CN110106019A - 一种利用裂壶藻生产复合型多不饱和脂肪酸油脂的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及微生物油脂领域，特别涉及一种利用裂壶藻生产复合型多不饱和脂肪酸油脂的方法。该方法包括：对裂壶藻进行发酵培养；将发酵培养后的菌体用水重悬，加入纤维素酶和中性蛋白酶进行酶解；将酶解液与正己烷混合，振荡萃取，离心，收集正己烷相，减压浓缩除去正己烷，干燥，得到油脂；将油脂采用冷冻结晶技术进行第一级结晶，将液体油脂进行第二级结晶，冷滤后得到二次结晶后的液体油脂；脱酸、脱色。本发明通过对发酵条件的调控和多不饱和脂肪酸的浓缩加工，成功地实现了将裂壶藻中二十碳五烯酸含量提升到12％以上，产出的油脂富含二十二碳六烯酸、二十二碳五烯酸和二十碳五烯酸，是一种可以替代鱼油来源多不饱和脂肪酸的新型油脂产品。

Description

一种利用裂壶藻生产复合型多不饱和脂肪酸油脂的方法
技术领域
本发明涉及微生物油脂领域，特别涉及一种利用裂壶藻生产复合型多不饱和脂肪酸油脂的方法。
背景技术
目前商业上ω-3多不饱和脂肪酸(PUFAs)主要来源于海洋鱼类，鱼油作为来源因为受腥臭味和稳定性等严重影响，限制了其作为食品添加剂和食品辅料的使用。全球鱼类资源因过度捕捞已趋于减少，日渐匮乏的海产鱼油难以满足人们对二十碳五烯酸(EPA)和二十二碳六烯酸(DHA)日益增长的需求。此外，鱼油的供应和质量受季节和天气的变化影响较大，有毒杂质重金属和有机物造成的海洋污染也限制了鱼油来源PUFAs的进一步开发。ω-3PUFAs的高市场价格使许多潜在的应用难以实现。意识到ω-3PUFAs的供给将远远落后于需求，人们开始寻求新的ω-3PUFAs的来源。
鱼油PUFAs制品中DHA、EPA的含量往往都在10％以上，是复合型的PUFAs产品，具有单一PUFAs难以实现的多种生理活性和功能。而目前已公开的文献中单一微藻发酵的油脂DHA、EPA的含量不能同时达到这一水平。裂壶藻(Schizochytrium sp.)是目前研究较多的用于生产DHA的异养微藻之一，是一种非常有前景的生产ω-3PUFAs的替代资源，具有生产成本低、发酵速度快、生物量高、油脂产量高、菌株安全性高等特点，是国家批准的藻油生产菌株。
目前，普通发酵条件下裂壶藻油脂中DHA含量达到35％以上，而EPA含量仅为0.5％～1.0％左右，EPA含量远远低于鱼油中EPA含量，难以进行复合型PUFAs产品开发。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种利用裂壶藻生产复合型多不饱和脂肪酸油脂的方法。该发明通过对发酵条件的调控和多不饱和脂肪酸的浓缩加工，成功地实现了将裂壶藻中二十碳五烯酸含量提升到12％以上，产出的油脂富含二十二碳六烯酸、二十二碳五烯酸和二十碳五烯酸，是一种可以替代鱼油来源多不饱和脂肪酸的新型油脂产品，具有显著的产业化开发价值。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种利用裂壶藻生产复合型多不饱和脂肪酸油脂的方法，包括如下步骤：
步骤(1)：对裂壶藻进行发酵培养，发酵培养基组成为：葡萄糖90～120g/L，谷氨酸钠16～32g/L，酵母粉2～16g/L，硫酸镁1.8～3.24g/L，硫酸铵3.5～6.8g/L，氯化钾0.5～1.5g/L，磷酸二氢钾3.2～3.8g/L，硫酸钠35～45g/L，水补足；
步骤(2)：将发酵培养后的菌体用水重悬，加入纤维素酶和中性蛋白酶进行酶解，得到酶解液；
步骤(3)：将酶解液与正己烷混合，振荡萃取，离心，收集正己烷相，减压浓缩除去正己烷，干燥，得到油脂；
步骤(4)：将油脂进行第一级结晶，冷滤后得到固体油脂和液体油脂；
