CN109504693B - 一种甘蓝型油菜昆虫抗性和抗病性BnGPAT基因及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于油菜基因工程技术领域，涉及油菜分子育种领域，提供了一种甘蓝型油菜昆虫抗性和抗病性BnGPAT6基因及其应用。所述基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.1所示。该基因的表达与抗病性相关。降低该GPAT6的表达量，植株抗病性减弱。降低该GPAT6的表达量，叶片组织的渗透性增加。叶片抗虫性降低。因此，过表达该BnGPAT6基因，将有利于在后代中选择高产、抗虫抗病新材料。

Description

一种甘蓝型油菜昆虫抗性和抗病性BnGPAT基因及其应用

技术领域

本发明属于油菜基因工程技术领域，涉及油菜分子育种领域，具体涉及一种甘蓝型油菜昆虫抗性和抗病性BnGPAT基因及其应用。该基因编码一种磷酸甘油酰基转移酶。

背景技术

GPAT是三酰甘油（TAG）生物合成的限速酶，催化TAG生物合成的起始步骤。在拟南芥中已报道的GPAT家族成员共10个，根据酶的亚细胞定位可分为3类，分别为质体GPAT、线粒体GPAT和内质网GPAT。对GPAT基因家族的研究主要集中在GPAT基因与植物的花粉育性上。目前国内外对植物GPAT基因家族的研究主要集中在对拟南芥、番茄等少数植物上。在甘蓝型油菜中只对BnGPAT4基因进行了研究。

植物在生长发育过程中，经常会受到一些植食性昆虫的危害。为抵御害虫的侵袭，植物在长期的进化中，形成了特有的复杂的防御体系。植物依靠自身产生的一些物质或自身的因素影响和控制害虫的数量和分布，从而使植物免遭病虫危害或者抵御病虫危害。

发明内容

本发明提供了一种甘蓝型油菜昆虫抗性和抗病性Bn GPAT基因及其应用。

本发明由如下技术方案实现的：一种甘蓝型油菜昆虫抗性及抗病性BnGPAT基因，所述基因的核苷酸序列是序列表SEQ ID NO.1中1-1631bp碱基所示的核苷酸序列。

所述基因在制备甘蓝型油菜抗病植株中的用途。采用RNA干扰技术降低转基因植株中BnGPAT6基因的表达量，BnGPAT6基因低表达的植株在自然条件下比野生型易感油菜菌核病。

所述基因在制备甘蓝型油菜高产和高含油量植株中的用途。采用RNA干扰技术降低转基因植株中BnGPAT6基因的表达量，BnGPAT6基因低表达的种子在自然条件下比野生型种子出苗慢。

采用RNA干扰技术降低转基因植株中BnGPAT6基因的表达量，BnGPAT6基因低表达的植株成熟种子千粒重较低，种子较小。

采用RNA干扰技术降低转基因植株中BnGPAT6基因的表达量，BnGPAT6基因低表达的植株叶片渗透性增加。

采用RNA干扰技术降低转基因植株中BnGPAT6基因的表达量，BnGPAT6基因低表达的植株在温室种植时易感蚜虫。

本发明所述BnGPAT6基因的表达与植株的抗病性有关，与植物叶片抗虫性有关，采用RNA干扰技术，使得该基因表达量降低后，植株的抗病性减弱，叶片抗虫性降低，该基因通过改变叶片组织的渗透性来改变叶片的抗病、虫性。降低该BnGPAT6的表达量，叶片组织的渗透性增加，抗病性减弱，抗虫性降低。

附图说明

图1为pCaMGPAT6-RNAi质粒的线性图谱；

图2为GPAT6基因的相对表达量，图中：WT：野生型植株； BT1-18，BT1-64，BT1-84，BT2-25，BT2-32：不同的GPAT6-RNAi植株；

图3为野生型和GPAT6-RNAi植株的生长发育情况， WT：野生型植株；BT2-32为GPAT6-RNAi植株；图A：植株出真叶情况；B：幼苗生长情况。

图4为野生型和GPAT6-RNAi植株收获种子性状：A、种子形状；B.千粒重。WT：野生型植株收获的种子； BT1-24，BT1-25：GPAT6-RNAi T₂植株收获的种子。

图5为野生型和GPAT6-RNAi植株叶片蚜虫为害情况；WT：野生型植株； BT：GPAT6-RNAi植株。

图6为野生型和GPAT6-RNAi植株经甲苯胺蓝染色和95%乙醇脱色后的结果；左为野生型植株；右为GPAT6-RNAi植株。

图7为野生型和GPAT6-RNAi植株经核盘菌侵染后的结果；WT：野生型植株； BT：GPAT6-RNAi植株。图A:离体叶片抗病性试验；B:叶片透射电镜观察。A.a-c:野生型植株叶片接种菌丝块24h、48 h、72 h记录；d-f:转基因植株叶片接种菌丝块24h、48 h、72 h记录。Bg-h:野生型植株正常叶片和接种菌丝块24h透射电镜观察；i-g: 转基因植株正常叶片和接种菌丝块24h透射电镜观察。

