CN104388444A - 月见草△6-脂肪酸脱饱和酶基因ObD6D2及其重组表达载体和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了月见草△6-脂肪酸脱饱和酶基因ObD6D2及其重组表达载体和应用，ObD6D2的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，具有△6-脂肪酸脱饱和酶活性，能够催化亚油酸形成γ-亚麻酸(GLA)，也能够催化α-亚麻酸(ALA)形成十八碳四烯酸(SDA)，将ObD6D2正义转入月见草以后，转基因月见草种子中GLA和SDA含量大幅提高；转入甘蓝型油菜以后，转基因油菜种子中积累了非转基因油菜种子所不具有的GLA和SDA；表明利用ObD6D2基因家族能够创造新资源材料，并用于工业提取GLA和SDA，或直接用于生产富含GLA和SDA的保健型食用油。

Description

月见草△6-脂肪酸脱饱和酶基因ObD6D2及其重组表达载体和应用

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体涉及月见草△6-脂肪酸脱饱和酶基因ObD6D2，还涉及ObD6D2基因的重组表达载体和应用。

背景技术

多不饱和脂肪酸(Polyunsaturated Fatty Acids，PUFA)是在碳原子之间含有两个以上双键的不饱和脂肪酸，其代谢途径是以亚油酸(Linoleic acid,LA；C18:3Δ^9,12,n-6)为初始底物，在一系列脂肪酸脱饱和酶(脂肪酸脱氢酶)和脂肪酸延伸酶的催化下，先后生成γ-亚麻酸(γ-linolenic acid，GLA；C18:3Δ^6,9,12,n-6)、α-亚麻酸(α-linolenic acid,ALA；C18:3Δ^9,12,15,n-3)、十八碳四烯酸(stearidonic acid,SDA,octadecatetraenoic acid,OTA,C18:4Δ^6,9,12,15,n-3)、双高γ-亚麻酸(DHLG)、花生四烯酸(ARA)、二十碳五烯酸(EPA,n-3)、二十二碳五烯酸(DPA)、二十二碳六烯酸(DHA,n-3)等长链多不饱和脂肪酸(LC-PUFAs)或超长链多不饱和脂肪酸(VLC-PUFAs)。

PUFA能促进生长发育，调节人体的脂质代谢，还能治疗和预防心脑血管疾病，同时具有免疫调节、抗癌、延缓衰老等重要的生理功能，对人类健康起到非常重要的作用。Ω3(n-3)系列脂肪酸对人体具有重要生理功能，其中ALA是n-3PUFA(EPA、DHA)合成前体；EPA是一类重要的多聚不饱和脂肪酸化学信使物，在免疫和炎症反应上起至关重要的作用；DPA是生成DHA的中间产物，对冠心病具有潜在的抑制作用；DHA是视网膜正常发育和发挥其正常功能所必需的，大脑和神经组织中DHA含量远远高于机体其他组织，对神经功能发挥着至关重要的作用。Ω6(n-6)系列脂肪酸对人体也具有重要生理功能，其中GLA是组成人体各组织生物膜的结构材料，也是合成前列腺素的前体，GLA水平的不足可导致体内机能的紊乱，引起某些疾病，如糖尿病、高血脂等。

△6-脂肪酸脱饱和酶(Δ6fatty acid desaturase，D6D)是一种多功能酶，也是PUFA生物合成途径经第一步限速酶，它能够以LA为底物催化合成GLA，也能够以ALA为底物催化合成SDA，据报道在它哺乳动物中还能够催化以24C-PUFA为底物的生化反应。

理论上人体只需要通过食物等途径摄入足够的LA和ALA，就可以利用人体自身的D6D等酶系统将它们分别合成为GLA和EPA、DHA，但残酷的现实是人体D6D活性很低而且易被多种环境因素(如膳食中的脂肪)所抑制。这就导致人体即使摄入了足够的底物LA和ALA，但合成GLA、EPA、DHA的水平依然严重不足，因此需要直接摄入GLA、EPA、DHA等来补充其不足。

GLA作为人体内必需的不饱和脂肪酸，成年人每日需要量约为36mg/kg。传统补充人体EPA和DHA的主要途径是深海鱼油，鱼油中的PUFA实际上是鱼通过取食藻类物等而富集在体内的，该种方式受到鱼类资源量的极大限制，来源极为有限，缺乏可持续性，且工艺复杂，成本高，价格昂贵。最近的研究表明，人体能够利用摄入的SDA迅速而有效地合成为EPA，进一步合成DHA，其效果虽然比直接摄入EPA和DHA略差，但远远比摄入ALA的效果好得多，可以有效解决人体EPA和DHA不足的问题。因此，直接补充EPA和DHA的方式完全可以由补充SDA的方式所取代。研究发现，不仅一些真菌和藻类物种中能够合成SDA，而且少数植物也能够合成SDA，紫草科(Boraginaceae)特别是蓝蓟属(Echium)植物、少数报春花属(Primula)植物的种子油脂中富含SDA，原因是它们的D6D酶能够有效利用ALA生成SDA，其它植物中SDA的情况以及D6D酶对ALA底物的利用效率问题则有待研究。

PUFA在市场上一直供不应求，而且市场需要量还在不断地增长。培养藻类和真菌生产PUFA是一个重要的研究热点，而且已经取得重要成就，但仍然受到操作复杂、成本高、价格贵的困扰。利用植物系统尤其是大宗油料作物的种子来生产PUFA，相比动物、真菌、藻类等生产途径，具有容易上规模、种植简单、成本相对较低、安全性好的优点。虽然大宗油料作物如油菜、大豆、花生、棉花、向日葵、棕榈、橄榄中不存在GLA，所有高等植物都不具有合成EPA和DHA的关键酶，而且通过植物代谢工程生产EPA和DHA在技术上极其困难，但如果通过基因工程方式导入既能利用LA也能利用ALA为底物的外源D6D基因，则可以利用大宗油料作物来生产GLA和SDA，满足市场需求量，并降低成本。

月见草(evening primrose，Oenothera biennis)别名夜来香、山芝麻，属柳叶菜科，月见草属，二年生草本植物，原产于北美洲，我国引入作花卉栽培而逸为野生，在东北地区东部山区储量较丰富，同时它作为一种特殊油料作物在我国已有大面积的种植。月见草种子可用于提取月见草油，它含有丰富的不饱和脂肪酸，其中LA占73.5％～81.9％，GLA占6.9％～12.6％，是GLA的最重要的天然生产来源之一。但是，天然月见草中GLA的含量仍然不高，通过代谢工程大幅提高其含量的现实意义重大。

