利要求11的方法，其中所述多肽是序列SEQ ID NO：4的多肽。
15.权利要求10的方法，其中所述植物或植物部分选自芥花、菜苔、含油种子油菜、油菜籽、大豆、海甘蓝、芥菜、蓖麻子、花生、芝麻、棉籽、亚麻子、红花、油棕、亚麻、葵花、玉米、水稻、大麦、粟、黑麦、小麦、燕麦、苜蓿和高粱。
16.权利要求10的方法，其中所述细胞进一步包含编码脂肪酸脱饱和酶或延伸酶的至少一种另外的多核苷酸。
17.权利要求16的方法，其中所述细胞进一步包含编码Δ6脱饱和酶、Δ6延伸酶、Δ18延伸酶、Δ15脱饱和酶、Δ9延伸酶、Δ8脱饱和酶、Δ17脱饱和酶、Δ4脱饱和酶或C20延伸酶的多核苷酸。
18.权利要求1的商业产品，其中所述多肽与SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4的多肽序列具有至少98％的序列同一性，具有在碳5使脂肪酸分子脱饱和的脱饱和酶活性，并且源自半片藻属。
19.权利要求10的方法，其中所述多肽与SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4的多肽序列具有至少98％的序列同一性，具有在碳5使脂肪酸分子脱饱和的脱饱和酶活性，并且源自半片藻属。
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