CN103201379A - 生产脂质的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及产生脂质的方法。具体地，本发明涉及提高转基因生物或其部分中的一种或多种非极性脂质水平和/或总非极性脂质含量的方法。在一个特定的实施方案中，本发明涉及使用例如单酰基甘油酰基转移酶(MGAT)的酰基转移酶提高植物、植物种子和/或叶子、藻类和真菌中的一种或多种非极性脂质水平和/或总非极性脂质含量。

Description

生产脂质的方法
发明领域
本发明涉及生产脂质的方法。具体而言，本发明涉及提高转基因生物或其部分中的一种或多种非极性脂质水平和/或总非极性脂质含量的方法。在一个特定的实施方案中，本发明涉及酰基转移酶例如单酰基甘油酰基转移酶(MGAT)在提高植物、植物种子和/或叶、藻类和真菌中的一种或多种非极性脂质水平和/或总非极性脂质含量中的用途。
发明背景
植物脂质诸如种子油三酰基甘油(TAG)具有许多用途，例如烹饪用途(起酥油、质地、调味)、工业用途(用于肥皂、蜡烛、香水、化妆品、适合作为干燥剂、绝缘体、润滑剂)，以及提供营养价值。使用植物脂质生产生物燃料的兴趣也在不断增长。
生物燃料
替代能源的增长需求可通过植物源生物燃料的可再生供应而得到至少部分的满足。要成为矿物燃料的可行替代方案，生物燃料应当在生产中提供净能量增益(net energy gain)，具有环境效益、经济竞争力并且能够大量生产，而不减少食品供应，这是目前在现有生物燃料生产中遇到的一个不遂人意的附带问题。
植物代表了脂质的重要来源，因为许多物种都会在种子中积聚脂质作为主要贮藏成分。在种子中，营养贮藏脂质(取决于物种，占种子重量的15-50%)的主要形式为三酰基甘油(TAG)。然而，脂质合成的初级底物是在绿色光合组织(叶和茎)中生成的碳水化合物，它们随后在叶绿体中代谢生成游离脂肪酸和乙酰辅酶A(乙酰基-CoA)单元，即TAG的基本原料。因此，植物叶子是TAG原料合成的主要部位。油料种子中积聚的TAG的量可部分地由质体中产生的脂肪酸的量决定(Bao和Ohlrogge,1999)。TAG的最终贮藏发生在种子的小型圆球样细胞器(称为油体(oil body))中。TAG只代表了大约0.2-0.3%的叶的生物质是。
高生物质植物尤其是阔叶高生物质植物具有巨大的生物燃料潜能。每英亩可产生100-400吨低成本、高价值生物质材料的植物尤其有用，特别是当高成本、劳动力需求、化学投入或与低生物质植物生产相关的地理限制这些因素都不存在时。
单酰基甘油酰基转移酶
单酰基甘油酰基转移酶(MGAT)与哺乳动物相关，主要与哺乳动物的肠道相关，在肠道中该酶催化由单酰基甘油(MAG)和脂肪酰基辅酶A直接合成二酰基甘油(DAG)。相比之下，存在于植物中的主要TAG合成途径为Kennedy途径，或不包括MGAT步骤的磷酸甘油途径(图1)。在Kennedy途径中，DAG在两步反应中由酰化甘油主链形成，该两步反应是：通过溶血磷脂酸酰基转移酶(LPAAT)发生初始酰化，该酶将脂肪酰基辅酶A加到溶血磷脂酸(LysoPA，LPA)底物上；以及随后从产物磷脂酸(PA)中移除磷酸酯基团，得到无机磷酸酯(Pi)和DAG。相比之下，MGAT通过用来自脂肪酰基辅酶A的酰基使MAG酰化而直接催化形成DAG。在合成DAG后，另一种酶，二酰基甘油酰基转移酶(DGAT)酰化DAG形成TAG。
待分离的第一种MGAT基因来自小鼠(MGAT1)，该基因编码膜结合的不溶性酶(Yen等，2002)。其他类似的MGAT基因已在动物中得以表征，包括来自小鼠的第二种MGAT基因(MGAT2)和三种人类基因，但是尚未证实已从植物中克隆出编码MGAT的基因(Cao等，2003；Cheng等，2003)。
二酰基甘油酰基转移酶
DGAT是催化植物、真菌和哺乳动物中产生TAG的最终酶促步骤的整合膜蛋白。该酶负责将酰基从酰基辅酶A(酰基-CoA)转移到DAG形成TAG。DGAT与植物和真菌中的膜和脂体组分相关，尤其是在油料种子中，其中DGAT有助于贮藏用作能源储备的碳。已知DGAT可调控TAG结构并指导TAG合成。此外，已知的是，DGAT反应为脂质合成特异性的。在野生型植物中，酰基辅酶A依赖性DGAT以种子特异性方式的过表达导致种子油沉积和平均种子重量的增加(Jako等，2001)。
为了最大程度提高脂质商业生产的产率，需要提高转基因生物或其部分诸如植物、种子、叶、藻类和真菌中脂质水平的更多方法，尤其是非极性脂质诸如DAG和TAG。
发明概述
本发明人令人吃惊地证实，MGAT基因或相关基因的转基因表达导致诸如植物细胞的细胞中脂质产率的明显提高。本发明人还鉴定了转基因生物诸如植物中DAG和TAG合成的新途径，该途径不同于熟知的Kennedy途径。
因此，本发明提供生产提取的脂质的方法，该方法包括以下步骤：
i)获得包含一种或多种外源多核苷酸的转基因非人生物或其部分，其中该转基因非人生物或其部分当与不含所述一种或多种外源多核苷酸的相应生物或其部分进行比较时具有升高水平的一种或多种非极性脂质，以及
ii)从该转基因非人生物或其部分提取脂质，
从而产生所述提取的脂质。
在一个实施方案中，该转基因非人生物或其部分的总非极性脂质含量当与相应的生物或其部分相比时是升高的。
该转基因非人生物或其部分可进一步通过单一或组合的特征(i)、(ii)、(iii)进行定义：特征(i)定量该一种或多种非极性脂质水平或总非极性脂质含量升高的程度，其可以表示为按重量计的升高程度，或表示为与相应非人生物或其部分中的水平相比的相对升高值；和/或特征(ii)规定植物的属或种，或者真菌或藻类的种，或其他细胞类型；以及特征(iii)规定升高的所述一种或多种特定脂质。
对于特征(i)，在一个实施方案中，所述一种或多种非极性脂质的升高程度比相应的非人生物或其部分按重量计高至少0.5%、至少1%、至少2%、至少3%、至少4%、至少5%、至少6%、至少7%、至少8%、至少9%、至少10%、至少11%、至少12%、至少13%、至少14%、至少15%、至少16%、至少17%、至少18%、至少19%、至少20%、至少21%、至少22%、至少23%或至少24%(w/w)，优选达到按重量计约25%(w/w)的最大升高值。
另外对于特征(i)，在一个优选的实施方案中，所述转基因非人生物或其部分的总非极性脂质含量当与相应的生物或其部分相比时是升高的。在一个实施方案中，总脂质含量比相应的非人生物或其部分按重量计升高至少0.5%、至少1%、至少2%、至少3%、至少4%、至少5%、至少6%、至少7%、至少8%、至少9%、至少10%、至少11%、至少12%、至少13%、至少14%、至少15%、至少16%、至少17%、至少18%、至少19%、至少20%、至少21%、至少22%、至少23%或至少24%(w/w)，优选达到按重量计约25%(w/w)的最大升高值。
进一步地，对于特征(i)，在一个实施方案中，所述一种或多种非极性脂质的水平和/或总非极性脂质含量比相应的非人生物或其部分在相对的基础上高至少1%、至少2%、至少3%、至少4%、至少5%、至少6%、至少7%、至少8%、至少9%、至少10%、至少11%、至少12%、至少13%、至少14%、至少15%、至少16%、至少17%、至少18%、至少19%、至少20%、至少21%、至少22%、至少23%、至少24%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%或至少90%。
另外对于特征(i)，所述一种或多种非极性脂质水平和/或总非极性脂质含量的升高程度比相应的非人生物或其部分在相对的基础上可以高至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍或至少10倍，优选达到约12倍的最大值。
对于特征(ii)，在一个实施方案中，转基因非人生物为植物、藻类或适合发酵的生物，诸如酵母或其他真菌，优选为含油酵母或其他真菌。植物可以为例如芸苔属、陆地棉、亚麻、向日葵属、红花、大豆、玉米、拟南芥、两色高梁、高粱(Sorghum vulgare)、燕麦、三叶草属、油棕(Elaesisguineenis)、本氏烟(Nicotiana benthamiana)、大麦(Hordeum vulgare)、羽扇豆(Lupinus angustifolius)、亚洲栽培稻(Oryza sativa)、光稃稻(Oryzaglaberrima)、亚麻荠、异源三倍体芒草奇岗或中国芒。
对于特征(iii)，TAG、DAG、TAG和DAG、MAG、多不饱和脂肪酸(PUFA)、或具体PUFA(诸如二十碳二烯酸(EDA)、花生四烯酸(ARA)、α亚麻酸(ALA)、十八碳四烯酸(SDA)、二十碳三烯酸(ETE)、二十碳四烯酸(ETA)、二十碳五烯酸(EPA)、二十二碳五烯酸(DPA)、二十二碳六烯酸(DHA))、或它们中两种或更多种的组合得以升高。TAG、DAG、TAG和DAG、MAG、PUFA或具体PUFA的升高程度可如上面的特征(i)所定义。在一个优选的实施方案中，MAG为2-MAG。优选地，DAG和/或TAG，更优选DAG和TAG的总和得以升高。
在优选的实施方案中，所述一种或多种非极性脂质和/或总非极性脂质含量通过特征(i)、(ii)和(iii)，或特征(i)和(ii)，或特征(i)和(iii)的组合定义。
在一个实施方案中，所述部分为植物的种子、果实、块茎、根或营养部分。植物的营养部分可以为地上植物部分或绿色部分诸如叶子或茎干。在另一个实施方案中，所述部分为多细胞生物的细胞。特定植物部分的所述一种或多种非极性脂质水平和/或总非极性脂质含量的升高程度可以如上面的特征(i)所定义。芸苔属、陆地棉、亚麻、向日葵属、红花、亚洲栽培稻、光稃稻、亚麻荠、大豆或玉米的植物部分优选为种子，而两色高梁、高粱、燕麦、三叶草属、油棕、本氏烟、大麦、羽扇豆、异源三倍体芒草奇岗或中国芒的优选部分为营养部分，具体地讲为叶子和茎干。
在一个实施方案中，所述部分为植物种子，而提取的脂质为种子油。本发明的方法可进一步包括从转基因植物收获种子，从种子压榨种子油，和/或在一个或多个步骤中纯化种子油。种子可以例如来自油菜植物、玉米植物、大豆植物、羽扇豆植物、花生植物、向日葵植物、棉花植物、红花植物或亚麻植物。
在一个实施方案中，种子的总油含量或总脂肪酸含量按重量计比不含所述一种或多种外源多核苷酸的相应种子高至少0.5%(w/w)至25%(w/w)。
在一个实施方案中，种子油的相对DAG含量比相应的种子高至少10%、至少10.5%、至少11%、至少11.5%、至少12%、至少12.5%、至少13%、至少13.5%、至少14%、至少14.5%、至少15%、至少15.5%、至少16%、至少16.5%、至少17%、至少17.5%、至少18%、至少18.5%、至少19%、至少19.5%、至少20%(w/w)。在一个实施方案中，种子的DAG含量升高的量如特征(i)所定义，而种子来自如特征(ii)所定义的属和/或种。
在一个实施方案中，种子油的相对TAG含量比相应的种子高至少5%、至少5.5%、至少6%、至少6.5%、至少7%、至少7.5%、至少8%、至少8.5%、至少9%、至少9.5%或至少10%(w/w)。在一个实施方案中，种子的TAG含量升高的量如特征(i)所定义，而种子来自如特征(ii)所定义的属和/或种。在一个实施方案中，种子为油含量按重量计(w/w)为至少45%、至少46%、至少47%、至少48%、至少49%、至少50%、至少51%、至少52%、至少53%、至少54%或至少55%的油菜种子。
在一个实施方案中，种子为油含量按重量计(w/w)为至少5%、至少6%、至少7%、至少8%、至少9%或至少10%的玉米种子。
在一个实施方案中，种子为油含量按重量计(w/w)为至少20%、至少21%、至少22%、至少23%、至少24%、至少25%、至少26%、至少27%、至少28%、至少29%或至少30%的大豆种子。
在一个实施方案中，种子为油含量按重量计(w/w)为至少10%、至少11%、至少12%、至少13%、至少14%、至少15%或至少16%的羽扇豆种子。
在一个实施方案中，种子为油含量按重量计(w/w)为至少50%、至少51%、至少52%、至少53%、至少54%或至少55%的花生种子。
在一个实施方案中，种子为油含量按重量计(w/w)为至少50%、至少51%、至少52%、至少53%、至少54%或至少55%的向日葵种子。
在一个实施方案中，种子为油含量按重量计(w/w)为至少41%、至少42%、至少43%、至少44%、至少45%、至少46%、至少47%、至少48%、至少49%或至少50%的棉花种子。
在一个实施方案中，种子为油含量按重量计(w/w)为至少35%、至少36%、至少37%、至少38%、至少39%、至少40%、至少41%、至少42%、至少43%、至少44%或至少45%的红花种子。
在一个实施方案中，种子为油含量按重量计(w/w)为至少36%、至少37%、至少38%、至少39%或至少40%的亚麻种子。
在一个实施方案中，种子为油含量按重量计(w/w)为至少36%、至少37%、至少38%、至少39%、至少40%、至少41%、至少42%、至少43%、至少44%或至少45%的亚麻荠种子。
在另一个实施方案中，生物部分为营养植物部分，并且营养植物部分的TAG、DAG、TAG和DAG或MAG含量比不含所述一种或多种外源多核苷酸的相应营养植物部分的TAG、DAG、TAG和DAG或MAG含量在相对的基础上高至少10%、至少11%、至少12%、至少13%、至少14%、至少15%、至少16%、至少17%、至少18%、至少19%、至少20%、至少21%、至少22%、至少23%、至少24%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%或至少90%(w/w)。在一个优选的实施方案中，MAG为2-MAG。在一个实施方案中，营养植物部分的TAG、DAG、TAG和DAG或MAG含量由营养植物部分的可提取脂质中的这些脂质组分的量决定。在进一步的实施方案中，转基因营养植物部分的TAG、DAG、TAG和DAG或MAG含量升高的量如特征(i)所定义。
在一个实施方案中，所述生物或其部分或从其提取的脂质的总非极性脂质含量的脂肪酸含量的至少60%(mol%)为油酸。
在另一个实施方案中，所述生物或其部分的PUFA含量当与相应的生物或其部分进行比较时是升高的。在此背景下，PUFA含量既包含酯化的PUFA(包括TAG、DAG等)也包含非酯化的PUFA。在一个实施方案中，所述生物或其部分的PUFA含量优选由生物或其部分的可提取脂质中PUFA的量决定。PUFA含量的升高程度可以如特征(i)所定义。PUFA含量可以包含EDA、ARA、ALA、SDA、ETE、ETA、EPA、DPA、DHA或它们中两种或更多种的组合。
在另一个实施方案中，生物或其部分或由其提取的脂质中的PUFA的水平与相应的生物或其部分或由其提取的脂质相比时是升高的。PUFA可以为EDA、ARA、ALA、SDA、ETE、ETA、EPA、DPA、DHA或它们中两种或更多种的组合。PUFA的升高程度可以如特征(i)所定义。
在一个实施方案中，所述一种或多种非极性脂质(诸如TAG、DAG、TAG和DAG、MAG、PUFA或特定的PUFA)的水平和/或总非极性脂质含量可通过使用气相色谱对得自提取的脂质的脂肪酸甲酯进行分析而测定。测定任何这些含量的备选方法在本领域中是已知的，并包括不需要从生物或其部分中提取脂质的方法，例如通过近红外(NIR)或核磁共振(NMR)进行分析。
在一个实施方案中，所述一种或多种外源多核苷酸编码：
i)单酰基甘油酰基转移酶(MGAT)，
ii)二酰基甘油酰基转移酶2(DGAT2)，
iii)MGAT和甘油-3-磷酸酰基转移酶(GPAT)，或
iv)MGAT和DGAT，或
v)MGAT、GPAT和DGAT。
在一个实施方案中，所述外源多核苷酸编码催化sn-1 MAG或sn-2MAG的酰化以分别形成sn-1,3 DAG或sn-1,2/2,3-DAG的MGAT。在一个优选的实施方案中，MGAT催化sn-2 MAG的酰化形成sn-1,2/2,3-DAG。编码MGAT的外源多核苷酸可包含以下一种或多种：
i)选自SEQ ID NO:1至44任一者的核苷酸序列，
ii)编码包含具有SEQ ID NO:45至82任一所提供的序列的氨基酸的多肽或其生物活性片段的核苷酸序列，
iii)与i)或ii)至少50%相同的核苷酸序列，或
iv)在严格条件下与i)至iii)的任一杂交的核苷酸序列。
在一个实施方案中，所述外源多核苷酸编码MGAT1，其包含以下一种或多种：
i)选自SEQ ID NO:1、3至5或7至23任一者的核苷酸序列，
ii)编码包含具有SEQ ID NO:45至61的任一所提供的序列的氨基酸多肽或其生物活性片段的核苷酸序列，
iii)与i)或ii)至少50%相同的核苷酸序列，或
iv)在严格条件下与i)至iii)的任一杂交的核苷酸序列。
在另一个实施方案中，所述外源多核苷酸编码MGAT2，其包含以下一种或多种：
i)选自SEQ ID NO:2、6或24至37任一者的核苷酸序列，
ii)编码包含具有SEQ ID NO:62至75的任一所提供的序列的氨基酸的多肽或其生物活性片段的核苷酸序列，
iii)与i)或ii)至少50%相同的核苷酸序列，或
iv)在严格条件下与i)至iii)任一杂交的核苷酸序列。
在另一个实施方案中，所述外源多核苷酸编码MGAT3，其包含以下一种或多种：
i)选自SEQ ID NO:38至44任一者的核苷酸序列，
ii)编码包含具有SEQ ID NO:76至82的任一所提供的序列的氨基酸的多肽或其生物活性片段的核苷酸序列，
iii)与i)或ii)至少50%相同的核苷酸序列，或
iv)在严格条件下与i)至iii)的任一杂交的核苷酸序列。
在另一个实施方案中，所述外源多核苷酸编码催化sn-1,3 DAG或sn-1,2/2,3-DAG、优选sn-1,2/2,3-DAG的酰化以形成TAG的DGAT。在一个实施方案中，所述外源多核苷酸编码DGAT2，其包含以下一种或多种：
i)选自SEQ ID NO:204至211任一者的核苷酸序列，
ii)编码包含具有SEQ ID NO:212至219的任一所提供的序列的氨基酸的多肽或其生物活性片段的核苷酸序列，
iii)与i)或ii)至少50%相同的核苷酸序列，或
iv)在严格条件下与i)至iii)的任一杂交的核苷酸序列。在一个优选的实施方案中，DGAT2包含SEQ ID NO:204的核苷酸序列和/或编码包含具有SEQ ID NO:212所提供的序列的氨基酸的多肽的核苷酸序列。
在另一个实施方案中，所述外源多核苷酸编码甘油-3-磷酸酰基转移酶(GPAT)。在一个优选的实施方案中，GPAT还具有磷酸酶活性并产生MAG(即，催化G-3-P形成sn-1 LPA或sn-2 LPA并从LPA移除磷酸酯基团形成MAG的GPAT)。在一个进一步优选的实施方案中，GPAT为sn-2GPAT(即，优先由G-3-P产生sn-2 LPA)并具有磷酸酶活性以产生2-MAG，例如拟南芥GPAT4或GPAT6。编码GPAT的外源多核苷酸可包含以下一种或多种：
i)选自SEQ ID NO:84至141任一者的核苷酸序列，
ii)编码包含具有SEQ ID NO:144至201的任一所提供的序列的氨基酸的多肽或其生物活性片段的核苷酸序列，
iii)与i)或ii)至少50%相同的核苷酸序列，或
iv)在严格条件下与i)至iii)的任一杂交的核苷酸序列。
在另一个或附加的实施方案中，所述外源多核苷酸编码以下GPAT，其具有磷酸酶活性，包含SEQ ID NO:225、226和227所提供的一个或多个保守氨基酸序列，或与其至少50%、优选至少60%、更优选至少65%相同的氨基酸序列。
在一个实施方案中，所述一种或多种外源多核苷酸编码突变MGAT和/或DGAT和/或GPAT。例如，所述一种或多种外源多核苷酸可编码相对于野生型MGAT和/或DGAT和/或GPAT具有如表1所示的保守氨基酸取代的MGAT和/或DGAT和/或GPAT。
在一个实施方案中，所述转基因非人生物或其部分包含编码MGAT的第一外源多核苷酸和编码GPAT的第二外源多核苷酸。所述第一和第二多核苷酸可作为单独的分子而提供或可作为邻接的单个分子而提供。在一个优选的实施方案中，GPAT为具有磷酸酶活性的GPAT，诸如拟南芥GPAT4或GPAT6。具有磷酸酶活性的GPAT起到在转基因非人生物或其部分中催化从G-3-P形成MAG的作用(即，酰化G-3-P形成LPA，随后移除磷酸酯基团形成MAG)。MGAT然后通过用衍生自脂肪酰基辅酶A的酰基使MAG酰化而起到在转基因非人生物或其部分中催化DAG形成的作用。MGAT诸如拟南芥MGAT1如果也具有DGAT活性还可起到在转基因非人生物或其部分中催化TAG形成的作用。
转基因非人生物或其部分可包含编码(例如)DGAT的第三外源多核苷酸。所述第一、第二和第三多核苷酸可作为单独的分子而提供或可作为邻接的单个分子而提供。DGAT通过用衍生自脂肪酰基辅酶A的酰基使DAG酰化(优选通过MGAT途径产生)而起到在转基因非人生物或其部分中催化TAG形成的作用。
在另一个实施方案中，所述转基因非人生物或其部分包含编码MGAT的第一外源多核苷酸和编码DGAT的第二外源多核苷酸。所述第一和第二多核苷酸可作为单独的分子而提供或可作为邻接的单个分子而提供。所述转基因非人生物可包含编码(例如)GPAT的第三外源多核苷酸，优选为具有磷酸酶活性的GPAT，诸如拟南芥属GPAT4或GPAT6。所述第一、第二和第三多核苷酸可作为单独的分子而提供或可作为邻接的单个分子而提供。
在进一步的实施方案中，所述转基因生物或其部分的所述一种或多种非极性脂质水平和/或所述总非极性脂质含量比不含所述一种或多种外源多核苷酸但包含编码拟南芥DGAT1(SEQ ID NO:83)的外源多核苷酸的相应生物或其部分按重量计高至少0.5%(w/w)和/或在相对的基础上高至少1%(w/w)。
在又一个实施方案中，所述转基因非人生物或其部分进一步包含一个或多个引入的突变，和/或包含下调所述非人转基因生物或其部分的内源酶的产生和/或活性的外源多核苷酸，所述内源酶选自DGAT、sn-1 GPAT、1-酰基-甘油-3-磷酸酰基转移酶(LPAAT)、酰基辅酶A:溶血卵磷脂酰基转移酶(LPCAT)、磷脂酸磷酸酶(PAP)或它们中两种或更多种的组合。sn-1 GPAT可以为处于野生型状态时无可检测的磷酸酶活性的GPAT，例如GPAT1或GPAT3。GPAT1可具有SEQ ID NO:202所提供的氨基酸序列，或其同源物。GPAT3可具有SEQ ID NO:203所示的氨基酸序列，或其同源物。
所述外源多核苷酸可以(例如)选自：反义多核苷酸、有义多核苷酸、催化多核苷酸、微RNA、编码结合所述内源酶的多肽的多核苷酸，以及双链RNA。
另一方面，本发明提供生产提取的脂质的方法，该方法包括以下步骤：
i)获得包含外源单酰基甘油酰基转移酶(MGAT)的转基因光养生物或其部分，其中该转基因光养生物或其部分与不含所述外源MGAT的此种生物或其部分相比具有升高水平的非极性脂质，以及
ii)从转基因光养生物或其部分提取脂质，
从而产生提取的脂质。
在另一方面，本发明提供包含一种或多种外源多核苷酸的转基因非人生物或其部分，其中该转基因非人生物或其部分当与不含所述一种或多种外源多核苷酸的相应生物或其部分进行比较时具有升高水平的一种或多种非极性脂质。
在一个优选的实施方案中，该转基因非人生物或其部分的总脂质含量与相应的生物或其部分相比时是升高的。所述一种或多种脂质和/或总非极性脂质含量的升高程度可如特征(i)所定义。所述转基因非人生物或其部分可如特征(ii)所定义。所述非极性脂质可如特征(iii)所定义。所述转基因非人生物或其部分可通过特征(i)、(ii)和(iii)，或特征(i)和(ii)，或特征(i)和(iii)的组合所定义。
在一个实施方案中，所述转基因非人生物或其部分的所述一种或多种非极性脂质的水平比相应的生物或其部分按重量计高至少0.5%(w/w)和/或在相对的基础上高至少1%(w/w)，或进一步如特征(i)所定义。
在进一步的实施方案中，所述转基因非人生物或其部分的所述总非极性脂质含量比相应的非人生物或其部分按重量计高至少0.5%(w/w)和/或在相对的基础上高至少1%(w/w)，或进一步如特征(i)所定义。
在一个实施方案中，所述转基因非人生物或其部分或由其提取的脂质的PUFA含量与相应的生物或其部分或由其提取的脂质相比时是升高的。PUFA含量的升高程度可以如特征(i)所定义。
在另一个实施方案中，所述转基因非人生物或其部分或由其提取的脂质中的PUFA的水平与相应的生物或其部分或由其提取的脂质相比时是升高的。PUFA的升高程度可以如特征(i)所定义。
在进一步的实施方案中，所述转基因生物或其部分的所述一种或多种非极性脂质水平和/或总非极性脂质含量比不含所述一种或多种外源多核苷酸但包含编码拟南芥DGAT1的外源多核苷酸的相应生物或其部分按重量计高至少0.5%(w/w)和/或在相对的基础上高至少1%(w/w)。
在一个实施方案中，所述转基因非人生物为植物、藻类或适合发酵的生物诸如酵母或真菌。植物可如特征(ii)所定义。
本发明还提供包含编码以下物质的一种或多种外源多核苷酸的转基因非人生物：
i)MGAT，
ii)DGAT2
iii)MGAT和GPAT
iv)MGAT和DGAT，或
v)MGAT、GPAT和DGAT。
所述转基因非人生物的特征可进一步在于本文所定义的一个或多个特征。所述一种或多种外源多核苷酸可包含如上所定义的序列。
在另一方面，本发明提供获得产生一种或多种非极性脂质的能力增强的细胞的方法，该方法包括
i)向细胞引入编码以下物质的一种或多种外源多核苷酸
a)MGAT，
b)DGAT2
c)MGAT和GPAT
d)MGAT和DGAT，或
e)MGAT、GPAT和DGAT
其中所述一种或多种外源多核苷酸可操作地连接至一种或多种能够指导所述一种或多种外源多核苷酸在细胞中表达的启动子，
ii)在细胞中表达所述一种或多种外源多核苷酸，
iii)分析细胞的脂质含量，以及
iv)选择当与不含所述外源多核苷酸的相应细胞相比时具有升高水平的一种或多种非极性脂质的细胞。
在一个优选的实施方案中，所选细胞的总脂质含量与相应细胞相比时是升高的。
在一个实施方案中，所选细胞的所述一种或多种非极性脂质和/或总非极性脂质含量比相应的细胞按重量计高至少0.5%(w/w)和/或在相对的基础上高至少1%(w/w)，或进一步如特征(i)所定义。
在另一个实施方案中，所选细胞的PUFA含量与相应细胞相比时是升高的。PUFA含量的升高程度可以如特征(i)所定义。
在另一个实施方案中，所选细胞中PUFA的水平与相应细胞相比时是升高的。PUFA的升高程度可以如特征(i)所定义。
在该方面，所述一种或多种外源多核苷酸可包含如上所定义的序列。进一步地，所述一种或多种外源多核苷酸在本方法前可能并不清楚是否编码MGAT、DGAT2、MGAT和GPAT、MGAT和DGAT、或MGAT、GPAT以及DGAT，但相反可以为它们的候选物。因此，本方法可用作一种测定法以鉴定或选择编码MGAT、DGAT2、MGAT和GPAT(优选地，也具有磷酸酶活性的GPAT)、MGAT和DGAT、或MGAT、GPAT(优选地，也具有磷酸酶活性的GPAT)以及DGA的多核苷酸。
GPAT的表达在GPAT也具有磷酸酶活性时可导致细胞中的MAG水平升高，MGAT的表达可导致细胞中的DAG水平升高，而DGAT的表达可导致细胞中的TAG水平的升高。MGAT的表达在MGAT也具有DGAT活性时还可导致细胞中的TAG水平升高。MGAT和DGAT的表达可导致细胞中的DAG和/或TAG水平升高。MGAT和GPAT的表达可导致细胞中的MAG(如果GPAT也具有磷酸酶活性)和/或DAG水平升高。MGAT和GPAT的表达在MGAT也具有DGAT活性时还可导致细胞中的TAG水平升高。MGAT、GPAT和DGAT的表达可导致细胞中的MAG(如果GPAT也具有磷酸酶活性)和/或DAG和/或TAG水平升高。
在一个实施方案中，所选的细胞为根据本发明的细胞。
在一个实施方案中，所述外源多核苷酸稳定整合到细胞基因组中。
本方法可进一步包括从细胞再生转基因生物和/或从细胞获得子代(例如获得种子)的步骤，这些步骤可在步骤i)之后的任何时间点进行。
在一个备选实施方案中，所述外源多核苷酸在细胞中瞬时表达。
在另一方面，本发明提供使用本发明的方法获得的转基因细胞或植物，或其子代。
在另一方面，本发明提供编码以下物质的一种或多种外源多核苷酸
i)MGAT，
ii)DGAT2
iii)MGAT和GPAT
iv)MGAT和DGAT，或
v)MGAT、GPAT和DGAT，
用于产生当与不含所述一种或多种外源多核苷酸的相应生物或其部分相比时具有增强的产生一种或多种非极性脂质的能力的转基因非人生物或其部分的用途。能力的增强程度可以如特征(i)所定义。所述转基因非人生物或其部分可如特征(ii)所定义，或可通过特征(i)、(ii)和(iii)，或特征(i)和(ii)，或特征(i)和(iii)的组合所定义。所述一种或多种外源多核苷酸可包含如上所定义的序列。
在另一方面，本发明提供植物的转基因种子，该种子包含一种或多种外源多核苷酸并与不含所述外源多核苷酸的相应种子相比具有升高的一种或多种非极性脂质水平和/或总非极性脂质含量。升高的程度可以如特征(i)所定义。所述转基因种子可来自如特征(ii)所定义的属和/或种。所述转基因种子可通过特征(i)、(ii)和(iii)，或特征(i)和(ii)，或特征(i)和(iii)的组合所定义。所述一种或多种外源多核苷酸可包含如上所定义的序列。
在另一方面，本发明提供产生本发明的种子的转基因植物。所述转基因植物可以为例如芸苔属、陆地棉、亚麻、向日葵属、红花、大豆、玉米、拟南芥、两色高梁、高粱、燕麦、三叶草属、油棕、本氏烟、大麦、羽扇豆、亚洲栽培稻、光稃稻、亚麻荠、异源三倍体芒草奇岗或中国芒。
在另一方面，本发明提供生产种子的方法，该方法包括：
i)使本发明的转基因植物生长，以及
ii)收获种子。
在另一方面，本发明提供发酵方法，包括以下步骤：
i)提供含有液体组合物的容器以及发酵和脂肪酸生物合成所需的成分，所述液体组合物包含适合发酵的本发明的转基因非人生物，以及
ii)提供有利于所述容器中所含的所述液体组合物发酵的条件。
在另一方面，本发明提供可通过本发明的方法、本发明的转基因非人生物、本发明的转基因细胞、本发明的转基因植物或本发明的转基因种子获得的提取的脂质。该可提取脂质具有升高的TAG含量、DAG含量、TAG和DAG含量、MAG含量、PUFA含量、或具体PUFA含量和/或总非极性脂质含量。在一个优选的实施方案中，MAG为2-MAG。TAG含量、DAG含量、TAG和DAG含量、MAG含量、PUFA含量、具体PUFA含量和/或总非极性脂质含量的升高程度可如特征(i)所定义。
本发明还提供所含的DAG含量按总提取脂质的重量计为至少1%(w/w)或至少2%(w/w)的提取脂质。优选地，提取脂质还包含可检测水平的MAG。在一个实施方案中，提取脂质为油菜、玉米、大豆、羽扇豆、花生、向日葵、棉花、红花或亚麻油。脂质可以包含可检测水平的芥酸、环丙烯脂肪酸(CPFA)和/或硫代葡糖苷。
本发明还提供本发明的转基因非人生物或其部分、本发明的转基因细胞、本发明的转基因植物、本发明的转基因种子或本发明的提取脂质的用途，以制造工业产品。该工业产品可以(例如)为燃料。燃料可包含最低水平的根据本发明的提取脂质，诸如至少10%、至少20%或至少30%(w/w)。
在另一方面，本发明提供生产燃料的方法，该方法包括：
i)任选地在存在催化剂的情况下使本发明的脂质与醇反应以产生烷基酯，以及
ii)任选地将烷基酯与基于石油的燃料共混。
在一个实施方案中，烷基酯为甲酯。本方法生产的燃料可包含最低水平的本发明的脂质，诸如至少10%、至少20%或至少30%(w/w)。