甘蓝型油菜(Brassica napus L.，2n＝38，AACC)为我国五大油料作物之首，经济性状好，产量高，含油量高，抗逆性强，是重要的食用油和蛋白质饲料来源，也是重要的工业原料。菜子油品质改良的重要内容是改善其中脂肪酸的成分和含量，对于普通食用型菜籽油而言，主要集中在降低或消除芥酸，增加油酸的比例，减少易导致油腐败的ALA的比例，提高含油量。通过导入外源D6D基因，利用油菜这一传统大宗油料作物作为生物反应器，来生产GLA、SDA等PUFA，是油菜品质改良和分子育种的另一个重要方面，在人类的医药保健领域具有重要的意义。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的之一在于提供月见草△6-脂肪酸脱饱和酶基因ObD6D2，本发明的目的之二在于提供含有月见草△6-脂肪酸脱饱和酶基因ObD6D2的重组表达载体；本发明的目的之三在于提供含有上述所述重组表达载体的转化子；本发明的目的之四在于提供月见草△6-脂肪酸脱饱和酶基因ObD6D2在提高月见草属植物γ-亚麻酸和十八碳四烯酸含量中的应用；本发明的目的之五在于提供月见草△6-脂肪酸脱饱和酶基因ObD6D2在大宗油料作物重建γ-亚麻酸和十八碳四烯酸合成途径中的应用。

为实现上述发明目的，本发明提供如下技术方案：

1、月见草△6-脂肪酸脱饱和酶基因ObD6D2，所述ObD6D2的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示或SEQ ID NO.4所示氨基酸序列取代、缺失或添加至少一个氨基酸，且来源于月见草的具有△6-脂肪酸脱饱和酶活性的氨基酸序列。

优选的，所述ObD6D2的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

优选的，所述ObD6D2的基因序列如SEQ ID NO.2所示或SEQ ID NO.2所示核苷酸序列经取代、缺失或添加至少一个核苷酸，且来源于月见草的编码具有△6-脂肪酸脱饱和酶活性的核苷酸序列。

更优选的，所述ObD6D2的基因序列如SEQ ID NO.2所示。

2、含有所述月见草△6-脂肪酸脱饱和酶基因ObD6D2的重组表达载体。

优选的，所述重组载体含有ObD6D2基因编码区，所述ObD6D1基因编码区的序列对应于SEQ ID No.2第94～1443位碱基所示。

更优选的，所述重组表达载体是将ObD6D2基因编码区的序列插入pC2301M1NPB载体的NapA启动子与Nos终止子之间而得；

或所述重组表达载体是ObD6D2基因编码区的序列插入pYES2质粒的XbaI和BamHI酶切位点处而得；

所述pC2301M1NPB载体由以下方法制备：用HindIII和EcoRI切下pBI121上的GUS基因表达盒然后插入pCAMBIA2301载体的HindIII和EcoRI酶切位点处，然后用SacI和XmaI切去GUS基因后用带有SacI和XmaI粘性末端的序列连接，得pC2301M1载体，然后在pC2301M1载体HindIII酶切位点处连入由MAS启动子驱动bar基因表达、MAS终止子终止表达的bar基因表达盒，得pC2301M1B载体；最后将pC2301M1B载体上的CaMV35S启动子用种子特异启动子NapA替换即得pC2301M1NPB载体。

3、含有所述重组表达载体的转化子。

4、所述月见草△6-脂肪酸脱饱和酶基因ObD6D2在提高月见草属植物γ-亚麻酸和十八碳四烯酸含量中的应用。

5、所述月见草△6-脂肪酸脱饱和酶基因ObD6D2在大宗油料作物重建γ-亚麻酸和十八碳四烯酸合成途径中的应用。

优选的，所述大宗油料作物为油菜、大豆、花生、棉花、向日葵、棕榈或橄榄，更优选的，大宗油料作物为油菜；最优选的，所述油菜为甘蓝型油菜。

本发明的有益效果在于：本发明提供了月见草△6-脂肪酸脱饱和酶基因ObD6D2的全长cDNA序列和gDNA序列、编码蛋白序列和结构特征、进化关系、表达的器官组织特异性等，并确认了ObD6D2编码有双活性的△6-脂肪酸脱饱和酶，采用转基因技术将ObD6D2基因正义转化月见草后能够大幅度提高种子中GLA和SDA的含量，将ObD6D2正义转化甘蓝型油菜后均能够引起种子中积累GLA和SDA，证明ObD6D2基因在植物GLA和SDA性状的分子育种方面具有很好的应用前景，其转基因植物可应用于工业提取GLA和SDA，或直接应用于生产富含GLA和SDA的保健型食用油。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图：

图1为ObD6D基因家族的克隆电泳图，其中A为ObD6D基因家族保守区标签序列的扩增，B为ObD6D1和ObD6D2的5’-RACE的巢式扩增(1为ObD6D1，2为ObD6D2)，C为ObD6D的3’-RACE的巢式扩增(1为ObD6D1；2为ObD6D2)，D为ObD6D的3’-RACE的巢式扩增(1为ObD6D1；2为ObD6D2)，M为Trans2K plus DNA marker。

图2为ObD6D1和ObD6D2的核苷酸序列及其编码的氨基酸序列图(A为ObD6D1，B为ObD6D2，起始密码子和终止密码子加方框，转录起始位点和poly(A)加尾位点加双下划线(主要位点为粗体)，poly(A)加尾信号加单下划线，嘌呤基序和连续的终止密码子加灰背景。

图3为ObD6D1和ObD6D2蛋白的系统分析图[D6D：△6-脂肪酸脱饱和酶；sD8D：△8-鞘脂脱饱和酶(也简称为SLD)；琉璃苣(Borago officinalis，AAD01410.1)；蓝蓟(Echiumgentianoides，AAL23580.1)；烟草(Nicotiana tabacum，ABO31111.1)；油茶(Camellia oleifera，ADD10720.1)；柱花草(Stylosanthes hamata，ABU98945.1)；报春花(Primula vialii，AAP23036.1)；报春花(Primula vialii，AAP23035.1)；拟南芥(Arabidopsis thaliana，AAM648951)；琉璃苣(Borago officinalis，AAG43277.1)；黑加仑(Ribes nigrum，ADA60230.1)；黑加仑(Ribes nigrum，ADA60229.1)；银莲花(Anemone leveillei，AAQ10732.1)；银莲花(Anemone leveillei，AAQ10731.1)；地钱(Marchantia polymorpha，AAT85661.1)；角齿藓(Ceratodon purpureus，CAB94993.1)]。