具体实施方式

实施例1：

1.供试材料:本实验中的供试材料为甘蓝型油菜品系7B。用于转化的外源质粒为携带有用于降低GPAT6基因表达量的RNA发夹结构的pCaMGPAT6-RNAi质粒，该质粒还含有用于RNAi转化植株筛选的GUS报告基因，编码β-半乳糖苷酶（β-glucuronidase），受35S启动子（CaMV35S）的调控；NPTII是新霉素基因，编码卡那霉素抗性，为转基因的抗生素筛选标记；HIndШ和Xbal分别为酶切位点。pCaM GPAT6-RNAi质粒的线性图谱如图1所示。

2. 实验方法

2.1 RNAi植株的获得

本实验采用花粉介导法进行RNAi转基因植株构建。供试材料甘蓝型油菜品系7B在山西省农科院实验田内进行种植。

供试材料2015年4月初在油菜开花期用花粉介导法将pCaM GPAT6-RNAi质粒转入油菜基因组中得到转化株。转化株种植于温室中收获T₁代种子。种子播种后待幼苗长出5、6片真叶时，提取野生型植株和RNAi植株的DNA ，利用质粒载体上的GUS标记做PCR扩增，进行RNAi植株的筛选。对筛选到的RNAi植株，进行生长发育和生理生化实验分析，直至收获T₂种子。

2.2野生型和转基因植株中GPAT6基因的相对表达量

在植株长到5，6片叶时，取幼嫩叶片提取野生型和GPAT6-RNAi植株的RNA，利用Primer Premier 5.0设计Actin和GPAT6基因的特异性引物。采用TaKaRa公司，一步法荧光定量PCR试剂盒（One Step PrimeScript PLUS RT-PCR Kit）说明书的操作方法，在美国应用生物系统（Applied Biosystems）（ABI）公司生产的7500 Real Time PCR System中进行qRT-PCR扩增，测定野生型和GPAT6-RNAi植株中GPAT6基因的表达量。

（1）Actin基因为内参基因，其引物的序列如下：

Actin-F：5’-CCCTGGAATTGCTGACCGTA-3’

Actin-R：5’-TGGAAAGTGCTGAGGGATGC-3’

GPAT6基因的引物的序列如下：

GPAT6-F：5’-GCTGATCTTACTCGCGTCCG-3’

GPAT6-R：5’-TGTCCCGCTTCAACTCTTTC-3’

根据qRT-PCR扩增结果，计算出野生型和GPAT6-RNAi植株的GPAT6基因表达量。

3 实验结果

GPAT6-RNAi植株的获得

2015年4月，采用花粉介导法将可干扰GPAT6基因转录的GPAT6-RNAi表达载体的pCaM GPAT6-RNAi质粒转入甘蓝型油菜品系7B中，并在当年5月收获种子。T₀油菜植株中，去雄总数358个，结果荚数89个，结果荚率为24.86%，其中收获种子278粒。

2015年11月从收获的T₁种子中，选取了129粒颗粒饱满的油菜种子，播种于山西太原温室中，待幼苗长出5-6片真叶时，通过CTAB法提取叶片总DNA。根据GUS基因序列，通过Primer Premier 5.0设计GUS报告基因的引物。通过PCR扩增检测拟转基因植株中GUS基因的整合，鉴定油菜GPAT6-RNAi转基因植株，得到RNAi植株 34株。

RNAi植株中GPAT6基因的相对表达量低于野生型植株

将pCaM GPAT6-RNAi质粒转入油菜后，利用qRT-PCR测定实验植株中GPAT6基因的相对表达量。结果如图2所示：所有测定的11株RNAi植株中GPAT6基因的相对表达量都显著低于野生型。以野生型植株GPAT6基因的表达量为1，测定RNAi植株GPAT6基因的相对表达量，在RNAi植株中，GPAT6基因的相对表达量最高的是BT1-64植株，GPAT6基因的相对表达量最高0.769，RNA干扰程度最小为23.1%；GPAT6基因的相对表达量最低的是BT2-32，其GPAT6基因的表达量仅为0.184，RNA干扰程度最大，为81.6%。