在另一方面，本发明提供生产饲料的方法，该方法包括将本发明的转基因非人生物或其部分、本发明的转基因细胞、本发明的转基因植物、本发明的转基因种子、或本发明的提取脂质、或其提取物或部分与至少一种其他食物成分混合。
在另一方面，本发明提供饲料、化妆品或化学品，它们包含本发明的转基因非人生物或其部分、本发明的转基因细胞、本发明的转基因植物、本发明的转基因种子、或本发明的提取脂质、或其提取物或部分。
在另一方面，本发明提供鉴定以下核酸分子的方法，该核酸分子编码在细胞中产生MAG、DAG和/或TAG的能力升高的酰基转移酶，该方法包括：
i)获得包含可操作地连接到在细胞中具有活性的启动子的核酸分子的细胞，其中该核酸分子包含如本文所定义的核苷酸序列和/或编码具有SEQID NO:220、221、222、223、224、225、226和227所提供的一种或多种氨基酸序列或与其至少50%、优选至少60%、更优选至少65%相同的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列，
ii)确定在细胞中产生的MAG、DAG和/或TAG的水平当与不含所述核酸的相应细胞相比时是否是升高的，以及
iii)鉴定编码在细胞中产生MAG、DAG和/或TAG的能力升高的酰基转移酶的核酸分子。
在一个实施方案中，该核酸分子包含编码SEQ ID NO:220、221、222、223和224所提供的一种或多种保守DGAT2和/或MGAT1/2氨基酸序列的核苷酸序列。在一个优选的实施方案中，该核酸分子包含编码SEQ ID NO:220和/或SEQ ID NO:224所提供的保守氨基酸序列的核苷酸序列。在另一个或附加的实施方案中，该核酸分子包含编码SEQ ID NO:225、226和227所提供的一种或多种保守GPAT氨基酸序列，或与其至少50%、优选至少60%、更优选至少65%相同的氨基酸序列的核苷酸序列。
在一个实施方案中，本方法用于鉴定具有增强的产生DAG和/或TAG的能力的MGAT。
在另一个实施方案中，本方法用于鉴定具有磷酸酶活性和增强的产生MAG的能力的GPAT。在一个优选的实施方案中，本方法用于鉴定具有磷酸酶活性和增强的产生2-MAG的能力的sn-2 GPAT。
在另一个实施方案中，本方法用于鉴定一起具有增强的产生MAG和/或DAG和/或TAG(优选TAG)的能力的MGAT和GPAT。在一个优选的实施方案中，本方法用于鉴定具有产生2-MAG的磷酸酶活性并与MGAT一起具有增强的产生sn-1,2/2,3 DAG和/或TAG的能力的sn-2 GPAT。
在另一个实施方案中，本方法用于鉴定具有增强的产生TAG的能力的DGAT。
在另一个实施方案中，本方法用于鉴定一起具有增强的产生DAG和/或TAG(优选TAG)的能力的MGAT和DGAT。
在另一个实施方案中，本方法用于鉴定一起具有增强的产MAG和/或DAG和/或TAG(优选TAG)的能力的MGAT、GPAT和DGAT。在一个优选的实施方案中，GPAT具有磷酸酶活性以产生MAG。在一个进一步优选的实施方案中，GPAT为具有产生2-MAG的磷酸酶活性的sn-2 GPAT。
在一个实施方案中，本方法进一步包括在步骤i)前向细胞中引入核酸分子。
在另一个实施方案中，本发明进一步包括由步骤i)的细胞再生转基因植物以及任选地从转基因植物获得种子的步骤。在一个实施方案中，该细胞为植物细胞。产生MAG和/或DAG和/或TAG的能力的升高程度可如特征(i)所定义。在一个优选的实施方案中，MAG为2-MAG。细胞可来自如特征(ii)所定义的属和/或种。细胞可通过特征(i)、(ii)和(iii)，或特征(i)和(ii)，或特征(i)和(iii)的组合所定义。
在另一个实施方案中，MGAT和/或GPAT和/或DGAT在细胞中提高TAG的产生的量高于拟南芥DGAT1(SEQ ID NO:83)。
在另一方面，本发明提供分离的和/或重组的多核苷酸，其包含：
i)选自SEQ ID NO:1至6任一者的核苷酸序列，
或
ii)与i)至少80%相同的核苷酸序列。
在另一方面，本发明提供包含本发明的多核苷酸的载体。
在另一方面，本发明提供包含本发明的多核苷酸或本发明的载体的转基因细胞。
在另一方面，本发明提供包含本发明的多核苷酸、本发明的载体或本发明的转基因细胞的转基因非人生物或其部分。在一个实施方案中，所述转基因生物为植物、藻类或适合发酵的生物诸如酵母或真菌。在另一个实施方案中，所述部分为植物的种子、果实、块茎、根或营养部分。
本领域技术人员将会认识到，在不脱离广义描述的本发明范围的情况下，可以对具体实施方案中所示的发明进行多种变型和/或修改。因此，本实施方案在所有方面都应视为示例性而非限制性的。本文所述的每个实施方案加以必要的变通将适用于各个其他实施方案，除非另外特别说明。
在本说明书全文中，词语“包含”或变型形式诸如“包括”或“含有”将被理解为意在包含所述的要素、整数或步骤，或要素、整数或步骤的群组，但不排除任何其他要素、整数或步骤，或要素、整数或步骤的群组。
术语“和/或”例如“X和/或Y”应被理解为表示“X和Y”或“X或Y”，并且应当用来明确支持两种含义或任一种含义。
附图简述
图1.各种脂质合成途径的图示，它们中的大多数均在DAG处汇合，DAG是脂质合成中的中心分子。该模型包括一条形成sn-2 MAG的可能路线，而sn-2 MAG可被双官能MGAT/DGAT用于由甘油-3-磷酸(G-3-P)形成DAG。缩写如下：
G-3-P：甘油-3-磷酸
LysoPA：溶血磷脂酸
PA：磷脂酸
MAG：单酰基甘油
DAG：二酰基甘油
TAG：三酰基甘油
酰基-CoA和FA-CoA：酰基辅酶A和脂肪酰基辅酶A
PC：磷脂酰胆碱
GPAT：甘油-3-磷酸酰基转移酶；甘油-3-磷酸O-酰基转移酶；酰基辅酶A:sn-甘油-3-磷酸1-O-酰基转移酶；EC 2.3.1.15
GPAT4：甘油-3-磷酸酰基转移酶4
GPAT6：甘油-3-磷酸酰基转移酶6
LPAAT：1-酰基-甘油-3-磷酸酰基转移酶；1-酰基甘油-3-磷酸O-酰基转移酶；酰基辅酶A:1-酰基-sn-甘油-3-磷酸2-O-酰基转移酶；EC 2.3.1.51
PAP：磷脂酸磷酸酶；磷脂酸磷酸酯酶；磷脂酸磷酸水解酶；磷脂酸磷酸酶；EC 3.1.3.4
MGAT：一种具有单酰基甘油酰基转移酶(MGAT；2-酰基甘油O-酰基转移酶酰基辅酶A:2-酰基甘油O-酰基转移酶；EC 2.3.1.22)活性的酰基转移酶
M/DGAT：一种具有单酰基甘油酰基转移酶(MGAT；2-酰基甘油O-酰基转移酶；酰基辅酶A:2-酰基甘油O-酰基转移酶；EC 2.3.1.22)和/或二酰基甘油酰基转移酶(DGAT；二酰基甘油O-酰基转移酶；酰基辅酶A:1,2-二酰基-sn-甘油O-酰基转移酶；EC 2.3.1.20)活性的酰基转移酶
LPCAT：酰基辅酶A:溶血卵磷脂酰基转移酶；1-酰基甘油磷酸胆碱O-酰基转移酶；酰基辅酶A:1-酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱O-酰基转移酶；EC2.3.1.23
PLD-Z：磷脂酶D zeta；胆碱磷酸酶；卵磷脂酶D；磷脂二酯酶II；EC3.1.4.4
CPT：CDP-胆碱:二酰基甘油胆碱磷酸转移酶；1-烷基-2-酰基甘油胆碱磷酸转移酶；烷基酰基甘油胆碱磷酸转移酶；胆碱磷酸转移酶；磷酰胆碱甘油酯转移酶；EC 2.7.8.2
PDCT：磷脂酰胆碱:二酰基甘油胆碱磷酸转移酶
PLC：磷脂酶C；EC 3.1.4.3
PDAT：磷脂:二酰基甘油酰基转移酶；磷脂:1,2-二酰基-sn-甘油O-酰基转移酶；EC 2.3.1.158
Pi：无机磷酸盐
图2.在用编码p19(阴性对照)、拟南芥DGAT1、小家鼠(Mus musculus)MGAT1以及DGAT1与MGAT1的组合(每一者均由35S启动子表达)的构建体转化的本氏烟叶子组织中的相对DAG和TAG升高。在促进叶子组织中DAG和TAG两者的积聚方面，MGAT1酶远比DGAT1酶的活性高。与仅DGAT1的表达相比，MGAT1基因的表达导致了叶子组织中DAG和TAG的积聚达两倍之多。
图3.在用编码p19(阴性对照)、拟南芥DGAT1、小家鼠MGAT2以及MGAT2与DGAT1组合的构建体转化的本氏烟叶子组织中的相对TAG升高。误差条表示三个平行样品的标准误差。
图4.从供给sn-2-MAG[14C]和未标记油酸的瞬时转化的本氏烟叶子裂解物中分离的MAG、DAG和TAG级分随时间进程的放射性(DPM)。所用的构建体如图3所示。
图5.如图4所示，但供给[14C]G-3-P和未标记的油酸。
图6.TLC板的放射自显影图，显示了在酵母测定中通过拟南芥DGAT1和小家鼠MGAT1但非小家鼠MGAT2形成TAG。该测定如实施例5所述。
序列表的标注
SEQ ID NO:1小家鼠(Mus musculus)密码子优化的MGAT1
SEQ ID NO:2小家鼠密码子优化的MGAT2
SEQ ID NO:3玻璃海鞘(Ciona intestinalis)密码子优化的预测MGAT1
SEQ ID NO:4赤拟谷盗(Tribolium castaneum)密码子优化的预测MGAT1
SEQ ID NO:5斑马鱼(Danio rerio)密码子优化的MGAT1
SEQ ID NO:6斑马鱼密码子优化的MGAT2
SEQ ID NO:7小家鼠MGAT1多核苷酸(AF384162)
SEQ ID NO:8智人(Homo spaniens)MGAT1多核苷酸(AF384163)
SEQ ID NO:9黑猩猩(Pan troglodytes)预测MGAT1多核苷酸转录变体(XM_001166055)
SEQ ID NO:10黑猩猩预测MGAT1多核苷酸转录变体2(XM_0526044.2)
SEQ ID NO:11家犬(Canis familiaris)预测MGAT1多核苷酸(XM_545667.2)
SEQ ID NO:12家牛(Bos taurus)MGAT1多核苷酸(NM_001001153.2)
SEQ ID NO:13褐家鼠(Rattus norvegicus)MGAT1多核苷酸(NM_001108803.1)
SEQ ID NO:14斑马鱼MGAT1多核苷酸(NM_001122623.1)
SEQ ID NO:15秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)预测MGAT1多核苷酸(NM_073012.4)
SEQ ID NO:16秀丽隐杆线虫预测MGAT1多核苷酸(NM_182380.5)
SEQ ID NO:17秀丽隐杆线虫预测MGAT1多核苷酸(NM_065258.3)
SEQ ID NO:18秀丽隐杆线虫预测MGAT1多核苷酸(NM_075068.3)
SEQ ID NO:19秀丽隐杆线虫预测MGAT1多核苷酸(NM_072248.3)
SEQ ID NO:20乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)预测MGAT1多核苷酸(XM_455588.1)
SEQ ID NO:21棉阿舒囊霉(Ashbya gossypii)预测MGAT1多核苷酸(NM_208895.1)
SEQ ID NO:22稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)预测MGAT1多核苷酸(XM_368741.1)
SEQ ID NO:23玻璃海鞘预测MGAT1多核苷酸(XM_002120843.1)
SEQ ID NO:24小家鼠MGAT2多核苷酸(AY157609)
SEQ ID NO:25智人MGAT2多核苷酸(AY157608)
SEQ ID NO:26黑猩猩预测MGAT2多核苷酸(XM_522112.2)
SEQ ID NO:27家犬预测MGAT2多核苷酸(XM_542304.1)
SEQ ID NO:28家牛MGAT2多核苷酸(NM_001099136.1)
SEQ ID NO:29褐家鼠MGAT2多核苷酸(NM_001109436.2)
SEQ ID NO:30红原鸡(Gallus gallus)预测MGAT2多核苷酸(XM_424082.2)
SEQ ID NO:31斑马鱼MGAT2多核苷酸(NM_001006083.1)
SEQ ID NO:32黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)MGAT2多核苷酸(NM_136474.2)
SEQ ID NO:33黑腹果蝇MGAT2多核苷酸(NM_136473.2)
SEQ ID NO:34黑腹果蝇MGAT2多核苷酸(NM_136475.2)
SEQ ID NO:35冈比亚按蚊(Anopheles gambiae)MGAT2多核苷酸(XM_001688709.1)
SEQ ID NO:36冈比亚按蚊MGAT2多核苷酸(XM_315985)
SEQ ID NO:37赤拟谷盗预测MGAT2多核苷酸(XM_970053.1)
SEQ ID NO:38智人MGAT3多核苷酸(AY229854)
SEQ ID NO:39黑猩猩预测MGAT3多核苷酸转录变体1(XM_001154107.1)
SEQ ID NO:40黑猩猩预测MGAT3多核苷酸转录变体2(XM_001154171.1)
SEQ ID NO:41黑猩猩预测MGAT3多核苷酸转录变体3(XM_527842.2)
SEQ ID NO:42家犬预测MGAT3多核苷酸(XM_845212.1)
SEQ ID NO:43家牛预测MGAT3多核苷酸(XM_870406.4)
SEQ ID NO:44斑马鱼预测MGAT3多核苷酸(XM_688413.4)
SEQ ID NO:45小家鼠MGAT1多肽(AAK84177.1)
SEQ ID NO:46智人MGAT1多肽(AAK84178.1)
SEQ ID NO:47黑猩猩预测MGAT1多肽同种型1(XP_001166055.1)
SEQ ID NO:48黑猩猩预测MGAT1多肽同种型2(XP_526044.2)
SEQ ID NO:49家犬预测MGAT1多肽(XP_545667.2)
SEQ ID NO:50家牛MGAT1多肽(NP_001001153.1)
SEQ ID NO:51褐家鼠MGAT1多肽(NP_001102273.1)
SEQ ID NO:52斑马鱼MGAT1多肽(NP_001116095.1)
SEQ ID NO:53秀丽隐杆线虫预测MGAT1多肽(NP_505413.1)
SEQ ID NO:54秀丽隐杆线虫预测MGAT1多肽(NP_872180.1)
SEQ ID NO:55秀丽隐杆线虫预测MGAT1多肽(NP_497659.1)
SEQ ID NO:56秀丽隐杆线虫预测MGAT1多肽(NP_507469.1)
SEQ ID NO:57秀丽隐杆线虫预测MGAT1多肽(NP_504649.1)
SEQ ID NO:58乳酸克鲁维酵母预测MGAT1多肽(XP_455588.1)
SEQ ID NO:59棉阿舒囊霉预测MGAT1多肽(NP_983542.1)
SEQ ID NO:60稻瘟病菌预测MGAT1多肽(XP_368741.1)
SEQ ID NO:61玻璃海鞘预测MGAT1多肽(XP_002120879)
SEQ ID NO:62小家鼠MGAT2多肽(AA023673.1)
SEQ ID NO:63智人MGAT2多肽(AA023672.1)
SEQ ID NO:64黑猩猩预测MGAT2多肽(XP_522112.2)
SEQ ID NO:65家犬预测MGAT2多肽(XP_542304.1)
SEQ ID NO:66家牛MGAT2多肽(NP_001092606.1)
SEQ ID NO:67褐家鼠MGAT2多肽(NP_001102906.2)
SEQ ID NO:68红原鸡预测MGAT2多肽(XP_424082.2)
SEQ ID NO:69斑马鱼MGAT2多肽(NP_001006083.1)
SEQ ID NO:70黑腹果蝇MGAT2多肽(NP_610318.1)
SEQ ID NO:71黑腹果蝇MGAT2多肽(NP_610317.1)
SEQ ID NO:72黑腹果蝇MGAT2多肽(NP_610319.2)
SEQ ID NO:73冈比亚按蚊MGAT2多肽(XP_001688761)
SEQ ID NO:74冈比亚按蚊MGAT2多肽(XP_315985.3)
SEQ ID NO:75赤拟谷盗预测MGAT2多肽(XP_975146)
SEQ ID NO:76智人MGAT3多肽(AA063579.1)
SEQ ID NO:77黑猩猩预测MGAT3多肽同种型1(XP_001154107.1)
SEQ ID NO:78黑猩猩预测MGAT3多肽同种型2(XP_001154171.1)
SEQ ID NO:79黑猩猩预测MGAT3同种型3(XP_527842.2)
SEQ ID NO:80家犬预测MGAT3多肽(XP_850305.1)
SEQ ID NO:81家牛预测MGAT3多肽(XP_875499.3)
SEQ ID NO:82斑马鱼预测MGAT3多肽(XP_693505.1)
SEQ ID NO:83拟南芥DGAT1多肽(CAB44774.1)
SEQ ID NO:84拟南芥GPAT4多核苷酸(NM_100043.4)
SEQ ID NO:85拟南芥GPAT6多核苷酸(NM_129367.3)
SEQ ID NO:86拟南芥BAC F5I10多核苷酸(AF195115.1)
SEQ ID NO:87拟南芥未知蛋白多核苷酸(AY062466.1)
SEQ ID NO:88亚洲栽培稻染色体3多核苷酸(AC118133.4)
SEQ ID NO:89北美云杉(Picea sitchensis)克隆WS0276_F13多核苷酸(EF086095.1)
SEQ ID NO:90玉米克隆ZM_BFc0110A1多核苷酸(BT067649.1)
SEQ ID NO:91拟南芥克隆RAFL16-19-H05多核苷酸(AK228870.1)
SEQ ID NO:92亚洲栽培稻克隆J065058J01多核苷酸(AK241033.1)
SEQ ID NO:93亚洲栽培稻染色体2多核苷酸(CM000127.1)
SEQ ID NO:94亚洲栽培稻染色体5多核苷酸(CM000130.1)
SEQ ID NO:95亚洲栽培稻染色体2多核苷酸(CM000139.1)
SEQ ID NO:96亚洲栽培稻染色体1多核苷酸(CM000126.1)
SEQ ID NO:97亚洲栽培稻染色体3多核苷酸(CM000128.1)
SEQ ID NO:98亚洲栽培稻染色体3多核苷酸(CM000140.1)
SEQ ID NO:99江南卷柏(Selaginella moellendorffii)SELMOscaffold_102多核苷酸(GL377667.1)
SEQ ID NO:100江南卷柏SELMOscaffold_102多核苷酸(GL377667.1)
SEQ ID NO:101江南卷柏SELMOscaffold_83多核苷酸(GL377648.1)
SEQ ID NO:102江南卷柏SELMOscaffold_57多核苷酸(GL377622.1)
SEQ ID NO:103江南卷柏SELMOscaffold_25多核苷酸(GL377590.1)
SEQ ID NO:104江南卷柏SELMOscaffold_11多核苷酸(GL377576.1)
SEQ ID NO:105江南卷柏SELMOscaffold_11多核苷酸(GL377576.1)
SEQ ID NO:106亚洲栽培稻Os01g0855000多核苷酸(NM_001051374.2)
SEQ ID NO:107亚洲栽培稻Os02g0114400多核苷酸(NM_001052203.1)
SEQ ID NO:108：玉米GPAT8多核苷酸(NM_001153970.1)
SEQ ID NO:109：玉米LOC100282930多核苷酸(NM_001155835.1)
SEQ ID NO:110：玉米LOC100382119多核苷酸(NM_001174880.1)
SEQ ID NO:111拟南芥GPAT6多核苷酸(NM_129367.3)
SEQ ID NO:112拟南芥GPAT8多核苷酸(NM_116264.5)
SEQ ID NO:113小立碗藓(Physcomitrella patens)预测蛋白(PHYPADRAFT_128739)多核苷酸(XM_001764949.1)
SEQ ID NO:114小立碗藓预测蛋白(PHYPADRAFT_83824)多核苷酸(XM_001769619.1)
SEQ ID NO:115小立碗藓预测蛋白(PHYPADRAFT_188308)多核苷酸(XM_001769672.1)
SEQ ID NO:116小立碗藓预测蛋白(PHYPADRAFT_189499)多核苷酸(XM_001771134.1)
SEQ ID NO:117小立碗藓预测蛋白(PHYPADRAFT_95487)多核苷酸(XM_001780481.1)
SEQ ID NO:118葡萄(Vitis Vinifera)预测蛋白LOG100243321多核苷酸(XM_002268477.1)
SEQ ID NO:119葡萄预测蛋白LOC100243093多核苷酸(XM_002275312.1)
SEQ ID NO:120葡萄预测蛋白LOC100259433多核苷酸(XM_002275996.1)
SEQ ID NO:121葡萄预测蛋白LOC100264832多核苷酸(XM_002279055.1)
SEQ ID NO:122毛果杨(Populus trichocarpa)预测蛋白多核苷酸(XM_002309088.1)
SEQ ID NO:123毛果杨预测蛋白多核苷酸(XM_002309240.1)
SEQ ID NO:124毛果杨预测蛋白多核苷酸(XM_002322716.1)
SEQ ID NO:125毛果杨预测蛋白多核苷酸(XM_002323527.1)
SEQ ID NO:126两色高梁蛋白多核苷酸(XM_002439842.1)
SEQ ID NO:127两色高梁蛋白多核苷酸(XM_002458741.1)
SEQ ID NO:128两色高梁蛋白多核苷酸(XM_002463871.1)
SEQ ID NO:129两色高梁蛋白多核苷酸(XM_002464585.1)
SEQ ID NO:130蓖麻(Ricinus communis)ER甘油磷酸酰基转移酶多核苷酸(XM_002511827.1)
SEQ ID NO:131蓖麻ER甘油磷酸酰基转移酶多核苷酸(XM_002517392.1)
SEQ ID NO:132蓖麻ER甘油磷酸酰基转移酶多核苷酸(XM_002520125.1)
SEQ ID NO:133琴叶拟南芥(Arabidopsis lyrata)磷脂/甘油酰基转移酶家族蛋白多核苷酸(XM_002872909.1)
SEQ ID NO:134琴叶拟南芥GPAT6多核苷酸(XM_002881518.1)
SEQ ID NO135油桐(Vernicia fordii)推定GPAT8多核苷酸(FJ479753.1)
SEQ ID NO136亚洲栽培稻Os03g0735900多核苷酸(NM_001057724.1)
SEQ ID NO137拟南芥GPAT4多核苷酸(NM_100043.4)
SEQ ID NO138毛果杨预测蛋白多核苷酸(XM_002320102.1)
SEQ ID NO:139两色高梁蛋白多核苷酸(XM_002451332.1)
SEQ ID NO:140蓖麻ER甘油磷酸酰基转移酶多核苷酸(XM_002531304.1)
SEQ ID NO:141琴叶拟南芥GPAT4多核苷酸(XM_002889315.1)
SEQ ID NO:142拟南芥GPAT1多核苷酸(NM_100531.2)
SEQ ID NO143拟南芥GPAT3多核苷酸(NM_116426.2)
SEQ ID NO:144拟南芥GPAT4多肽(NP_171667.1)
SEQ ID NO:145拟南芥GPAT6多肽(NP_181346.1)
SEQ ID NO:146拟南芥F5I10.4基因产物多肽(AAF02784.1)
SEQ ID NO:147拟南芥未知蛋白多肽(AAL32544.1)
SEQ ID NO:148亚洲栽培稻蛋白多肽(AAP03413.1)
SEQ ID NO:149北美云杉未知多肽(ABK25381.1)
SEQ ID NO:150玉米未知多肽(ACN34546.1)
SEQ NO ID:151拟南芥预测蛋白多肽(BAF00762.1)
SEQ ID NO:152亚洲栽培稻未命名蛋白产物多肽(BAH00933.1)
SEQ ID NO:153亚洲栽培稻预测蛋白Osl_05566多肽(EAY84189.1)
SEQ ID NO:154亚洲栽培稻预测蛋白Osl_20155多肽(EAY98245.1)
SEQ ID NO:155亚洲栽培稻预测蛋白OsJ_05094多肽(EAZ21484.1)
SEQ ID NO:156亚洲栽培稻预测蛋白Osl_04478多肽(EEC71826.1)
SEQ ID NO:157亚洲栽培稻预测蛋白Osl_13423多肽(EEC76137.1)
SEQ ID NO:158亚洲栽培稻预测蛋白OsJ_12482多肽(EEE59882.1)
SEQ ID NO:159江南卷柏预测蛋白SELMODRAFT_269600多肽(EFJ08963.1)
SEQ ID NO:160江南卷柏预测蛋白SELMODRAFT_184962多肽(EFJ08964.1)
SEQ ID NO:161江南卷柏预测蛋白SELMODRAFT_235331多肽(EFJ11200.1)
SEQ ID NO:162江南卷柏预测蛋白SELMODRAFT_118155多肽(EFJ15664.1)
SEQ ID NO:163江南卷柏预测蛋白SELMODRAFT_102257多肽(EFJ24086.1)
SEQ ID NO:164江南卷柏预测蛋白SELMODRAFT_170164多肽(EFJ29816.1)
SEQ ID NO:165江南卷柏预测蛋白SELMODRAFT_170165多肽(EFJ29817.1)
SEQ ID NO:166亚洲栽培稻Os01g0855000多肽(NP_001044839.1)
SEQ ID NO:167亚洲栽培稻Os02g0114400多肽(NP_001045668.1)
SEQ ID NO:168玉米GPAT8多肽(NP_001147442.1)
SEQ ID NO:169玉米LOC100282930多肽(NP_001149307.1)
SEQ ID NO:170玉米蛋白LOC100382119多肽(NP_001168351.1)
SEQ ID NO:171拟南芥GPAT6多肽(NP_181346.1)
SEQ ID NO:172拟南芥GPAT8多肽(NP_191950.2)
SEQ ID NO:173小立碗藓蛋白多肽(XP_001765001.1)
SEQ ID NO:174小立碗藓蛋白多肽(XP_001769671.1)
SEQ ID NO:175小立碗藓蛋白多肽(XP_001769724.1)
SEQ ID NO:176小立碗藓蛋白多肽(XP_001771186.1)
SEQ ID NO:177小立碗藓蛋白多肽(XP_001780533.1)
SEQ ID NO:178葡萄蛋白多肽(XP_002268513.1)
SEQ ID NO:179葡萄蛋白多肽(XP_002275348.1)
SEQ ID NO:180葡萄蛋白多肽(XP_002276032.1)
SEQ ID NO:181葡萄蛋白多肽(XP_002279091.1)
SEQ ID NO:182毛果杨蛋白多肽(XP_002309124.1)
SEQ ID NO:183毛果杨蛋白多肽(XP_002309276.1)
SEQ ID NO:184毛果杨蛋白多肽(XP_002322752.1)
SEQ ID NO:185毛果杨蛋白多肽(XP_002323563.1)
SEQ ID NO:186两色高梁蛋白SORBIDRAFT_09g022020多肽(XP_002439887.1)
SEQ ID NO:187两色高梁蛋白SORBIDRAFT_03g040260多肽(XP_002458786.1)
SEQ ID NO:188两色高梁蛋白SORBIDRAFT_01g008880多肽(XP_002463916.1)
SEQ ID NO:189两色高梁蛋白SORBIDRAFT_01g022140多肽(XP_002464630.1)
SEQ ID NO:190蓖麻ER甘油磷酸酰基转移酶多肽(XP_002511873.1)
SEQ ID NO:191蓖麻ER甘油磷酸酰基转移酶多肽(XP_002517438.1)
SEQ ID NO:192蓖麻ER甘油磷酸酰基转移酶多肽(XP_002520171.1)
SEQ ID NO:193琴叶拟南芥磷脂/甘油酰基转移酶家族蛋白多肽(XP_002872955.1)
SEQ ID NO:194琴叶拟南芥GPAT6多肽(XP_002881564.1)
SEQ ID NO:195油桐推定GPAT多肽(ACT32032.1)
SEQ ID NO:196亚洲栽培稻Os03g0735900多肽(NP_001051189.1)
SEQ ID NO:197拟南芥GPAT4多肽(NP_171667.1)
SEQ ID NO:198毛果杨蛋白多肽(XP_002320138.1)
SEQ ID NO:199两色高梁蛋白SORBIDRAFT_04g001060多肽(XP_002451377.1)
SEQ ID NO:200蓖麻ER甘油磷酸酰基转移酶多肽(XP_002531350.1)
SEQ ID NO:201琴叶拟南芥GPAT4多肽(XP_002889361.1)
SEQ ID NO:202拟南芥GPAT1多肽(NP_563768.1)
SEQ ID NO:203拟南芥GPAT3多肽(NP_192104.1)
SEQ ID NO:204拟南芥DGAT2多核苷酸(NM_115011.3)
SEQ ID NO:205蓖麻DGAT2多核苷酸(AY916129.1)
SEQ ID NO:206油桐DGAT2多核苷酸(DQ356682.1)
SEQ ID NO:207拉曼被孢霉(Mortierella ramanniana)DGAT2多核苷酸(AF391089.1)
SEQ ID NO:208智人DGAT2多核苷酸(NM_032564.1)
SEQ ID NO:209智人DGAT2多核苷酸(NM_001013579.2)
SEQ ID NO:210家牛DGAT2多核苷酸(NM_205793.2)
SEQ ID NO:211小家鼠DGAT2多核苷酸(AF384160.1)
SEQ ID NO:212拟南芥DGAT2多肽(NP_566952.1)
SEQ ID NO:213蓖麻DGAT2多肽(AAY16324.1)
SEQ ID NO:214油桐DGAT2多肽(ABC94474.1)
SEQ ID NO:215拉曼被孢霉DGAT2多肽(AAK84179.1)
SEQ ID NO:216智人DGAT2多肽(Q96PD7.2)
SEQ ID NO:217智人DGAT2多肽(Q58HT5.1)
SEQ ID NO:218家牛DGAT2多肽(Q70VZ8.1)
SEQ ID NO:219小家鼠DGAT2多肽(AAK84175.1)
SEQ ID NO:220YFP三肽保守DGAT2和/或MGAT1/2序列基序
SEQ ID NO:221HPHG四肽保守DGAT2和/或MGAT1/2序列基序