图4为ObD6D1和ObD6D2在月见草各器官中转录表达的荧光定量PCR检测结果(A为ObD6D1，B为ObD6D2)。

图5为pCD-ObD6D1、pCD-ObD6D2、pCN-ObD6D1、pCN-ObD6D2转化甘蓝型油菜的脂肪酸GC检测图(A为野生型甘蓝型油菜的脂肪酸GC检测图；B为pCD-ObD6D1转化甘蓝型油菜的脂肪酸GC检测图；C为pCD-ObD6D2转化甘蓝型油菜的脂肪酸GC检测图；D为pCN-ObD6D1转化甘蓝型油菜的脂肪酸GC检测图；E为pCN-ObD6D2转化甘蓝型油菜的脂肪酸GC检测图的当代阳性植株成熟种子的脂肪酸GC图)。

具体实施方式

下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南(第三版，J.萨姆布鲁克等著)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

本发明实施例采用的植物材料：甘蓝型油菜(Brassica napus)品种中双10号的商业推广种子由中国农业科学院油料作物研究所张学昆研究员惠赠，中油821等其它品种材料为自己保存。月见草(evening primrose，Oenothera biennis)和甘蓝型油菜的种植条件为常规试验条件。

本发明实施例采用的试剂及试剂盒：SMARTer^TM RACE cDNA Amplification Kit为美国Clontech公司产品；PrimeScript^TM RT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)、Premix Ex Taq^TM II(Tli RNaseH Plus)ROX plus、DNA Ligation Kit、pMD18-T、pMD19-T、TaqDNA聚合酶、DNase I(RNase-free)及buffer、RNase Inhibitor、DL-2000及λ-HindIII DNA Marker购自大连宝生物(TaKaRa)生物工程有限公司；胶回收试剂盒、小量法质粒抽提试剂盒购自上海华舜生物技术有限公司；限制性内切酶购自立陶宛MBI Fermentas公司；MS(Murashige&Skoog medium,including vitamins)培养基为荷兰Duchefa公司产品；DL-2000plus、Easy-Taq酶、dNTPs等试剂购自北京全式金(Transgen)生物技术有限公司；X-Gluc(5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-glucuronic acid)、利福平(Rif)、链霉素(Str)、卡那霉素(Kan)、氨苄青霉素(Amp)、琼脂糖、Tris、CTAB、Tris饱和酚(pH＝8.0)、Tryptone、Yeast Extract、X-gal、IPTG、CTAB等其它生化与分子生物学试剂购自上海生工生物工程技术服务有限公司；植物激素购自上海稼丰园艺用品等公司。

本发明实施例采用的主要仪器：Veriti^TM多重控温PCR仪购自美国Applied Biosystems公司；CFX96荧光定量PCR仪购自美国Bio-Rad公司；气相色谱仪(Gas Chromatography，GC)为日本岛津GC-7A型；以及分子生物学和基因工程的其它仪器设备。

本发明实施例DNA合成和测序由上海英骏/英潍捷基公司、上海生工、北京六合华大等公司商业完成。

实施例1、月见草△6-脂肪酸脱饱和酶ObD6D基因家族的克隆

(1)月见草基因组总DNA和总RNA的提取

取月见草植株的嫩叶，采用十六烷基三甲基溴化胺(CTAB)法提取基因组总DNA，采用1.0％琼脂糖凝胶电泳法和分光光度法评价核酸样品的质量和浓度。结果显示，提取的月见草基因组总DNA的完整性好，平均分子量略大于λ-HindIII DNA Marker的23kb条带，RNA消化完全，分光光度法检测其纯度也较高，可用于PCR扩增。

同时，以月见草的根(Ro)、茎(St)、叶(Le)、蕾(Bu)、花(Fl)、果皮(Pe)、早期种子(ES)、中期种子(MS)、后期种子(LS)为材料，分别采用小量植物组织RNA抽提试剂盒提取总RNA，用DNase I去除总RNA中含有的DNA杂质，电泳检测总RNA的质量，紫外分光光度计测定总RNA的浓度和纯度。电泳检测表明获得的总RNA特征条带清晰，无明显RNA降解和DNA污染，分光光度法检测评价的质量也较好，能够满足后述实验的要求，然后储存于-80℃冰箱备用。

(2)月见草种子RACE总cDNA第一链的获得

取月见草各发育阶段的总RNA各1μg混合，采用SMARTer^TM RACE cDNA AmplificationKit按照其说明书操作，分别得到5'-RACE-Ready cDNA和3'-RACE-Ready cDNA第一链备用。

(3)ObD6D基因家族保守区的扩增

通过Vector NTI Advance 9.0对琉璃苣(Borago officinalis)、蓝蓟(Echium gentianoides)、草玉梅(Anemone leveillei)、高穗花报春(Primula vialii)等植物的D6D基因进行多重比对，根据保守点设计兼并引物，上游引物为FD6DON，下游引物为RD6DO，具体序列如表1所示。然后以3'-RACE-Ready cDNA 1μl为模板，FD6DON和RD6DO为引物，扩增ObD6D基因家族的保守区序列。PCR反应的程序为：94℃预变性2min；94℃变性1min，52℃退火1min，72℃延伸2min，35个循环；72℃延伸10min。将PCR扩增产物进行电泳检测，结果如图1中A所示。结果显示，扩增出了1条近1.3kb的特异条带，然后回收特异条带，进行TA克隆后转化大肠杆菌，送6个阳性克隆子测序，将测序结果进行多重比对后发现获得了2个独立基因(unigene)的标签序列，净长度分别为1299bp和1305bp(不计引物上的人工酶切位点)。经nucleotide blast(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)比对后发现它们均与植物特别是紫草科D6D基因最同源，表明该序列为ObD6D基因家族2个成员的序列，分别命名为ObD6D1和ObD6D2。

(4)ObD6D基因家族5’-cDNA末端和3’-cDNA末端的扩增

根据克隆获得的保守区序列，分析保守区序列的同源性后，设计了克隆ObD6D1和ObD6D25’端的3个反向引物，分别如下ObD6D5P、ObD6D5NP1、ObD6D5NP2，其引物序列如表1所示。然后以5'-RACE-Ready cDNA 1μL为模板，用引物组合UPM和ObD6D5P对ObD6D基因家族的5’-RACE第一次PCR扩增。PCR反应程序为：94℃预变性2min；94℃变性1min，60℃退火1min，72℃延伸1min，28个循环；72℃延伸10min。将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，电泳结果显示第一次PCR扩增后获得约950bp的暗带，smear较重。取第一次PCR扩增0.1μL为模板，分别用引物组合NUP和ObD6D5NP1、NUP和ObD6D5NP2对ObD6D1和ObD6D2进行5’-RACE巢式PCR扩增，PCR反应程序同第一次PCR扩增，扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图1中B所示。结果显示，扩增获得约700bp的特异条带，与根据其它植物D6D基因序列长度相近。回收扩增产物，经TA克隆后转化大肠杆菌。然后通过PCR筛选阳性克隆子，各送6个代表性的克隆子测序，结果表明ObD6D1的5’-cDNA末端净长度为641、643、749bp三种，ObD6D2的5’-cDNA末端净长度为689bp和683bp两种，长度多态性系由转录起始位点的位置不同而引起的。