GPAT6-RNAi植株生长发育受到影响

在野生型植株和RNAi植株的生长发育过程中，观察发现GPAT6-RNAi植株的种子萌发比野生型种子慢、出真叶晚，苗期植株较小。（如图3A；图3B所示）。种子成熟时，GPAT6-RNAi植株的种子颗粒不饱满、颗粒较小，野生型植株的种子颗粒饱满、颗粒较大（如图4所示）。说明GPAT6基因会影响植株的生长发育。

上述实验结果表明：GPAT6基因可以影响植株的生长发育。GPAT6-RNA干扰植株中GPAT6基因的表达量下降后，出真叶时间晚，苗期植株较小。GPAT6基因与种子产量相关。GPAT6基因表达量降低，种子颗粒较小，不饱满。因此，过表达GPAT6基因有利于在后代中筛选高生长量（高产）和高含油量材料，在育种实践中具有重要意义。

实施例2：

1.供试材料:实施例1所得转pCaM GPAT6-RNAi质粒的GPAT6-RNAi转基因植株和野生型植株。

2. 实验方法

2.1 叶片抗虫性分析

野生型和RNAi幼苗经4℃春化后，于2016年9月初种植于山西农业科学院日光温室中，50天后观察叶片背面上蚜虫虫口密度。

2.2 叶片的甲苯胺蓝染色

（1）采集野生型植株和RNAi植株倒第四片叶（即从上往下数第四片叶）、面积约1平方分米的叶片，清洗干净并去除叶表面的杂质，然后用吸水纸擦去叶表面的水渍。

（2）将整个叶片全部浸入装有0.025%的甲苯胺蓝溶液的磁盘（23cm×16cm）中进行染色，然后用保鲜膜密封，期间不断的观察其染色情况。

（3）染色2天后，取出甲苯胺蓝溶液中染色后的叶片，放到自来水下以流水状态小心冲洗叶片10分钟，以便除去叶表面残留的甲苯胺蓝溶液，然后用吸水纸擦去叶表面的水渍。将擦干后的叶片全部浸入无水乙醇中进行脱色，观察并记录其脱色情况。

3.实验结果

3.1 温室条件下油菜植株叶片虫害发生程度

野生型和GPAT6-RNAi植株在温室自然条件下的蚜虫发生情况见图5和表1，从表1可以看出GPAT6-RNAi植株表现了显著的易感昆虫特征。

表1 野生型和RNAi植株叶片蚜虫发生情况

2 GPAT6-RNAi植株叶片的甲苯胺蓝染色面积较野生型植株叶片大

将野生型植株和GPAT6-RNAi植株的叶片浸没在0.025%的甲苯胺蓝溶液中，在0.025%的甲苯胺蓝溶液中浸没染色48小时后，放入95%的乙醇中进行脱色处理，结果见图6。由图6可知结果染色后野生型叶片（WT）着色较少，约占叶片总面积的5%；GPAT6-RNAi植株叶片着色面积较大，约占叶片总面积的50%。表明GPAT6-RNAi植株叶片在甲苯胺蓝染色时，易着色。甲苯胺蓝作为一种指示剂，用在叶片染色中，可以指示叶片组织的渗透性。利用RNAi技术，降低了GPAT6基因在转基因植株中的表达量，影响了GPAT6-RNAi植株的叶片结构，致使GPAT6-RNAi植株叶片的渗透性增加，进一步导致了叶片抗虫性的减弱。因此，利用基因工程技术，构建过表达GPAT6基因的转基因植株，有利于在后代中筛选高抗虫性材料，在育种实践中具有重要意义。

3.2 GPAT6-RNAi植株叶片经核盘菌侵染后抗病性较野生型植株弱

将供试核盘菌接种于PDA平板，23℃恒温培养，用酒精灯烧过的直径5mm的打孔器打取菌落的边缘，并采集大小均一、新鲜无破损的油菜叶片，接种前用蒸馏水冲洗叶片表面，并擦干。然后放置于铺有湿润吸水纸的托盘中，将菌丝接种于叶片同一部位后用保鲜膜覆盖接种盘保湿，23℃下培养，分别于24h、48 h、72 h记录发病情况，结果见图7A。取正常野生植株（WT）和GPAT6-RNAi植株的叶片及接种菌丝块24 h后的野生和GPAT6-RNAi植株叶片用2.5%戊二醛4℃固定，PBS缓冲液冲洗3次，每次10分钟，后用1％锇酸4℃后固定2小时，PBS缓冲液冲洗3次，每次10分钟；乙醇系列梯度脱水，30%、50%、70%、90%、100%的乙醇每次10分钟，其中100%两次；Epon812环氧树脂包埋，37℃、45℃、65℃温箱固化，每级温度24小时；UltracutE超薄切片机制超薄切片，醋酸双氧铀硝酸铅染色后并于日本JEOL公司JEM-1200EX透射电镜下上机测试、镜检照相。投射电镜的操作方法依照青岛科普研发中心电镜公共平台的电镜操作规程，结果见图7B。结果表明，GPAT6-RNAi植株相比于野生型植株，接种菌丝块后其发病快，相同时间下其病斑明显大于野生型植株。从叶片的透射电镜中我们可以看出GPAT6-RNAi植株的细胞壁比野生型植株的薄，且松散；相同时间下病菌对转基因植株的细胞侵染更严重。利用RNAi技术，降低了GPAT6基因在转基因植株中的表达量，影响了GPAT6-RNAi植株的叶片结构，致使GPAT6-RNAi植株叶片的细胞壁变且松散，进一步导致了叶片抗病性的减弱。因此，利用基因工程技术，构建过表达GPAT6基因的转基因植株，有利于在后代中筛选高抗病性材料，在育种实践中具有重要意义。