步骤(5)：将液体油脂进行第二级结晶，冷滤后得到二次结晶后的液体油脂；
步骤(6)：将二次结晶后的液体油脂脱酸、脱色。
优选地，发酵培养基组成为：葡萄糖100g/L，谷氨酸钠20g/L，酵母粉4g/L，硫酸镁2.24g/L，硫酸铵4.8g/L，氯化钾1g/L，磷酸二氢钾3.5g/L，硫酸钠37g/L，水补足。
作为优选，发酵培养的接种量为5％～15％，转速为200～500rpm，通气量为0.5～2vvm，温度为23～29℃，pH自然；在36h以后补加葡萄糖40～80g/L，发酵培养的时间为84～168h。
优选地，发酵培养的接种量为10％，转速为300rpm，通气量为1.39vvm，温度为26℃，pH自然；在48h时补加葡萄糖40g/L，发酵培养的时间为96h。
作为优选，步骤(2)菌体与水的质量比为1:(0.5～2.5)。
优选地，步骤(2)菌体与水的质量比为1:2。
在本发明中，步骤1发酵所得菌体可以干燥后得到干藻粉，重悬干藻粉，则加水比例为1:(2～6)。
作为优选，纤维素酶的加入量为2000～5000U/g，中性蛋白酶的加入量为2000～5000U/g。
优选地，纤维素酶的加入量为2500U/g，中性蛋白酶的加入量为2500U/g。
作为优选，酶解的温度为50～60℃，酶解的时间为1.5～6h，酶解的转速为50～200r/min。
优选地，酶解的温度为55℃，酶解的时间为4h，酶解的转速为60r/min。
作为优选，以裂壶藻干粉质量计，正己烷的加入量为0.5～4mL/g；
优选地，以裂壶藻干粉质量计，正己烷的加入量为2mL/g。
作为优选，振荡萃取的时间为1～10min，于3000～8000r/min转速下离心3～10min，重复萃取2～5次；
优选地，振荡萃取的时间为2min，于5000r/min转速下离心5min，重复萃取3次。
作为优选，减压浓缩的温度为35～60℃，干燥的温度为40～60℃。
优选地，减压浓缩的温度为40℃，干燥的温度为50℃。
作为优选，第一级结晶具体为：将油脂置于结晶罐中，在氮气保护下，先搅拌并升温至35～50℃，保温至油脂全部融化，然后在24h内逐步降温至10℃，降温速率2～3℃/h，油温降至10℃后保温6h以上。
优选地，第一级结晶具体为：将油脂置于结晶罐中，在氮气保护下，先搅拌并升温至40℃，保温至油脂全部融化。
作为优选，第二级结晶具体为：搅拌并升温至20℃，保温至油脂全部融化，然后在24h内逐步降温至-2℃，降温速率为2℃/h。
作为优选，脱酸为：在氮气保护下，将油脂水浴加热至50～80℃并维持恒温；缓慢添加质量百分浓度为8％～12％的氢氧化钠溶液，边添加边搅拌，氢氧化钠溶液添加量达到完全中和油脂中的游离脂肪酸的量，搅拌9～13min后停止搅拌，静置分层，回收上层油相得到脱酸后的藻油。
优选地，脱酸为：在氮气保护下，将油脂水浴加热至60℃并维持恒温；缓慢添加质量百分浓度为10％的氢氧化钠溶液，边添加边搅拌，氢氧化钠溶液添加量达到完全中和油脂中的游离脂肪酸的量，搅拌10min后停止搅拌，静置分层，回收上层油相得到脱酸后的藻油。
作为优选，脱色为：在氮气保护下，将油脂水浴加热至55～70℃并维持恒温和搅拌；逐渐加大真空度至-0.08～-0.10MPa，对物料进行脱水12～16min，然后添加脱色剂；维持恒温、真空度和搅拌，吸附时间为40～45min；真空过滤分离脱色剂。
优选地，脱色为：在氮气保护下，将油脂水浴加热至60℃并维持恒温和搅拌；逐渐加大真空度至-0.09MPa，对物料进行脱水15min，然后添加脱色剂；维持恒温、真空度和搅拌，吸附时间为40～45min；真空过滤分离脱色剂。