根据克隆获得的保守区序列，分析保守区序列的同源性后，设计3个正向引物：ObD6D3P、ObD6D3NP1、ObD6D3NP2，其引物序列如表1所示其引物序列如表1所示。以3'-RACE-ReadycDNA 1μL为模板，用引物组合ObD6D3P和UPM进行ObD6D基因家族的3’-RACE第一次PCR扩增，反应程序同5'-RACE，取第一次PCR扩增产物0.1μL为模板，分别用引物组合ObD6D3NP1和NUP、ObD6D3NP2和NUP进行ObD6D1和ObD6D2的3’-RACE的巢式PCR扩增，PCR反应程序同第一次PCR扩增，扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图1中C所示。结果显示，电泳获得1条约600bp的特异亮带，与根据其它植物D6D基因序列预测的长度相近。将扩增产物进行胶回收，TA克隆后转化大肠杆菌，然后对插入片段进行PCR检测。结果表明，获得的单斑克隆子存在插入长度的多态性，各送5个代表性的克隆子测序，结果表明ObD6D1的3’-cDNA末端净长度为597bp，ObD6D2的3’-cDNA末端净长度为482bp和449bp两种，长度多态性系由poly(A)加尾位置不同而引起的。

5、ObD6D基因家族全长cDNA和gDNA的克隆

根据ObD6D基因家族的保守区、5’-RACE、3’-RACE的测序结果，利用软件分别拼接出ObD6D1和ObD6D2的全长cDNA序列，然后分别设计了ObD6D1全长cDNA和gDNA的扩增引物组合FObD6D1与RObD6D1、ObD6D2全长cDNA和gDNA的扩增引物组合FObD6D2与RObD6D2，其引物序列如表1所示。

以3'-RACE-Ready cDNA 1μL为模板，分别用引物组合FObD6D1与RObD6D1、FObD6D2与RObD6D2进行扩增，PCR反应程序为：94℃预变性2min；94℃变性1min，60℃退火1min，72℃延伸2min，35个循环；72℃延伸10min。扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图1中D所示，结果显示，扩增获得了1条约1.9kb和1条约1.7kb的特异条带。将扩增产物进行胶回收，经TA克隆后转化大肠杆菌，然后阳性克隆子进行测序。结果表明，ObD6D1的全长cDNA为1922bp，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，ObD6D2的全长cDNA为1752bp，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，且序列与软件拼接全长cDNA序列完全一致。

将模板替换为基因组总DNA 1μL，用引物组合FObD6D1与RObD6D1、FObD6D2与RObD6D2进行PCR扩增，扩增产物回收，经TA克隆后，进行测序。结果显示，扩增得到的ObD6D1和ObD6D2基因的gDNA条带与获得的全长cDNA的扩增条带大小一致，表明ObD6D1和ObD6D2这两个基因均没有内含子。

表1、月见草△6-脂肪酸脱饱和酶基因ObD6D2的克隆

实施例2、ObD6D基因家族的生物信息学分析

在Vector NTI Advance 9.0上进行基因和蛋白注释、序列比对、开放阅读框(ORF)查找与翻译、参数分析，在http://www.ncbi.nlm.nih.gov/网站上进行BLAST和蛋白CDD搜索，在http://bip.weizmann.ac.il/和www.expasy.org等提供链接的生物信息学网站上进行蛋白质结构分析，在http://prodes.toulouse.inra.fr/multalin/multalin.html和http://www.ebi.ac.uk/clustalw/等网站上进行基因和蛋白质序列多重比对和系统发生学分析。

(1)ObD6D的基因家族的结构和核酸特征

ObD6D1基因如图2中A所示，结果显示ObD6D1基因为1922bp，最长mRNA为1922bp(不计poly(A)尾巴，下同)，存在G₁、G₁₀₇、C₁₀₈、A₁₀₉四种转录起始位点，最长5’UTR(非翻译区)为154bp，最长3’UTR为424bp，ORF为1344bp。

ObD6D2基因如图2中B所示，结果显示ObD6D2基因为1752bp，最长mRNA为1752bp，存在A₁、G₇两种转录起始位点，最长5’UTR为93bp，存在T₁₇₁₉和T₁₇₅₂两种poly(A)加尾位点，最长3’UTR为309bp，ORF为1350bp。

分析ObD6D1和ObD6D2的基因结构，发现它们在起始密码子前都存在一串25-26bp的嘌呤基序，完全由AG构成，它们的编码区结束后分别存在连续10个和连续4个终止密码子，它们的3’UTR中分别存在1个和2个典型的poly(A)加尾信号AATAAA。

(2)ObD6D家族蛋白的结构特征

推导的ObD6D1蛋白为447个氨基酸，氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，分子量为51.07kD，等电点为8.25，呈碱性，带电荷、酸性、碱性、极性、疏水性氨基酸数目分别占26.4％、7.38％、8.05％、26.85％、40.27％，氨基酸种类中以亮氨酸含量(10.74％)最高，其次为缬氨酸(7.83％)、丝氨酸(7.38％)、丙氨酸(6.94％)和苯丙氨酸(6.94％)，以谷氨酸含量最低(2.24％)。

推导的ObD6D2蛋白为449个氨基酸，氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，分子量为51.16kD，等电点为8.49，呈碱性，带电荷、酸性、碱性、极性、疏水性氨基酸数目分别占25.61％、7.13％、8.02％、24.94％、41.87％，氨基酸数目的成分中以亮氨酸(11.14％)最高，其次为缬氨酸(7.80％)、丝氨酸(7.57％)、丙氨酸(7.13％)和苯丙氨酸(6.68％)，以谷氨酸含量最低(2.23％)。

SignalP3.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)预测ObD6D1和ObD6D2蛋白没有信号肽，Softberry-ProComp 9.0(http://linux1.softberry.com/berry.phtml)预测它们定位于细胞质膜上，TMpred(http://www.ch.embnet.org/software/TMPRED_form.html)预测它们分别有5个和6个跨膜域，REP预测它们没有重复结构，NetPhos2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)预测它们分别有11个和12个潜在的磷酸化位点，丝氨酸磷酸化位点稍多，其次是苏氨酸和酪氨酸磷酸化位点。