SEQ ID NO:222EPHS四肽保守植物DGAT2序列基序
SEQ ID NO:223作为推定甘油磷脂结构域一部分的DGAT2的RXGFX(K/R)XAXXXGXXX(L/V)VPXXXFG(E/Q)长保守序列基序
SEQ ID NO:224作为推定中性脂质结合结构域的小鼠DGAT2和MGAT 1/2的FLXLXXXN保守序列基序
SEQ ID NO:225GPAT的plsC酰基转移酶结构域(PF01553)
SEQ ID NO:226GPAT的HAD样水解酶(PF12710)超家族结构域
SEQ ID NO:227磷酸丝氨酸磷酸酶结构域(PF00702).GPAT4-8包含与此结构域同源的N端区域
SEQ ID NO:228保守GPAT氨基酸序列GDLVICPEGTTCREP
SEQ ID NO:229保守GPAT/磷酸酶氨基酸序列(基序I)
SEQ ID NO:230保守GPAT/磷酸酶氨基酸序列(基序III)
发明详述
一般技术和定义
除非另外明确限定，否则本文所用的所有科技术语应采取本领域(如，细胞培养、分子遗传学、免疫学、免疫化学、蛋白化学、脂质和脂肪酸化学、生物燃料生产和生物化学领域)技术人员通常所理解的相同含义。
除非另外指明，否则本发明所用的重组蛋白、细胞培养和免疫学技术为本领域技术人员熟知的标准程序。此类技术在诸如以下文献资源中有所描述和解释：J.Perbal,A Practical Guide to Molecular Cloning,John Wiley andSons(1984),J.Sambrook等，Molecular Cloning:A Laboratory Manual,ColdSpring Harbour Laboratory Press(1989),T.A.Brown(编者),EssentialMolecular Biology:A Practical Approach,卷1和2,IRL Press(1991),D.M.Glover和B.D.Hames(编者),DNA Cloning:A Practical Approach,卷1-4,IRLPress(1995和1996),F.M.Ausubel等(编者),Current Protocols in MolecularBiology,Greene Pub.Associates and Wiley-Interscience(1988，包括到目前为止的所有更新),Ed Harlow和David Lane(编者)Antibodies:A LaboratoryManual,Cold Spring Harbour Laboratory,(1988),和J.E.Coligan等(编者)Current Protocols in Immunology,John Wiley&Sons(包括到目前为止的所有更新)。
所选的定义
术语“转基因非人生物”是指(例如)包含外源多核苷酸(转基因)或外源多肽的整个植物、藻类、非人动物或适合发酵的生物，诸如酵母或真菌。在一个实施方案中，转基因非人生物不是动物或其部分。在一个实施方案中，转基因非人生物是能够由阳光获得能量以合成有机化合物作为营养的光养生物(例如植物或藻类)。在另一个实施方案中，转基因非人生物为光合细菌。在多核苷酸或多肽背景下的术语“外源”是指当以与天然状态相比时改变的量存在于细胞中时的多核苷酸或多肽。在一个实施方案中，细胞是天然不含所述多核苷酸或多肽的细胞。在另一个实施方案中，外源多核苷酸或多肽来自不同的属。在另一个实施方案中，外源多核苷酸或多肽来自不同的种。在一个实施方案中，外源多核苷酸或多肽在寄主植物或植物细胞中表达，并且外源多核苷酸或多肽来自不同的种或属。在一个实施方案中，外源多肽为外源MGAT。如本文所用，术语“提取脂质”是指从包含至少60%(w/w)脂质的转基因生物或其部分中提取的组合物。
如本文所用，术语“非极性脂质”是指可溶于有机溶剂但不溶于水的脂肪酸及其衍生物。脂肪酸可以为游离脂肪酸和/或为酯化形式。酯化形式的实例包括但不限于三酰基甘油(TAG)、二酰基甘油(DAG)、单酰基甘油(MAG)。非极性脂质还包括甾醇、甾醇酯和蜡酯。非极性脂质也称为“中性脂质”。非极性脂质在室温下通常为液体。优选地，非极性脂质主要(>50%)包含长度为至少16个碳的脂肪酸。更优选地，非极性脂质中总脂肪酸的至少50%为C18脂肪酸，例如油酸。在一个实施方案中，本发明的非极性脂质中脂肪酸的至少50%、更优选至少70%、更优选至少80%、更优选至少90%、更优选至少91%、更优选至少92%、更优选至少93%、更优选至少94%、更优选至少95%、更优选至少96%、更优选至少97%、更优选至少98%、更优选至少99%可作为TAG存在。非极性脂质可(例如)通过用强碱水解以释放游离脂肪酸或通过分馏、蒸馏等方法进一步纯化或处理。本发明的非极性脂质如果通过种子获得则可形成“种子油”的一部分。非极性脂质可存在于或得自其他植物部分(包括叶子或果实)，得自重组细胞或非人生物，在此情况下，脂质不是如本文所定义的种子油。
提取脂质中的游离和酯化甾醇(例如，谷甾醇、菜油甾醇、豆甾醇、芸苔甾醇、D5-燕麦甾醇(D5-avenasterol)、谷甾烷醇(sitostanol)、菜油甾烷醇(campestanol)和胆固醇)浓度可如Phillips等，2002中所述。
如本文所用，术语“种子油”是指从包含至少60%(w/w)脂质的植物的种子/粮食获得的或者在种子油仍存在于种子/粮食中时可从种子/粮食获得的组合物。也就是说，本发明的种子油包括存在于种子/粮食或其部分中的种子油，以及已从种子/粮食中提取出来的种子油。种子油优选为提取的种子油。种子油在室温下通常为液体。优选地，种子油中的总脂肪酸(TFA)含量主要(>50%)包含长度为至少16个碳的脂肪酸。更优选地，种子油中的总脂肪酸的至少50%为C18脂肪酸，例如油酸。脂肪酸通常为酯化形式，诸如TAG、DAG、酰基辅酶A或磷脂。脂肪酸可以为游离脂肪酸和/或为酯化形式。在一个实施方案中，本发明的种子油中脂肪酸的至少50%、更优选至少70%、更优选至少80%、更优选至少90%、更优选至少91%、更优选至少92%、更优选至少93%、更优选至少94%、更优选至少95%、更优选至少96%、更优选至少97%、更优选至少98%、更优选至少99%可作为TAG存在。在一个实施方案中，本发明的种子油为已从在种子中或粗提取物中与其相关的一种或多种其他脂质、核酸、多肽或其他污染分子分离的“基本上纯化的”或“纯化的”油。优选的是，基本上纯化的种子油至少60%、更优选至少75%、更优选至少90%不含在种子或提取物中与其相关的其他组分。本发明的种子油可进一步包含非脂肪酸分子，诸如但不限于甾醇。在一个实施方案中，种子油为油菜油(甘蓝型油菜(Brassica napus)、白菜型油菜(Brassica rapa ssp.))、芥子油(芥菜(Brassica juncea))、其他芸苔属植物油(如芜青甘蓝(Brassica napobrassica)、Brassica camelina)、向日葵油(向日葵(Helianthus annus))、亚麻籽油(亚麻(Linum usitatissimum))、大豆油(大豆(Glycine max))、红花油(红花(Carthamus tinctorius))、玉米油(玉米(Zeamays))、烟草油(烟草(Nicotiana tabacum))、花生油(花生(Arachis hypogaea))、棕榈油(油棕(Elaeis guineensis))、棉花种子油(陆地棉(Gossypium hirsutum))、椰子油(椰子(Cocos nucifera))、鳄梨油(鳄梨(Persea americana))、橄榄油(橄榄(Olea europaea))、腰果油(腰果(Anacardium occidentale))、夏威夷果油(澳洲坚果(Macadamia intergrifolia))、杏仁油(杏仁(Prunus amygdalus))、燕麦种子油(燕麦(Avena sativa))、米油(亚洲栽培稻或光稃稻)或拟南芥种子油(拟南芥(Arabidopsis thaliana))。种子油可通过本领域已知的任何方法从种子/粮食中提取。这通常涉及使用通常与种子的第一次破碎相关的非极性溶剂诸如乙醚、石油醚、氯仿/甲醇或丁醇混合物进行提取。粮食中与淀粉相关的脂质可使用水饱和的丁醇提取。种子油可以通过本领域已知的方法“脱胶”以除去多糖，或以其他方式处理以除去污染物或改善纯度、稳定性或色泽。种子油中的TAG和其他酯可以水解以释放游离脂肪酸，或者如本领域所已知将种子油氢化、化学处理或酶法处理。
如本文所用，术语“脂肪酸”是指饱和或未饱和的具有长度为至少8个碳原子的长脂族尾部的羧酸。通常，脂肪酸具有长度为至少12个碳的碳-碳键合链。最多的天然存在的脂肪酸具有偶数个碳原子，因为它们的生物合成涉及具有两个碳原子的乙酸酯。脂肪酸可以为游离状态(非酯化)或酯化形式，诸如TAG、DAG、MAG、酰基辅酶A(硫代酯)键合或其他共价键合形式的一部分。当以酯化形式共价键合时，脂肪酸在本文称为“酰基”基团。脂肪酸可以酯化为磷脂，诸如磷脂酰胆碱(PC)、磷酸酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇或双磷脂酰甘油。饱和脂肪酸沿着链不含任何双键或其他官能团。术语“饱和的”是指氢，因为所有的碳(除了羧酸[-COOH]基团)都包含尽可能多的氢。换句话讲，omega(ω)端含3个氢(CH3-)，链内的每个碳含2个氢(-CH2-)。不饱和脂肪酸具有与饱和脂肪酸相似的形式，不同的是一个或多个烯烃官能团沿着链存在，而每个烯烃用双键的″-CH=CH-″部分(即，以双键键合到另一个碳的碳)取代链的单键″-CH2-CH2-″部分。结合到双键任一侧的链中的两个紧邻碳原子可以按顺式或反式构型存在。
如本文所用，术语“多不饱和脂肪酸”或″PUFA″是指包含其碳链中的至少12个碳原子以及至少两个烯烃基团(碳-碳双键)的脂肪酸。
“单酰基甘油酯”或″MAG″是其中甘油被一个脂肪酸酯化的甘油酯。如本文所用，MAG包含位于sn-1/3(本文也称为sn-1 MAG或1-MAG或1/3-MAG)或sn-2位(本文也称为2-MAG)的羟基，因此MAG不包括磷酰化分子，诸如PA或PC。MAG因此为细胞中的中性脂质的组分。
“二酰基甘油酯”或″DAG″是其中甘油被两个脂肪酸酯化的甘油酯。如本文所用，DAG包含位于sn-1,3或sn-1,2/2,3位的羟基，因此DAG不包括磷酰化分子，诸如PA或PC。DAG因此为细胞中的中性脂质的组分。在DAG合成的Kennedy途径中(图1)，前体sn-甘油-3-磷酸(G-3-P)在sn-1位通过甘油-3-磷酸酰基转移酶(GPAT)催化的第一反应中酯化到两个酰基(每一个来自脂肪酸辅酶A酯)形成LysoPA，然后在通过溶血磷脂酸酰基转移酶(LPAAT)催化的sn-2位的第二酰化形成磷脂酸(PA)。该中间体然后去磷酰化形成DAG。在备选合成代谢途径中(图1)，DAG可通过MGAT催化的sn-1 MAG或优选sn-2 MAG的酰化形成。DAG也可通过脂肪酶移除酰基由TAG形成，或通过CPT、PDCT或PLC任一种酶移除胆碱头基而基本上由PC形成(图1)。
“三酰基甘油酯”或″TAG″是其中甘油被三个脂肪酸酯化的甘油酯。在TAG合成的Kennedy途径中，DAG如上所述形成，然后通过DGAT的活性将第三酰基酯化到甘油主链。形成TAG的备选途径包括酶PDAT催化的途径和本文所述的MGAT途径。
如本文所用，术语“酰基转移酶”是指能够将酰基从酰基辅酶A转移到底物上的蛋白并包括MGAT、GPAT和DGAT。
如本文所用，术语“单酰基甘油酰基转移酶”或″MGAT″是指将脂肪酰基从酰基辅酶A转移到MAG底物产生DAG的蛋白。因此，术语“单酰基甘油酰基转移酶活性”至少是指将酰基从酰基辅酶A转移到MAG产生DAG。MGAT因其在哺乳动物肠道的脂肪吸收中的作用而最为知名，其中通过膳食脂肪消化生成的脂肪酸和sn-2 MAG在肠细胞中重新合成为TAG，用于乳糜微粒的合成和分泌。MGAT催化此过程的第一步，其中来自脂肪酰基辅酶A的由脂肪酸和CoA形成的酰基与sn-2 MAG共价接合。如本文所用的术语″MGAT″包括作用于sn-1/3 MAG和/或sn-2 MAG底物以分别形成sn-1,3 DAG和/或sn-1,2/2,3-DAG的酶。在一个优选的实施方案中，MGAT比sn-1 MAG更偏好sn-2 MAG，或基本上只使用sn-2 MAG作为底物，实例包括以下文献中所述的MGAT：Cao等，2003(小鼠MGAT1对sn2-18:1-MAG的特异性>sn1/3-18:1-MAG(图5))；Yen和Farese,2003(小鼠MGAT1和人MGAT2的一般活性对2-MAG高于1-MAG酰基受体底物(图5))；以及Cheng等，2003(人MGAT3对2-MAG的活性远高于对1/3-MAG底物的活性(图2D))。
如本文所用，MGAT不包括将酰基优先地转移到LysoPA而非MAG的酶，此类酶称为LPAAT。也就是说，MGAT优先地使用非磷酰化单酰基底物，即使它们可能对LysoPA的催化活性较低。优选的MGAT不具有可检测的酰化LysoPA的活性。如本文所示，MGAT(即，小家鼠MGAT2)还可具有DGAT功能，但主要用作MGAT，也就是说，当将酶活性以nmol产物/min/mg蛋白为单位表示时，它作为MGAT的催化活性高于作为DGAT的催化活性(另见Yen等，2002)。
有三类已知的MGAT，分别称为MGAT1、MGAT2和MGAT3。人MGAT1基因(AF384163)的同源物至少存在(即，序列是已知的)于黑猩猩、狗、牛、小鼠、大鼠、斑马鱼、秀丽隐杆线虫、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、乳酸克鲁维酵母、棉假囊酵母菌(Eremothecium gossypii)、稻瘟病菌和粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)中。人MGAT2基因(AY157608)的同源物至少存在于黑猩猩、狗、牛、小鼠、大鼠、鸡、斑马鱼、果蝇和蚊子中。人MGAT3基因(AY229854)的同源物至少存在于黑猩猩、狗、牛和斑马鱼中。然而，其他生物的同源物可容易地通过本领域鉴定同源序列的已知方法加以鉴定。
MGAT1多肽的实例包括通过得自智人(AF384163)、小家鼠(AF384162)、黑猩猩(XM_001166055、XM_0526044.2)、家犬(XM_545667.2)、家牛(NM_001001153.2)、褐家鼠(NM_001108803.1)、斑马鱼MGAT1(NM_001122623.1)、秀丽隐杆线虫(NM_073012.4、NM_182380.5、NM_065258.3、NM_075068.3、NM_072248.3)、乳酸克鲁维酵母(XM_455588.1)、棉阿舒囊霉(NM_208895.1)、稻瘟病菌(XM_368741.1)、玻璃海鞘预测(XM_002120843.1)的MGAT1基因编码的蛋白。MGAT2多肽的实例包括通过得自智人(AY157608)、小家鼠(AY157609)、黑猩猩(XM_522112.2)、家犬(XM_542304.1)、家牛(NM_001099136.1)、褐家鼠、红原鸡(XM_424082.2)、斑马鱼(NM_001006083.1)、黑腹果蝇(NM_136474.2、NM_136473.2、NM_136475.2)、冈比亚按蚊(XM_001688709.1、XM_315985)、赤拟谷盗(XM_970053.1)的MGAT2基因编码的蛋白。MGAT3多肽的实例包括通过得自智人(AY229854)、黑猩猩(XM_001154107.1、XM_001154171.1、XM_527842.2)、家犬(XM_845212.1)、家牛(XM_870406.4)、斑马鱼(XM_688413.4)的MGAT3基因编码的蛋白。
如本文所用，“MGAT途径”是指形成TAG的不同于Kennedy途径的合成代谢途径，其中DAG通过MGAT催化的sn-1 MAG或优选sn-2 MAG的酰化而形成。DAG可随后用于形成TAG或其他脂质。MGAT途径在图1中示例性示出。
如本文所用，术语“二酰基甘油酰基转移酶”(DGAT)是指将脂肪酰基从酰基辅酶A转移到DAG底物产生TAG的蛋白。因此，术语“二酰基甘油酰基转移酶活性”是指将酰基从酰基辅酶A转移到DAG产生TAG。DGAT还可具有MGAT功能，但主要用作DGAT，也就是说，当将酶活性以nmol产物/min/mg蛋白为单位表示时，它作为DGAT的催化活性高于作为MGAT的催化活性(参见例如Yen等，2005)。
有三种已知类型的DGAT，分别称为DGAT1、DGAT2和DGAT3。DGAT1多肽通常具有10个跨膜结构域，DGAT2多肽通常具有2个跨膜结构域，而DGAT3多肽通常不含跨膜结构域并被认为可溶于细胞质，而不整合进细胞膜。DGAT1多肽的实例包括通过得自烟曲霉(Aspergillusfumigatus)(登录号XP_755172)、拟南芥(CAB44774)、蓖麻(AAR11479)、油桐(ABC94472)、斑鸠菊(Vernonia galamensis)(ABV21945、ABV21946)、卫矛(Euonymus alatus)(AAV31083)、秀丽隐杆线虫(AAF82410)、褐家鼠(NP_445889)、智人(NP_036211)的DGAT1基因及其变体和/或突变体编码的蛋白。DGAT2多肽的实例包括通过得自拟南芥(NP_566952.1；SEQ ID NO:212)、蓖麻(AAY16324.1；SEQ ID NO:213)、油桐(ABC94474.1；SEQ ID NO:214)、拉曼被孢霉(AAK84179.1；SEQ ID NO:215)、智人(Q96PD7.2；SEQID NO:216)(Q58HT5.1；SEQ ID NO:217)、家牛(Q70VZ8.1；SEQ ID NO:218)、小家鼠(AAK84175.1；SEQ ID NO:219)的DGAT2基因及其变体和/或突变体编码的蛋白。
DGAT3多肽的实例包括通过得自花生(Arachis hypogaea,Saha等，2006)的DGAT3基因及其变体和/或突变体编码的蛋白。DGAT几乎没有可检测的MGAT活性，例如低于300pmol/min/mg蛋白，优选低于200pmol/min/mg蛋白，更优选低于100pmol/min/mg蛋白。
DGAT2但非DGAT1与MGAT酶共有高序列同源性，从而表明DGAT2和MGAT基因可能共有共同的遗传起源。虽然多种同种型在TAG合成中涉及到催化相同的步骤，但是它们可能发挥着不同的功能作用，如通过酶DGAT/MGAT家族的不同组织分布和亚细胞定位而表明。在哺乳动物中，MGAT1主要在胃、肾、脂肪组织中表达，而MGAT2和MGAT3则在小肠中表现出最高的表达。在哺乳动物中，DGAT1在许多组织中泛表达，在小肠中的表达最高，而DGAT2则在肝脏中的丰度最高。生物信息学分析表明，MGAT3只存在于高等哺乳动物和人类中而不存在于啮齿动物中。MGAT3比MGAT1和MGAT3与DGAT2共有更高的序列同源性。当将MAG或DAG用作底物时MGAT3比MGAT1和MGAT2酶表现出明显更高的DGAT活性(MGAT3>MGAT1>MGAT2)，从而表明MGAT3用作推定的TAG合酶。
MGAT1和MGAT2均属于同一类作为DGAT2的酰基转移酶。已表明在某些DGAT2中对DGAT2催化活性具有重要意义的某些基序在MGAT酰基转移酶中也是保守的。特别感兴趣的是具有共有序列FLXLXXXN(SEQID NO:224)(其中每个X独立地为非脯氨酸的任何氨基酸，N为任何非极性氨基酸，该序列位于N端跨膜结构域内)的推定中性脂质结合结构域，接着为推定甘油/磷脂酰基转移酶结构域。FLXLXXXN基序存在于小鼠DGAT2(第81-88位氨基酸)和MGAT1/2中但不存在于酵母或植物DGAT2中。它对小鼠DGAT2的活性具有重要意义。其他DGAT2和/或MGAT1/2序列基序包括：
1.存在于大多数DGAT2多肽中也存在于MGAT1和MGAT2中的高度保守的YFP三肽(SEQ ID NO:220)，例如作为小鼠DGAT2中的第139-141位氨基酸而存在。通过非保守取代使酵母DGAT2内的该基序发生突变将使酶丧失功能。
2.在MGAT中以及在动物和真菌的DGAT2序列中高度保守的HPHG四肽(SEQ ID NO:221)，例如作为小鼠DGAT2中的第161-164位氨基酸而存在，并至少在酵母和小鼠DGAT2中对催化活性具有重要意义。植物DGAT2酰基转移酶相反具有EPHS(SEQ ID NO:222)保守序列，因此可以接受对第一和第四氨基酸的保守变化。
3.作为推定甘油磷脂结构域一部分的较长保守基序。该基序的实例为RXGFX(K/R)XAXXXGXXX(L/V)VPXXXFG(E/Q)(SEQ ID NO:223)，其作为小鼠DGAT2中的第304-327位氨基酸而存在。该基序在氨基酸序列中不如其他的保守，如可以通过其长度所预料，但是通过基序查找可以识别同源物。在更保守的氨基酸之间，间距可以变化，也就是说，与上面的序列相比，在基序内可以存在附加的X氨基酸或者更少的X氨基酸。
如本文所用，术语“甘油-3-磷酸酰基转移酶”或″GPAT″是指使甘油-3-磷酸(G-3-P)酰化形成LysoPA和/或MAG的蛋白质，如果GPAT也具有对LysoPA的磷酸酶活性则形成后一产物。转移的酰基基团通常来自酰基辅酶A。因此，术语“甘油-3-磷酸酰基转移酶活性”是指G-3-P酰化形成LysoPA和/或MAG。术语″GPAT″涵盖使G-3-P酰化形成sn-1 LPA和/或sn-2 LPA优选sn-2 LPA的酶。在一个优选的实施方案中，GPAT具有磷酸酶活性。在最优选的实施方案中，GPAT为具有产生sn-2 MAG的磷酸酶活性的sn-2GPAT。
如本文所用，术语“sn-1甘油-3-磷酸酰基转移酶”(sn-1 GPAT)是指使sn-甘油-3-磷酸(G-3-P)酰化优先地形成1-酰基-sn-甘油-3-磷酸(sn-1 LPA)的蛋白质。因此，术语“sn-1甘油-3-磷酸酰基转移酶活性”是指使sn-甘油-3-磷酸酰化形成1-酰基-sn-甘油-3-磷酸(sn-1 LPA)。
如本文所用，术语“sn-2甘油-3-磷酸酰基转移酶”(sn-2 GPAT)是指使sn-甘油-3-磷酸(G-3-P)酰化优先地形成2-酰基-sn-甘油-3-磷酸(sn-2 LPA)的蛋白质。因此，术语“sn-2甘油-3-磷酸酰基转移酶活性”是指使sn-甘油-3-磷酸酰化形成2-酰基-sn-甘油-3-磷酸(sn-2 LPA)。
GPAT家族是一个庞大的家族，所有已知的成员均包含两个保守结构域：plsC酰基转移酶结构域(PF01553；SEQ ID NO:225)和HAD样水解酶(PF12710；SEQ ID NO:226)超家族结构域。除此之外，在拟南芥中，GPAT4-8均包含与磷酸丝氨酸磷酸酶结构域(PF00702；SEQ ID NO:227)同源的N端区域。GPAT4和GPAT6均包含已知对磷酸酶活性至关重要的保守残基，具体地讲，位于N端的基序I(DXDX[T/V][L/V]；SEQ ID NO:229)和基序III(K-[G/S][D/S]XXX[D/N]；SEQ ID NO:330)中的保守氨基酸(Yang等，2010)。优选地，GPAT具有sn-2偏好和磷酸酶活性以通过甘油-3-磷酸(G-3-P)产生sn-2 MAG(也称为″2-MAG″)(图1)，例如，得自拟南芥属的GPAT4(NP_171667.1)和GPAT6(NP_181346.1)。更优选地，GPAT使用酰基辅酶A作为脂肪酸底物。
GPAT4(NP_171667)和GPAT6(NP_181346)的同源物包括AAF02784、AAL32544、AAP03413、ABK25381、ACN34546、BAF00762、BAH00933、EAY84189、EAY98245、EAZ21484、EEC71826、EEC76137、EEE59882、EFJ08963、EFJ08964、EFJ11200、EFJ15664、EFJ24086、EFJ29816、EFJ29817、NP_001044839、NP_001045668、NP_001147442、NP_001149307、NP_001168351、NP_181346、NP_191950、XP_001765001、XP_001769671、XP_001769724、XP_001771186、XP_001780533、XP_002268513、XP_002275348、XP_002276032、XP_002279091、XP_002309124、XP_002309276、XP_002322752、XP_002323563、XP_002439887、XP_002458786、XP_002463916、XP_002464630、XP_002511873、XP_002517438、XP_002520171、XP_002872955、XP_002881564、ACT32032、ACT32032、NP_001051189、NP_171667、XP_002320138、XP_002451377、XP_002451377、XP_002531350、XP_002872955和XP_002889361。
保守基序和/或残基可用作基于序列的诊断法，以鉴定双官能的GPAT/磷酸酶。可选择地，可以采用更严格的基于功能的测定法。这样的测定法涉及(例如)向细胞或微粒体供给加标记的甘油-3-磷酸，然后通过薄层层析或类似技术定量标记产物的水平。GPAT活性导致产生标记的LPA，而GPAT/磷酸酶活性则导致产生标记的MAG。
如本文所用，术语“野生型”或其变型形式是指未经过遗传修饰的细胞或非人生物或其部分。
术语“相应的”是指与本发明的细胞或非人生物或其部分具有相同或相似遗传背景但未如本文所述进行修饰的细胞或非人生物或其部分(例如，不含编码MGAT或外源MGAT的外源多核苷酸的细胞或非人生物或其部分)。相应的细胞或非人生物或其部分可用作对照，以与如本文所述进行修饰的细胞或非人生物或其部分比较核酸或蛋白表达水平，或性状修饰的程度和性质，例如非极性脂质的产生和/或含量。
如本文所用，“与...比较”是指将表达一种或多种外源多核苷酸或外源多肽的转基因非人生物或其部分的非极性脂质水平或总非极性脂质含量与不含所述一种或多种外源多核苷酸或多肽的转基因非人生物或其部分进行比较。
如本文所用，“增强的产生非极性脂质的能力”是一个相对意义上的术语，是指通过本发明的细胞或非人生物或其部分产生的非极性脂质的总量相对于相应的细胞或非人生物或其部分是升高的。在一个实施方案中，非极性脂质的TAG和/或多不饱和脂肪酸含量是升高的。
如本文所用，术语“下调内源酶的产生和/活性的分离或重组多核苷酸”或其变型形式是指所编码的RNA分子下调内源酶的产生和/或活性(例如，编码siRNA)或其本身即可下调内源酶的产生和/或活性(例如，为可直接递送到例如细胞中的siRNA)的多核苷酸，所述内源酶例如为DGAT、sn-1甘油-3-磷酸酰基转移酶(GPAT)、1-酰基-甘油-3-磷酸酰基转移酶(LPAAT)、酰基辅酶A:溶血卵磷脂酰基转移酶(LPCAT)、磷脂酸磷酸酶(PAP)或它们中两种或更多种的组合。
如本文所用，术语“按重量计”是指物质(例如，TAG、DAG、脂肪酸)的重量作为包含该物质的组合物(例如，种子、叶子)的重量的百分比。例如，如果转基因种子每120μg种子重量具有25μg总脂肪酸，则总脂肪酸的百分比按重量计为20.8%。
如本文所用，术语“在相对的基础上”是指物质在包含该物质的组合物中的量与相应组合物按百分比计算的比较。
如本文所用，术语“相对非脂质含量”是指细胞、生物或其部分或从其得到的提取脂质的非极性脂质含量与相应细胞、生物或其部分或从相应细胞、生物或其部分提取的脂质按百分比计算的比较的表达。例如，如果转基因种子具有25μg总脂肪酸，而相应的种子具有20μg总脂肪酸，则在相对的基础上非极性脂质含量的升高等于25%。
二酰基甘油和三酰基甘油的产生
在一个实施方案中，本发明的转基因非人生物或其部分与相应的非人生物或其部分相比产生更高水平的非极性脂质，诸如DAG或TAG，优选是这两者。在一个实例中，本发明的转基因植物产生的种子和/或叶子当与相应的种子和/或叶子相比时具有升高的非极性脂质含量，诸如DAG或TAG，优选是这两者。非极性生物或其部分的非极性脂质含量当与相应的非人生物或其部分相比时按重量计高0.5%。
在另一个实施方案中，转基因非人生物或其部分(优选植物或种子)产生富集一种或多种特定脂肪酸的DAG和/或TAG。多种多样的脂肪酸可结合到DAG和/或TAG中，包括饱和与不饱和脂肪酸以及短链与长链脂肪酸。可结合到DAG和/或TAG中的脂肪酸的某些非限制实例包括：羊蜡酸(10:0)、月桂酸(12:0)、肉豆蔻酸(14:0)、棕榈酸(16:0)、棕榈油酸(16:1)、硬脂酸(18:0)、油酸(18:1)、异油酸(18:1)、亚油酸(18:2)、桐油酸(18:3)、γ-亚麻酸(18:3)、α-亚麻酸(18:3ω3)、十八碳四烯酸(18:4ω3)、花生酸(20:0)、二十碳二烯酸(20:2)、二高-γ-亚油酸(20:3)、二十碳三烯酸(20:3)、花生四烯酸(20:4)、二十碳四烯酸(20:4)、二十碳五烯酸(20:5ω3)、二十二烷酸(22:0)、二十二碳五烯酸(22:5ω)、二十二碳六烯酸(22:6ω3)、二十四烷酸(24:0)、神经酸(24:1)、蜡酸(26:0)和褐煤酸(28:0)脂肪酸。在本发明的一个实施方案中，转基因生物或其部分富集包含多不饱和脂肪酸的DAG和/或TAG。
在本发明的一个实施方案中，将转基因非人生物或其部分(优选植物或种子)用编码如本文所定义的可以或可以不具有DGAT活性的MGAT的嵌合DNA转化。MGAT的表达优选导致所述转基因非人生物或其部分中更高水平的非极性脂质诸如DAG或TAG和/或升高的非极性脂质产率。在一个优选的实施方案中，转基因非人生物为植物。
在进一步的实施方案中，将转基因非人生物或其部分用编码GPAT或DGAT的嵌合DNA转化。优选地，将生物优选地用共价连接在一个DNA分子诸如单个T-DNA分子上的两种嵌合DNA转化。
Yang等人(2010)描述了得自具有能够由甘油-3-磷酸(G-3-P)产生sn-2MAG的sn-2偏好和磷酸酶活性的拟南芥属的甘油-3-磷酸酰基转移酶(GPAT4和GPAT6)(图1)。这些酶被认为是角质合成途径的一部分。拟南芥属GPAT4和GPAT6已证实使用酰基辅酶A作为脂肪酸底物(Zheng等，2003)。
将双官能GPAT/磷酸酶与MGAT结合产生一种新的DAG合成途径，它使用G-3-P作为一种底物，以及衍生自酰基辅酶A的两个酰基基团作为另外的底物。相似地，将这样的双官能GPAT/磷酸酶与具有DGAT活性的MGAT结合产生一种新的TAG合成途径，它使用甘油-3-磷酸作为一种底物，以及衍生自酰基辅酶A的三个酰基基团作为另外的底物。
因此，在本发明的一个实施方案中，将转基因非人生物或其部分用双官能GPAT/磷酸酶以及用不具有DGAT活性的MGAT共转化。这将导致通过双官能GPAT/磷酸酶产生MAG，继而将通过MGAT转化成DAG，然后通过天然DGAT或其他活性转化成TAG。新DAG产生过程可通过例如在包含致死SLC1+SLC4敲除的酵母菌株中进行这样的共转化而加以确认和选择，例如Benghezal等人(2007；图2)所述。Benghezal等人(2007)的图2显示了敲除两个酵母LPATS(SLC1&SLC4)是致死性的。SLC1+SLC4双酵母突变体只能因提供反式的slc基因之一(对它们而言为SLC1)的互补质粒而得以维持。通过向培养基添加FOA的负选择导致此互补质粒丧失(Ura选择标记的反选择)并使细胞不能存活。