序列表

<110> 山西大学

<120> 一种甘蓝型油菜昆虫抗性和抗病性BnGPAT基因及其应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1631

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

aaaagtattc acaatccatt ctcaacttct aaatcaccct ttactctctc tctctgttct 60

cttctttttc tgctctctcc agcttattcc ctgatggggg ctcacgagaa gcggcgtcgt 120

ttcgagccaa tatcaagtta cgagattaag gaccggtcga accaaaccgt tgccgctgat 180

cttgacggga ccttactaat ctctcgtagt gcatttcctt attattttct cgtggccctc 240

gaagcaggga gcttactccg agccttgatc ttactcgcat ccgtaccgtt tgtttacctc 300

atgtacctct caatttccga gactctagcc atcaacgttt tcatctttat caccttcgcg 360

ggtctcaaga tccgagacgt cgagctcgtg gtccgttccg tacttccaag gttctacgcc 420

gaggatgtga ggccagactc gtggagtatc ttcaacacgt tcgggaaacg ttacatagta 480

acagcgagtc cacggatcat ggtcgaaccg ttcgcgaaga cattcctagg tgtcgataaa 540

gttcttggaa cagaactcga ggtttccaaa tccggtcggg caaccggttt tgtcagaaga 600

cccggtgttc ttgtcggtca acacaaacgc gatgccgttt tgagagagtt cggtggcgtt 660

gcgtctagtt tacctgattt ggggcttggc gatagtaaga cagaccacga tttcatgaca 720

atttgcaagg agggttacat ggtgccacgt acaaaatgcg aaccattacc aagaaacaaa 780

ctcttaagca ccataatatt ccacgagggc agattagtcc aacgtccaac gccattagtt 840

gctctgttaa ctctcctttg gcttcccatc ggttttctag tctctcttat ccgtgtctac 900

acgaatattc cactacccga acgcattgca cgttataact acaagctcac agggatcaaa 960

ctagtcgtca acggccaccc tcctccgccg cctaagcctg gccaaccagg ccacctattg 1020

gtatgcaacc accggactgt actcgaccct gtggtgacag ctgtggtgct cggtcggaaa 1080

atcagctgcg taacctacag tatcagtaaa ttctctgagc taatctctcc aatcaaaacc 1140

gttgcgttga ctcgtcagcg cgataaagac gcagcgaaca tcaagcgtct cttggaggaa 1200

ggcgatcttg tgatatgtcc cgagggaacc acgtgccgtg agcctttcct gcttcggttt 1260

agcgccatgt tcgccgagct cacggaccgg atcgtccctg tggctatcaa caccaaacaa 1320

agcatgttta atggtacaac cacacgtggc tacaagcttc ttgatcctta cttcgcgttt 1380

atgaatccca ttcccacgtt cgagatcact ttccttaagc agctgccggc tgagctgaca 1440

tgtaaaggag gcaagtcgcc gatagaggtg gcgaattaca tacagagggt tttggcagga 1500

accttagggt ttgagtgcac aaatttcaca agaaaggata agtacgcaat gctagctggc 1560

actgacggta gggttccaat gaagaaggag aagatataat tattgattgg ataaaagaga 1620

agatgaagaa a 1631

Claims (2)

1.一种甘蓝型油菜昆虫抗性和抗病性BnGPAT6基因的应用，其特征在于：所述基因在制备甘蓝型油菜抗蚜虫、抗病植株中的用途，该基因的核苷酸序列为序列表SEQ ID NO.1中1-1631bp碱基所示的核苷酸序列。

2.根据权利要求1所述的一种甘蓝型油菜昆虫抗性和抗病性BnGPAT6基因的应用，其特征在于：所述基因在制备甘蓝型油菜高产和高含油量植株中的用途。

Images