NCBI protein blast保守域搜索(NCBI Conserved Domain Search)表明，ObD6D1蛋白的M₁₄₅-L₄₀₂和ObD6D2蛋白的M₁₄₅-L₄₀₄存在一个Delta6-FADS-like保守域(cd03506)，该保守域存在于来源于脊椎动物、高等植物、真菌、细菌中的△4脂肪酸脱饱和酶、△5脂肪酸脱饱和酶、△6脂肪酸脱饱和酶、△8脂肪酸脱饱和酶、△8鞘脂脱饱和酶(SLD)、△11脂肪酸脱饱和酶中，均是整合于质膜上合成PUFA的关键酶，保持膜流动性，影响多种生物学功能。

SOPMA(http://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page＝npsa_sopma.html)软件预测，ObD6D1和ObD6D2蛋白的二级结构中α-螺旋分别占45.41％和46.10％，随机卷曲分别占32.66％和33.18％，延伸链分别占16.78％和17.70％，β-转角分别占5.15％和6.01％。

在ESyPred3D 1.0(www.fundp.ac.be/sciences/biologie/urbm/bioinfo/esypred/)预测出了ObD6D1和ObD6D2蛋白的部分三级结构，均与三维结构模型2OZ0的A链有18.1％的一致性。产生的ObD6D1的三维结构中包含了91个氨基酸，ObD6D2的三维结构中包含了163个氨基酸，三级结构上所观察到α-螺旋情况与二级结构一致。ObD6D1与ObD6D2在蛋白高级结构尽管有相似性，但存在明显的差异。

(3)ObD6D基因家族的同源性分析

Vector NTI Advance 9.0上的两两比对表明，ObD6D1与ObD6D2之间具有明显同源性，在全长基因/mRNA水平上的一致率为79.6％，编码蛋白水平的一致性和相似性分别为87.1％和92.4％。它们之间在编码区的一致性为89.6％，5’UTR的一致率为45.9％，3’UTR的一致率为56.3％，编码区明显比非编码区保守，符合功能基因的特征。比对还发现，二者之间在起始密码子前面、5’UTR末尾处的歧化最快，ObD6D2相比ObD6D1在此处发生了几处明显的片段删除现象，其次是它们的3’UTR歧化也很快，一些区间的一致性很低。但是，它们起始码子前面的嘌呤基序则特异保守。

BLASTn分析表明，ObD6D基因家族两个成员的核苷酸序列与多种其它植物D6D基因有显著的同源性。BLASTp和系统发生分析表明，ObD6D基因家族两个成员的推导蛋白序列与来自植物界、真菌界的D6D或sD8D/SLD(Δ8-sphingolipid desaturase，Δ8-鞘脂脱饱和酶)具有广泛的同源性(图3)。

实施例3、ObD6D基因家族表达器官特异性的荧光定量PCR检测

以月见草的根(Ro)、茎(St)、叶(Le)、蕾(Bu)、花(Fl)、果皮(Pe)、早期种子(ES)、中期种子(MS)、后期种子(LS)的总RNA，然后用RNase-free DNase I按其说明书处理以消除DNA污染。取每个器官的总RNA各1μg，20μl体系采用PrimeScript^TM RT reagent Kit withgDNA Eraser进行反转录获得总cDNA第一链用于基因表达检测。荧光定量PCR检测在CFX96型定量PCR仪上进行，试剂盒为Premix Ex Taq^TM II(Tli RNaseH Plus)ROX plus，以引物组合F25S与R25S为内标进行扩增，ObD6D1和ObD6D2引物组合分别为ObD6D3NP1与RobD6D1Y、ObD6D3NP2与RobD6D2Y，引物序列见表1和表2所示。

荧光定量RT-PCR检测结果如图4所示，结果表明，ObD6D1基因在蕾中表达最高，在发育中期的种子和根中表达较高，在其它器官中表达较弱或很弱；ObD6D2基因在根中表达最高，在发育早期的种子和叶中表达较高，在其它器官中表达较弱或很弱。

表2、ObD6D基因家族荧光定量PCR引物

实施例4、ObD6D基因家族编码蛋白活性的酵母表达检测

根据ObD6D1和ObD6D2基因的编码区序列设计酵母表达引物FObD6DY、RObD6D1Y、RObD6D2Y，引物序列如表3所示。用引物组合FObD6DY与RObD6D1Y、FObD6DY与RObD6D2Y分别扩增ObD6D1和ObD6D2基因的1407bp和1400bp编码区序列，然后与pMD19-T进行TA克隆，分别得pMD19-T-ObD6D1Y和pMD19-T-ObD6D2Y，经测序证明序列没有突变后，进行下一步酵母载体构建。

表3、ObD6D基因家族酵母表达引物

用限制性内切酶BamHI和SphI完全双酶切质粒pYES2，回收线状载体骨架。pMD19-T-ObD6D1Y质粒先用SphI完全酶切进行开环，然后再用BamHI部分酶切2min后回收1407bp目的基因片段ObD6D1Y，然后将该目的基因片段与pYES2线状载体骨架用T₄ DNA连接酶进行连接，转化大肠杆菌，获得ObD6D1基因的酵母表达载体pYES2-ObD6D1，然后抽提该重组载体的质粒用于酿酒酵母的转化及其诱导表达。

再用限制性内切酶XbaI和BamI完全双酶切质粒pYES2和质粒pMD19-T-ObD6D2Y，回收pYES2的线状骨架载体和目的基因片段ObD6D2Y，然后将二者用T₄ DNA连接酶进行连接，转化大肠杆菌，获得ObD6D2基因的酵母表达载体pYES2-ObD6D2，然后抽提该重组载体的质粒用于酿酒酵母的转化及其诱导表达。

酿酒酵母菌株INVScI的感受态细胞制备、质粒转化采用Invitrogen公司的方法进行。将表达质粒pYES2-ObD6D1、pYES2-ObD6D2、pYES2(对照，CK)三种质粒转化酵母INVScI后，经选择培养基SD-Ura筛选，分别得到转化子菌液，以引物组合FObD6DY与RObD6D1Y、FObD6DY与RObD6D2Y分别对pYES2-ObD6D1转化菌液和pYES2-ObD6D2转化菌液进行PCR检测，电泳得到大约1400bp的特异扩增条带，与预测结果一致，同时用这两组引物组合对对照质粒pYES2转化菌液进行PCR检测，没有发现有目的片段大小的特异扩增条带。