在本发明的另一个实施方案中，将转基因非人生物或其部分(优选植物或种子)用编码双官能GPAT/磷酸酶以及具有DGAT活性的MGAT的嵌合DNA共转化。这将导致通过双官能GPAT/磷酸酶产生MAG，继而将通过MGAT转化成DAG然后转化成TAG。
在进一步的实施方案中，使不具有可检测的磷酸酶活性的一种或多种内源GPAT沉默，例如使编码在Kennedy途径中酰化甘油-3-磷酸形成LPA的GPAT(例如，拟南芥属GPAT1)的一种或多种基因沉默。
可通过(例如)向表达MGAT变体的转基因H1246酵母菌株提供一定浓度的防止与野生型MGAT基因互补的特定游离脂肪酸(例如，DHA)而将底物偏好工程化到新型DAG和TAG合成途径中。只有能够使用所提供的游离脂肪酸的变体才能生长。多轮MGAT工程化将导致产生更偏好特定氨基酸的MGAT。
上文所述的各种Kennedy途径互补和补充因为初始底物甘油-3-磷酸的普遍存在性而可在任何细胞类型中进行。在一个实施方案中，转基因的使用导致油产率升高。
多核苷酸
术语“多核苷酸”和“核酸”可互换使用。它们是指任何长度的聚合物形式的核苷酸，即脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸或其类似物。本发明的多核苷酸可以具有基因组、cDNA、半合成或合成起源，可为双链或单链的，并且归因于其起源或操纵：(1)与其在自然界中相关的多核苷酸的全部或一部分相关，(2)连接到其在自然界中所连接的之外的多核苷酸，或(3)不存在于自然界中。以下是多核苷酸的非限制性实例：基因或基因片段的编码或非编码区、通过连接分析定义的基因座、外显子、内含子、信使RNA(mRNA)、转移RNA(tRNA)、核糖体RNA(rRNA)、核糖酶、cDNA、重组多核苷酸、支化多核苷酸、质粒、载体、任何序列的分离DNA、任何序列的分离RNA、任何序列的嵌合DNA、核酸探针和引物。多核苷酸可包括修饰的核苷酸，诸如甲基化核苷酸和核苷酸类似物。核苷酸结构的修饰当存在时可在聚合物组装前或组装后赋予。核苷酸序列可通过非核苷酸组分而中断。多核苷酸可在聚合反应后进一步修饰，诸如通过与标记组分缀合。
所谓“分离的多核苷酸”是指已总体上从其天然状态下与之相关或连接的多核苷酸序列中分离的多核苷酸。优选地，分离的多核苷酸至少60%、更优选至少75%、更优选至少90%不含与之天然相关或连接的多核苷酸序列。
如本文所用，术语“基因”将采取其最广泛的含义，并包括以下脱氧核糖核苷酸序列，它含有结构基因的转录区以及发生翻译时的蛋白编码区并包括位于5′和3′两个末端上的编码区附近的序列，它们在任一末端上距离末端的距离为至少约2kb并涉及到基因的表达。就这一点而言，基因包含与给定基因天然相关的控制信号，诸如启动子、增强子、终止和/或多聚腺苷酸化信号，或包含异源控制信号，在此情况下，基因称为“嵌合基因”。位于蛋白编码区5′并存在于mRNA上的序列称为5′非翻译序列。位于蛋白编码区3′或下游并存在于mRNA上的序列称为3′非翻译序列。术语“基因”涵盖基因的cDNA和基因组两种形式。基因的基因组形式或克隆包含可通过称为“内含子”、“间插区”或“间插序列”的非编码序列中断的编码区。内含子是转录成核RNA(nRNA)的基因片段。内含子可包含调控元件，诸如增强子。内含子从核或初级转录物中移除或“剪除”；因此内含子不存在于mRNA转录物中。mRNA在翻译过程中起到指定新生多肽中的氨基酸序列或顺序的作用。术语“基因”包括编码本文所述的本发明蛋白质全部或一部分的合成或融合分子以及与上文任何一种序列互补的核苷酸序列。
如本文所用，“嵌合DNA”是指不是天然存在于自然界中的任何DNA分子；本文也称为“DNA构建体”。通常，嵌合DNA包含不是一起天然存在于自然界中的调控和转录或蛋白编码序列。因此，嵌合DNA可包含衍生自不同来源的调控序列和编码序列，或衍生自相同来源的调控序列和编码序列但以不同于自然界中所存在的方式排列。开放阅读框可以或可以不连接到其天然上游和下游调控元件。开放阅读框可以整合到(例如)植物基因组中、处于非天然位置或处于复制子或载体中，在其中它在天然状态下不存在，诸如细菌质粒或病毒载体。术语“嵌合DNA”不限于能在宿主中复制的DNA分子，而是包括能够通过(例如)特定的衔接子序列连接到复制子中的DNA。
“转基因”是已通过转化程序引入基因组中的基因。术语“遗传修饰的”、“转基因的”及其变型形式包括通过转化或转导将基因引入细胞，使细胞中的基因突变以及从遗传学上改变或调节细胞中的基因调控，或如上所述进行修饰的任何细胞的子代。
如本文所用的“基因组区域”是指基因组内的位置，在该位置处已将转基因或转基因群组(本文也成为基因簇)插入细胞或其前体细胞。此类区域只含已通过人工干预诸如通过本文所述的方法整合的核苷酸。
本发明的“重组多核苷酸”是指已通过人工重组方法构建或修饰的核酸分子。重组多核苷酸与其天然状态相比可以改变的量存在于细胞中或以改变的速率表达(例如，就mRNA而言)。在一个实施方案中，将多核苷酸引入天然不含该多核苷酸的细胞。通常，将外源DNA用作mRNA转录的模板，然后在转化的细胞内翻译成编码本发明的多肽的氨基酸残基的连续序列。在另一个实施方案中，多核苷酸是细胞的内源多核苷酸，并且其表达通过重组手段改变，例如，将外源控制序列引入所关注的内源基因的上游，以使得转化的细胞能表达由所述基因编码的多肽。
本发明的重组多核苷酸包括还未与其所存在的基于细胞或无细胞的表达系统的其他组分分离的多核苷酸，以及在所述基于细胞或无细胞系统中产生、随后从至少某些其他组分中纯化的多核苷酸。多核苷酸可以是存在于自然界中的核苷酸的邻接延伸(contiguous stretch)，或者包含不同来源(天然存在的和/或合成的)的接合形成单个多核苷酸的核苷酸的两个或更多个邻接延伸。通常，此类嵌合多核苷酸包含至少一个编码本发明多肽的开放阅读框，它可操作地连接至适合促使该开放阅读框在所关注的细胞中转录的启动子。
至于所定义的多核苷酸，应当理解，高于上文所提供的那些值的百分比同一性数值将涵盖优选的实施方案。因此，适用时，按照最低百分比同一性数值，优选的是，多核苷酸所含的多核苷酸序列与相关的命名SEQ IDNO至少60%、更优选至少65%、更优选至少70%、更优选至少75%、更优选至少80%、更优选至少85%、更优选至少90%、更优选至少91%、更优选至少92%、更优选至少93%、更优选至少94%、更优选至少95%、更优选至少96%、更优选至少97%、更优选至少98%、更优选至少99%、更优选至少99.1%、更优选至少99.2%、更优选至少99.3%、更优选至少99.4%、更优选至少99.5%、更优选至少99.6%、更优选至少99.7%、更优选至少99.8%甚至更优选至少99.9%相同。
本发明的多核苷酸或可用于本发明的多核苷酸可在严格条件下选择性杂交到本文所定义的多核苷酸。如本文所用，严格条件为以下这些：(1)在42℃下在杂交期间采用诸如甲酰胺的变性剂，例如50%(v/v)甲酰胺与0.1%(w/v)牛血清白蛋白、0.1%Ficoll、0.1%聚乙烯吡咯烷酮、含750mM NaCl、75mM柠檬酸钠的50mM磷酸钠缓冲液(pH 6.5)；或(2)在42℃下在0.2xSSC和0.1%SDS中采用50%甲酰胺、5x SSC(0.75M NaCl、0.075M柠檬酸钠)、50mM磷酸钠(pH6.8)、0.1%焦磷酸钠、5x Denhardt溶液、超声处理的鲑精DNA(50g/ml)、0.1%SDS和10%硫酸葡聚糖；和/或(3)在50℃下采用低离子强度和高温进行洗涤，例如0.015M NaCl/0.0015M柠檬酸钠/0.1%SDS。
本发明的多核苷酸当与天然存在的分子相比时可具有一个或多个突变，它们为核苷酸残基的缺失、插入或取代。相对于参考序列具有突变的多核苷酸可以是天然存在的(也就是说，从天然来源中分离)或合成的(例如，通过对如上所述的核酸进行定点诱变或DNA改组)。
重组载体
本发明的一个实施方案包括重组载体，其包含本文所定义的至少一种多核苷酸并能够将该多核苷酸递送进宿主细胞。重组载体包括表达载体。重组载体包含异源多核苷酸序列，也就是说，天然不与本文所定义的多核苷酸相邻的多核苷酸序列，优选地，衍生自不同的种。载体可以是RNA或DNA，原核或真核的，并通常为衍生自病毒的病毒载体或质粒。质粒载体通常包含附加的核酸序列，以便于原核细胞中表达盒的选择、扩增和转化，例如，pSK源载体、pGEM源载体、pSP源载体、pBS源载体或包含一个或多个T-DNA区域的二元载体。附加的核酸序列包含复制起点，以便以下物质的自主复制：载体，优选编码抗生素或除草剂抗性的选择标记基因，提供多个位点以插入在核酸构建体中编码的核酸序列或基因的独特的多个克隆位点，以及增强原核和真核(特别是植物)细胞转化的序列。
如本文所用的“可操作地连接”是指两个或更多个核酸(如DNA)片段之间的功能关系。通常，是指转录序列的转录调控元件(启动子)的功能关系。例如，将启动子可操作地连接到本文所定义的多核苷酸的编码序列，如果它在合适的细胞中刺激或调节该编码序列的转录。通常，可操作地连接到转录序列的启动子转录调控元件与转录序列在物理上连续，即，它们为顺式作用的。然而，某些转录调控元件诸如增强子不需要与它们增强转录的编码序列在物理上连续或在位置上紧邻。
当存在多个启动子时，每个启动子可以独立地为相同的或不同的。
重组载体还可以包含：(a)一个或多个分泌信号，其编码信号肽序列以使得本文所定义的表达多肽能从产生该多肽的细胞中分泌，或其使表达的多肽定位，例如将多肽保持在细胞内质网(ER)中，或转移到质粒中；和/或(b)包含融合序列，其导致核酸分子作为融合蛋白而表达。合适的信号片段的实例包括能够指导本文所定义的多肽分泌或定位的任何信号片段。优选的信号片段包括但不限于Nicotiana nectarin信号肽(US5,939,288)、烟草伸展蛋白信号或大豆油体蛋白油体结合蛋白信号。重组载体还可以包含本文所定义的多核苷酸的核酸序列周围和/或内部的间插和/或非翻译序列。
为了有利于鉴定转化体，重组载体有利地包含作为本文所定义的多核苷酸的核酸序列或除了本文所定义的多核苷酸的核酸序列外的选择或筛选标记基因。所谓“标记基因”是指使表达该标记基因的细胞具有不同的表型并因此允许将此类转化细胞与不具有该标记的细胞进行区分的基因。选择标记基因赋予一种性状，可以根据对选择剂(如，除草剂、抗生素、辐射、热或对非转化细胞的其他处理伤害)的抗性对其加以选择。筛选标记基因(或报告基因)赋予可通过观察或测试，也就是说通过“筛选”进行鉴定的性状(如，不存在于非转化细胞中的β-葡糖醛酸酶、荧光素酶、GFP或其他酶活性)。标记基因和所关注的核苷酸序列不必连接，因为如(例如)US 4,399,216中所述的非连接基因的共转化也是(例如)植物转化中的有效过程。标记的实际选择不是决定性的，只要与所选的细胞诸如植物细胞组合时为双官能的(即，选择性的)即可。
细菌选择标记的实例为赋予抗生素抗性的标记，诸如氨苄青霉素、红霉素、氯四环素或四环素抗性，优选卡那霉素抗性。选择植物转化体的示例性选择标记包括但不限于：编码潮霉素B抗性的hyg基因；赋予卡那霉素、巴龙霉素、G418抗性的新霉素磷酸转移酶(nptII)基因；赋予谷胱甘肽源除草剂抗性的得自大鼠肝脏的谷胱甘肽-S-转移酶基因，如(例如)EP256223中所述；过表达时赋予谷氨酰胺合成酶抑制剂(诸如草胺膦)抗性的谷氨酰胺合成酶基因，如(例如)WO 87/05327中所述；赋予选择剂草胺膦抗性的得自绿色产色链霉菌(Streptomyces viridochromogenes)的乙酰基转移酶基因，如(例如)EP 275957中所述；编码赋予草双甘膦耐性的5-烯醇式丙酮酸莽草酸-3-磷酸合成酶(EPSPS)的基因，如(例如)Hinchee等人(1988)所述；赋予双丙氨磷抗性的bar基因，如(例如)WO91/02071中所述；赋予溴苯腈抗性的得自臭鼻克雷伯氏菌(Klebsiella ozaenae)的腈水解酶基因，诸如bxn(Stalker等，1988)；赋予甲氨蝶呤抗性的二氢叶酸还原酶(DHFR)基因(Thillet等，1988)；赋予咪唑啉酮类、磺酰脲类或其他ALS抑制性化学剂的突变乙酰乳酸合酶基因(ALS)(EP 154,204)；赋予5-甲基色氨酸抗性的突变邻氨基苯甲酸合成酶基因；或赋予除草剂抗性的茅草枯脱卤素酶基因。
优选的筛选标记包括但不限于：编码已知其各种生色底物的β-葡糖醛酸酶(GUS)的uidA基因；编码已知其生色底物的酶的β-葡糖醛酸酶基因；可用于钙敏感生物发光检测的水母发光蛋白基因(Prasher等，1985)；绿荧光蛋白基因(Niedz等，1995)或其衍生物；或允许生物发光检测的荧光素酶(luc)基因(Ow等，1986)。所谓“报告基因”是指这样一种分子，通过其化学性质，提供有利于通过参考蛋白产物测定启动子活性的能通过分析而鉴定的信号。
优选地，重组载体稳定地整合到细胞诸如植物细胞的基因组中。因此，重组载体可包含允许载体整合到细胞基因组或染色体组中的合适元件。
表达载体
如本文所用，“表达载体”是能够转化宿主细胞并实现一种或多种指定多核苷酸表达的DNA或RNA载体。优选地，表达载体能够在宿主细胞内复制。表达载体可以为原核或真核的，通常为病毒或质粒。本发明的表达载体包括在本发明的宿主细胞中发挥作用(即，指导基因表达)的任何载体，包括在细菌、真菌、体内寄生虫、节肢动物、动物、藻类和植物细胞中。本发明的尤其优选的表达载体可以指导酵母、藻类和/或植物细胞中的基因表达。
本发明的表达载体包含调控序列，诸如转录控制序列、翻译控制序列、复制起点以及与宿主细胞相容并控制本发明多核苷酸表达的其他调控序列。具体地讲，本发明的表达载体包括转录控制序列。转录控制序列是控制转录的起始、伸长和终止的序列。尤其重要的转录控制序列是控制转录起始的那些，诸如启动子、增强子、操纵子和阻遏序列。合适的转录控制序列包括能在本发明的重组细胞的至少一者中发挥作用的任何转录控制序列。所用调控序列的选择取决于所关注的目标生物诸如植物和/或目标器官或组织。此类调控序列可得自任何真核生物诸如植物或植物病毒，或者可以化学合成。多种此类转录控制序列是本领域技术人员已知的。尤其优选的转录控制序列为在植物中具有转录指导活性的启动子，或为组成型的或为阶段和/或组织特异性的，具体取决于植物或其部分的使用。
许多适合植物细胞稳定转染或适合建立转基因植物的载体已在(例如)Pouwels等，Cloning Vectors:A Laboratory Manual,1985,副刊1987；Weissbach和Weissbach,Methods for Plant Molecular Biology,Academic Press,1989；和Gelvin等，Plant Molecular Biology Manual,Kluwer AcademicPublishers,1990中有所描述。通常，植物表达载体包含(例如)受5′和3′调控序列的转录控制的一个或多个克隆植物基因以及显性选择标记。此类植物表达载体还可以包含启动子调控区域(如，控制诱导或组成型、受环境或发育调控的、或细胞或组织特异性表达的调控区域)、转录起始位点、核糖体结合位点、RNA加工信号、转录终止位点和/或多聚腺苷酸化信号。
许多在植物细胞中具有活性的组成型启动子已得到了描述。在植物中组成型表达的合适启动子包括但不限于：花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子、玄参花叶病毒(FMV)35S启动子、甘蔗杆状病毒启动子、鸭跖草黄斑驳病毒启动子、得自核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶小亚基的光诱导型启动子、水稻细胞溶质丙糖磷酸异构酶启动子、拟南芥腺嘌呤磷酸核糖转移酶启动子、水稻肌动蛋白1基因启动子、甘露氨酸合酶及章鱼碱合酶启动子、Adh启动子、蔗糖合酶启动子、R基因复合启动子和叶绿素α/β结合蛋白基因启动子。这些启动子已用于构建已在植物中表达的DNA载体，参见例如WO84/02913。所有这些启动子已用于构建各种类型的植物表达性重组DNA载体。
为了在植物的源组织诸如叶子、根部或茎干中表达，优选的是，用于本发明的启动子在这些特定组织中具有相对高的表达。为此，可以针对具有组织或细胞特异性表达或增强表达的基因选择多种启动子。在文献中报导的此类启动子的实例包括：得自豌豆的叶绿体谷氨酰胺合成酶GS2启动子、得自小麦的叶绿体果糖-1,6-二磷酸酶启动子、得自马铃薯的核光合作用ST-LS1启动子、得自拟南芥的丝氨酸/苏氨酸激酶启动子和葡萄糖淀粉酶(CHS)启动子。还报导在光合有效组织中具有活性的为得自北美落叶松(Larix laricina)的核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶启动子，得自松树的Cab基因Cab6的启动子，得自小麦的Cab-1基因的启动子，得自菠菜的Cab-1基因的启动子，得自水稻的Cab 1R基因的启动子，得自玉米的丙酮酸磷酸双激酶(PPDK)启动子，烟草Lhcb1*2基因的启动子；拟南芥Suc2蔗糖-H30同向转运启动子，以及得自菠菜的类囊体膜蛋白基因的启动子(PsaD、PsaF、PsaE、PC、FNR、AtpC、AtpD、Cab、RbcS)。叶绿素α/β-结合蛋白的其他启动子也可用于本发明，诸如得自白芥(Sinapis alba)的LhcB基因和PsbP基因的启动子。
响应环境、激素、化学和/或发育信号而调控的多种植物基因启动子也可用于在植物细胞中表达RNA结合蛋白基因，包括受以下因素调控的启动子：(1)热；(2)光(如豌豆RbcS-3A启动子、玉米RbcS启动子)；(3)激素，诸如脱落酸；(4)创伤(如WunI)；或(5)化学剂，诸如茉莉酸甲酯、水杨酸、甾类激素、醇、安全剂(WO97/06269)，或者也可有利地采用(6)器官特异性启动子。
如本文所用，术语“植物贮藏器官特异性启动子”是指当与其他植物组织相比时优先地指导植物贮藏器官中的基因转录的启动子。优选地，该启动子只指导贮藏器官中所关注基因的表达，和/或植物其他部分诸如叶子中所关注基因的表达不能通过Northern印迹分析和/或RT-PCR检测。通常，启动子在贮藏器官的生长和发育期间促使基因表达，尤其是贮藏器官中贮藏化合物的合成和积聚阶段。此类启动子可促使整个植物贮藏器官或仅其部分诸如双子叶植物种子的种皮、胚芽或子叶或单子叶植物种子的胚乳或糊粉层中的基因表达。
为了在植物的库组织中表达，诸如马铃薯植物的块茎、番茄的果实或大豆、油菜、棉花、玉米、小麦、水稻和大麦的种子，优选的是，用于本发明的启动子在这些特定组织中具有相对高的表达。具有块茎特异性表达或增强表达的基因的多种启动子是已知的，包括I类马铃薯块茎特异蛋白(patatin)启动子、马铃薯块茎ADPGPP基因(大小亚基)的启动子、蔗糖合酶启动子、主要块茎蛋白(包括22kD蛋白复合物和蛋白酶抑制剂)的启动子、颗粒结合型淀粉合成酶(GBSS)的启动子以及其他I和II类patatin启动子。其他启动子也可用于在特定组织诸如种子或果实中表达蛋白。可以使用β-伴球蛋白的启动子或其他种子特异性启动子，诸如油菜籽蛋白(napin)、玉米蛋白、核丝(linin)和菜豆蛋白启动子。也可使用根特异性启动子。这样的启动子的实例为酸性几丁质酶基因的启动子。根组织中的表达也可通过利用已得到鉴定的CaMV 35S启动子的根特异性亚结构域而实现。
在尤其优选的实施方案中，启动子指导发生脂质生物合成的组织和器官中的表达。此类启动子在合适的时间作用于种子发育以改变种子中的脂质组成。
在进一步尤其优选的实施方案中，启动子为植物贮藏器官特异性启动子。在一个实施方案中，植物贮藏器官特异性启动子为种子特异性启动子。在更优选的实施方案中，启动子相对于种子胚芽中的表达或相对于植物其他器官诸如叶子中的表达优先地指导双子叶植物子叶中或单子叶植物胚乳中的表达。种子特异性表达的优选启动子包括：1)编码种子中脂质生物合成和积聚涉及到的酶(诸如去饱和酶和延长酶)的基因的启动子；2)编码种子贮藏蛋白的基因的启动子；和3)编码种子中碳水化合物生物合成和积聚涉及到的酶的基因的启动子。合适的种子特异性启动子为：油料种子油菜napin基因启动子(US5,608,152)、蚕豆(Vicia faba)USP启动子(Baumlein等，1991)、拟南芥油体蛋白启动子(WO 98/45461)、菜豆(Phaseolus vulgaris)蛋白启动子(US 5,504,200)、芸苔Bce4启动子(WO 91/13980)或豆球蛋白B4启动子(Baumlein等，1992)以及导致单子叶植物诸如玉米、大麦、小麦、裸麦、水稻等种子特异性表达的启动子。值得注意的合适启动子为大麦lpt2或lpt1基因启动子(WO 95/15389和WO 95/23230)或WO 99/16890中所述的启动子(大麦醇溶蛋白基因、水稻谷蛋白基因、水稻素(oryzin)基因、水稻醇溶蛋白基因、小麦醇溶蛋白基因、小麦谷蛋白基因、玉米醇溶蛋白基因、燕麦谷蛋白基因、高粱醇溶蛋白基因、黑麦醇溶蛋白基因的启动子)。其他启动子包括Broun等(1998)、Potenza等(2004)、US 20070192902和US20030159173所述的那些。在一个实施方案中，种子特异性启动子优先地在种子的限定部分诸如子叶或胚乳中表达。子叶特异性启动子的实例包括但不限于：FP1启动子(Ellerstrom等，1996)、豌豆豆球蛋白启动子(Perrin等，2000)和菜豆植物凝集素启动子(Perrin等，2000)。胚乳特异性启动子的实例包括但不限于：玉米醇溶蛋白-1启动子(Chikwamba等，2003)、水稻谷蛋白-1启动子(Yang等，2003)、D大麦醇溶蛋白启动子(Horvath等，2000)和小麦HMW谷蛋白启动子(Alvarez等，2000)。在进一步的实施方案中，种子特异性启动子在胚芽中和/或种子发芽后不表达或仅以低水平表达。
在另一个实施方案中，植物贮藏器官特异性启动子为块茎特异性启动子。实例包括但不限于马铃薯块茎特异蛋白(patatin)B33、PAT21和GBSS启动子以及甘薯贮藏蛋白启动子(有关综述，参见Potenza等，2004)。在优选的实施方案中，该启动子指导相对于块茎的外层(皮)或胚芽优先在块茎髓部中的表达。
在另一个实施方案中，植物贮藏器官特异性启动子为果实特异性启动子。实例包括但不限于番茄聚半乳糖醛酸酶E8和Pds启动子以及苹果ACC氧化酶启动子(有关综述，参见Potenza等，2004)。在优选的实施方案中，启动子相对于果皮或果实内的种子优先地指导果实可食用部分(例如果髓)中的表达。
5′非翻译前导序列可衍生自所选的启动子以表达本发明多核苷酸的异源基因序列，或可相对于待产生的酶的编码区为异源的，并可根据需要进行特定修饰以便增强mRNA的翻译。有关优化转基因表达的综述，参见Koziel等(1996)。5′非翻译区也可得自植物病毒RNA(烟草花叶病毒、烟草蚀纹病毒、玉米矮小花叶病毒、苜蓿花叶病毒等等)，得自合适的真核基因、植物基因(小麦和玉米叶绿素a/b结合蛋白基因前导序列)或得自合成的基因序列。本发明不限于其中非翻译区衍生自伴随启动子序列的5′非翻译区的构建体。前导序列也可衍生自非相关启动子或编码序列。可用于本发明背景的前导序列包括玉米Hsp70前导序列(US 5,362,865和US 5,859,347)以及TMVω元件。
转录的终止通过在表达载体中可操作地连接到所关注多核苷酸的3′非翻译DNA序列而完成。重组DNA分子的3′非翻译区包含在植物中作用于使腺苷酸核苷酸加成到RNA的3′端的多聚腺苷酸化信号。3′非翻译区可得自在植物细胞中表达的多种基因。胭脂碱合酶3′非翻译区、豌豆小亚基Rubisco基因的3′非翻译区、大豆7S种子贮藏蛋白基因的3′非翻译区常用于此能力。包含农杆菌属(Agrobacterium)肿瘤诱导(Ti)质粒基因的多聚腺苷酸化信号的3′转录非翻译区也是合适的。
重组DNA技术可用于通过操纵(例如)宿主细胞内多核苷酸的拷贝数、这些多核苷酸的转录效率、所得转录物的翻译效率以及转录后修饰的效率而改善转化的多核苷酸的表达。可用于增加本文所定义的多核苷酸的表达的重组技术包括但不限于：将多核苷酸可操作地连接到高拷贝数质粒、将多核苷酸分子整合到一个或多个宿主细胞染色体、将载体稳定性序列添加到质粒、对转录控制信号(如启动子、操纵子、增强子)的取代或修饰、对翻译控制信号(如核糖体结合位点、Shine-Dalgarno序列)的取代或修饰、对多核苷酸的修饰以对应于宿主细胞的密码子使用以及导致转录物不稳定的序列缺失。
转移核酸
转移核酸可用于将外源多核苷酸递送到细胞，并包含一个、优选两个边界序列和所关注的多核苷酸。转移核酸可以或可以不编码选择标记。优选地，转移核酸在细菌中形成二元载体的一部分，其中该二元载体进一步包含这样的元件，它们允许载体在细菌中复制、选择或维持包含该二元载体的细菌细胞。转移到真核细胞后，二元载体的转移核酸成分能够整合到真核细胞的基因组中。
如本文所用，术语“染色体外转移核酸”是指能够从细菌诸如农杆菌属转移到真核细胞诸如植物叶子细胞的核酸分子。染色体外转移核酸是一种遗传元件，它作为能够转移随后将其边界内所含的核苷酸序列整合到受体细胞基因组中的元件而广为人知。在这方面，转移核酸的侧翼通常为两个“边界”序列，但在某些情况下，可以使用一个末端的单个边界，而转移核酸的第二末端则在转移过程中随机生成。所关注的多核苷酸通常位于转移核酸的左边界样序列与右边界样序列之间。转移核酸内所含的多核苷酸可以可操作地连接到多种不同的有利于其表达(即，多核苷酸的转录和/或翻译)的启动子和终止子调控元件。农杆菌属诸如根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)或发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)的转移DNA(T-DNA)及其人造变体/突变体可能是转移核酸中研究最为透彻的实例。另一个实例是得自植物的包含T-DNA边界样序列的P-DNA(“植物DNA”)。
如本文所用，″T-DNA″是指(例如)根癌农杆菌Ti质粒或发根农杆菌Ri质粒的T-DNA，或其作为T-DNA发挥作用的人造变体。T-DNA可以包括同时包含左右边界序列的整个T-DNA，但只需要包含转移所需的顺式最小序列，即右侧T-DNA边界序列。本发明的T-DNA已插入它们之间，位于左右侧边界序列(如果存在)之间的任何位置，所关注的多核苷酸的侧翼为位点特异性重组酶的靶点。编码将T-DNA转移到植物细胞所需的因子的反式序列诸如vir基因可以插入T-DNA，或者可以存在于与T-DNA相同的复制子上，或优选地以反式存在于农杆菌属宿主的相容复制子上。此类“二元载体系统”在本领域是熟知的。
如本文所用，″P-DNA″是指从植物基因组分离的转移核酸或其人造变体/突变体，并在每个末端或只在一个末端包含T-DNA边界样序列。边界样序列优选与得自农杆菌属诸如根癌农杆菌或发根农杆菌的T-DNA边界序列共有至少50%、至少60%、至少70%、至少75%、至少80%、至少90%或至少95%但低于100%的序列同一性。因此，P-DNA可用于替代T-DNA从(例如)农杆菌属将P-DNA内所含的核苷酸序列转移到另一细胞。P-DNA在插入待转移的外源多核苷酸之前可以进行修饰以有利于克隆并且应当优选不编码任何蛋白质。P-DNA的特征在于至少包含右侧边界序列并优选地也包含左侧边界序列。
如本文所用，转移核酸的“边界”序列可从所选的生物诸如植物或细菌中分离，或者可以为其人造变体/突变体。边界序列促进并有利于其所连接的多核苷酸的转移，并可有利于其在受体细胞基因组中的整合。在一个实施方案中，边界序列的长度介于5-100个碱基对(bp)之间、10-80bp之间、15-75bp之间、15-60bp之间、15-50bp之间、15-40bp之间、15-30bp之间、16-30bp之间、20-30bp之间、21-30bp之间、22-30bp之间、23-30bp之间、24-30bp之间、25-30bp之间或26-30bp之间。农杆菌属T-DNA的边界序列在本领域中是熟知的，并包括Lacroix等(2008)、Tzfira和Citovsky(2006)和Glevin(2003)所述的那些。
虽然在传统上仅使用农杆菌属将基因转移到植物细胞，但是现今已鉴定/开发了大量的系统可按类似于农杆菌属的方式发挥作用。最近已对多种非农杆菌属物种遗传修饰，从而能够用于基因转移(Chung等，2006；Broothaerts等，2005)。它们包括根瘤菌属(Rhizobium sp.)NGR234、苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)和百脉根中慢生根瘤菌(Mezorhizobiumloti)。通过向细菌提供转化过程所需的机制使细菌能够用于基因转移，该机制即一组通过农杆菌属Ti质粒编码的毒力基因以及位于单独的小二元质粒上的T-DNA区段。以此方式工程化的细菌能够转化不同的植物组织(叶盘、愈伤组织和椭圆形组织)、单子叶植物或双子叶植物，以及各种不同的植物物种(如烟草、水稻)。
在几十年前，通过哺乳动物细胞与携带质粒的大肠杆菌(Escherichiacoli)的原生质体的融合，首次实现了真核表达质粒从细菌到真核宿主的直接转移(Schaffner,1980)。从那时起，能够将基因递送进哺乳动物细胞的细菌数量稳定增长(Weiss,2003)，由四个小组独立地发现(Sizemore等1995；Courvalin等，1995；Powell等，1996；Darji等，1997)。
已通过弗氏志贺菌(Shigella flexneri)的毒力质粒(pWR100)使得具有侵袭性的减活弗氏志贺菌、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)或大肠杆菌已表明能够在侵入宿主细胞后转移表达质粒并因代谢衰减而在细胞内死亡。经鼻或经口腔粘膜施用此类重组志贺氏杆菌或沙门氏菌引起了针对表达质粒所编码的抗原的免疫反应。同时，已证实能在体内外将表达质粒转移到哺乳动物宿主细胞的细菌名单已翻了一倍以上，并针对伤寒沙门菌(S.typhi)、猪霍乱沙门菌(S.choleraesuis)、单核细胞增多性李斯特菌(Listeriamonocytogenes)、假结核耶尔森氏菌(Yersinia pseudotuberculosis)和小肠结肠炎耶尔森氏茵(Y.enterocolitica)进行了记述(Fennelly等，1999；Shiau等，2001；Dietrich等，1998；Hense等，2001；Al-Mariri等，2002)。
一般来讲，可以假定，所有能够进入宿主细胞(如弗氏志贺菌或单核细胞增多性李斯特菌)胞质溶胶并在此细胞区室内裂解的细菌都应当能够转移DNA。这称为“顿挫”或“自杀”侵入，因为细菌必须裂解才能使DNA发生转移(Grillot-Courvalin等，1999)。此外，甚至许多留在吞噬液泡中的细菌(如鼠伤寒沙门氏菌)也有此能力。因此，已工程化为侵袭性但不能逃离吞噬体的重组大肠杆菌实验室菌株却能将它们的质粒负荷递送到感染哺乳动物细胞的细胞核(Grillot-Courvalin等，1998)。此外，最近也已表明根癌农杆菌能将转基因引入哺乳动物细胞(Kunik等，2001)。
如本文所用，术语“转染”、“转化”及其变型形式通常可互换使用。“转染的”或“转化的”细胞可经过操纵引入所关注的多核苷酸，或者可以为从其衍生的后代细胞。
重组细胞