本发明提供了一种利用裂壶藻生产复合型多不饱和脂肪酸油脂的方法。该方法包括如下步骤：对裂壶藻进行发酵培养；将发酵培养后的菌体用水重悬，加入纤维素酶和中性蛋白酶进行酶解，得到酶解液；将酶解液与正己烷混合，振荡萃取，离心，收集正己烷相，减压浓缩除去正己烷，干燥，得到油脂；将油脂进行第一级结晶，冷滤后得到固体油脂和液体油脂；将液体油脂进行第二级结晶，冷滤后得到二次结晶后的液体油脂；将二次结晶后的液体油脂脱酸、脱色。本发明具有如下优势：
本发明通过对发酵条件的调控和多不饱和脂肪酸的浓缩加工，成功地实现了将裂壶藻中二十碳五烯酸含量提升到12％以上，是已公开文献中EPA含量的10倍以上，产出的油脂富含二十二碳六烯酸、二十二碳五烯酸和二十碳五烯酸，是一种可以替代鱼油来源多不饱和脂肪酸的新型油脂产品，具有显著的产业化开发价值。
具体实施方式
本发明公开了一种利用裂壶藻生产复合型多不饱和脂肪酸油脂的方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明的技术要点如下：
(1)配制发酵培养基组成为：葡萄糖90-120g/L，谷氨酸钠16-32g/L，酵母粉2-16g/L，硫酸镁1.8-3.24g/L，硫酸铵3.5-6.8g/L，KCl0.5-1.5g/L，KH2PO4 3.2-3.8g/L，Na2SO435-45g/L；接种发酵，接种量5-15％，转速200-500rpm，通气量0.5-2vvm，温度23-29℃，pH自然；在36h以后补葡萄糖40-80g/L；
(2)裂壶藻发酵液经过离心或板框压滤得到湿菌体，按藻泥和水的比例1:0.5-2.5加入水(若为干藻粉，则加水比例1:2-6)，将裂壶藻菌体重悬；
(3)按2000-5000U/g加入纤维素酶和中性蛋白酶，酶解温度50-60℃，酶解时间1.5-6h，放于水浴恒温振荡器中50-200r/min进行酶解；
(4)酶解结束后，按裂壶藻干粉质量，以0.5-4mL/g的用量加入正己烷，振荡萃取1-10min，于3000-8000r/min离心3-10min，收集上层正己烷相，重复萃取2-5次，合并正己烷相；
(5)经35-60℃减压浓缩(旋转蒸发)除去正己烷；
(6)得到的藻油于40-60℃干燥至恒重，称取油脂重量；
(7)将提取得到的油脂泵入带有冷热水加热夹套的结晶罐中，并补充高纯氮气保护，防止氧化；
(8)搅拌并升温至35-50℃，保温至油脂全部融化。
(9)利用夹套逐渐降温，温度降低速率与转速降低速率根据具体设备的参数进行设定，将油脂在24h内逐步降温至10℃，降温速率2-3℃/h，油温降至10℃后保温6h以上。
(10)将结晶良好的油脂进行冷滤，得到固体油脂与液体油脂两相，将液体油脂进行第二级结晶分提；
(11)第二级结晶分提为：搅拌并升温至20℃，保温至油脂全部融化后，利用夹套逐渐降温，温度降低速率与转速降低速率根据具体设备的参数进行设定，将油脂在24h内逐步降温至-2℃，降温速率为2℃/h；
(12)将二次结晶良好的油脂进行冷滤，得到的液体油进行下一步的精制。
(13)油脂脱酸，根据油脂酸价利用氢氧化钠溶液，在氮气保护下脱除游离脂肪酸，脱酸温度为55-65℃，碱液的添加量根据游离脂肪酸量计算；在容器中加入一定量的藻油，充氮气保护，水浴加热至50-80℃并维持恒温；添加8-12％的氢氧化钠溶液，缓慢添加，边添加边搅拌，搅拌9-13min后停止搅拌，静置分层，回收上层油相得到脱酸后的藻油；
(14)油脂脱色，根据油脂颜色指标，利用活性白土和活性炭进行脱色处理；在容器中加入藻油，充氮气保护，水浴加热至55-70℃并维持恒温和搅拌；逐渐加大真空度至-0.08～-0.10MPa，对物料进行脱水12-16min，然后添加脱色剂；维持恒温、真空度，并搅拌吸附时间为40-45min；真空过滤分离脱色剂后最终得到合格的产品。
本发明提供的利用裂壶藻生产复合型多不饱和脂肪酸油脂的方法中所用试剂或仪器均可由市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1