使用LiAc-半乳糖诱导方法来对携带pYES2-ObD6D1质粒、pYES2-ObD6D2质粒、对照质粒pYES2的酵母工程菌株进行诱导，添加LA底物后进行培养，然后收集三种工程菌株的菌体进行脂肪酸甲酯化，用气相色谱仪对脂肪酸组分和含量进行分析。结果表明，转pYES2的对照酵母中只检测到ALA这一种PUFA，而转pYES2-ObD6D1和pYES2-ObD6D2的酵母均检测到三种PUFA，均比对照多出两种PUFA——GLA和SDA。采用面积归一化法计算结果，结果如表4所示。结果显示，ObD6D1转酵母后GLA和SDA分别占总脂肪酸的2.80％和2.65％，ObD6D2转酵母后GLA和SDA分别占总脂肪酸的3.12％和3.41％，证明本发明克隆的ObD6D基因家族两个成员均编码双活性Δ6-脂肪酸脱饱和酶，即催化LA形成GLA以及催化ALA形成SDA。

表4、pYES2、pYES2-ObD6D1和pYES2-ObD6D2转化酵母的脂肪酸组份(％)

实施例5、超量表达ObD6D1和ObD6D2提高月见草种子的GLA含量

(1)改造pCAMBIA2301载体获得新型植物表达平台载体pC2301M1DPB

pCAMBIA2301、pBI121、pFGC5941均为广泛应用的商业植物表达载体，本发明在它们的基础上，构建获得了种子特异表达的植物表达载体pC2301M1NPB：

A、采用HindIII和EcoRI双酶切切下pBI121上的GUS基因表达盒(3038bp，CaMV35S启动子驱动GUS基因编码区，后接Nos终止子)，重组到pCAMBIA2301多克隆位点区的HindIII与EcoRI间，得到14602bp的植物表达载体pC2301G。

B、合成DNA单链2301M1F和2301M1R，具体序列见表5所示，将2301M1F和2301M1R变性并退火成互补双链衔接子2301M1，此衔接子的末端分别带有SacI和XmaI的粘性末端。采用SacI和XmaI双酶切pC2301G，切去1.9kb的GUS基因后回收载体骨架，然后与2301M1衔接子进行连接重组，得到12747bp的植物表达载体pC2301M1。

C、设计引物FPbarT和RPbarT，具体序列见表5所示。然后以pFGC5941质粒为模板，PCR扩增1224bp的bar基因表达盒(MAS启动子驱动bar基因编码区，后接MAS终止子)，TA克隆并测序确定无误后，用HindIII单酶切将该表达盒亚克隆插入到pC2301M1的HindIII切点处，得到13965bp的植物表达平台载体pC2301M1B。

D、设计引物FNAP和RNAP，具体序列见表5所示。然后以甘蓝型油菜品种中油821的叶片基因组总DNA为材料，PCR扩增获得1146bp的种子特异启动子NapA(GenBankaccession number：J02798)，经TA克隆和测序验证后，采用PstI和XbaI双酶切，用NapA启动子替换pC2301M1B中的CaMV35S启动子，得到14252bp的植物表达载体pC2301M1NPB。

(2)ObD6D基因家族植物表达载体的构建和工程菌株的获得

用前述月见草3'-RACE-Ready cDNA 1μL为模板，用引物组合FObD6D1C和RObD6D1扩增ObD6D1编码区及3’UTR共1792bp，引物序列如表5所示；用引物组合FObD6D2C和RObD6D2扩增ObD6D2编码区及3’UTR共1681bp，引物序列如表5所示；回收扩增产物、经TA克隆后测序验证无误后抽提pGEM T-easy-ObD6D1C质粒和pGEM T-easy-ObD6D2C质粒，用XbaI和SacI进行双酶切，分别回收1.8kb的ObD6D1基因条带和1.7kb的ObD6D2基因条带。

分别抽提pC2301M1NPB质粒和pC2301M1B，用XbaI和SacI进行双酶切，胶回收得到线状的载体骨架，然后分别与前述ObD6D1和ObD6D2基因的回收产物进行连接重组，分别得到ObD6D1基因的组成型植物表达载体pC2301M1NPB-ObD6D1(简称pCN-ObD6D1，15566bp)和pC2301M1B--ObD6D1(简称pCD-ObD6D1)，ObD6D2基因的组成型植物表达载体pC2301M1NPB-ObD6D2(简称pCN-ObD6D2，15455bp)和pC2301M1B--ObD6D2(简称pCD-ObD6D2)。将获得的植物表达载体转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，对Kan抗性LB平板筛选的转化子单克隆分别采用引物组合F35S3N和RObD6D1和F35S3N和RObD6D2进行PCR检测，阳性克隆子采用冻融法转化根癌农杆菌LBA4404，对三重抗性(Kan+Str+Rif)LB平板筛选的转化子单克隆进行PCR检测，阳性克隆子作为工程菌株保存，用于植物转化。

(3)农杆菌介导的ObD6D基因家族转化月见草，大幅增加种子GLA含量

所有组织培养操作均在标准的植物组织培养条件下进行，超净工作台、培养间、驯化间的洁净级别分别为100级、10000级和100000级，相应试剂、材料、器皿均按规程进行无菌处理。月见草的成熟种子用体积分数为75％的乙醇表面消毒1min后用无菌水冲洗3次，然后用质量分数为10％的次氯酸钠浸泡20min，无菌水多次冲洗干净，然后接种于MS固体培养基[MS粉2.21g/L+聚乙烯吡咯烷酮K₃₀(PVP)2mg/L+Phytagel 2.6g/L+蔗糖30.0g/L，pH5.8，不加Phytagel即为液体培养基]上，于25℃、2000Lux光照、14h/d光周期培养(后面的组培条件除特别注明者外，均与此相同)。取苗龄14-28d无菌苗的子叶，切成约6mm×6mm的小块，接种到预培培养基MSp[MS固体培养基+0.1mg/L噻苯隆(TDZ)+0.5mg/L吲哚丁酸(IBA)]预培养3d。

将-80℃保存的工程菌株在加有100mg/L Kan+20mg/L Str+40mg/L Rif的LB液体培养基中于28℃、250r/min振荡培养1～2d，使农杆菌生长至对数期，转接培养一次。5000rpm、10min室温离心收集菌体，用浸染培养基MSm[MS液体培养基+0.1mg/L TDZ+0.5mg/LIBA+100μmol/L乙酰丁香酮(AS)]调节细菌浓度至OD₆₀₀约0.5左右，即为浸染液。