本发明还提供重组细胞，例如，重组植物细胞，其为通过本文所定义的一种或多种多核苷酸或载体或它们的组合转化的宿主细胞。术语“重组细胞”与术语“转基因细胞”在本文可互换使用。本发明的合适细胞包括可通过编码(例如)本文所述的多肽或酶的本发明多核苷酸或重组载体转化的任何细胞。该细胞优选为因此能够用于生产脂质的细胞。重组细胞可以是培养中的细胞、体外或生物(诸如植物)中或器官(诸如种子或叶子)中的细胞。优选地，细胞在植物中，更优选在植物的种子中。
向其中引入多核苷酸的宿主细胞可以是非转化细胞或已通过至少一种核酸转化的细胞。此类核酸可以与脂质合成相关或不相关。本发明的宿主细胞可以内源性地(即，天然地)能够产生本文所定义的多肽，在此情况下，从其衍生的重组细胞具有增强的产生所述多肽的能力，或者仅在用本发明的至少一种多核苷酸转化后才能产生所述多肽。在一个实施方案中，本发明的重组细胞具有增强的产生非极性脂质的能力。
本发明的宿主细胞可以是能够产生至少一种本文所述的蛋白质的任何细胞，并包括细菌、真菌(包括酵母)、寄生虫、节肢动物、动物、藻类和植物细胞。细胞可以是原核或真核的。优选的宿主细胞为酵母、藻类和植物细胞。在一个优选的实施方案中，植物细胞为种子细胞，具体地讲，为种子子叶或胚乳中的细胞。在一个实施方案中，细胞为动物细胞。动物细胞可以为任何类型的动物细胞，诸如非人动物细胞、非人脊椎动物细胞、非人哺乳动物细胞或水生动物细胞，诸如鱼或甲壳纲动物、无脊椎动物、昆虫等。节肢动物的非限制性实例包括昆虫细胞，诸如秋粘虫(Spodopterafrugiperda)(Sf)细胞，例如Sf9、Sf21；粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)细胞和果蝇S2细胞。可用作本发明宿主细胞的细菌细胞的实例为聚球藻属(Synechococcus spp.)(也称为集胞藻属(Synechocystis spp.))，例如细长聚球藻(Synechococcus elongatus)。可用作本发明宿主细胞的藻类细胞的实例包括(例如)衣藻属(Chlamydomonas sp.)(例如莱茵衣藻(Chlamydomonasreinhardtii))、杜氏藻属(Dunaliella sp.)、红球藻属(Haematococcus sp.)、小球藻属(Chlorella sp.)、破囊壶菌属(Thraustochytrium sp.)、裂殖壶菌属(Schizochytrium sp.)和团藻属(Volvox sp.)。
用于表达本发明核酸的宿主细胞可以包括在宽范围的温度和pH值下在多种原料(包括简单或复杂碳水化合物、有机酸和醇和/或烃)上生长的微生物宿主。优选的微生物宿主为能够天然合成非极性脂质的油脂性生物。
宿主细胞可以是适合发酵方法的生物，诸如解脂耶氏酵母(Yarrowialipolytica)或其他酵母。
转基因植物
本发明还提供包含本发明的外源多核苷酸或多肽、本发明的细胞、本发明的载体或它们的组合的植物。术语“植物”是指整个植株，而术语“其部分”是指植物器官(如叶子、茎干、根部、花朵、果实)、单个细胞(如花粉)、种子、种子部分(诸如胚芽、胚乳、盾片或种皮)、植物组织(诸如脉管组织)、植物细胞及其子代。如本文所用，植物部分包括植物细胞。
如本文所用，术语“植物”以其最广泛的含义使用。这包括但不限于草、观赏或装饰性植物、农作物或谷类(如油料种子、玉米、大豆)、秣料或草料、水果或蔬菜植物、草药植物、木本植物、花卉植物或树的任何物种。这不表示将植物限制到任何特定的结构。它还指单细胞植物(如微藻)。关于植物的术语“其部分”是指植物细胞及其子代，大量分化成集落的多个植物细胞(如团藻属)、在植物发育的任何阶段存在的结构、或植物组织。此类结构包括但不限于叶子、茎干、花朵、果实、坚果、根部、种子、种皮、胚芽。术语“植物组织”包括植物的分化和未分化组织，包括存在于叶子、茎干、花朵、果实、坚果、根部、种子中的那些，例如胚芽组织、胚乳、皮组织(如表皮、周皮)、脉管组织(如木质部、韧皮部)或基本组织(包括薄壁组织、厚角组织和/或厚壁组织细胞)以及培养中的细胞(如单细胞、原生质体、愈伤组织、胚芽等)。植物组织可以在原位，在器官培养、组织培养或细胞培养中。
“转基因植物”、“遗传修饰的植物”或其变型形式是指包含不存在于相同物种、品种或品系的野生型植物中的转基因的植物。在本发明背景下定义的转基因植物包括使用重组技术进行遗传修饰以导致在所需的植物或其部分中产生本文所定义的至少一种多核苷酸的植物及其子代。转基因植物部分具有相应的含义。
术语“种子”和“粮食”可互换使用。“粮食”是指成熟的粮食，诸如收获的粮食或仍在植物上但已准备收获的粮食，但根据上下文也可以指吸胀或发芽后的粮食。成熟的粮食通常具有低于约18-20%的含水量。如本文所用的“发育种子”是指成熟前的种子，通常存在于受精或开花后的植物生殖结构中，但也可以指从植物中分离的成熟前的此类种子。
如本文所用，术语“植物贮藏器官”是指特化的以贮藏(例如)蛋白质、碳水化合物、脂质形式的能量的植物部分。植物贮藏器官的实例为种子、果实、块状根和块茎。本发明的优选植物贮藏器官为种子。
如本文所用，术语“表型正常的”是指遗传修饰的植物或其部分，尤其是贮藏器官，诸如本发明的种子、块茎或果实，它们与未修饰的植物或其部分相比时生长和繁殖能力无明显降低。在一个实施方案中，表型正常的遗传修饰植物或其部分包含编码可操作地连接到植物贮藏器官特异性启动子的沉默抑制子的重组多核苷酸，并具有基本上与不含所述多核苷酸的相应植物或其部分相同的生长或繁殖能力。优选地，所产生的活力种子的生物质、生长速率、发芽速率、贮藏器官大小、种子大小和/或数量当与不含所述重组多核苷酸的植物在相同的条件下生长时不低于该不含所述重组多核苷酸的植物的相应指标的90%。这个术语不涵盖可以不同于野生型植物但不影响将植物用于商业用途的植物特征，诸如幼苗叶片的ballerina表型。
本发明提供的或设想用于实践本发明的植物既包括单子叶植物也包括双子叶植物。在优选的实施方案中，本发明的植物为农作物(例如谷类和豆类、玉米、小麦、马铃薯、木薯、水稻、高粱、小米、大麦或豌豆)或其他豆科植物。植物可以生长产生可食用的根部、块茎、叶子、茎干、花朵或果实。植物可以是蔬菜或观赏植物。本发明的植物可以为：玉米(Zea mays)、油菜(甘蓝型油菜、白菜型油菜)、其他芸苔属植物，诸如芜菁甘蓝(Brassicanapobrassica)或Brassica camelina、甜菜(Beta vulgaris)、三叶草(Trifoliumsp.)、亚麻(Linum usitatissimum)、苜蓿(Medicago sativa)、水稻(Oryza sativa)、裸麦(Secale cerale)、高粱(两色高梁、高粱)、向日葵(Helianthus annus)、小麦(Tritium aestivum)、大豆(Glycine max)、烟草(Nicotiana tabacum)、马铃薯(Solanum tuberosum)、花生(Arachis hypogaea)、棉花(Gossypium hirsutum)、甘薯(Lopmoea batatus)、木薯(Manihot esculenta)、咖啡(Cofea spp.)、椰子(Cocos nucifera)、菠萝(Anana comosus)、柑橘树(Citrus spp.)、可可(Theobromacacao)、茶(Camellia senensis)、香蕉(Musa spp.)、鳄梨(Persea americana)、无花果(Ficus casica)、番石榴(Psidium guajava)、芒果(Mangifer indica)、橄榄(Olea europaea)、番木瓜(Carica papaya)、腰果(Anacardium occidentale)、夏威夷果(Macadamia intergrifolia)、杏仁(Prunus amygdalus)、甜菜(Betavulgaris)、燕麦或大麦。
其他优选的植物包括C4草类植物，诸如大须芒草(Andropogon gerardi)、垂穗草(Bouteloua curtipendula)、细格兰马草(B.gracilis)、野牛草(Buchloedactyloides)、柳枝稷(Panicum virgatum)、裂稃草(Schizachyrium scoparium)、芒草属例如异源三倍体芒草奇岗和中国芒、印度草(Sorghastrum nutans)、曲折鼠尾粟(Sporobolus cryptandrus)、柳枝稷(Panicum virgatum)；C3草类植物，诸如加拿大披碱草(Elymus canadensis)、豆科植物头状胡枝子(Lespedezacapitata)和Petalostemum villosum、非禾本草本植物Aster azureus；以及木本植物，诸如Quercus ellipsoidalis和大果栎(Q.macrocarpa)。
在一个优选的实施方案中，植物为被子植物。
在一个实施方案中，植物为油料种子植物，优选为油料种子农作物。如本文所用，“油料种子植物”是用于从植物种子商业生产脂质的植物物种。油料种子植物可以是油菜籽(诸如芥花)、玉米、向日葵、红花、大豆、高粱属、亚麻(亚麻籽)或甜菜。此外，油料种子植物可以是其他芸苔属植物、棉花、花生、罂粟、芜菁甘蓝、芥菜、蓖麻、芝麻、红花或产坚果植物。植物可以在其果实中产生高水平的脂质，诸如橄榄、油棕或椰子。本发明适用的园艺植物为莴苣、菊苣或蔬菜类芸苔属植物，包括卷心菜、西兰花或菜花。本发明可应用于烟草属植物、葫芦科植物、胡萝卜、草莓、番茄或胡椒。
在一个优选的实施方案中，转基因植物对于已引入的每一个基因(转基因)为纯合的，使得其子代不发生所需表型的分离。转基因植物也可对于引入的转基因为杂合的，优选对于转基因为均匀杂合的，诸如在通过杂交种子生长成的F1子代中。此类植物可提供本领域熟知的多种优点，诸如杂种优势。
相关时，转基因植物还可以包含附加的编码产生非极性脂质时涉及到的酶的转基因，诸如但不限于LPAAT、LPCAT、PAP或磷脂:二酰基甘油酰基转移酶(PDAT1、PDAT2或PDAT3，参见例如Ghosal等，2007)或它们中两种或更多种的组合。本发明的转基因植物还可以通过外源多核苷酸表达油体蛋白。
植物的转化
转基因植物可使用本领域已知的技术而产生，诸如通常在Slater等，Plant Biotechnology-The Genetic Manipulation of Plants,Oxford UniversityPress(2003),以及Christou和Klee,Handbook of Plant Biotechnology,JohnWiley and Sons(2004)中所述的那些技术。
如本文所用，术语“稳定转化”、“稳定转化的”及其变型形式是指多核苷酸整合到细胞基因组中使得它们在细胞分裂过程中转移到后代细胞而无需对它们的存在进行阳性选择。稳定的转化体或其子代可通过本领域已知的任何方法进行选择，诸如对染色体DNA的Southern印迹或基因组DNA的原位杂交。
农杆菌属介导的转移是将基因引入植物细胞的广泛使用的系统，因为可以将DNA引入整个植物组织、植物器官或植物培养中的外植体中的细胞，从而瞬时表达或将DNA稳定整合到植物细胞基因组中。使用农杆菌属介导的植物整合载体将DNA引入植物细胞在本领域是熟知的(参见例如US5177010、US 5104310、US 5004863或US 5159135)。待转移的DNA区域通过边界序列限定，并且通常将间插DNA(T-DNA)插入植物基因组中。进一步地，T-DNA的整合是相对精确的过程，很少导致重排。在其中农杆菌属介导的转化是有效的那些植物品种中，这是首选的方法，原因在于基因转移的容易性和确定性。优选的农杆菌转化载体能够在大肠杆菌以及农杆菌属中复制，从而允许方便地操纵，如文献所述(Klee等，In:Plant DNAInfectious Agents,Hohn和Schell编辑,Springer-Verlag,New York,pp.179-203(1985))。
可用的加速方法包括(例如)微弹轰击法(microprojectile bombardment)等。将转化核酸分子递送进植物细胞的方法的一个实例为微弹轰击法。该方法在Yang等，Particle Bombardment Technology for Gene Transfer,OxfordPress,Oxford,England(1994)中进行了综述。非生物性粒子(微弹)可用核酸包被并通过推进力递送进细胞。示例性粒子包括由钨、金、铂等构成的那些。微弹轰击法的特定优点除了是可再生转化单子叶植物的有效手段外还在于既不需要分离原生质体也不需要农杆菌属感染的易感性。用于通过加速将DNA递送进玉米细胞的方法的示例性实施方案为生物弹道α粒子递送系统，其可用于通过丝网诸如不锈钢或Nytex丝网将包被有DNA的粒子推进到覆盖有悬浮培养的玉米细胞的过滤器表面上。适于与本发明一起使用的粒子递送系统为可得自Bio-Rad Laboratories的氦气加速PDS-1000/He基因枪。
对于轰击，可将悬浮细胞浓缩在过滤器上。将含待轰击的细胞的过滤器设置在微弹阻档板下方的合适距离处。如果需要，还将一个或多个丝网设置在基因枪与待轰击的细胞之间。
可选择地，将未成熟的胚或其他靶细胞布置在固体培养基上。将待轰击的细胞设置在微弹阻档板下方的合适距离处。如果需要，还将一个或多个丝网设置在加速装置与待轰击的细胞之间。通过使用本文所述的技术，可以获得瞬时表达标记基因的细胞的多达1000个或更多个病灶。轰击后48小时一个病灶中表达基因产物的细胞的数量通常在一个到十个的范围内，平均一个到三个。
在轰击转化中，可以优化轰击前的培养条件和轰击参数，以得到最大数量的稳定转化体。在该技术中，轰击的物理和生物参数均具有重要意义。物理因素是涉及操纵DNA/微弹沉淀(microprojectile precipitate)的那些因素或影响大子弹或微弹飞行和速度的那些因素。生物因素包括在轰击前以及紧接轰击后操纵细胞时涉及到的所有步骤，有助于缓解轰击相关创伤的靶细胞渗透调节，以及转化DNA的性质诸如线性化DNA或完整的超螺旋质粒。据信，轰击前操纵对于成功转化未成熟的胚特别重要。
在另一个备选实施方案中，质粒可以稳定转化。针对在高等植物中进行质粒转化所公开的方法包括含有选择标记并通过同源重组将DNA靶向质粒基因组的DNA的粒子枪递送(US 5,451,513、US 5,545,818、US5,877,402、US 5,932479和WO 99/05265)。
因此，预期人们可能希望在小规模研究中调整轰击参数的各个方面以全面优化轰击条件。可能尤其希望调整物理参数诸如间隙距离、飞行距离、组织距离和氦气压力。还可能通过修改影响受体细胞生理状态并因此可影响转化和整合效率的条件而最小化创伤减少因素。例如，可以调节渗透状态、组织水合和传代培养阶段或受体细胞的细胞周期以实现最优转化。按照本公开，执行其他常规调节将是本领域技术人员已知的。
植物原生质体的转化可使用基于磷酸钙沉淀、聚乙二醇处理、电穿孔和这些处理的组合的方法而实现。将这些系统应用于不同的植物品种取决于从原生质体再生该特定植物菌株的能力。从原生质体再生谷物的示例性方法已有所描述(Fujimura等，1985；Toriyama等，1986；Abdullah等，1986)。
其他细胞转化方法也可使用，并且包括但不限于通过将DNA直接转移进花粉、通过将DNA直接注射进植物的生殖器官或通过将DNA直接注射进未成熟胚的细胞然后通过干燥胚的再水合而将DNA引入植物。
通过单个植物原生质体转化株或通过各种转化的外植体实现植物的再生、发育和培养在本领域是熟知的(Weissbach等，见于Methods for PlantMolecular Biology,Academic Press,San Diego,Calif.,(1988))。该再生和生长过程通常包括选择转化细胞、通过胚发育的通常阶段培养那些个体化细胞、通过生根苗阶段的步骤。使转基因胚和种子相似地再生。之后，将所得的转基因生根芽植入合适的生长培养基中，诸如土壤。
包含异体外源基因的植物的发育或再生在本领域是熟知的。优选地，使再生的植物自花受粉以提供纯合的转基因植物。或者，将得自再生植物的花粉异花授粉到在农学上重要谱系的由种子长成的植物。反之，将得自这些重要谱系的植物的花粉用于对再生植物授粉。将本发明的包含所需多核苷酸的转基因植物用本领域技术人员熟知的方法进行培养。
转化双子叶植物(主要通过使用根癌农杆菌)并获得转基因植物的方法已有公布，如棉花(US 5,004,863,US 5,159,135,US 5,518,908)、大豆(US5,569,834,US 5,416,011)、芸苔属植物(US 5,463,174)、花生(Cheng等，1996)和豌豆(Grant等，1995)。
转化谷类植物诸如小麦和大麦以通过引入外源核酸而将遗传变异引入植物以及通过原生质体或未成熟植物胚再生植物的方法在本领域是熟知的，参见(例如)CA 2,092,588、AU 61781/94、AU 667939、US 6,100,447、PCT/US97/10621、US 5,589,617、US 6,541,257，以及其他方法在WO99/14314中有所阐述。优选地，转基因小麦或大麦植株通过根癌农杆菌介导的转化过程而产生。携带所需多核苷酸的载体可引入可再生的小麦组织培养植株或外植体的细胞，或合适的植物系统诸如原生质体。
可再生的小麦细胞优选得自未成熟胚的盾片、成熟胚、由它们衍生的愈伤组织、或分生组织。
为了确认转基因在转基因细胞和植物中的存在性，可使用本领域技术人员已知的方法进行聚合酶链反应(PCR)扩增或Southern印迹分析。可根据产物性质按多种方式的任何一种检测转基因的表达产物，并包括Western印迹和酶测定法。定量测定不同植物组织中的蛋白表达并检测复制的一种尤其有用的方式是使用报告基因，诸如GUS。一旦得到转基因植物后，可让它们生长以产生具有所需表型的植物组织或部分。可以收获植物组织或植物部分，和/或收集种子。种子可用作长成其组织或部分具有所需特性的另外植物的来源。
使用农杆菌属或其他转化方法形成的转基因植物通常在一条染色体上包含单个遗传基因座。此类转基因植物对于添加的基因可称为半合子的。更优选的是对于添加的基因为纯合的转基因植物，即包含两个添加的基因的转基因植物，一个基因位于染色体对每条染色体上的相同基因座。纯合的转基因植物可通过使半合子转基因植物自株传粉、使产生的其中一些种子发芽以及分析所得植物的所关注基因而获得。
还应当了解，包含两个独立分离外源基因或基因座的两种不同的转基因植物也可异花授粉(配育)以产生包含两组基因或基因座的后代。合适的F1子代的自花受精可产生对于两种外源基因或转座子为纯合的植物。还可以想到亲本植株的回交以及与非转基因植物的异交，如营养繁殖。常用于不同性状和农作物的其他育种方法的描述可见于Fehr,Breeding Methods forCultivar Development,Wilcox J.编辑，American Society of Agronomy,Madison Wis.(1987)。
TILLING
在一个实施方案中，TILLING(定向诱导基因组局部突变技术)可用于产生其中内源基因被敲除的植物，例如，编码以下酶的基因：DGAT、sn-1甘油-3-磷酸酰基转移酶(GPAT)、1-酰基-甘油-3-磷酸酰基转移酶(LPAAT)、酰基辅酶A:溶血卵磷脂酰基转移酶(LPCAT)、磷脂酸磷酸酶(PAP)或它们中两种或更多种的组合。
在第一步骤中，通过以下方法在一组植物中诱导引入的突变，诸如新的单一碱基对变化：用化学诱变剂处理种子(或花粉)，然后使植物生长到突变将稳定遗传的世代。提取DNA，并从种群的所有成员保存种子，以形成可随时间反复获取的资源。
对于TILLING分析，设计PCR引物以特异性扩增所关注的单个基因靶标。如果靶标是基因家族的成员或多倍体基因组的部分，则特异性特别重要。接下来，可用染料标记的引物从多个个体的混合DNA扩增PCR产物。使这些PCR产物变性和再次退火以允许形成错配的碱基对。错配或异源双链代表了均天然存在的单核苷酸多态性(SNP)(即，种群的多个植株可能携带相同的多态性)和诱导SNP(即，只有极少的单独植株可能显示突变)。形成异源双链后，使用识别和裂解错配DNA的内切酶诸如CelI是发现TILLING种群内的新型SNP的关键。
使用该方法，可以筛选数千种植物以鉴定在基因组的任何基因或特定区域中具有单碱基变化以及小插入或缺失(1-30bp)的任何个体。进行分析的基因组片段的大小可以为0.3至1.6kb之间的任何值。每次分析达8倍共用(pooling)、1.4kb片段(略去片段的末端，在末端中SNP检测会因噪音而存在问题)和96道，这一组合允许单次分析可筛选基因组DNA的高达一百万个碱基对，从而使得TILLING成为一种高通量技术。
TILLING进一步见述于Slade和Knauf(2005)以及Henikoff等(2004)。
除了实现突变的高效检测外，高通量TILLING技术是检测自然多态性的理想选择。因此，通过与已知序列构建异源双链来探查未知的同源DNA可揭露多态位点的数量和位置。核苷酸变化以及小插入和缺失均进行鉴定，包括至少一些重复数多态性。这称为Ecotilling(Comai等，2004)。
每个SNP由其在一些核苷酸内的大致位置而记录。因此，各单倍型可基于其迁移率而归档。序列数据可通过用于错配裂解测定的相同扩增DNA的等分试样以相对小的增量努力获得。用于单一反应的左端或右端测序引物通过其与多态性的接近度而选择。Sequencher软件执行多重比对并发现碱基变化，这在每种情况下确认了凝胶带。
Ecotilling的执行可比完整测序(当前用于大多数SNP发现的方法)更加便宜。可对包含生态型DNA阵列的平板进行筛选，而不是得自经诱变处理的植物的DNA池。由于检测在近乎碱基对分辨率的凝胶上进行，并且背景图案是均匀交叉的泳道，具有相同大小的条带可以匹配，从而在单个步骤中发现SNP并进行基因分型。以此方式，SNP的终极测序简单而高效，基于用于筛选的相同PCR产物的等分试样也可用来进行DNA测序这一事实而尤其如此。
提高外源RNA水平和稳定化表达
转录后基因沉默(PTGS)是一种既可靶向细胞也可靶向病毒mRNA以发生降解的核苷酸序列特异性防御机制。PTGS发生在通过重组多核苷酸稳定或瞬时转化的植物或真菌中，并导致与引入的多核苷酸具有序列相似性的RNA分子的积聚减少。
可通过在植物或其部分的贮藏器官中限制沉默抑制子的表达而使RNA分子水平升高，和/或使RNA分子水平稳定数代。如本文所用，“沉默抑制子”是可以在植物细胞中表达的任何多核苷酸或多肽，其提高植物细胞中不同转基因的表达产物的水平，尤其是从最初转化的植物起经历数代。在一个实施方案中，沉默抑制子是病毒沉默抑制子或其突变体。大量的病毒沉默抑制子在本领域是已知的，并包括但不限于P19、V2、P38、Pe-Po和RPV-P0。合适的病毒沉默抑制子的实例包括在WO 2010/057246中所述的那些。沉默抑制子可在本发明的植物或其部分中稳定表达。
如本文所用，术语“稳定表达”或其变型形式是指当与不含编码沉默抑制子的外源多核苷酸的相应植物相比时经历数代(例如至少三代、至少五代或至少十代)后在子代植物中基本上相同或更高的RNA分子水平。然而，该术语不排除经历数代后与前一代相比时存在一定程度的RNA分子水平损失的可能性，例如，每代不低于10%的损失。
抑制子可选自任何来源，例如植物、病毒、哺乳动物等。抑制子可以为(例如)：
兽棚病毒B2，
黄金葛潜伏病毒P14，
黄金葛潜伏病毒AC2，
非洲木薯花叶病毒AC4，
秋葵黄脉花叶病C2，
秋葵黄脉花叶病C4，
秋葵黄脉花叶病βC1，
番茄褪绿病毒p22，
番茄褪绿病毒CP，
番茄褪绿病毒CPm，
番茄金色花叶病毒AL2，
番茄曲叶Java病毒βC1，
番茄黄化曲叶病毒V2，
中国番茄黄化曲叶病毒C2，
中国番茄黄化曲叶病毒Y10分离株βC1，
番茄黄化曲叶病毒以色列分离株V2，
绿豆黄色花叶病毒豇豆AC2，
木槿褪绿环斑病毒CP，
芜菁皱缩病毒P38，
芜菁皱缩病毒CP，
花椰菜花叶病毒P6，
甜菜黄化病毒p21，
柑橘衰退病毒p20，
柑橘衰退病毒p23，
柑橘衰退病毒CP，
豇豆花叶病毒SCP，
甘薯褪绿矮化病毒p22，
黄瓜花叶病毒2b，
番茄不孕病毒HC-Pro，
甜菜曲顶病毒L2，
土壤传播小麦花叶病毒19K，
大麦条纹花叶病毒Gammab，
早熟禾半潜病毒Gammab，
花生簇生病毒P15，
稻矮小病毒Pns10，
南瓜蚜传黄化病毒P0，
甜菜西黄病毒P0，
马铃薯病毒X P25，
黄瓜脉黄化病毒P1b，
李痘病毒HC-Pro，
甘蔗花叶病毒HC-Pro，
马铃薯病毒Y株HC-Pro，
烟草蚀纹病毒P1/HC-Pro，
芜菁花叶病毒P1/HC-Pro，
鸭茅斑驳病毒P1，
鸭茅斑驳病毒挪威分离株P1，
水稻黄斑驳病毒P1，
水稻黄斑驳病毒尼日利亚分离株P1，
水稻白叶病毒NS3，
水稻条纹病毒NS3，
十字花科感染烟草花叶病毒126K，
十字花科感染烟草花叶病毒p122，
烟草花叶病毒p122，
烟草花叶病毒126，
烟草花叶病毒130K，
烟草脆裂病毒16K，
番茄丛矮病毒P19，
番茄斑萎病毒NSs，
苹果褪绿叶斑病毒P50，
葡萄病毒A p10，
BYV p21的葡萄卷叶相关病毒-2同源物，
以及它们的变体/突变体。以上列表提供了可从其获得抑制子的病毒，以及各特定病毒的抑制子的蛋白质(如B2、P14等)或编码区命名。
可以使用一种抑制子的多个拷贝。可以一起使用不同的抑制子(例如，一前一后地)。
期望在植物贮藏器官中表达的基本上任何RNA分子均可与沉默抑制子共表达。RNA分子可影响农学性状、抗昆虫性、抗病性、抗除草剂性、不育性、粮食特性等。编码的多肽可涉及在脂质、淀粉、碳水化合物、营养物等的代谢中，或可负责蛋白质、肽、脂质、蜡、淀粉、糖、碳水化合物、香气、气味、毒素、类胡萝卜素、激素、聚合物、类黄酮、贮藏蛋白、酚醛酸、生物碱、木质素、纤维素、糖蛋白、糖脂等的合成。
在一个特定实例中，植物产生升高水平的酶，以在植物如芸苔属植物，例如油料种子油菜或向日葵、红花、亚麻、棉花、大豆或玉米中产生脂质。
非极性脂质的产生
在本领域经常用于实践的技术可用于提取、加工、纯化和分析本发明细胞、生物或其部分产生的非极性脂质。此类技术在诸如以下文献资源中有所描述和解释：Fereidoon Shahidi,Current Protocols in Food AnalyticalChemistry,John Wiley&Sons,Inc.(2001)D1.1.1-D1.1.11以及Perez-Vich等(1998)。
种子油的产生
通常，将植物种子煮熟、压榨和/或提取以产生粗制种子油，然后脱胶、精炼、脱色和除臭。一般来讲，破碎种子的技术是本领域已知的。例如，可通过向油料种子喷水以将含水量提高到(例如)8.5%而使油料种子缓和，然后使用间隙设为0.23至0.27mm的平滑辊压成薄片。取决于种子的类型，在破碎前可不加水。施热使酶失活、有利于进一步破碎细胞、合并脂质、产生液滴以及聚集蛋白颗粒，所有这些都有利于提取过程。
大部分种子油在通过螺旋榨油机后释放出来。螺旋榨油机排出的油饼然后使用伴热柱通过溶剂提取，例如通过己烷提取。可选择地，可使通过压榨作业产生的粗制种子油通过具有槽线排放盖的沉降槽，以除去在压榨作业期间与种子油榨出的固体。可使澄清的种子油通过板框压滤机以除去任何剩余的细固体颗粒。如果需要，可将通过提取过程回收的种子油与澄清的种子油合并以产生混合的粗制种子油。
将溶剂从粗制种子油除去后，使压榨和提取的部分合并，然后接受正常的脂质加工工序(即，脱胶、碱炼、脱色和除臭)。脱胶可通过以下方法进行：将浓磷酸加入粗制种子油以将不可水化的磷脂转化成可水化的形式以及螯合存在的微量金属。通过离心将胶从种子油中分离。种子油可通过加入足量的氢氧化钠溶液以滴定所有脂肪酸并除去因此形成的皂而精炼。
除臭可通过在真空下将种子油加热到260℃并以大约0.1ml/分钟/100ml种子油的速率将蒸汽缓慢引入种子油而进行。鼓泡约30分钟后，使种子油在真空下冷却。通常将种子油转移到玻璃容器中，用氩气吹扫，然后冷藏。如果种子油的量有限，可将种子油放在真空下，例如在Parr反应器中，然后加热到260℃持续与除臭会采用的相同时长。该处理改善种子油的色泽，并除去大部分挥发性物质。
用于产生脂质的植物生物质
光合作用中涉及到的植物部分(例如，高等植物和水生植物诸如藻类的茎干和叶子)也可用于产生脂质。与植物的类型无关，有多种方法可从绿色生物质中提取脂质。一种方式是物理提取，其通常不使用溶剂提取。这是一种使用多种不同类型的机械提取的“传统”方式。榨油机压榨提取是常见的类型，如螺旋榨油机和冲压机提取方法。使用这些方法提取的脂质的量差异很大，具体取决于所用的植物材料和机械过程。机械提取的效率通常不如下文所述的溶剂提取高。
在溶剂提取中，将有机溶剂(如，己烷)至少与遗传修饰的植物绿色生物质混合，优选在使绿色生物质干燥和研磨后。当然，除了绿色生物质外的其他植物部分(例如，含脂质的种子)也可进行研磨和混合。溶剂使生物质等部分中的脂质溶解，形成的溶液然后通过机械作用(例如，通过上文的压榨过程)而与生物质分离。该分离步骤也可通过过滤(如，使用压滤机或类似装置)或离心等方法进行。然后，可使有机溶剂与非极性脂质分离(如，通过蒸馏)。该第二分离步骤从植物产生非极性脂质，并且在采用常规蒸气回收时可得到能重复利用的溶剂。
藻类燃料的产生
藻产业是一种涉及种植藻类物种(包括微藻类，也称为浮游植物、微植物或浮游藻类，以及大型藻类，通常称为海藻)的水产养殖形式。可用于本发明的藻类物种包括(例如)衣藻属(例如莱茵衣藻)、杜氏藻属、红球藻属、小球藻属、破囊壶菌属、裂殖壶菌属和团藻属。
商业和工业藻类养殖具有许多用途，包括生产食品配料、食品和藻类燃料。
单一或混合藻类培养可在开放池塘(诸如水沟类池塘和湖泊)或光生物反应器中进行。
藻类可使用微孔筛网、通过离心、通过絮凝(使用例如脱乙酰壳多糖、矾和氯化铁)以及通过泡沫浮选而收获。中断二氧化碳供应可使藻类自身絮凝，这称为“自絮凝”。在泡沫浮选中，养殖机向水通气形成泡沫，然后从水面撇去藻类。超声和其他收获方法当前正在开发中。
脂质可通过机械破碎从藻类分离。当干燥藻类时，藻类保持其脂质含量，然后可通过榨油机“榨出”。由于不同的藻株在其物理特性方面差异巨大，对于特定类型的藻类，多种榨油机构造(螺旋、挤压、活塞等)更有效。
渗透压休克有时用于从藻类释放细胞成分，诸如脂质。渗透压休克是渗透压的急剧降低，并可导致溶液中的细胞发生破裂。
超声提取可加速提取过程，尤其是用于从藻类提取脂质的酶法提取过程。超声波用于在溶剂材料中产生空化气泡。当这些气泡在细胞壁附近破灭时，所产生的冲击波和液体射流导致这些细胞壁破碎并将它们的内含物释放进溶剂。
化学溶剂(例如，己烷、苯、石油醚)常用于从藻类中提取脂质。索氏提取可用于在特殊玻璃器皿中在回流下用有机溶剂反复洗涤或渗漉而从藻类中提取脂质。
酶法提取可用于从藻类中提取脂质。酶法提取以水作为溶剂使用酶降解细胞壁。酶法提取可通过超声波处理加以支持。
超临界CO2也可用作溶剂。在该方法中，CO2在压力下液化，并加热到变为超临界状态(同时具有液体和气体的性质)从而允许其作为溶剂的点。
用于脂质生产的发酵方法