本实施例中利用裂壶藻生产复合型多不饱和脂肪酸油脂的方法如下：
(1)配制发酵培养基(300L)：葡萄糖30kg，谷氨酸钠6kg，酵母粉1.2kg，硫酸镁0.672kg，硫酸铵1.44kg，KCl0.3kg，KH2PO4 1.05kg，Na2SO411.1kg；接种发酵，接种量10％，转速300rpm，通气量25m3/h，温度26℃，pH自然。在48h时一次性补糖12kg。
(2)裂壶藻发酵液经过离心或板框压滤得到湿菌体，按藻泥和水的比例1:2加入水，将裂壶藻菌体重悬；
(3)按2500U/g加入纤维素酶(食品级，10万U/g，河南万邦实业有限公司)和中性蛋白酶(食品级，20万U/g，河南万邦实业有限公司)(2:8，U:U)，酶解温度55℃，酶解时间4h，放于水浴恒温振荡器中60r/min进行酶解；
(4)酶解结束后，按裂壶藻干重，以2mL/g的用量加入正己烷，振荡萃取2min，于5000r/min离心5min，收集上层正己烷相，重复萃取3次，合并正己烷相；
(5)经40℃减压浓缩(旋转蒸发)除去正己烷；
(6)得到的藻油于50℃干燥至恒重，称取油脂重量；
(7)将提取得到的油脂泵入带有冷热水加热夹套的结晶罐中，并补充高纯氮气保护，防止氧化；
(8)搅拌并升温至40℃，保温至油脂全部融化。
(9)利用夹套逐渐降温，温度降低速率与转速降低速率根据具体设备的参数进行设定，将油脂在24h内逐步降温至10℃，降温速率2-3℃/h，油温降至10℃后保温6h以上。
(10)将结晶良好的油脂进行冷滤，得到固体油脂与液体油脂两相，将液体油脂进行第二级结晶分提；
(11)第二级结晶分提为：搅拌并升温至20℃，保温至油脂全部融化后，利用夹套逐渐降温，温度降低速率与转速降低速率根据具体设备的参数进行设定，将油脂在24h内逐步降温至-2℃，降温速率为2℃/h；
(12)将二次结晶良好的油脂进行冷滤，得到的液体油进行下一步的精制。
(13)油脂脱酸，根据油脂酸价利用氢氧化钠溶液，在氮气保护下脱除游离脂肪酸，脱酸温度为60℃，碱液的添加量根据游离脂肪酸量计算；在容器中加入一定量的藻油，充氮气保护，水浴加热至60℃并维持恒温；添加10％的氢氧化钠溶液，缓慢添加，边添加边搅拌，搅拌10min后停止搅拌，静置分层，回收上层油相得到脱酸后的藻油；
(14)油脂脱色，根据油脂颜色指标，利用活性白土和活性炭进行脱色处理；在容器中加入藻油，充氮气保护，水浴加热至60℃并维持恒温和搅拌；逐渐加大真空度至-0.09MPa，对物料进行脱水15min，然后添加脱色剂；维持恒温、真空度，并搅拌吸附时间为40-45min；真空过滤分离脱色剂后最终得到合格的产品。
利用500L发酵罐(发酵容积300L)，通过4天发酵，消耗葡萄糖40.82kg，获得干藻粉13.80kg，含油率36.60％，破壁得裂壶藻油脂5.05kg，油脂中含有DHA 27.67％，ω6DPA11.02％，ω3DPA1.87％，EPA9.44％。经过PUFA浓缩加工之后的终产品液体油PUFA含量为EPA21.14％、DHA 36.96％、ω3DPA 2.38％，ω6DPA 8.23％)。本实例制备的裂壶藻油脂中PUFAs含量尤其是EPA含量是已公开文献中EPA含量的10倍以上，具有极大的创新性和产业化开发价值。
本实例制备的裂壶藻油脂中PUFAs含量尤其是EPA含量是已公开文献中EPA含量的10倍以上，同时含有较高含量的DPA，该油脂中富含的DHA、EPA、DPA具有辅助降血脂、预防和降低心血管疾病风险的良好作用，同时该生产工艺稳定，具备非常高的大生产及产业化的可行性，因此该发明物从工艺和使用范围上具有极大的创新性和产业化开发价值。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种利用裂壶藻生产复合型多不饱和脂肪酸油脂的方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤(1)：对裂壶藻进行发酵培养，发酵培养基组成为：葡萄糖90～120g/L，谷氨酸钠16～32g/L，酵母粉2～16g/L，硫酸镁1.8～3.24g/L，硫酸铵3.5～6.8g/L，氯化钾0.5～1.5g/L，磷酸二氢钾3.2～3.8g/L，硫酸钠35～45g/L，水补足；