将预培养后的子叶块浸入浸染液中5-10min，期间间歇性轻轻摇荡，然后将子叶块在灭菌纸上吸干多余的菌液，接种到共培培养基MSc[MS固体培养基+0.1mg/L TDZ+0.5mg/LIBA+100μmol/L AS]，23.5℃暗培养48h。用杀菌液体培养基MSk[MS液体培养基+0.1mg/LTDZ+0.5mg/L IBA+500mg/L头孢霉素(Cef)]浸泡洗涤外植体3×10min，用灭菌纸吸干表面液体，转接到诱导培养基MSi[MS固体培养基+0.1mg/L TDZ+0.5mg/L IBA+500mg/L Cef]培养，1周后转入筛选培养基MSs[MS固体培养基+0.1mg/L TDZ+0.5mg/L IBA+500mg/LCef+15mg/L Kan]培养，定期更换相同的新鲜培养基进行继代，至长出抗性愈伤并分化出再生芽，然后转接到生根培养基MSr[MS固体培养基+0.5mg/L IBA+300mg/L Cef]培养至长出发达根系，生根后的小苗经驯化后，移栽到含有灭菌珍珠岩、蛭石、草炭土混合物(质量比为1:1:1)的盆钵中，按温室盆栽进行管理。

最终，pCD-ObD6D1、pCD-ObD6D2、pCN-ObD6D1、pCN-ObD6D2转化月见草后，分别获得18、20、22、19株再生植株；对再生植株叶片滴加200mg/L Basta溶液检测抗性，切取再生植株的叶块进行GUS组织化学染色，并提取再生植株的叶片基因组总DNA分别采用引物组合F35S3N与RObD6D1、F35S3N与RObD6D2、FNAP与RObD6D1、FNAP与RObD6D2进行PCR检测，引物序列如表5所示。结果表明分别获得5、7、8、6株三重阳性转基因植株。

表5、构建超量表达ObD6D1和ObD6D2表达载体的引物和衔接子序列

对转基因阳性植株进行全面的生物学和农学观察，上述种载体的转基因植株均未出现明显的副作用，生物学和农学性状与非转基因对照植株没有明显差异。采用气相色谱法对转基因月见草成熟种子进行脂肪酸GC分析，采用面积归一化法进行相对定量，发现与阴性对照相比，pCD-ObD6D1、pCD-ObD6D2、pCN-ObD6D1、pCN-ObD6D2的转基因月见草成熟种子中GLA占总脂肪酸的比例均有大幅度提高(表6)，证明无论是采用组成型启动子还是种子特异启动子驱动ObD6D基因家族的两个成员基因在月见草中超量表达，均能够大幅提高种子中GLA的含量，达到了代谢工程分子育种的目的。

表6、转基因月见草的种子脂肪酸组份(％)

对转基因当代植株进行自交繁殖，采用与转基因当代植株一样的叶片滴加Basta抗性检测和GUS染色检测，筛选鉴定出pCD-ObD6D1、pCD-ObD6D2、pCN-ObD6D1、pCN-ObD6D2的转基因月见草纯合优株系，GC检测表明最优株系种子中GLA占总脂肪酸含量均超过45％，说明转基因性状可以稳定遗传且纯合后代株系比当代(杂合)单株的转基因性状更好。

实施例6、超量表达ObD6D1和ObD6D2在油菜种子中积累GLA和SDA

(1)农杆菌介导的ObD6D基因家族转化甘蓝型油菜，介导种子积累GLA和SDA

所有组织培养操作均在标准的植物组织培养条件下进行，超净工作台、培养间、驯化间的洁净级别分别为100级、10000级和100000级，相应试剂、材料、器皿均按规程进行无菌处理。甘蓝型油菜典型品种中双10号的种子用体积分数为75％的乙醇表面消毒1min后用无菌水冲洗3次，然后用质量分数为5％的次氯酸钠浸泡20min，用无菌水冲洗干净后接种于MS固体培养基[MS粉4.41g/L+Phytagel 2.6g/L+蔗糖30.0g/L，pH5.8；不加Phytagel即为液体培养基]中，于25℃、2000Lux光照、16h/d光周期培养(后面的组培间培养条件除特别注明者外，均与此相同)。切取苗龄8d左右无菌苗的下胚轴切成长0.5～1.0cm的小段，接种到预培培养基MSp[MS培养基+1.0mg/L 6-苄基氨基嘌呤(6-BA)+1.0mg/L 2,4-二氯苯氧基乙酸(2,4-D)]预培养3d。

取-80℃保存的工程菌株在加有100mg/L Kan+20mg/L Str+40mg/L Rif的LB液体培养基中于28℃、250r/min振荡培养1～2d，使农杆菌生长至对数期，转接培养一次。然后在5000rpm条件下室温离心10min，收集菌体，菌体用浸染培养基MSm[MS液体培养基+1.0mg/L 2,4-D+1.0mg/L 6-BA+100μmol/L AS]调节细菌浓度至OD₆₀₀约0.5左右，即为浸染液。

将预培养后的下胚轴段浸入浸染液中5-10min，间歇性轻轻摇荡，然后将下胚轴段在灭菌纸上吸干多余菌液，接种到共培培养基MSc[MS固体培养基+2.0mg/L 6-BA+0.5mg/L萘乙酸(NAA)]中，23.5℃暗培养48h。用杀菌液体培养基MSk[MS液体培养基+1.0mg/L 2,4-D+1.0mg/L 6-BA+500mg/L Cef]浸泡洗涤外植体3×10min，用灭菌纸吸干表面液体，转接到诱导筛选培养基MSi[MS固体培养基+1.0mg/L 6-BA+1.0mg/L 2,4-D+500mg/L Cef+12.5mg/L Basta+6mg/L AgNO₃]培养，约2周继代1次，至长出肉眼可见的抗性愈伤，再转接到分化培养基MSd[MS固体培养基+4.0mg/L 6-BA+2.0mg/L玉米素(ZT)+5.0mg/L AgNO₃+500mg/L Cef+12.5mg/L Basta]中培养14d以上，诱导愈伤组织分化出小芽，再转接到茎分化培养基MSs(MS固体培养基+3.0mg/L 6-BA+2.0mg/L ZT+500mg/L Cef+12.5mg/L Basta)培养至长出小茎，再转接到长茎培养基MSe(MS固体培养基+0.05mg/L 6-BA+500mg/L Cef+12.5mg/L Basta)中培养至长出无根小苗，再转接到生根培养基MSr[MS固体培养基+2mg/L萘乙酸(NAA)]培养至长出发达根系，生根后的小苗经驯化后，移栽到含有灭菌珍珠岩、蛭石、草炭土混合物(质量比为1:1:1)的盆钵中，按温室盆栽进行管理。

最终，pCD-ObD6D1、pCD-ObD6D2、pCN-ObD6D1、pCN-ObD6D2转化甘蓝型油菜中双10号后，分别获得15、13、14、22株再生植株；对再生植株叶片滴加200mg/L Basta溶液检测抗性，切取再生植株的叶块进行GUS组织化学染色，并提取再生植株的叶片基因组总DNA分别采用引物组合F35S3N+RObD6D1、F35S3N+RObD6D2、FNAP+RObD6D1、FNAP+RObD6D2进行PCR检测，结果表明分别获得6、5、5、8株三重阳性转基因植株。