如本文所用，术语“发酵方法”是指任何发酵方法或包括发酵步骤的任何工艺。发酵方法包括但不限于：用于生产醇(如乙醇、甲醇、丁醇)、有机酸(如柠檬酸、乙酸、衣康酸、乳酸、葡萄糖酸)、酮(如丙酮)、氨基酸(如谷氨酸)、气体(如H2和CO2)、抗生素(如青霉素和四环素)、酶、维生素(如核黄素、β-胡萝卜素)和激素的发酵方法。发酵方法还包括用于消耗品酒业(如啤酒和葡萄酒)、乳品业(如发酵奶制品)、皮革业和烟草业。优选的发酵方法包括本领域熟知的酒精发酵方法。优选的发酵方法为本领域熟知的厌氧发酵方法。合适的发酵细胞通常为能够发酵的微生物，也就是说，将诸如葡萄糖或麦芽糖的糖类直接或间接转化成所需的发酵产物。发酵微生物的实例包括真菌生物，诸如酵母，优选为含油生物。如本文所用，“含油生物”是积聚的干重的至少25%为三甘油酯的生物。如本文所用，“酵母”包括酵母属、酿酒酵母、卡尔酵母(Saccharomyces carlbergensis)、假丝酵母属(Candida spp.)、克鲁维酵母属(Kluveromyces spp.)、毕赤酵母属(Pichia spp.)、汉逊酵母属(Hansenula spp.)、木霉属(Trichoderma spp.)、斯达氏油脂酵母(Lipomyces starkey)和解脂耶氏酵母。优选的酵母包括解脂耶氏酵母或其他含油酵母和酵母属菌株，尤其是酿酒酵母。
转基因微生物优选在使脂肪酸生物合成基因和酰基转移酶基因活性最佳的条件下生长。这导致最多、最经济地产生脂质。一般来讲，可以优化的培养基条件包括碳源的类型和量、氮源的类型和量、碳氮比、氧气水平、生长温度、pH、生物质生产期的长度、脂质积聚期的长度和细胞收获时间。
发酵培养基必须包含合适的碳源。合适的碳源可包括但不限于：单糖(如葡萄糖、果糖)、二糖(如乳糖、蔗糖)、寡糖、多糖(如淀粉、纤维素或其混合物)、糖醇(如甘油)或得自可再生原料(如干酪乳清渗透物、玉米浸泡液、糖用甜菜糖蜜、大麦麦芽)的混合物。另外，碳源可包括烷烃、脂肪酸、脂肪酸酯、单甘油酯、二甘油脂、三甘油酯、磷脂和各种脂肪酸商业来源，包括植物油(如大豆油)和动物脂肪。另外，碳底物可包括一碳底物(如二氧化碳、甲醇、甲醛、甲酸盐、含碳的胺)，已证实了它们代谢转化成关键的生物化学中间体。因此，预期用于本发明的碳源可涵盖多种含碳底物，并且将只受宿主微生物的选择的限制。虽然所有上述碳底物及其混合物源预计均适用于本发明，但优选的碳底物为糖和/或脂肪酸。最优选的是葡萄糖和/或含10-22个碳的脂肪酸。
氮可由无机(如(NH4)2SO4)或有机源(如尿素、谷氨酸盐)供应。除了合适的碳源和氮源外，发酵培养基还可以包含合适的矿物质、盐、辅因子、缓冲剂、微生素和本领域技术人员已知适于微生物生长并促进脂质生产所必需的酶途径的其他组分。
合适的发酵pH范围通常在约pH 4.0至pH 8.0之间，其中pH 5.5至pH7.0是初始生长条件的优选范围。发酵可在有氧或无氧条件下进行，其中微氧条件是优选的。
通常，含油微生物细胞中高水平脂质的积聚需要两个阶段的过程，因为代谢状态必需在生长与脂肪合成/贮藏之间得到“平衡”。因此，最优选地，两阶段发酵过程是在微生物中生产脂质所必需的。在该方法中，发酵的第一阶段是为了生成和积聚细胞群，并且特征在于快速的细胞生长和细胞分裂。在发酵的第二阶段，优选的是确立培养中的缺氮条件，以促进高水平的脂质积聚。该缺氮的作用是为了降低细胞中的AMP有效浓度，从而降低线粒体的NAD依赖性异柠檬酸脱氢酶的活性。当这种情况发生时，柠檬酸将会积聚，从而在细胞质中形成丰富的乙酰辅酶A库，并引发脂肪酸合成。因此，这一阶段的特征在于细胞分裂终止，然后是脂肪酸的合成和TAG的积聚。
虽然细胞通常在大约30℃生长，但一些研究已表明在较低的温度下不饱和脂肪酸的合成增加。基于工艺的经济性，在两阶段发酵的第一阶段后，当出现大量微生物生长时，该温度漂移应该可能发生。
预期，可以采用多种发酵方法设计，其中使用本发明的核酸进行脂质商业生产是所需的。例如，由重组微生物宿主商业化生产脂质可通过分批发酵、分批补料发酵或连续发酵方法而进行。
分批发酵方法是一个封闭的系统，其中培养基组成在工艺开始时设定并且在工艺过程中除了维持pH和氧气水平所需的那些外不进一步添加物料。因此，在培养过程开始时，将培养基用所需的生物接种，不用向培养基添加另外的底物(即，碳源和氮源)即允许生长或代谢活性发生。在分批工艺中，系统的代谢物和生物质组成不断变化，直到停止培养时。在典型的分批工艺中，细胞温和通过静态停滞期到快速生长对数期，最后到静止期，其中生长速率降低或停止。如果不进行处理，静止期的细胞将最终死亡。标准分批工艺的变型形式为分批补料工艺，其中在发酵方法过程中将底物连续加入发酵罐。分批补料发酵也适用于本发明。分批补料工艺可用在分解代谢产物阻抑倾向于抑制细胞代谢时或者其中希望在任何一个时间培养基中具有有限量的底物的情况。分批补料系统中底物浓度的测量是困难的，因此可以基于可测因素诸如pH、溶解氧和废气(如，CO2)分压的变化而进行估计。分批和分批补料培养方法是普通的方法，在本领域中是熟知的，实例可见于Brock,Biotechnology:A Textbook of Industrial Microbiology,第2版,Sinauer Associates,Sunderland,Mass.,(1989)；或Deshpande和Mukund(1992)。
使用本发明的细胞商业生产脂质也可通过连续发酵方法而实现，其中将限定培养基连续加到生物反应器中，同时将等量体积的培养基移除以回收产物。连续培养通常以恒定的细胞密度将细胞维持在生长的对数期。连续或半连续培养方法允许调节影响细胞生长或终产物浓度的一个因素或任何多个因素。例如，一种方法可限制碳源并允许所有其他参数减弱代谢。在其他系统中，影响生长的多个因素可连续改变，而通过培养基浊度衡量的细胞浓度则保持不变。连续系统力求维持稳态生长，因此由于从培养中吸走培养基，细胞生长速率必须与细胞损失保持平衡。调节连续培养工艺的营养物和生长因子的方法以及使产物形成速率最大化的技术在工业微生物学领域是熟知的，上文的Brock对多种方法进行了详细介绍。
包括PUFA的脂肪酸可以游离脂肪酸或酯化形式诸如酰基甘油、磷脂、硫脂或糖脂存在于宿主微生物中，并可通过本领域熟知的多种手段从宿主细胞中提取。
一般来讲，用于纯化包括PUFA的脂肪酸的手段可包括有机溶剂提取、超声处理、超临界提取(如，使用二氧化碳)、皂化以及诸如压榨的物理手段，或它们的组合。尤其关注的是在存在水的情况下用甲醇和氯仿提取(Bligh和Dyer,1959)。需要时，可将含水层酸化以使带负电的部分质子化，并因此提高所需产物向有机层中的分配。提取后，可在氮气流下通过蒸发除去有机溶剂。当以共轭形式分离时，可使产物通过酶法或化学方法裂解以释放出所关注的游离脂肪酸或不太复杂的共轭物，然后可接受进一步的操纵以产生所需的终产物。有利地，脂肪酸的共轭形式可用氢氧化钾裂解。
如果需要进一步的纯化，可采用标准方法。此类方法可包括提取、尿素处理、分离结晶、HPLC、分馏、硅胶层析、高速离心或蒸馏或这些技术的组合。反应性基团诸如酸或链烯基的保护可通过已知的技术(如，烷化、碘化)在任何步骤进行。所用的方法包括将脂肪酸甲基化产生甲酯。相似地，可在任何步骤除去保护基团。有利地，包含GLA、STA、ARA、DHA和EPA的馏分的纯化可通过尿素处理和/或分馏而实现。
脂质的用途
通过所述方法产生的脂质具有多种用途。在一些实施方案中，将脂质用作食用油。在其他实施方案中，将脂质精炼并用作润滑剂或用于其他工业用途，诸如塑料合成。在一些优选的实施方案中，将脂质精炼以生产生物柴油。
生物柴油
生物柴油或烷基酯的生产是熟知的。有三种通过脂质产生酯的基本路线：1)通过醇进行脂质的碱催化酯交换反应；2)通过甲醇进行脂质的直接酸催化酯化反应；以及3)将脂质转化成脂肪酸，然后通过酸催化形成烷基酯。
在一些优选的实施方案中，使脂质发生酯交换反应以产生甲酯和甘油。在一些优选的实施方案中，使脂质与醇(诸如甲醇或乙醇)在存在催化剂(氢氧化钾或氢氧化钠)的情况下反应以产生烷基酯。烷基酯可用于生物柴油或与基于石油的燃料共混。
饲料
本发明包括可用作饲料的组合物。出于本发明的目的，“饲料”包括供人或动物消耗(包括供肠道和/或非肠道消耗)的任何食物或制剂，当进入体内时其：(1)起到滋养或增长组织或供能的作用，和/或(2)维持、恢复或支持足够的营养状况或代谢功能。本发明的饲料包括针对婴儿和/或幼儿的营养组合物。
本发明的饲料包括(例如)本发明的细胞、本发明的植物、本发明的植物部分、本发明的种子、本发明的提取物、本发明方法的产物、本发明发酵方法的产物、或与合适载体一起的组合物。术语“载体”以其最广泛的含义使用以涵盖可以或可以不具有营养价值的任何组分。如本领域技术人员将会知道，载体必须适用于(或以足够低的浓度用于)饲料，使得其对消耗饲料的生物不产生有害作用。
本发明的饲料包含通过使用本文所公开的方法、细胞或生物直接或间接产生的脂质。组合物可以为固体或液体形式。另外，组合物可以包含特定用途所需量的可食用大量营养素、维生素和/或矿物质。这些成分的量将随组合物是旨在用于正常个体还是用于具有特殊需求的个体诸如患有代谢疾病等的个体而变化。
无营养价值的合适载体的实例包括但不限于诸如食用脂肪、碳水化合物和蛋白质的大量营养素。此类食用脂肪的实例包括但不限于椰子油、琉璃苣油、真菌油、黑醋栗油、大豆油以及单-和二-甘油酯。此类碳水化合物的实例包括但不限于葡萄糖、食用乳糖和水解淀粉。另外，可用于本发明的营养组合物的蛋白质的实例包括但不限于大豆蛋白、电渗析乳清、电渗析脱脂乳、乳清或这些蛋白质的水解产物。
关于维生素和矿物质，可将以下成分添加到本发明的饲料组合物中：钙、磷、钾、钠、氯化物、镁、锰、铁、铜、锌、硒、碘和微生素A、E、D、C和B族。也可以添加其他此类维生素和矿物质。
用于本发明的饲料组合物的组分可以具有半纯化或纯化起源。所谓半纯化或纯化是指通过天然材料的纯化或通过从头合成制备的材料。
本发明的饲料组合物还可以添加到食物中，甚至在不需要膳食补充时。例如，可将该组合物添加到任何类型的食物中，包括但不限于人造黄油、改性黄油、奶酪、牛奶、酸奶、巧克力、糖果、小吃、色拉油、烹调用油、烹调用脂肪、肉类、鱼肉和饮料。
酵母属用于酿造啤酒和葡萄酒，以及作为烘培尤其是面包中的配料。酵母是蔬菜提取物的主要成分。酵母还用作动物饲料中的添加剂。将显而易见的是，可提供适于合成本文所述的脂质的遗传修饰酵母菌株。这些酵母菌株然后可用于食物和葡萄酒及啤酒酿造以提供具有提高的脂质含量的产品。
另外，根据本发明产生的脂质或经转化以包含和表达主题基因的宿主细胞也可用作动物食物补充剂以改变动物组织或牛奶脂肪酸组成以更适合人或动物消耗。此类动物的实例包括羊、牛、马等。
此外，本发明的饲料可用于水产养殖以提高鱼中的脂肪酸水平供人或动物消耗。
本发明的优选饲料为可直接用作人或其他动物的食物或饲料的植物、种子和其他植物部分诸如叶子、果实和茎干。例如，动物可直接吃在田野中生长的此类植物或以控制摄食的方式喂养更加定量的量。本发明包括将此类植物和植物部分用作饲料，以提高人和其他动物中的多不饱和脂肪酸水平。
组合物
本发明还涵盖包含使用本发明的方法产生的一种或多种脂质的组合物，尤其是药物组合物。
药物组合物可包含与标准、熟知、无毒药学上可接受的载体、佐剂或媒介物诸如磷酸盐缓冲盐水、水、乙醇、多元醇、蔬菜油、润湿剂或乳剂诸如水/油乳剂相结合的一种或多种脂质。组合物可以为液体或固体形式。例如，组合物可以为片剂、胶囊、可摄取液体、粉末、外用膏剂或霜剂的形式。适当的流动性可(例如)通过就分散剂而言维持所需的粒度以及通过使用表面活性剂而维持。还可能可取的是包含等渗剂，例如糖、氯化钠等。除了此类惰性稀释剂外，组合物还可包含佐剂，诸如润湿剂、乳化及助悬剂、甜味剂、矫味剂和芳香剂。
混悬剂除了活性化合物外还可包含助悬剂，诸如乙氧基化异十八烷醇、聚氧乙烯山梨糖醇和脱水山梨糖醇酯、微晶纤维素、氢氧化铝氧化物、膨润土、琼脂和黄蓍胶或这些物质的混合物。
固体剂型诸如片剂和胶囊剂可使用本领域熟知的技术制备。例如，根据本发明产生的脂质可和与粘合剂诸如阿拉伯树胶、玉米淀粉或明胶，崩解剂诸如马铃薯淀粉或藻酸以及润滑剂诸如硬脂酸或硬脂酸镁相结合的常规片剂基料诸如乳糖、蔗糖和玉米淀粉一起压片。胶囊可通过将这些赋形剂与抗氧化剂和相关脂质一起装入明胶胶囊中而制备。
对于静脉内施用，根据本发明产生的脂质或其衍生物可掺入商业制剂中。
特定脂肪酸的典型剂量为0.1mg至20g，每天使用一至五次(每天最多100g)，并优选在每天约10mg至约1、2、5或10g的范围内(以一个或多个剂量使用)。如本领域所已知，最低约300mg/天的脂肪酸，特别是多不饱和脂肪酸是可取的。然而，应当理解任何量的脂肪酸将有益于受试者。
本发明的药物组合物的可能施用途径包括(例如)肠道和非肠道。例如，可经口施用液体制剂。另外，均匀混合物可完全分散于水中，在无菌条件下与生理上可接受的稀释剂、防腐剂、缓冲剂或推进剂混合以形成喷雾剂或吸入剂。
待施用给受试者的组合物的剂型可由本领域的普通技术人员决定，并取决于多种因素，诸如受试者的体重、年龄、总体健康状况、既往史、免疫状态等。
另外，本发明的组合物可用于美容目的。该组合物可加到现有美容组合物中使得形成混合物，或者可将根据本发明产生的脂肪酸用作美容组合物中唯一的“活性”成分。
多肽
术语“多肽”和“蛋白质”通常可互换使用。
一种多肽或一类多肽可通过其氨基酸序列与参考氨基酸序列的同一性程度(百分比同一性)或通过与一个参考氨基酸序列比与另一个参考氨基酸序列具有更高的百分比同一性而限定。多肽与参考氨基酸序列的百分比同一性通常通过GAP分析(Needleman和Wunsch,1970；GCG程序)以空位形成罚分=5和空位延伸罚分=0.3的参数而确定。查询序列的长度为至少100个氨基酸，GAP分析在至少100个氨基酸的区域上比对两个序列。甚至更优选地，查询序列的长度为至少250个氨基酸，GAP分析在至少250个氨基酸的区域上比对两个序列。甚至更优选地，GAP分析在整个长度上比对两个序列。所述一种多肽或一类多肽可具有与参考多肽相同的酶活性、或不同的活性或无活性。优选多肽的酶活性为参考多肽的活性的至少10%。
如本文所用，“生物活性片段”是本发明的多肽的一部分，其保持了全长参考多肽的限定活性，例如MGAT活性。如本文所用的生物活性片段不包括全长多肽。生物活性片段可以为任何大小的部分，只要它们保持限定的活性即可。优选地，生物活性片段保持全长多肽活性的至少10%。
至于限定的多肽或酶，应当理解高于本文所提供的那些数值的百分比同一性数值将涵盖优选的实施方案。因此，适用时，按照最低百分比同一性数值，优选的是，多肽/酶所含的氨基酸序列与相关的命名SEQ ID NO至少60%、更优选至少65%、更优选至少70%、更优选至少75%、更优选至少80%、更优选至少85%、更优选至少90%、更优选至少91%、更优选至少92%、更优选至少93%、更优选至少94%、更优选至少95%、更优选至少96%、更优选至少97%、更优选至少98%、更优选至少99%、更优选至少99.1%、更优选至少99.2%、更优选至少99.3%、更优选至少99.4%、更优选至少99.5%、更优选至少99.6%、更优选至少99.7%、更优选至少99.8%甚至更优选至少99.9%相同。
本文所限定的多肽的氨基酸序列突变体可通过将合适的核苷酸变化引入本文所限定的核酸或通过体外合成所需的多肽而制备。此类突变体包括(例如)氨基酸序列内残基的缺失、插入或置换。可使缺失、插入和置换的组合出现在最终构建体中，前提条件是最终多肽产物具有所需的特性。
突变(改变)的多肽可使用本领域已知的任何技术例如使用定向进化或合理设计策略(见下文)而制备。衍生自突变/改变的DNA的产物可使用本文所述的技术容易地筛选，以确定它们是否具有酰基转移酶活性，例如MGAT、DGAT或GPAT/磷酸酶活性。
在设计氨基酸序列突变体时，突变位点的位置和突变的性质将取决于待修饰的特性。突变位点可例如通过以下方式单独地或连续地进行修饰：(1)根据实现的结果首先通过保守氨基酸选择然后通过更激进的选择进行取代，(2)使目标残基缺失，或(3)邻近定位的位点插入其他残基。
氨基酸序列缺失通常在约1至15个残基、更优选约1至10个残基，通常约1至5个邻接残基的范围内。
置换突变体具有至少一个在多肽中移除的氨基酸残基以及在其位置插入的不同残基。置换诱变最受关注的位点包括鉴定为活性位点的位点。所关注的其他位点为其中得自各品系或物种的特定残基为相同的那些位点。这些位置可以对生物活性具有重要意义。这些位点，特别是落在至少三个其他相同保守位点的序列内的那些位点，优选以相对保守的方式置换。此类保守置换在表1中以“示例性置换”的标题示出。
在一个优选的实施方案中，突变体/变体多肽与天然存在的多肽相比时只具有或不超过一个或两个或三个或四个保守氨基酸变化。保守氨基酸变化的详细信息在表1中提供。技术人员将会意识到，此类微小的变化可合理地预测为当在重组细胞中表达时不改变多肽的活性。
表1.示例性置换
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定向进化
在定向进化中，将随机诱变应用于蛋白质，并将选择方案用于挑选出具有所需质量(例如增强的酰基转移酶活性)的变体。然后应用更多轮的突变和选择。典型的定向进化策略涉及三个步骤：
1)多样化：使编码所关注的蛋白质的基因随机突变和/或重组以创建大型基因变体文库。变体基因文库可通过易错PCR(参见例如Leung,1989；Cadwell和Joyce,1992)由通过亲本模板制备的DNA酶I消化片段库(Stemmer,1994a；Stemmer,1994b；Crameri等，1998；Coco等，2001)、由简并寡核苷酸(Ness等，2002,Coco,2002)或由两者的混合物或甚至由未消化的亲本模板(Zhao等，1998；Eggert等，2005；Jezequek等，2008)构建，并通常通过PCR组装。文库也可由通过同源或非同源重组体内或体外重组的亲本序列而制备(Ostermeier等，1999；Volkov等，1999；Sieber等，2001)。变体基因文库还可通过将所关注的基因亚克隆进合适的载体、将载体转化进“致突变”菌株诸如大肠杆菌XL-1红(Stratagene)然后使转化细菌繁殖合适的代数而构建。变体基因文库也可通过使所关注的基因接受DNA改组(即，通过随机片段化和重新组装而体外同源重组所选突变基因的库)而构建，如Harayama(1998)大体描述。
2)选择：使用筛选或选择测试文库具有所需特性的突变体(变体)的存在性。筛选使得能够手动鉴定和分离高性能突变体，而选择则自动消除所有非功能性突变体。筛选可涉及筛选已知保守氨基酸基序的存在性。可选择地或除此之外，筛选可涉及在宿主生物或其部分中表达突变的多核苷酸以及通过(例如)以下方式测定酰基转移酶活性水平：定量从生物或其部分提取的脂质中所得产物的水平，以及测定生物或其部分的提取脂质中相对于不含突变多核苷酸的相应生物或其部分的产物水平并任选地表达亲本(未突变的)多核苷酸。可选择地，筛选可涉及向生物或其部分供给未标记的底物以及测定生物或其部分中相对于不含突变多核苷酸的相应生物或其部分的底物或产物水平并任选地表达亲本(未突变的)多核苷酸。
3)扩增：使选择或筛选中鉴定的变体复制许多倍，从而使得研究人员能够对它们的DNA测序以便掌握发生了什么突变。
这三个步骤一起称为定向进化的“轮”。大多数实验将采用多于一轮。在这些实验中，将前一轮的“获胜者”在下一轮中多样化，以产生新的文库。在实验结束时，将所有进化的蛋白质或多核苷酸突变体使用生物化学方法进行表征。
合理设计
蛋白质可基于已知的蛋白质结构和折叠相关信息而合理设计。这可通过对草稿的设计(从头设计)或基于天然支架的重新设计而实现(参见例如Hallinga,1997；以及Lu和Berry,Protein Structure Design and Engineering,Handbook of Proteins2,1153-1157(2007))。蛋白质设计通常涉及鉴定折叠成给定或目标结构的序列并可使用计算机模型而实现。计算机蛋白质设计算法搜索当折叠成目标结构时能量较低的序列的序列-构象空间。计算机蛋白质设计算法使用蛋白质能量学模型评价突变将如何影响蛋白质的结构和功能。这些能量函数通常包括分子力学、统计学(即，基于知识的)和其他经验术语的组合。合适的可用软件包括IPRO(Interative Protein Redesign andOptimization)、EGAD(A Genetic Algorithm for Protein Design)、RosettaDesign、Sharpen和Abalone。
还包括在本发明范围内的是本文所定义的多肽，其在合成期间或合成后(例如)通过以下方式差异修饰：生物素化、苄基化、糖基化、乙酰化、磷酸化、酰胺化、通过已知保护/封闭基团衍生化、蛋白水解裂解、连接到抗体分子或其他细胞配体等。这些修饰可起到提高本发明的多肽的稳定性和/或生物活性的作用。
酰基转移酶的鉴定
在一个方面，本发明提供鉴定以下核酸分子的方法，该核酸分子编码在细胞中产生MAG、DAG和/或TAG的能力升高的酰基转移酶。
该方法包括获得这样的细胞，其包含的核酸分子编码可操作地连接到在细胞中具有活性的启动子的酰基转移酶。核酸分子可编码天然存在的酰基转移酶诸如MGAT、GPAT和/或DGAT或其突变体。可使用本领域的标准程序(参见上文)使突变体工程化，诸如通过对所关注的已知基因执行随机诱变、定向诱变或饱和诱变，或通过使不同的基因进行DNA改组。例如，可使用(例如)易错PCR和/或DNA改组，使包含编码MGAT的选自SEQ IDNO:1至44任一序列的多核苷酸随机突变和/或重组，以创建大型基因变体(突变体)文库。可基于包含保守氨基酸基序对突变体进行选择以进一步研究。例如，就编码MGAT的候选核酸而言，技术人员可在测试核酸是否编码功能性MGAT突变体(通过例如转染进宿主细胞诸如植物细胞，并测定酰基转移酶(即MGAT)活性，如本文所述)之前确定核酸是否包含SEQ ID NO:220、221、222、223和/或224所提供的序列。核酸或其片段的直接PCR测序可用于确定精确的核苷酸序列以及推导相应的氨基酸序列并因此鉴定保守氨基酸序列。基于保守氨基酸序列的简并引物可用于直接PCR扩增。简并引物还可用作DNA杂交测定中的探针。可选择地，保守氨基酸序列可在利用以下物质的蛋白质杂交测定中检测，例如：特异性结合到保守氨基酸序列的抗体，或特异性结合到保守氨基酸序列的底物，诸如结合FLXLXXXN(推定的中性脂质结合结构域；SEQ ID NO:224)的脂质。
在一个实施方案中，该核酸分子包含编码MGAT的核苷酸序列。核苷酸序列可i)包含选自SEQ ID NO:1至44任一序列，ii)编码包含具有SEQ IDNO:45至82任一所提供的序列的氨基酸的多肽或其生物活性片段，iii)与i)或ii)至少50%相同，或iv)在严格条件下与i)至iii)的任一杂交。在另一个或附加的实施方案中，该核酸分子包含编码SEQ ID NO:220、221、222、223和224所提供的一种或多种保守DGAT2和/或MGAT1/2氨基酸序列的核苷酸序列。在一个优选的实施方案中，该核酸分子包含编码SEQ ID NO:220和/或SEQ ID NO:224所提供的保守氨基酸序列的核苷酸序列。
在另一个实施方案中，该核酸分子包含编码GPAT、优选具有磷酸酶活性的GPAT的核苷酸序列。核苷酸序列可i)包含选自SEQ ID NO:84至141的任一序列，ii)编码包含具有SEQ ID NO:144至201任一所提供的序列的氨基酸多肽或其生物活性片段，iii)与i)或ii)至少50%相同，或iv)在严格条件下与i)至iii)的任一杂交。在另一个或附加的实施方案中，该核酸分子包含编码SEQ ID NO:225、226和227所提供的一种或多种保守GPAT氨基酸序列，或与其至少50%、优选至少60%、更优选至少65%相同的氨基酸序列的核苷酸序列。
在另一个实施方案中，该核酸分子包含编码DGAT2的核苷酸序列。核苷酸序列可包含i)选自SEQ ID NO:204至211任一的序列，ii)编码包含具有SEQ ID NO:212至219任一所提供序列的氨基酸的多肽或其生物活性片段，iii)与i)或ii)至少50%相同，或iv)在严格条件下与i)至iii)的任一杂交。在一个优选的实施方案中，DGAT2包含SEQ ID NO:204的核苷酸序列和/或编码包含具有SEQ ID NO:212所提供的序列的氨基酸的多肽的核苷酸序列。
包含编码可操作地连接到在细胞中具有活性的启动子的酰基转移酶的核酸分子的细胞可使用本领域的标准程序获得，诸如通过将核酸分子引入细胞，方式例如为磷酸钙沉淀、聚乙二醇处理、电穿孔以及这些处理的组合。细胞转化的其他方法也可使用并包括但不限于通过直接DNA转移或注射将DNA引入植物。转化的植物细胞也可使用如本文所述的农杆菌属介导的转移和加速方法获得。
该方法进一步包括使用本领域已知的技术诸如在实施例1中示例性示出的那些技术测定细胞中产生的MAG、DAG和/或TAG水平与不含该核酸的相应细胞相比时是否升高。例如，可在氯仿/甲醇溶液中提取脂质，干燥，以及通过薄层层析(TLC)分离。TAG、DAG、MAG、游离脂肪酸和其他脂质的鉴定可在碘蒸气染色后用脂质内标进行确认。所得的色谱图可使用PhosphorImager进行分析并根据已知量的内标对MAG、DAG和TAG的量进行定量，或者可选择地，可向细胞供给sn-2单油酰基甘油[14C]或[14C]甘油-3-磷酸，并通过液闪计数法对相关放射性进行定量(即，对标记的MAG、DAG和TAG的量进行定量)。
该方法进一步包括鉴定编码在细胞中产生MAG、DAG和/或TAG的能力升高的酰基转移酶的核酸分子。在优选的实施方案中，酰基转移酶催化MGAT途径中的酶反应。在进一步优选的实施方案中，DAG通过MGAT途径而升高(即，脂肪酰基辅酶A对MAG的酰化通过MGAT催化形成DAG)。在另一个或附加的实施方案中，底物MAG通过也具有磷酸酶活性的GPAT而产生和/或DAG通过DGAT和/或具有DGAT活性的MGAT由脂肪酰基辅酶A酰化形成TAG。
实施例
实施例1.一般材料和方法
以瞬时表达系统在植物细胞中表达基因
使用基本上如Voinnet等(2003)和Wood等(2009)所述的瞬时表达系统使基因在植物细胞中表达。将二元载体引入根癌农杆菌菌株AGL1，该二元载体含有通过强组成型e35S启动子表达的编码区，该启动子包含重复的增强子区域。将用于表达p19病毒沉默抑制子的嵌合二元载体35S:p19单独地引入AGL1，如WO2010/057246中所述。使重组细胞在补充了50mg/L卡那霉素和50mg/L利福平的LB肉汤中在28℃下生长到静止期。然后使细菌在室温下以5000g离心沉淀5分钟，之后在含有10mM MES pH 5.7、10mM MgCl2和100μM乙酰丁香酮的浸润缓冲液中重悬到OD600=1.0。然后，将细胞在28℃下振荡温育3小时，之后测量OD600，将达到OD600=0.125最终浓度所需体积的各培养物(包含35S:p19)加到新的管中。最终体积用上述缓冲液补足。然后将叶子用培养混合物浸润，而植株通常在浸润后再生长三到五天，之后回收叶圆片用于纯化的细胞裂解物制备或总脂质分离。对照浸润为只有35S:p19菌株。
纯化的叶裂解物测定
将之前如上所述浸润的本氏烟叶子组织在含有0.1M磷酸钾缓冲液(pH7.2)和0.33M蔗糖的溶液中用玻璃匀化器研磨。将叶匀浆物在4℃下以20,000g离心45分钟，之后收集各上清液。各上清液中的蛋白质含量根据Bradford(1976)使用Wallac1420多标记计数仪和Bio-Rad蛋白测定染料试剂(Bio-Rad Laboratories,Hercules,CA USA)进行测量。酰基转移酶测定根据作了一些修改的Cao等(2007)方法使用100μg蛋白。反应培养基含有100mMTris-HCl(pH 7.0)、5mM MgCl2、1mg/mL BSA(无脂肪酸)、200mM蔗糖、40mM冷油酰基辅酶A、16.4μM sn-2单油酰基甘油[14C](55mCi/mmol,American Radiochemicals,Saint Louis,MO USA)或6.0μM[14C]甘油-3-磷酸(G-3-P)二钠盐(150mCi/mmol,American Radiochemicals)。测定进行7.5、15或30分钟。
脂质分析
通过叶裂解物测定来分析脂质
将得自裂解物测定的脂质用氯仿:甲醇:0.1M KCl(2:1:1)提取并回收。将样品中不同的脂质类别在用10%硼酸浸渍过的硅胶60薄层层析(TLC)板(MERCK,Dermstadt,Germany)上分离。用于从脂质提取物中分级分离TAG的溶剂体系由氯仿/丙酮(90/10v/v)组成。各脂质类别通过将平板暴露于碘蒸气而显色，并通过在相同的TLC平板上运行平行可信标准品而鉴定。将平板过夜暴露于磷成像屏，通过Fujifilm FLA-5000磷屏成像仪进行分析，之后液闪计数以进行DPM定量。
总脂质分离和分级分离
如Bligh and Dyer(1959)所述，将组织冷冻干燥、称重并提取总脂质。将各样品中不同的脂质类别在硅胶60TLC板上分离。用于分级分离中性脂质(NL)和极性脂质(PL)的溶剂体系由己烷/乙醚/乙酸(70/30/1v/v/v)组成。各脂质类别通过将平板暴露于碘蒸气而显色，并通过在相同的TLC平板上运行平行可信标准品而鉴定。
为了确定脂质样品中的脂肪酸组成，通过如下方法产生NL(包括TAG、DAG和/或MAG)和PL部分的脂肪酸甲酯(FAME)：从TLC板中移除相应的条带，并将它们在80℃下与已知量的作为内标的十六酸一起在甲醇/HCl/二氯甲烷(10/1/1v/v/v)溶液中温育2小时。将FAME在己烷/DCM中提取，在己烷中浓缩到小体积，然后进样到气相色谱仪。
脂质馏分中存在的各脂肪酸和总脂肪酸(TFA)的量通过测定各峰下面积而定量，并通过与已知量内标的峰面积进行比较而计算。
毛细管气-液色谱(GC)
使用配有EquityTM-1熔融石英毛细管柱(15m x 0.1mm内径，0.1μm膜厚)、FID、分流/不分流进样器以及Agilent Technologies7683系列自动样品器和进样器的Agilent Technologies 6890N气相色谱仪(Palo Alto,California,USA)通过气相色谱(GC)对FAME进行分析。将氦气用作载气。在120℃的柱箱温度下以不分流模式进样。进样后，将柱箱温度以10℃.min-1升至270℃，最后以5℃.min-1升至310℃。
通过Agilent Technologies ChemStation软件(Rev B.03.01(317),PaloAlto,California,USA)对峰进行定量。
酿酒酵母H1246中的DGAT测定
酿酒酵母菌株H1246因四个基因(DGA1、LRO1、ARE1、ARE2)中的敲除突变而完全没有DGAT活性并缺乏TAG和甾醇酯。将游离脂肪酸(如1mM 18:1Δ9)加入H1246生长培养基中在不存在DGAT活性的情况下是有毒的。在此类培养基上的生长可因此用作此酵母菌株中存在DGAT活性的指标或用于选择该活性的存在性。
将酿酒酵母H1246用pYES2构建体(阴性对照)、编码pYES2中拟南芥DGAT1的构建体或编码pYES2中小家鼠MGAT2的构建体转化。向转化体供给[14C]18:1Δ9游离脂肪酸。
在单独的实验中，将酿酒酵母H1246用pYES2构建体(阴性对照)、编码pYES2中Bernadia pulchella DGAT1的构建体或编码pYES2中小家鼠MGAT1的构建体转化，并供给18:1Δ9游离脂肪酸。用pYES2转化的酿酒酵母S288C野生型菌株作为阳性对照。
将酵母转化体重悬在无菌mQ水中，稀释到OD600=1。将样品以四个连续稀释度进一步稀释，每次以1/10进行。将2μL各稀释液与2μL mQ水和2μL未转化的H1246细胞悬液(OD600=1)一起点样在各平板上(YNBD、YNBG、YNBG+FA)。将平板在30℃下温育6天，然后对生长进行评分。
各平板培养基，每块平板40mL培养基