步骤(2)：将发酵培养后的菌体用水重悬，加入纤维素酶和中性蛋白酶进行酶解，得到酶解液；
步骤(3)：将酶解液与正己烷混合，振荡萃取，离心，收集正己烷相，减压浓缩除去正己烷，干燥，得到油脂；
步骤(4)：将油脂进行第一级结晶，冷滤后得到固体油脂和液体油脂；
步骤(5)：将液体油脂进行第二级结晶，冷滤后得到二次结晶后的液体油脂；
步骤(6)：将二次结晶后的液体油脂脱酸、脱色。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述发酵培养的接种量为5％～15％，转速为200～500rpm，通气量为0.5～2vvm，温度为23～29℃，pH自然；在36h以后补加葡萄糖40～80g/L，发酵培养的时间为84～168h。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述菌体与所述水的质量比为1:(0.5～2.5)。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述纤维素酶的加入量为2000～5000U/g，所述中性蛋白酶的加入量为2000～5000U/g。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述酶解的温度为50～60℃，酶解的时间为1.5～6h，酶解的转速为50～200r/min。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，以裂壶藻干粉质量计，所述正己烷的加入量为0.5～4mL/g；
振荡萃取的时间为1～10min，于3000～8000r/min转速下离心3～10min，重复萃取2～5次；
减压浓缩的温度为35～60℃，干燥的温度为40～60℃。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一级结晶具体为：将油脂置于结晶罐中，在氮气保护下，先搅拌并升温至35～50℃，保温至油脂全部融化，然后在24h内逐步降温至10℃，降温速率2～3℃/h，油温降至10℃后保温6h以上。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第二级结晶具体为：搅拌并升温至20℃，保温至油脂全部融化，然后在24h内逐步降温至-2℃，降温速率为2℃/h。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述脱酸为：在氮气保护下，将油脂水浴加热至50～80℃并维持恒温；缓慢添加质量百分浓度为8％～12％的氢氧化钠溶液，边添加边搅拌，氢氧化钠溶液添加量达到完全中和油脂中的游离脂肪酸的量，搅拌9～13min后停止搅拌，静置分层，回收上层油相得到脱酸后的藻油。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其特征在于，所述脱色为：在氮气保护下，将油脂水浴加热至55～70℃并维持恒温和搅拌；逐渐加大真空度至-0.08～-0.10MPa，对物料进行脱水12～16min，然后添加脱色剂；维持恒温、真空度和搅拌，吸附时间为40～45min；真空过滤分离脱色剂。
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