对转基因阳性植株进行全面的生物学和农学观察，上述种载体的转基因植株均未出现明显的副作用，生物学和农学性状与非转基因对照植株没有明显差异。采用气相色谱法对转基因油菜成熟种子进行脂肪酸GC分析，发现与非转基因植株(阴性对照)相比，pCD-ObD6D1、pCD-ObD6D2、pCN-ObD6D1、pCN-ObD6D2的转基因油菜成熟种子都多出了两个新PUFA波峰—GLA和SDA(图5)，采用面积归一化法计算得知GLA占总脂肪酸的百分比分别为2.24％～2.96％、2.54％～2.91％、3.47％～4.26％、3.42％～5.36％，SDA占总脂肪酸的百分比分别为2.36％～3.90％、2.35％～2.75％、2.14％～2.63％、2.23％～3.80％，证明无论是采用组成型启动子还是采用种子特异启动子驱动ObD6D基因家族的两个成员基因在油菜中异源表达，均能够介导种子中积累GLA和SDA，达到了代谢工程分子育种的目的。

对转基因当代植株进行自交繁殖，采用与转基因当代植株一样的叶片滴加Basta抗性检测和GUS染色检测，筛选鉴定出pCD-ObD6D1、pCD-ObD6D2、pCN-ObD6D1、pCN-ObD6D2的转基因油菜纯合优株系，GC检测表明最优株系种子中GLA占总脂肪酸含量达到16.2％，SDA占总脂肪酸含量达到5.6％，说明转基因性状可以稳定遗传且纯合后代株系比当代(杂合)单株的转基因性状更好。

其它说明

这里特别申明，应用形式上的如下改变也都必然属于本发明的精神和范围所覆盖：

1、本发明中的基因和其片段，除了SEQ ID No.2以外，也包括来自于月见草的其它ObD6D2等位基因的序列，包括来自于月见草的其它亚种、生态型、品种、杂交种的ObD6D2基因序列，也包括来自于月见草属的近缘物种中与本发明的ObD6D2序列高度相似的基因序列(ORF全编码区水平一致率大于97％)，尽管它们与SEQ ID No.2可能有小的差异。

2、本发明中的基因和其片段，除了SEQ ID No.2以外，也包括与它在连续80bp及以上有98.00％以上一致性的任意核苷酸序列。

3、本发明中的基因和其片段，除了SEQ ID No.2以外，也包括编码蛋白与SEQ IDNo.4有100％一致率的人工合成核苷酸序列。

4、本发明中的基因和其片段，除了象优先实施例中所举的用于月见草、甘蓝型油菜以外，还可以应用于其它物种。

5、本发明中的ObD6D2基因和其片段，除了象优先实施例中所举的正义转化进行超量表达和异源表达外，还可以采用反义RNA、RNA干扰、基因组编辑(ZFN、TALEN、CRISPR-Cas)等技术，来介导月见草属植物内源ObD6D2基因或基因家族的沉默，阻止GLA的合成，提高月见草属植物LA和ALA的含量。

6、本发明中的基因和其片段，除了优选实施例中所举的采用pC2301M1DPB和pC2301M1NPB进行植物表达载体构建以外，还可以采用其它载体来进行植物表达载体构建；本发明中的载体构建物，除了象优先实施例中所举的采用根癌农杆菌菌株LBA4404介导的改良叶盘法进行遗传转化以外，也可以采用其它方法进行植物遗传转化。

7、本发明应用实例所取得的效应参数值仅指采用实例中的品种作为外植体进行转基因操作的结果，如果采用其它品种(如超高油酸、超高亚麻酸品种)作为外植体进行转基因操作，会取得更优的操作效果参数值。

最后说明的是，以上实施例仅用以举例说明本发明的技术方案，但并非限制于此。尽管通过参照本发明的优选实施例已经对本发明进行了描述，但本领域的普通技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离所附权利要求书所限定的本发明的精神和范围。

Claims (10)

1.月见草△6-脂肪酸脱饱和酶基因ObD6D2，其特征在于：所述ObD6D2的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示或SEQ ID NO.4所示氨基酸序列取代、缺失或添加至少一个氨基酸，且来源于月见草的具有△6-脂肪酸脱饱和酶活性的氨基酸序列。

2.根据权利要求1所述的月见草△6-脂肪酸脱饱和酶基因ObD6D2，其特征在于：所述ObD6D2的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

3.权利要求1所述的月见草△6-脂肪酸脱饱和酶基因ObD6D2，其特征在于：所述ObD6D2的基因序列如SEQ ID NO.2所示或SEQ ID NO.2所示核苷酸序列经取代、缺失或添加至少一个核苷酸，且来源于月见草的编码具有△6-脂肪酸脱饱和酶活性的核苷酸序列。

4.根据权利要求3所述的月见草△6-脂肪酸脱饱和酶基因ObD6D2，其特征在于：所述ObD6D2的基因序列如SEQ ID NO.2所示。

5.含有权利要求3所述月见草△6-脂肪酸脱饱和酶基因ObD6D2的重组表达载体。

6.根据权利要求5所述的重组表达载体，其特征在于：所述重组载体含有ObD6D2基因编码区，所述ObD6D2基因编码区的序列对应于SEQ ID No.2第94～1443位碱基所示。

7.根据权利要求6所述的重组表达载体，其特征在于：所述重组表达载体是将ObD6D2基因编码区的序列插入pC2301M1NPB载体的NapA启动子与Nos终止子之间而得；

或所述重组表达载体是ObD6D2基因编码区的序列插入pYES2质粒的XbaI和BamHI酶切位点而得；

所述pC2301M1NPB载体由以下方法制备：用HindIII和EcoRI切下pBI121上的GUS基因表达盒然后插入pCAMBIA2301载体的HindIII和EcoRI酶切位点处，然后用SacI和XmaI切去GUS基因后用带有SacI和XmaI粘性末端的序列连接，得pC2301M1载体，然后在pC2301M1载体HindIII酶切位点处连入由MAS启动子驱动bar基因表达、MAS终止子终止表达的bar基因表达盒，得pC2301M1B载体；最后将pC2301M1B载体上的CaMV35S启动子用种子特异启动子NapA替换即得pC2301M1NPB载体。

8.含有权利要求5-7任一项所述重组表达载体的转化子。

9.权利要求1-4任一项所述月见草△6-脂肪酸脱饱和酶基因ObD6D2在提高月见草属植物γ-亚麻酸和十八碳四烯酸含量中的应用。

10.权利要求1-4任一项所述月见草△6-脂肪酸脱饱和酶基因ObD6D2在大宗油料作物重建γ-亚麻酸和十八碳四烯酸合成途径中的应用。