·YNBD：不含尿嘧啶，含有2%葡萄糖、0.01%NP40和100μL乙醇的最小省却培养基。
·YNBG：不含尿嘧啶，含有2%半乳糖、1%棉子糖、0.01%NP40和100μL乙醇的最小省却培养基。
·YNBG+FA：不含尿嘧啶，含有溶于100μL乙醇的2%半乳糖、1%棉子糖、0.01%NP40和1M C18:1Δ9的最小省却培养基。
实施例2.单酰基甘油酰基转移酶在植物细胞中的组成型表达
MGAT1
使用如实施例1中所述的瞬时表达系统，在本氏烟叶子组织中证实了小家鼠基因编码的单酰基甘油酰基转移酶1(MGAT1)(Yen等，2002)和在这里用作与MGAT1比较的拟南芥二酰基甘油酰基转移酶(DGAT1)(Bouvier-Nave等，2000)的酶活性。
通过在T4DNA聚合酶处理后将含有35S启动子的PstI片段插入载体pORE04的SfoI位点使末端钝化而制备命名为35S-pORE04的载体(Coutu等，2007)。通过Geneart合成对甘蓝型油菜进行密码子优化的编码小家鼠MGAT1的嵌合DNA，并命名为0954364_MGAT_pMA。通过将EcoRI片段内所含的0954364_MGAT_pMA的整个编码区在EcoRI位点插入35S-pORE04而制备命名为35S:MGAT1并编码小家鼠MGAT1(Genbank登录号Q91ZV4)以在植物细胞中表达的嵌合DNA。含有35S:MGAT1构建体的载体命名为pJP3184。相似地，通过将BamHl-EcoRV片段内所含的pXZP513E的整个编码区在BamHl-EcoRV位点插入35S-pORE04而制备编码拟南芥DGAT1(Genbank登录号AAF19262)以在植物细胞中表达的嵌合DNA 35S:DGAT1。含有35S:DGAT1构建体的载体命名为pJP2078。
将嵌合载体引入根癌农杆菌菌株AGL1中，这些培养物的细胞在24℃生长室中浸润进本氏烟植株的叶子组织中。为了能够进行样品之间的直接比较以及减少叶子之间的变化，对进行比较的样品在同一叶子的两侧上浸润。一式三份地进行实验。浸润后，使植物再生长三天，之后获取叶圆片，冷冻干燥，对从样品中提取的脂质进行分级分离和定量，如实施例1中所述。该分析表明，MGAT1和DGAT1基因起到增加本氏烟中叶子油水平的作用，具体如下。
仅用35S:p19构建体(阴性对照)转化的叶子组织含有每mg叶子干重平均4μg衍生自DAG的游离脂肪酸(FFA)以及每mg叶子干重平均5μg衍生自TAG的FFA。用35S:p19和35S:DGAT1构建体(DGAT1表达的对照)转化的叶子组织含有每mg叶子干重平均4μg衍生自DAG的FFA以及每mg叶子干重平均22μg衍生自TAG的FFA。用35S:p19和35S:MGAT1构建体转化的叶子组织含有每mg叶子干重平均8μg衍生自DAG的FFA以及每mg叶子干重平均44μg衍生自TAG的FFA。用35S:p19、35S:DGAT1和35S:MGAT1构建体转化的叶子组织所含的DAG或TAG水平没有在35S:p19和35S:MGAT1浸润中观察到的那些水平高(图2)。另外，在MGAT表达后，与p19对照或DGAT1样品相比，观察到种子中饱和物质的水平降低(表2)。
上述数据表明MGAT1酶在促进叶子组织中DAG和TAG两者积聚方面远比DGAT1酶的活性高。与表达DGAT1时相比，MGAT1基因的表达导致叶子组织中的TAG和DAG的积聚达两倍高。考虑到MGAT是一种在小鼠肠中表达的酶，而小鼠肠是与植物叶子大相径庭的生物系统，因此该结果非常令人吃惊并出乎意外。该研究首次证实了植物细胞中的异位MGAT表达。
用小家鼠MGAT1浸润的叶子组织相对于仅用拟南芥DGAT1浸润的叶子组织积聚了两倍高的DAG和TAG。鉴于小鼠MGAT只具有如DGAT的非常低的活性，TAG的产生效率也令人吃惊并出乎意外。用编码MGAT1和DGAT1两者的基因浸润的叶子组织相比仅有MGAT1的叶子样品并未积聚明显更多的TAG。图1是各种TAG积聚途径的图示，它们中的大多数均在DAG处汇合，DAG是脂质合成中的中心分子。例如，MAG、DAG和TAG可通过各种酶活性(包括转酰基化、脂肪酶、MGAT、DGAT和PDAT)而相互之间转化。在MGAT表达后也注意到了饱和物质水平的降低。
MGAT2
通过将EcoRI片段内所含的整个MGAT2编码区在EcoRI位点插入35S-pORE04而制备命名为35S:MGAT2并编码小家鼠MGAT2以在植物细胞中表达的嵌合DNA。也使用如实施例1中所述的瞬时表达系统，在本氏烟叶子组织中证实了小家鼠基因编码的单酰基甘油酰基转移酶2(MGAT2)(Yen,2003)(Genbank登录号Q80W94)和在这里用作与MGAT2比较的拟南芥DGAT1(Bouvier-Nave等，2000)的酶活性。
与对照相比时，DGAT1表达将叶子TAG提高5.9倍，MGAT2提高7.3倍，MGAT2+DGAT1的组合提高9.8倍(图3)。仅有MGAT2时，在导致TAG的这种明显升高方面的能力因多种原因而出乎意料。首先，存在于叶子组织中的底物MAG的量已知较低，预计来自此底物的TAG积聚不会大量升高。其次，只添加MGAT活性(即，添加无DGAT活性的MGAT2)预计会产生DAG而非TAG，特别是在通常只存在很低的天然DGAT活性的叶子环境中。
讨论
本发明人令人吃惊地证实，MGAT基因的转基因表达导致植物细胞中脂质产率的明显提高。本发明人了解到，Tumaney等人已分离出了具有一些MGAT活性的DGAT，并且他们在尝试克隆如本文所定义的编码MGAT的基因时未能获得成功。Tumaney等人(2001)报道了在花生中的MGAT活性并分离出了负责这种活性的酶。然而，Tumaney等人并未公布DGAT活性的测试结果，因此看来所报道的酶是具有一些MGAT活性的DGAT。实际上，前人的工作在鉴定其他物种中的任何MGAT活性时均以失败告终(Stobart等，1997)。此外，令人吃惊的是，Tumaney等人分离的酶是可溶性胞质酶，而非膜结合酶。最后，虽然Tumaney等人随后公布的摘要声称他们已从花生(Rajasekharan等，2006)和拟南芥(Ghosh等，2006)中分离出了MGAT基因，但尚未有发表的论文描述这些基因的分离。
实施例3.生物化学方法证实叶子提取物中的转基因MGAT活性
通过已如实施例1中所述用35S:MGAT1、35S:MGAT2和35S:DGAT1浸润的本氏烟叶子组织制备细胞裂解物。对仅含有35S:p19构建体的菌株(阴性对照)、与35S:p19菌株一起的35S:MGAT2菌株，以及35S:MGAT2和35S:DGAT1农杆菌菌株与35S:p19菌株的混合物，均一式三份地进行了单独的叶子浸润。三天后收获一式三份样品，通过机械法组织裂解和离心制备纯化的细胞裂解物。通过如实施例1所述向裂解物供给[14C]MAG而对纯化的细胞裂解物的MGAT活性进行比较。数据在图4中示出。
在35S:p19对照样品中观察到了极低的MGAT活性，因为在整个测定中大部分放射性保留在MAG中。相比之下，35S:MGAT2样品中的大部分标记的MAG快速转化成DAG(图4，中图)，表明由35S:MGAT2构建体表达了强MGAT活性。此外，还产生了大量的TAG。在35S:MGAT2样品中观察到的TAG产生可能是由于天然本氏烟DGAT活性所致，或者通过另一条TAG合成路线产生。TAG的产生量通过进一步添加35S:DGAT1而大大提高(图4，右图)，表明MGAT2酶产生了可在植物营养组织中通过DGAT1转化成TAG的DAG。
实施例4.生物化学方法证实叶子提取物中MGAT可用的MAG的产生
在使用叶子裂解物的实施例3中所述的体外测定中，外源供应底物(sn-2MAG和油酰基辅酶A)，而完整植物组织中的体内MGAT活性则需要天然存在这些底物。之前已有人报道了各种植物组织中存在低水平的MAG(Hirayama和Hujii,1965；Panekina等，1978；Lakshminarayana等，1984；Perry&Harwood,1993)。为了测试MGAT2是否能够使用天然植物途径产生的MAG，重复上述实验，但这次向裂解液供给[14C]G-3-P。所得的数据在图5中示出。
在所有样品中均观察到了带标记的MAG的产生，表明在植物叶子裂解物中由G-3-P从头产生了MAG。还在所有样品中观察到了带标记的DAG和TAG产物，尽管这些产物在35S:p19对照样品中相对较低，表明通过内源Kennedy途径产生的这些中性脂质在该样品中相对较低。相比之下，在MGAT2和MGAT2+DGAT1样品中的大部分标记物出现在DAG和TAG库中，表明外源添加的MGAT通过天然植物途径催化由标记的G-3-P产生的MAG的转化。
实施例2至4证实了若干个要点：1)叶子组织可由G-3-P合成MAG，使得MAG可由在叶子组织中表达的外源MGAT使用；2)甚至衍生自哺乳动物肠的MGAT也可在未知具有内源MGAT的植物组织中发挥作用，需要与脂质合成中涉及到的其他植物因子成功地相互作用；3)通过外源MGAT活性产生的DAG可由植物DGAT或外源DGAT使用，以产生TAG；以及4)外源MGAT的表达可导致植物组织中TAG水平的大大提高，该水平至少和通过外源拟南芥DGAT1表达所产生的水平一样高。
实施例5.DGAT1、MGAT1和MGAT2在酵母中的表达
通过将编码拟南芥DGAT1、小家鼠MGAT1和小家鼠MGAT2的基因插入pYES2载体以产生pYES2:DGAT1、pYES2:MGAT1和pYES2:MGAT2，而构建嵌合酵母表达载体。将这些构建体在因四个基因(DGA1、LRO1、ARE1、ARE2)中的敲除突变而完全没有DGAT活性并缺乏TAG和甾醇酯的酿酒酵母菌株H1246中转化。酵母菌株H1246能够通过外源添加的脂肪酸合成DAG，但是由于敲除突变不能将DAG转化成TAG。向转化的酵母培养物供给[14C]18:1Δ9，然后如实施例1中所述提取总脂质并通过TLC分级分离。代表性TLC板的放射自显影图在图6中示出。
对于含有DGAT1(阳性对照)和哺乳动物MGAT1的酵母细胞，观察到了表明DGAT活性存在的TAG形成，但在含有MGAT2的细胞中未观察到。结论是，小鼠的MGAT1也在酵母细胞中具有DGAT活性，并因此作为双功能MGAT/DGAT酶发挥作用，而MGAT2无可检测的DGAT活性并因此仅仅是MGAT。
实施例6.单酰基甘油酰基转移酶在植物、种子和真菌中的表达
MGAT1在拟南芥种子中的表达
将编码小家鼠MGAT1并受种子特异性启动子(FP1，截短的甘蓝型油菜napin启动子)控制的基因用于生成稳定转化的拟南芥植物和后代种子。通过将含有侧翼为FP1启动子和大豆凝集素多聚腺苷酸化信号的EcoRI位点的SalI片段插入载体pCW141的SalI-XhoI位点而制备命名为pJP3174的载体。pCW141载体还含有作为筛选标记基因的FP1驱动的、内含子中断的、种子分泌的GFP。通过将EcoRI片段内所含的构建体0954364_MGAT_pMA的整个编码区在EcoRI位点插入pJP3174从而生成pJP3179而制备命名为FP1:MGAT1-GFP的嵌合基因。将该嵌合载体引入根癌农杆菌菌株AGL1，将得自转化农杆菌培养物的细胞通过浸花转化法用于处理拟南芥(哥伦比亚生态型)植株(Clough和Bent,1998)。成熟后，将得自经处理的植株的种子在Leica MZFLIII解剖显微镜和ebq 100汞灯下观察。对十五粒转基因种子(强GFP阳性)和十五粒非转基因种子(GFP阴性)进行分离，将各组汇总。如实施例1中所述，分析GFP阳性和GFP阴性库的总脂肪酸含量。该分析提供了用MGAT构建体转化的种子的平均脂肪酸含量和组成，但这些种子是在可能包含半合子和纯合转化种子的群体中。
该分析揭示，MGAT1基因起到增加拟南芥种子中种子油水平的作用，其中十五粒非转基因种子(对照，与野生型相同)平均含有69.4μg总脂肪酸，而用GFP基因转化并因此可能包含FP1:MGAT1基因构建体的十五粒转基因种子平均含有71.9μg总脂肪酸。相对于对照(野生型)，这使油含量提高了3.5%。该分析还揭示，MGAT基因起到在种子中富集多不饱和脂肪酸的作用，如通过从种子获得的总提取脂质的脂肪酸组成所见。具体地讲，存在的ALA的量作为从种子提取的总脂肪酸的百分比从16.0%增至19.6%。相似地，脂肪酸20:2n6的百分比从1.25%增至1.90%，脂肪酸20:3n3的百分比从0.26%增至0.51%(表2)。
表2 MGAT表达对种子脂肪酸组成的影响
Figure BDA00002863709300871
开展了进一步的实验，其中对FP1:MGAT1-GFP嵌合DNA进行修饰以移除GFP基因。将命名为FP1:MGAT1的该基因构建体转化到FAD2突变的拟南芥株系中。根据实施例1测定抗生素抗性T1植株的T2种子以及在这些植株旁边生长的亲本品系的总脂肪酸含量。数据在表3中示出。得自对照品系的种子的平均总脂肪酸为347.9μg/100粒种子，而转基因种子的平均值则为381.0μg/100粒种子。当排除对照株系C6的数据以确定平均值时，对照的平均值为370μg/100粒种子。转基因种子中的油含量与非转化种子中的油含量相比相对而言提高了约3%。
为在植物细胞中表达而密码子优化的小鼠MGAT2基因的编码区取代上述构建体中的MGAT1并引入拟南芥中。所得转基因植株的种子油含量升高。
表3 拟南芥T2FP1:MGAT1转基因和亲本对照种子脂肪酸谱和总脂肪酸定量
Figure BDA00002863709300881
Figure BDA00002863709300891
MGAT1在甘蓝型油菜种子中的表达
将用于在拟南芥种子中表达小家鼠MGAT1的载体FP1:MGAT1用于生成转化的甘蓝型油菜植株。将载体通过标准电穿孔程序引入根癌农杆菌菌株AGL1。使培养物在150rpm搅拌下在28℃的LB培养基中过夜生长。通过在4000rpm下离心5分钟收集细菌细胞，使用Winans′AB(Winans,1988)进行洗涤，然后重悬在10mL Winans′AB培养基(pH 5.2)中，并在添加100μM乙酰丁香酮下，与卡那霉素(50mg/L)和利福平(25mg/L)一起过夜生长。感染芸苔植物细胞前两小时，加入亚精胺(120mg/L)，并用新鲜AB培养基将细菌最终密度调节到0.3-0.4的OD 600nm。将得自在1/2 MS(Murashige-Skoog,1962)上生长8天大的甘蓝型油菜幼苗的新分离子叶柄或在含有1mg/L噻苯隆(TDZ)+0.1mg/Lα-萘乙酸(NAA)的MS培养基上预处理3-4天的下胚轴段用10mL农杆菌培养物感染5分钟。然后将农杆菌感染的外植体(子叶柄和下胚轴)涂在无菌滤纸上，以除去多余的农杆菌，并转移到补充或未补充不同抗氧化剂(L-半胱氨酸50mg/L和抗坏血酸15mg/L)的共培养培养基(具有1mg/L TDZ+0.1mg/L NAA+100μM乙酰丁香酮的MS培养基)中。将所有平板用石蜡密封，在23-24℃的暗处温育48小时。
然后将共培养的外植体(子叶柄和下胚轴)用无菌蒸馏水+500mg/L头孢噻肟+50mg/L特美汀洗涤10分钟，在无菌蒸馏水中漂洗10分钟，在无菌滤纸上吸干，转移到预选培养基(MS+1mg/L TDZ+0.1mg/L NAA+20mg/L硫酸腺嘌呤(ADS)+1.5mg/L AgNO3+250mg/L头孢噻肟和50mg/L特美汀)并在24℃下以16小时/8小时的光周期培养五天。然后将它们转移到含有1.5mg/L草铵膦的选择培养基(MS+1mg/L TDZ+0.1mg/LNAA+20mg/L ADS+1.5mg/L AgNO3+250mg/L头孢噻肟和50mg/L特美汀)中，在24℃下以16小时/8小时的光周期培养4周，其中两周一次传代培养到相同的培养基上。将具有绿色愈伤组织的外植体转移到长芽培养基(MS+1mg/L激动素+20mg/L ADS+1.5mg/L AgNO3+250mg/L头孢噻肟+50mg/L特美汀+1.5mg/L草铵膦)并再培养2-3周。将从抗性外植体长出的芽转移到芽伸长培养基(具有0.1mg/L赤霉酸+20mg/L ADS+1.5mg/LAgNO3+250mg/L头孢噻肟+1.5mg/L草铵膦的MS培养基)并再培养两周。选择2-3cm长的健康芽，转移到生根培养基(具有1mg/L NAA+20mg/LADS+1.5mg/L AgNO3+250mg/L头孢噻肟的1/2MS)并培养2-3周。将具有根的完全长成的芽转移到盆(育苗混合物)中，在生长室中生长两周，随后转移到温室。确认了十六个单独的转化体为FP1:MGAT1构建体转基因的，并使它们在温室条件下正常生长。植株的生长表现正常，并且植株正常繁殖、开花和结实。使植株生长到成熟，收获得自转化植株的种子，并分析种子的油含量和脂肪酸组成。MGAT1的种子特异性表达提高油含量，并提高芸苔植物种子油中多不饱和脂肪酸的百分比。
为在植物细胞中表达而密码子优化的小鼠MGAT2基因的编码区取代上述构建体中的MGAT1并引入芸苔植物中。所得转基因植株的种子油含量升高。
MGAT1在陆地棉种子中的表达
将用于在拟南芥种子中表达小家鼠MGAT1的相同种子特异性嵌合基因用于生成转化的陆地棉植株。通过标准电穿孔程序将命名为FP1:MGAT1的载体引入根癌农杆菌菌株AGL1，将得自农杆菌培养物的细胞用于将嵌合DNA引入陆地棉品种Coker315的细胞。将从10天大的棉苗离体的子叶用作外植体，用根癌农杆菌感染并共培养两天的时间。然后在含有0.1mg/L2,4-D、0.1mg/L激动素、50mg/L硫酸卡那霉素和25mg/L头孢噻肟的MS培养基(Murashige和Skoog,1962)上进行六周的选择。在28℃下将衍生自子叶外植体的健康愈伤组织转移到含有5mg/L6-(γ,γ-二甲基烯丙基氨基)嘌呤(2ip)、0.1mg/L萘乙酸(NAA)、25mg/L卡那霉素和250mg/L头孢噻肟的MS培养基持续第二段为期六周的时间。使在温育约六至十周后形成的体细胞胚在相同的培养基上但不添加植物激素或抗生素的情况下发芽和维持。将由体细胞胚发育成的苗转移到土壤中，以28℃/20℃(白天/晚上)的生长温度在温室中维持，直到发育出叶子和根。使含有FP1-MGAT1构建体的转基因植物在温室中生长，开花，产生含有种子的棉铃。在成熟时收获种子。MGAT1的种子特异性表达提高油含量，并提高棉花种子油中多不饱和脂肪酸的百分比。
稳定转化后MGAT1和MGAT2基因在本氏烟植株中的表达
将本氏烟用实施例2中所述的35S:MGAT1构建体稳定转化。通过标准电穿孔程序将35S:MGAT1引入根癌农杆菌菌株AGL1。使转化的细胞在补充了卡那霉素(50mg/L)和利福平(25mg/L)的固体LB培养基上生长，在28℃温育两天。将单一集落用于启动新的培养。在48小时的有力培养后，以2,000xg离心收集细胞，移除上清液。将细胞以OD600=0.5的密度重悬在含有50%LB和50%MS培养基的新鲜溶液中。
切下体外生长的本氏烟叶子样品，在浸入根癌农杆菌溶液的同时用锋利的解剖刀切成大小约0.5-1cm2的方形部分。使淹没在根癌农杆菌中的创伤本氏烟叶子碎片在室温下静置10分钟，然后在无菌滤纸上吸干，再转移到无补充物的MS平板上。在24℃下的两天共培养期后，用无菌液体MS培养基将外植体洗涤三次，然后用无菌滤纸吸干，再放到补充了1.0mg/L苄氨基嘌呤(BAP)、0.25mg/L吲哚乙酸(IAA)、50mg/L卡那霉素和250mg/L头孢噻肟的选择性MS琼脂上。将平板在24℃温育两周，以使转化的本氏烟叶子碎片发育出芽。
为了在体外形成生根的转基因植株，将健康的绿芽切断，转移到装有补充了25μg/L IAA、50mg/L卡那霉素和250mg/L头孢噻肟的MS琼脂培养基的200mL组织培养盆中。从转基因芽获取足够大的叶圆片，冷冻干燥，用于如实施例1中所述的TAG分级分离和定量分析(表4)。与对照品系中85.02μg/100mg干重叶子组织的平均TAG含量相比，最佳的35S:MGAT1本氏烟植株具有204.85μg/100mg干重叶子组织的TAG含量，这表示TAG含量升高了241%。
将本氏烟也用实施例2中所述的35S:MGAT2构建体以及对照二元载体pORE4稳定转化(表5)。与对照株系中9.5μg/100mg干重叶子组织的TAG含量相比，最佳的35S:MGAT2本氏烟植株具有79.0μg/100mg干重叶子组织的TAG含量，这表示TAG含量升高了731%。TAG部分的脂肪酸谱也发生改变，其中饱和脂肪酸16:0和18:0的水平明显降低，而多不饱和脂肪酸尤其是18:3ω3(ALA)的水平升高(表5)。得自相同叶子样品的极性脂质的脂肪酸谱不受明显影响，表明非极性脂质的脂肪酸组成的变化是真正存在的。该实验中的对照植株比使用35S:MGAT1构建体的先前实验中的植株小，并在生理学上是不同的，这可能对一个实验与另一个实验之间对照植株的油含量不同给出了解释。使用大小和生理相同的植株进行直接将35S:MGAT1和35:MGAT2构建体与对照植株进行比较的实验。
使用具有重复增强子区域(e35S)的35S启动子制备了一组新的组成型二元表达载体。如下制备35S:MGAT1#2(pJP3346)、35S:MGAT2#2(pJP3347)和35S:DGAT1#2(pJP3352)：首先将BamHI-EcoRI片段内所含的e35S启动子在BamHI-EcoRI位点克隆进pORE04以产生pJP3343，然后通过分别将MGAT1和MGAT2基因克隆进pJP3343的EcoRI位点而制备pJP3346和pJP3347。通过将XhoI-AsiSI位点内所含的拟南芥DGAT1克隆进pJP3343的XhoI-AsiSI位点而制备pJP3352。
将农杆菌菌株AGL1中的pJP3346、pJP3347和pJP3352如上所述用于转化本氏烟。回收十四棵经确认的转基因植株的pJP3346，以及22棵pJP3347。已通过pJP3352生成了许多卡那霉素抗性的转化芽。在用MGAT1或MGAT2转化的植株上进行了转基因的表达分析。选择具有高表达水平的植株。对用拟南芥DGAT1转化的植株进行表达分析。植物正常生长，并使其长至成熟。成熟时收获种子。将得自高表达子代的种子直接播种到土壤上，对包括纯合和杂合植株两者的T2分离群进行脂质分析。表达高水平MGAT1或MGAT2的植株叶子的油含量与用拟南芥DGAT1转化的植株或对照植株相比明显升高。
将AGL1中的pJP3346、pJP3347和对照载体也如上所述用于转化拟南芥。鉴定了25棵经确认的含有来自pJP3346的T-DNA的转基因T2植株，以及43棵pJP3347的相应转基因植株。对转基因植株进行表达分析。收获高表达子代的种子，直接播种到土壤上。对得自T2和T3子代(包括不含转基因的分离子)的叶子进行脂质分析，包括油含量。在对MGAT转基因纯合的植株中获得了最高水平的TAG。
表4 用35S:MGAT1构建体稳定转化的本氏烟叶子组织中的脂肪酸谱和TAG定量；′M′样品为35S:MGAT1，而′C′样品为亲本对照植株
表5 用35S:MGAT2构建体稳定转化的本氏烟叶子组织中的脂肪酸谱和TAG定量；′M′样品为35S:MGAT2，而′S′样品为亲本对照植株；
从各植株采集两片叶子，单独进行分析
Figure BDA00002863709300941
MGAT1在稳定转化的白三叶草(Trifolium repens)植株中的表达
将编码小家鼠MGAT1的嵌合基因用于转化另一种双子叶植物白三叶草。将含有嵌合基因35S:MGAT1和35S:DGAT1的载体通过标准电穿孔程序引入根癌农杆菌。两种载体还含有35S:BAR选择标记基因。使转化的农杆菌细胞在补充了卡那霉素(50mg/L)和利福平(25mg/L)的固体LB培养基上生长，在28℃温育两天。将单一集落用于启动各构建体新的培养。在48小时的有力培养后，将农杆菌培养物用于处理已从吸水饱和种子解剖出来的海发白三叶草(cv.Haifa)子叶，如Larkin等人(1996)所述。在共培养三天后，将外植体暴露于5mg/L PPT以选择转化的芽，然后转移到生根培养基形成根，再转移到土壤。得到含有MGAT1的转化植株。35S启动子在转化植株的细胞中组成型表达。油含量至少在营养组织诸如叶子中升高。
MGAT在稳定转化的大麦中的表达
将含有小家鼠MGAT1的嵌合载体用于产生稳定转化的单子叶植物大麦。通过将整个小家鼠MGAT1和拟南芥DGAT1编码区分别克隆进pWVEC8-Ubi而构建含有嵌合基因Ubi:MGAT1和Ubi:DGAT1的载体。将含有嵌合基因Ubi:MGAT1和Ubi:DGAT1的载体通过标准电穿孔程序引入根癌农杆菌菌株AGL1。使转化的农杆菌细胞在补充了卡那霉素(50mg/L)和利福平(25mg/L)的固体LB培养基上生长，将平板在28℃温育两天。将各细菌的单一集落用于启动新的培养。
在48小时的有力培养后，根据公开的方法(Tingay等，1997；Bartlett等，2008)但作出一些修改，将农杆菌培养物用于转化黄金大麦(cv.GoldenPromise)成熟胚中的细胞。简而言之，从未成熟的颖果分离长度为1.5到2.5mm之间的胚，去除胚轴。将所得的外植体与转基因农杆菌共培养2-3天，然后在暗处在含有特美汀和潮霉素的培养基上培养4-6周以生成胚性愈伤组织，再移到低光照条件下的过渡培养基两周。然后将愈伤组织转移到再生培养基以允许芽和根再生，再转移到土壤中。得到转化植株，然后转移到温室。使MGAT1编码区在Ubi启动子控制下在转化植株的细胞中组成型表达。油含量至少在营养组织中升高。
为在植物细胞中表达而密码子优化的小鼠MGAT2基因的编码区取代上述构建体中的MGAT1，并如上所述引入大麦中。所得转基因植株的营养组织的油含量升高。
MGAT在酵母细胞中的表达
将包含小家鼠MGAT1的嵌合载体用于转化酵母，在该实施例中为酿 酒酵母，这是适合通过发酵产生油的真菌微生物。通过将EcoRI片段内所含的命名为0954364_MGAT_pMA的构建体的整个编码区在EcoRI位点插入pYES2从而生成pJP3301而制备基因构建体Gal1:MGAT1。相似地，通过将整个拟南芥DGAT1编码区插入pYES2制备在这里用作比较并单独编码拟南芥DGAT1酶的基因构建体Gal1:DGAT1。通过热休克将这些嵌合载体引入酿酒酵母菌株S288C中，在含有2%棉子糖作为唯一碳源的酵母基本培养基(YMM)平板上选择转化体。在含有2%棉子糖作为唯一碳源的液体YMM中建立克隆接种培养物。将得到的实验培养物接种到含有1%NP-40的YMM中，达到约0.3的OD600。使培养物在28℃振荡(约100rpm)条件下生长，直到OD600为约1.0。此时，将半乳糖加入达到2%(w/v)的最终浓度。将培养物在25℃再振荡培养48小时，然后离心收获。将细胞沉淀用水洗涤，然后冷冻干燥，用于如实施例1所述进行脂质类别分级分离和定量分析。Gal启动子在转化酵母细胞中诱导表达，从而提高细胞中的油含量。
为在酵母细胞中表达而密码子优化的小鼠MGAT2基因的编码区取代上述构建体中的MGAT1，并引入酵母中。所得的转基因细胞的油含量升高。还将基因引入含油酵母、解脂耶氏酵母中以提高油含量。
MGAT在藻类细胞莱茵衣藻中的表达
将含有小家鼠MGAT1的嵌合载体用于稳定转化藻类细胞。通过将MGAT1编码区克隆进通过莱茵衣藻RBCS2启动子表达的含有花椰菜花叶病毒35S启动子盒和巴龙霉素抗性基因(氨基糖苷-O-磷酸转移酶VIII)的克隆载体中而制备命名为35S:MGAT1的基因构建体。通过改良微玻璃珠方法(Kindle,1990)将35S:MGAT1单独引入5x107个cc503(莱茵衣藻的细胞壁缺陷菌株)的对数培养物。两种载体还含有BLE抗性基因作为选择标记基因。简而言之，使保持在约24℃的TAP琼脂平板上的非转化细胞的集落经四天生长到约5x106个细胞/mL，于室温将所得的细胞在3000g下离心沉淀3分钟，然后在300μL TAP培养基中重悬以得到5x107个细胞。将300μL0.6mm直径的玻璃珠、0.6μg溶于5μL和100μL20%PEG MW8000中的质粒加入，将混合物以最大速度涡旋30秒，然后转移到10mL TAP，在暗处振荡温育16小时。将细胞离心沉淀，重悬在200μL TAP中，然后接种到含有5mg/L博莱霉素的TAP平板上，在暗处温育3周。将转化的集落传代培养到新的TAP+博莱霉素5mg/L平板，然后使它们在标准培养基条件下通过博莱霉素筛选而长大。离心收获后，将细胞沉淀用水洗涤，然后冷冻干燥，用于如实施例1中所述进行脂质类别分级分离和定量分析。35S:MGAT1启动子在转化的藻类细胞中组成型表达。细胞的油含量明显升高。
为在植物细胞中表达而密码子优化的小鼠MGAT2基因的编码区取代上述构建体中的MGAT1，并引入衣藻中。所得转基因细胞中的油含量明显升高。
MGAT在稳定转化的羽扇豆中的表达
将包含小家鼠MGAT1的嵌合载体用于转化豆科植物羽扇豆。如Pigeaire等人(1997)所述，将农杆菌中的嵌合载体35S:MGAT1和35S:DGAT1用于转化羽扇豆。简而言之，将枝条尖外植体与转基因农杆菌共培养，然后用PPT溶液(2mg/ml)彻底润湿，再转移到无PPT的再生培养基上。将枝条尖发育的多个腋生枝切下到含有20mg/L PPT的培养基上，将存活的枝条转移到含有20mg/L PPT的新鲜培养基中。然后将健康的枝条转移到土壤中。35S启动子在转化植株的细胞中组成型表达，从而提高营养组织和种子中的油含量。种子特异性启动子用于进一步提高转基因羽扇豆种子中的油含量。
为在植物细胞中表达而密码子优化的小鼠MGAT2基因的编码区取代上述构建体中的MGAT1，并引入羽扇豆中。所得转基因植株的种子和营养组织的油含量升高。
MGAT在稳定转化的两色高梁中的表达
将含有小家鼠MGAT1的嵌合载体用于稳定转化两色高梁。如Gurel等人(2009)所述将根癌农杆菌菌株AGL1中的Ubi:MGAT1和Ubi:DGAT1用于转化两色高梁。将农杆菌首先在4℃下以5,000rpm离心5分钟，然后用液体共培养基稀释到OD550=0.4。将之前分离的未成熟胚随后用农杆菌悬液完全覆盖15分钟，然后在24℃于暗处在共培养基上以盾片侧向上培养2天。将未成熟的胚然后转移到含有100mg/L羧苄青霉素以抑制农杆菌生长的愈伤组织诱导培养基(CIM)中，并保持4周。然后将组织转移到再生培养基中以发芽生根。Ubi启动子在转化植株的细胞中组成型表达，从而提高至少营养组织中的油含量。
为在植物细胞中表达而密码子优化的小鼠MGAT2基因的编码区取代上述构建体中的MGAT1，并引入高粱中。所得转基因植株的营养组织的油含量升高。
MGAT在稳定转化的大豆植株中的表达
将编码小家鼠MGAT1的嵌合基因用于稳定转化可用于产油的另一种豆科植物大豆。如Zhang等人(1999)所述，将农杆菌中的35S:MGAT1用于转化大豆。将农杆菌与得自五天大的幼苗的子叶外植体共培养三天。然后将外植体在补充了1.67mg/L BAP和5.0mg/L草铵膦的Gamborg B5培养基上培养四周，之后将外植体传代培养到含有MS大量盐和微量盐以及B5维生素(MS/B5)的培养基，其补充了1.0mg/L玉米素核苷、0.5mg/L GA3和0.1mg/L IAA，用1.7mg/L或2.0mg/L的草铵膦改良。使长枝条在补充了0.5mg/L NAA的MS/B5生根培养基上生根，无需进一步的草胺磷筛选。35S启动子在转化植株的细胞中组成型表达，从而提高营养组织和种子中的油含量。
为在植物细胞中表达而密码子优化的小鼠MGAT2基因的编码区取代上述构建体中的MGAT1，并引入大豆中。所得转基因植株的营养组织和种子的油含量升高。
MGAT在稳定转化的玉米中的表达
将编码小家鼠MGAT1的嵌合基因用于稳定转化玉米。如Gould等人(1991)所述，将含有35S:MGAT1和35S:DGAT1的载体用于转化玉米。简而言之，将枝条尖外植体与转基因农杆菌共培养两天，然后转移到含有卡那霉素和羧苄西林的MS盐培养基上。多轮传代培养后，转化的芽和根同时形成，然后移植到土壤中。35S启动子在转化植株的细胞中表达，从而提高营养组织和种子中的油含量。
为在植物细胞中表达而密码子优化的小鼠MGAT2基因的编码区取代上述构建体中的MGAT1，并引入玉米中。所得转基因植株的营养组织和种子的油含量升高。可选择地，使MGAT编码区在胚乳特异性启动子诸如玉米蛋白启动子或得自单子叶植物的胚特异性启动子的控制下表达，以增强表达和提高种子中的油含量。将另外的编码具有磷酸酶活性的GPAT诸如拟南芥GPAT4或GPAT6的嵌合基因与MGAT组合引入玉米中，从而进一步提高玉米种子中的油含量。
MGAT在稳定转化的油棕(棕榈油)中的表达
将编码小家鼠MGAT1的嵌合基因用于稳定转化油棕。使用农杆菌中命名为Ubi:MGAT1和Ubi:DGAT1的嵌合载体。48小时的有力培养后，如Izawati等人(2009)所述将细胞用于转化油棕。Ubi启动子在转化植株的细胞中组成型表达，从而提高至少果实和种子中的油含量，并可用于获得油。
为在植物细胞中表达而密码子优化的小鼠MGAT2基因的编码区取代上述构建体中的MGAT1，并引入油棕中。所得转基因植株的种子油含量升高。
MGAT在稳定转化的燕麦中的表达
将编码小家鼠MGAT1的嵌合基因用于稳定转化另一种单子叶植物燕麦。如Zhang等人(1999)所述，将如上所述的并均含有Ubi:BAR选择标记的命名为Ubi:MGAT1和Ubi:DGAT1的嵌合载体用于转化燕麦。
为在植物细胞中表达而密码子优化的小鼠MGAT2基因的编码区取代上述构建体中的MGAT1，并引入燕麦中。所得转基因植株的种子油含量升高。
实施例7.工程化具有DGAT活性的MGAT
具有可比DGAT活性的MGAT可通过对所关注的MGAT基因执行随机诱变、定向诱变或饱和诱变或者通过将不同的MGAT和/或DGAT基因进行DNA改组而工程化。DGAT功能可通过使用(例如)以下酵母菌株而进行阳性筛选，该酵母菌株在供给游离脂肪酸时具有TAG合成互补的绝对需求，诸如在四个基因(DGA1、LRO1、ARE1、ARE2)中包含突变的H1246。在这样的菌株中转化MGAT变体然后向转化的酵母提供一定浓度的防止与野生型MGAT基因互补的游离脂肪酸，由于提高的DGAT活性将只允许具有增强的TAG合成能力的变体生长。这些突变基因的MGAT活性可通过供给带标记的sn-1或sn-2 MAG并对带标记的DAG的产生情况进行定量而测定。与合理蛋白设计相结合的多轮定向进化将导致具有类似MGAT和DGAT活性的新型MGAT基因的产生。
实施例8.植物中拟南芥二酰基甘油酰基转移酶2的组成型表达
拟南芥DGAT2在酵母(Weselake等，2009)和昆虫细胞(Lardizabal等，2001)中的表达未证实DGAT活性。相似地，DGAT2未能与拟南芥DGAT1敲除互补(Weselake等，2009)。如实施例1所述，使用本氏烟瞬时表达系统测定了拟南芥DGAT2在叶子组织中的酶活性。通过基因组PCR获得拟南芥DGAT2(登录号Q9ASU1)，然后在35S启动子控制下克隆进二元表达载体，以生成35S:DGAT2。将该嵌合载体引入根癌农杆菌菌株AGL1，在24℃的生长室中将得自这些培养物的细胞浸润进本氏烟植株的叶子组织，其中使用35S:DGAT1作为对照。为了进行多个直接比较，将进行比较的样品在同一叶子的两侧上浸润。一式三份地进行实验。浸润后，使植株再生长五天，然后获取叶圆片，冷冻干燥，用于如实施例1所述进行脂质类别分级分离和定量分析。该分析表明DGAT1和DGAT2两者都起到提高本氏烟叶子油水平的作用(表6)。
用35S:p19构建体转化的叶子组织(阴性对照)每100mg叶子干重平均含有34.9μg衍生自TAG的游离脂肪酸。用35S:p19和35S:DGAT1构建体转化的叶子组织(阳性对照)每100mg叶子干重平均含有126.7μg衍生自TAG的游离脂肪酸。用35S:p19和35S:DGAT2构建体转化的叶子组织每100mg叶子干重平均含有310.0μg衍生自TAG的游离脂肪酸。
上述数据表明，拟南芥DGAT2酶在促进叶子组织中的TAG积聚方面比拟南芥DGAT1酶更具活性。与表达DGAT1时相比，DGAT2基因的表达导致叶子组织中的TAG积聚高达245%。
实施例9.转基因种子中MGAT和GPAT的共表达
Yang等人(2010)描述了均具有sn-2偏好(即，优先形成sn-2 MAG而非sn-1/3 MAG)和磷酸酶活性的两种甘油-3-磷酸酰基转移酶(GPAT4和GPAT6)，它们能够由G-3-P产生sn-2 MAG(图1)。这些酶被认为是角质合成途径的一部分。GPAT4和GPAT6不在种子组织中高表达。将这种双官能GPAT/磷酸酶与MGAT相结合产生了使用G-3-P作为底物的新DAG合成途径，其可代替或补充植物中合成DAG的典型Kennedy途径，尤其是油料种子中，或其他细胞中，从而导致油含量升高，尤其是TAG水平升高。
通过以下方式制备与用于在植物种子中表达的小家鼠MGAT2一起的分别编码GPAT4和GPAT6且命名为pJP3382和pJP3383的嵌合DNA：首先将SwaI片段内所含的整个MGAT2编码区在Smal位点插入pJP3362，得到pJP3378。pJP3362为含有空FAE1和FP1表达盒以及作为选择标记的卡那霉素抗性基因的二元表达载体。拟南芥GPAT4由cDNA扩增，并在NotI位点克隆进pJP3378，得到pJP3382，其中GPAT4通过截短的napin启动子FP1表达，而MGAT2通过拟南芥FAE1启动子表达。相似地，拟南芥GPAT6由cDNA扩增，并在NotI位点克隆进pJP3378，得到pJP3384，其中GPAT6可操作地连接到截短的napin启动子FP1，而MGAT2通过拟南芥FAE1启动子表达。将pJP3382和pJP3383通过浸花法转化入拟南芥(哥伦比亚生态型)中。将得自处理过的植株的种子接种到含有抗生素卡那霉素的培养基平板上，以选择转化的子代植株(T1植株)。将转基因幼苗转移到土壤中，在温室内生长。测定发育胚中的转基因表达。选择具有最高水平的表达并表现出每个株系3:1的转基因:非转基因植株比的转基因植株(表明单个基因座插入转基因)，并长至成熟。从这些植株(T2)获得种子，而这些植株中的一些为转基因纯合的。使每个株系的十五棵子代植株(T2植株)在土壤中生长，测定所得种子的脂质含量、TAG含量和脂肪酸组成。既含MGAT也含GPAT4或GPAT6的种子的中性脂质含量、尤其是TAG含量与对照相比以及与只含MGAT或只含拟南芥DGAT1的种子相比大大提高。MAG和DAG含量也得以提高。从这些种子提取的脂质的脂肪酸组成发生改变，尤其是多不饱和脂肪酸诸如ALA的含量显著升高。
实施例10.通过GPAT沉默和突变测试GPAT4和GPAT6对MGAT介导的TAG升高的影响
GPAT家族是一个庞大的家族，所有已知的成员均包含两个保守结构域：plsC酰基转移酶结构域和HAD样水解酶超家族结构域。除此之外，拟南芥GPAT4-8均包含与磷酸丝氨酸磷酸酶结构域同源的N端区域。拟南芥GPAT4和GPAT6均含有已知对磷酸酶活性至关重要的保守残基(Yang等，2010)。
设计基于保守氨基酸序列GDLVICPEGTTCREP(SEQ ID NO:228)的简并引物，以在叶子组织中表达的本氏烟GPAT上扩增片段。将使用这些引物和oligo-dT反向引物对从本氏烟叶子组织中分离的RNA执行3’RACE。具有磷酸酶活性的GPAT(即，GPAT4/6样)通过它们与上述N端磷酸丝氨酸磷酸酶结构域的同源性而加以鉴定。生成靶向这些基因的35S驱动的RNAi构建体，并在根癌农杆菌菌株AGL1中转化。相似地，将含有V2病毒沉默抑制蛋白的35S:V2构建体在根癌农杆菌菌株AGL1中表达。V2已知可抑制原生植物沉默机制，以允许有效的瞬时表达，但还允许基于RNAi的基因沉默起作用。
然后在用以下菌株混合物浸润的瞬时转化叶子样品之间对TAG积聚进行比较：1)35S:V2(阴性对照)；2)35S:V2+35S:MGAT2(阳性对照)；3)35S:V2+GPAT-RNAi；4)35S:V2+GPAT-RNAi+35S:MGAT2。预计，35S:V2+GPAT-RNAi+35S:MGAT2混合物会导致比35S:V2+35S:MGAT2样品更少的TAG积聚，因为GPAT沉默导致了sn-2 MAG合成中断。
使用突变的拟南芥和本氏烟GPAT4/6样序列进行类似的实验，以移除已知对磷酸酶活性至关重要的保守残基(Yang等，2010)。这些突变基因(统称为GPAT4/6-δ)然后克隆入35S驱动的表达二元载体中，并在根癌农杆菌中转化。然后在用以下菌株混合物浸润的瞬时转化叶子样品之间对TAG积聚进行比较：1)35S:p19(阴性对照)；2)35S:p19+35S:MGAT2(阳性对照)；3)35S:p19+GPAT4/6-δ；4)35S:p19+GPAT4/6-δ+35S:MGAT2。预计，35S:p19+GPAT4/6-δ+35S:MGAT2混合物会导致比35S:p19+35S:MGAT2样品更少的TAG积聚，因为GPAT突变导致了sn-2 MAG合成中断。虽然天然本氏烟GPAT4/6样基因将存在于该实验中，但预计高水平的GPAT4/6-δ构建体表达在获取G-3-P底物方面将超出内源基因。
表6 在用35S:p19、35S:DGAT1和35S:DGAT2构建体瞬时转化的一式三份本氏烟叶子组织中的脂肪酸谱和TAG定量
Figure BDA00002863709301021
本领域技术人员将会认识到，在不脱离广义描述的本发明精神或范围的情况下，可以对具体实施方案中所示的发明进行多种改变和/或修改。因此，本实施方案在所有方面都应视为示例性而非限制性的。
本文所讨论和/或参考的所有出版物整体援引加入本文。
已包括在本说明书中的对文件、行动、材料、装置、物品等的任何讨论仅仅是为了向本发明提供背景。不应视作承认任何或所有这些事项构成了现有技术基础的一部分或它们只是本领域中与本发明相关的常见性一般知识，因为它在本申请各权利要求项的优先权日之前已存在。
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Claims (82)

1.一种产生提取的脂质的方法，所述方法包括以下步骤：
i)获得包含一种或多种外源多核苷酸的转基因非人生物或其部分，其中所述转基因非人生物或其部分当与不含所述一种或多种外源多核苷酸的相应生物或其部分进行比较时具有升高水平的一种或多种非极性脂质，以及
ii)从所述转基因非人生物或其部分提取所述脂质，
从而产生所述提取的脂质。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述转基因非人生物或其部分的一种或多种非极性脂质的水平按重量计比相应的非人生物或其部分高至少0.5%(w/w)。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述转基因非人生物或其部分的一种或多种非极性脂质的水平在相对的基础上比相应的非人生物或其部分高至少1%(w/w)。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述转基因非人生物或其部分的总非极性脂质含量当与相应的生物或其部分相比时是升高的。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述转基因非人生物或其部分的总非极性脂质含量按重量计比相应的非人生物或其部分高至少0.5%(w/w)。
6.根据权利要求4或5所述的方法，其中所述转基因非人生物或其部分的总非极性脂质含量在相对的基础上比相应的非人生物或其部分高至少1%(w/w)。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述转基因非人生物为植物、藻类或适合发酵的生物如酵母或真菌。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述植物为芸苔(Brassica sp.)、陆地棉(Gossypium hirsutum)、亚麻(Linum usitatissimum)、向日葵(Helianthussp.)、红花(Carthamus tinctorius)、大豆(Glycine max)、玉米(Zea mays)、拟南芥(Arabidopsis thaliana)、两色高梁(Sorghum bicolor)、高粱(Sorghumvulgare)、燕麦(Avena sativa)、三叶草(Trifolium sp.)、亚麻荠(Camelina sativa)、异源三倍体芒草奇岗(Miscanthus x giganteus)或中国芒(Miscanthussinensis)。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中所述部分为植物的种子、果实或营养部分。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述部分为植物种子并且所述提取的脂质为种子油。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述种子的总油含量或总脂肪酸含量按重量计比不含所述一种或多种外源多核苷酸的相应种子高至少0.5%(w/w)至25%(w/w)。
12.根据权利要求10或11所述的方法，其中所述种子来自：
i)油菜植物，
ii)玉米植物，
iii)大豆植物，
iv)羽扇豆植物，
v)花生植物，
vi)向日葵植物，
vii)棉花植物，
viii)红花植物，或
ix)亚麻植物。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述油菜种子包含以下一种或多种：
i)按重量计至少45%的种子油，
ii)比相应种子高至少5%(w/w)的相对种子油含量，
iii)比相应种子高至少10%(w/w)的相对DAG含量，以及
iv)比相应种子高至少5%(w/w)的相对TAG含量。
14.根据权利要求12所述的方法，其中所述玉米种子包含以下一种或多种：
i)按重量计至少5%的种子油，
ii)比相应种子高至少5%(w/w)的相对种子油含量，
iii)比相应种子高至少10%(w/w)的相对DAG含量，以及
iv)比相应种子高至少5%(w/w)的相对TAG含量。
15.根据权利要求12所述的方法，其中所述大豆种子包含以下一种或多种：
i)按重量计至少20%的种子油，
ii)比相应种子高至少5%(w/w)的相对种子油含量，
iii)比相应种子高至少10%(w/w)的相对DAG含量，以及
iv)比相应种子高至少5%(w/w)的相对TAG含量。
16.根据权利要求12所述的方法，其中所述羽扇豆种子包含以下一种或多种：
i)按重量计至少10%的种子油，
ii)比相应种子高至少5%(w/w)的相对种子油含量，
iii)比相应种子高至少10%(w/w)的相对DAG含量，以及
iv)比相应种子高至少5%(w/w)的相对TAG含量。
17.根据权利要求12所述的方法，其中所述花生种子包含以下一种或多种：
i)按重量计至少50%的种子油，
ii)比相应种子高至少5%(w/w)的相对种子油含量，
iii)比相应种子高至少10%(w/w)的相对DAG含量，以及
iv)比相应种子高至少5%(w/w)的相对TAG含量。
18.根据权利要求9所述的方法，其中所述植物的营养部分为地上植物部分或绿色部分如叶子或茎干。
19.根据权利要求18所述的方法，其中所述营养植物部分的TAG、DAG、TAG和DAG或MAG含量在相对的基础上比不含所述一种或多种外源多核苷酸的相应营养植物部分的TAG、DAG、TAG和DAG或MAG高至少10%(w/w)。
20.根据权利要求1至19中任一项所述的方法，其中所述提取的脂质的脂肪酸含量的至少60%(mol%)为油酸。
21.根据权利要求1至20中任一项所述的方法，其中所述提取的脂质的多不饱和脂肪酸含量与从相应生物或其部分提取的脂质相比时是升高的。
22.根据权利要求1至21中任一项所述的方法，其中所述提取的脂质中多不饱和脂肪酸的水平当与从相应生物或其部分提取的脂质相比时是升高的，其中所述多不饱和脂肪酸为二十碳二烯酸、花生四烯酸(ARA)、α-亚麻酸(ALA)、十八碳四烯酸(SDA)、二十碳三烯酸(ETE)、二十碳四烯酸(ETA)、二十碳五烯酸(EPA)、二十二碳五烯酸(DPA)、二十二碳六烯酸(DHA)或它们中两种或更多种的组合。
23.根据权利要求1至22中任一项所述的方法，其中所述一种或多种脂质的水平和/或所述总非极性脂质含量可通过使用得自所述提取的脂质的脂肪酸甲酯的气相色谱法进行分析而测定。
24.根据权利要求10至17中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括从所述转基因植物收获所述种子，从所述种子压榨所述种子油，和/或纯化所述种子油。
25.根据权利要求1至24中任一项所述的方法，其中所述一种或多种外源多核苷酸编码：
i)单酰基甘油酰基转移酶(MGAT)，
ii)二酰基甘油酰基转移酶2(DGAT2)，
iii)MGAT和甘油-3-磷酸酰基转移酶(GPAT)，
iv)MGAT和DGAT，或
v)MGAT、GPAT和DGAT。
26.根据权利要求25所述的方法，其中所述GPAT还具有磷酸酶活性以产生MAG，如拟南芥GPAT4或GPAT6。
27.根据权利要求25或26所述的方法，其中所述DGAT为DGAT2。
28.根据权利要求25至27中任一项所述的方法，其中编码MGAT的外源多核苷酸包含以下一种或多种：
i)选自SEQ ID NO:1至44任一的核苷酸序列，
ii)编码包含具有SEQ ID NO:45至82任一提供的序列的氨基酸的多肽或其生物学活性片段的核苷酸序列，
iii)与i)或ii)至少50%相同的核苷酸序列，以及
iv)在严格条件下与i)至iii)任一杂交的核苷酸序列。
29.根据权利要求25至28中任一项所述的方法，其中编码GPAT的外源多核苷酸包含以下一种或多种：
i)选自SEQ ID NO:84至141任一的核苷酸序列，
ii)编码包含具有SEQ ID NO:144至201任一提供的序列的氨基酸的多肽或其生物学活性片段的核苷酸序列，
iii)与i)或ii)至少50%相同的核苷酸序列，以及
iv)在严格条件下与i)至iii)任一杂交的核苷酸序列。
30.根据权利要求25至29中任一项所述的方法，其中编码DGAT2的外源多核苷酸包含以下一种或多种：
i)SEQ ID NO:204的核苷酸序列，
ii)编码包含具有SEQ ID NO:212提供的序列的氨基酸的多肽或其生物学活性片段的核苷酸序列，
iii)与i)或ii)至少50%相同的核苷酸序列，以及
iv)在严格条件下与i)至iii)任一杂交的核苷酸序列。
31.根据权利要求25至30中任一项所述的方法，其中所述转基因生物或其部分的一种或多种非极性脂质水平和/或总非极性脂质含量比不含所述一种或多种外源多核苷酸但包含编码拟南芥DGAT1的外源多核苷酸的相应生物或其部分按重量计高至少0.5%(w/w)和/或在相对的基础上高至少1%(w/w)。
32.根据权利要求1至31中任一项所述的方法，其中所述转基因非人生物或其部分进一步包含一个或多个引入的突变，和/或包含下调所述非人转基因生物或其部分的内源酶的产生和/或活性的外源多核苷酸，所述内源酶选自DGAT、sn-1甘油-3-磷酸酰基转移酶(sn-1GPAT)、1-酰基-甘油-3-磷酸酰基转移酶(LPAAT)、酰基辅酶A:溶血卵磷脂酰基转移酶(LPCAT)、磷脂酸磷酸酶(PAP)或它们中的两种或更多种的组合。
33.根据权利要求32所述的方法，其中所述外源多核苷酸选自：反义多核苷酸、有义多核苷酸、催化多核苷酸、微RNA、编码结合所述内源酶的多肽的多核苷酸以及双链RNA。
34.根据权利要求1至33中任一项所述的方法，其中所述非极性脂质为TAG、DAG、TAG和DAG、MAG、总PUFA，或者为二十碳二烯酸(EDA)、花生四烯酸(ARA)、α-亚麻酸(ALA)、十八碳四烯酸(SDA)、二十碳三烯酸(ETE)、二十碳四烯酸(ETA)、二十碳五烯酸(EPA)、二十二碳五烯酸(DPA)、二十二碳六烯酸(DHA)的具体PUFA，或者它们中两种或更多种的组合。
35.一种包含一种或多种外源多核苷酸的转基因非人生物或其部分，其中所述转基因非人生物或其部分当与不含所述一种或多种外源多核苷酸的相应生物或其部分相比时具有升高水平的一种或多种非极性脂质。
36.根据权利要求35所述的转基因非人生物或其部分，其中所述转基因非人生物或其部分的一种或多种非极性脂质的水平比相应的生物或其部分按重量计高至少0.5%(w/w)和/或在相对的基础上高至少1%(w/w)。
37.根据权利要求35或36所述的转基因非人生物或其部分，其中所述转基因非人生物或其部分的总非极性脂质含量当与相应的生物或其部分相比时是升高的。
38.根据权利要求37所述的转基因非人生物或其部分，其中所述转基因非人生物或其部分的总非极性脂质含量比相应的生物或其部分按重量计高至少0.5%(w/w)和/或在相对的基础上高至少1%。
39.根据权利要求35至38中任一项所述的转基因非人生物或其部分，其中所述转基因非人生物或其部分的提取的脂质中的多不饱和脂肪酸含量当与相应生物或其部分的提取的脂质相比时是升高的。
40.根据权利要求35至39中任一项所述的转基因非人生物或其部分，其中所述提取的脂质中多不饱和脂肪酸的含量当与从相应生物或其部分提取的脂质相比时是升高的，其中所述多不饱和脂肪酸包括二十碳二烯酸(EDA)、花生四烯酸(ARA)、α-亚麻酸(ALA)、十八碳四烯酸(SDA)、二十碳三烯酸(ETE)、二十碳四烯酸(ETA)、二十碳五烯酸(EPA)、二十二碳五烯酸(DPA)、二十二碳六烯酸(DHA)或它们中两种或更多种的组合。
41.根据权利要求35至40中任一项所述的转基因非人生物或其部分，其中所述一种或多种外源多核苷酸编码：
i)MGAT，
ii)DGAT2，
iii)MGAT和GPAT，
iv)MGAT和DGAT，或
v)MGAT、GPAT和DGAT。
42.根据权利要求41所述的转基因非人生物，其中所述GPAT还具有磷酸酶活性以产生MAG，如拟南芥GPAT4或GPAT6。
43.根据权利要求41或42所述的转基因非人生物，其中所述DGAT为DGAT2。
44.根据权利要求41至43中任一项所述的转基因非人生物或其部分，其中编码MGAT的外源多核苷酸包含以下一种或多种：
i)选自SEQ ID NO:1至44任一的核苷酸序列，
ii)编码包含具有SEQ ID NO:45至82任一提供的序列的氨基酸的多肽或其生物学活性片段的核苷酸序列，
iii)与i)或ii)至少50%相同的核苷酸序列，以及
iv)在严格条件下与i)至iii)任一杂交的核苷酸序列。
45.根据权利要求41至44中任一项所述的转基因非人生物或其部分，其中编码GPAT的外源多核苷酸包含以下一种或多种：
i)选自SEQ ID NO:84至141任一的核苷酸序列，
ii)编码包含具有SEQ ID NO:144至201任一提供的序列的氨基酸的多肽或其生物学活性片段的核苷酸序列，
iii)与i)或ii)至少50%相同的核苷酸序列，以及
iv)在严格条件下与i)至iii)任一杂交的核苷酸序列。
46.根据权利要求41至45中任一项所述的转基因非人生物或其部分，其中编码DGAT2的外源多核苷酸包含以下一种或多种：
i)SEQ ID NO:204的核苷酸序列，
ii)编码包含具有SEQ ID NO:212提供的序列的氨基酸的多肽或其生物学活性片段的核苷酸序列，
iii)与i)或ii)至少50%相同的核苷酸序列，以及
iv)在严格条件下与i)至iii)任一杂交的核苷酸序列。
47.根据权利要求44至46中任一项所述的转基因非人生物或其部分，其中所述转基因生物或其部分的一种或多种非极性脂质水平和/或总脂质含量比不含所述一种或多种外源多核苷酸但包含编码拟南芥DGAT1的外源多核苷酸的相应生物或其部分按重量计高至少0.5%(w/w)和/或在相对的基础上高至少1%(w/w)。
48.根据权利要求35至47中任一项所述的转基因非人生物，其中所述转基因非人生物为植物、藻类或适合发酵的生物如酵母或真菌。
49.一种转基因非人生物，其包含一种或多种外源多核苷酸，所述外源多核苷酸编码：
i)MGAT，
ii)DGAT2，
iii)MGAT和GPAT，
iv)MGAT和DGAT，或
v)MGAT、GPAT和DGAT。
50.根据权利要求49所述的转基因非人生物或其部分，其进一步特征在于权利要求35至48中任一项所述的一项或多项特征。
51.一种获得具有增强的产生一种或多种非极性脂质的能力的细胞的方法，所述方法包括：
i)向细胞引入一种或多种外源多核苷酸，所述外源多核苷酸编码
a)MGAT，
b)DGAT2
c)MGAT和GPAT
d)MGAT和DGAT，或
e)MGAT、GPAT和DGAT；
其中所述一种或多种外源多核苷酸可操作地连接至一种或多种能够指导所述一种或多种外源多核苷酸在所述细胞中表达的启动子，
ii)在所述细胞中表达所述一种或多种外源多核苷酸，
iii)分析所述细胞的脂质含量，以及
iv)选择当与不含所述外源多核苷酸的相应细胞相比时具有升高水平的一种或多种非极性脂质的细胞。
52.根据权利要求51所述的方法，其中选择的细胞具有如权利要求36至48任一项所定义的生物或其部分的特征中的一种或多种。
53.根据权利要求51或52所述的方法，其中第一和第二外源多核苷酸稳定整合到所述细胞的基因组中。
54.根据权利要求53所述的方法，进一步包括从步骤i)的细胞再生转基因植物的步骤。
55.一种使用权利要求51至54中任一项所述的方法获得的转基因细胞或植物，或由其获得的转基因植物部分。
56.一种或多种外源多核苷酸用于产生当与不含所述一种或多种外源多核苷酸的相应生物或其部分相比时具有增强的产生一种或多种非极性脂质的能力的转基因非人生物或其部分的用途，所述外源多核苷酸编码：
i)MGAT，
ii)DGAT2，
iii)MGAT和GPAT
iv)MGAT和DGAT，或
v)MGAT、GPAT和DGAT。
57.一种植物的转基因种子，所述种子包含一种或多种外源多核苷酸并与不含所述外源多核苷酸的相应种子相比具有升高水平的一种或多种非极性脂质。
58.根据权利要求57所述的转基因种子，所述转基因种子包含权利要求36至48所定义的特征中的一种或多种。
59.一种转基因植物，其产生权利要求57或58所述的种子。
60.根据权利要求59所述的转基因植物，其中所述植物为芸苔(Brassica sp.)、陆地棉(Gossypium hirsutum)、亚麻(Linum usitatissimum)、向日葵(Helianthus sp.)、红花(Carthamus tinctorius)、大豆(Glycine max)、玉米(Zea mays)、拟南芥(Arabidopsis thaliana)、两色高梁(Sorghum bicolor)、高粱(Sorghum vulgare)、燕麦(Avena sativa)、三叶草(Trifolium sp.)、亚麻荠(Camelina sativa)、异源三倍体芒草奇岗(Miscanthus x giganteus)或中国芒(Miscanthus sinensis)。
61.一种产生种子的方法，所述方法包括：
i)使权利要求59或60所述的转基因植物生长，以及
ii)收获所述种子。
62.一种发酵方法，包括以下步骤：
i)提供含有液体组合物的容器以及发酵和脂肪酸生物合成所需的成分，所述液体组合物包含适合发酵的权利要求48所述的转基因非人生物，以及
ii)提供有利于所述容器中所含的液体组合物发酵的条件。
63.可通过权利要求1至34中任一项所述的方法获得的，或者可通过权利要求35至50中任一项所述的转基因非人生物或其部分、权利要求55所述的转基因细胞或植物、权利要求57或58所述的转基因种子、或权利要求59或60所述的转基因植物获得的提取的脂质。
64.一种可从转基因非人生物或其部分获得的提取的脂质，其包含按所述提取的脂质的重量计至少1%(w/w)的DAG含量。
65.权利要求35至50中任一项所述的转基因非人生物或其部分、权利要求55所述的转基因细胞或植物、权利要求57或58所述的转基因种子、权利要求59或60所述的转基因植物、或者权利要求63或64所述的提取的脂质用于制造工业产品的用途。
66.根据权利要求65所述的用途，其中所述工业产品为燃料。
67.一种产生燃料的方法，所述方法包括：
i)任选地在存在催化剂的情况下将权利要求63或64所述的脂质与醇反应以产生烷基酯，以及
ii)任选地将所述烷基酯与基于石油的燃料共混。
68.根据权利要求67所述的方法，其中所述烷基酯为甲酯。
69.一种产生饲料的方法，所述方法包括将权利要求35至50中任一项所述的转基因非人生物或其部分、权利要求55所述的转基因细胞或植物、权利要求57或58所述的转基因种子、权利要求59或60所述的转基因植物、或者权利要求63或64所述的提取的脂质、或其提取物或部分与至少一种其他食品成分混合。
70.饲料、化妆品或化学品，其包含权利要求35至50中任一项所述的转基因非人生物或其部分、权利要求55所述的转基因细胞或植物、权利要求57或58所述的转基因种子、权利要求59或60所述的转基因植物、或者权利要求63或64所述的提取的脂质、或其提取物或部分。
71.一种用于鉴定编码在细胞中产生MAG、DAG和/或TAG的能力升高的酰基转移酶的核酸分子的方法，所述方法包括：
i)获得包含可操作地连接到在细胞中具有活性的启动子的核酸分子的细胞，其中所述核酸分子包含如权利要求27、28或29中任一项或多项所定义的核苷酸序列和/或编码具有SEQ ID NO:220、221、222、223、224、225、226和227所提供的一种或多种氨基酸序列或与其至少50%、优选至少60%、更优选至少65%相同的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列，
ii)确定所述细胞中产生的MAG、DAG和/或TAG的水平当与不含所述核酸的相应细胞相比时是否是升高的，以及
iii)鉴定编码在所述细胞中产生MAG、DAG和/或TAG的能力升高的酰基转移酶的核酸分子。
72.根据权利要求71所述的方法，其中所述酰基转移酶催化MGAT途径中的酶反应。
73.根据权利要求71或72所述的方法，其中所述酰基转移酶为MGAT、GPAT和/或DGAT。
74.根据权利要求73所述的方法，其中所述GPAT还具有磷酸酶活性以产生MAG，如拟南芥GPAT4或GPAT6。
75.根据权利要求73或74所述的方法，其中所述DGAT为DGAT2。
76.根据权利要求71至75中任一项所述的方法，进一步包括在步骤i)前向细胞中引入所述核酸分子。
77.根据权利要求71至76中任一项所述的方法，其中所述细胞为植物细胞。
78.根据权利要求71至77中任一项所述的方法，其中所述酰基转移酶比拟南芥DGAT1更多地提高所述细胞中TAG的产生。
79.一种分离和/或重组的多核苷酸，其包含：
i)选自SEQ ID NO:1至6任一的核苷酸序列，或
ii)与i)至少80%相同的核苷酸序列。
80.一种载体，其包含权利要求79所述的多核苷酸。
81.一种转基因细胞，其包含权利要求79所述的多核苷酸或权利要求80所述的载体。
82.一种转基因非人生物或其部分，其包含权利要求79所述的多核苷酸、权利要求80所述的载体或权利要求81所述的转基因细胞。
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