CN105349586B - 一种促进棕榈酸生物合成的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种促进棕榈酸生物合成的方法，包括以下步骤：S1、将裂殖壶菌的菌种使用种子培养基培养成种子液；S2、将种子液按照体积百分比3％～10％接入发酵培养基中进行发酵培养；S3、发酵培养过程中，前24h的培养温度25～28℃，在第20～24h向发酵培养基中添加0.5～8.0mL/L的无菌乳酸，并保持恒定转速180～200rpm；发酵培养24h后，培养温度为30～34℃，转速调至220～250rpm，并保持恒定；S4、发酵培养完成后，收集菌体，并对菌体进行油脂提取。本发明在较短的发酵周期内有效促进了棕榈酸合成，油脂占细胞干重的含量超过80％，棕榈酸占总油脂的含量超过65％，有效降低了棕榈酸生产成本，具有生产效率高，易于工业应用等优点。
Description
技术领域
本发明涉及微生物发酵生产，更具体的说，涉及一种促进棕榈酸生物合成的方法。
背景技术
棕榈酸(Palmitic acid)，又称软脂酸，是一种含有十六个碳原子的饱和高级脂肪酸，以甘油脂的形式普遍存在于动植物油脂中，在自然界中分布很广。由于其在生物能源和化工领域均有广泛的应用而备受关注。目前的生物柴油领域存在原料油来源匮乏、原料制备成本过高等问题，而棕榈酸是用于制备生物柴油较为理想的原料；而且棕榈酸的铝盐和锌盐还可大量应用于工业上的润滑剂、涂料、油墨及增塑剂中；棕榈酸的钠盐或钾盐也被广泛应用于制药工业中的乳化剂等，因此，棕榈酸的市场需求巨大。
棕榈酸的主要来源有棕榈树等植物油脂的分离提取，以及从动物油脂获取等，但以上生产方式存在原料获取周期长、制备成本过高、产量低等问题。裂殖壶菌作为一种海洋真菌，因其生长周期较短、油脂含量较高，且油脂中含有多不饱和脂肪酸而受到广泛关注。裂殖壶菌所产油脂的成分简单，主要为棕榈酸和二十二碳六烯酸，且棕榈酸的含量可超过30％，甚至更高。通过优化裂殖壶菌发酵技术，可在短期内获取大量且高含量的棕榈酸，因此，可以显著降低棕榈酸的制备成本，从而为棕榈酸的广泛应用提供新的原料来源保障。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于：提供一种促进棕榈酸生物合成的方法，解决现有的棕榈酸生产过程中存在的原料获取周期长、制备成本过高、产量低等问题。
本发明解决上述问题的技术方案在于：提供一种促进棕榈酸生物合成的方法，使用裂殖壶菌发酵生产棕榈酸，发酵培养基中添加淀粉水解液、豆粕水解液，并在发酵过程中向发酵培养基中添加乳酸。
在本发明提供的促进棕榈酸生物合成的方法中，所述淀粉水解液使用的淀粉为木薯淀粉、玉米淀粉、土豆淀粉中的至少一种；所述淀粉水解液中还原糖浓度250.0～300.0g/L。
在本发明提供的促进棕榈酸生物合成的方法中，所述豆粕水解液的制备过程包括：
每升水中混入豆粕粉120～160g，充分搅拌后常压下煮沸50～70min，待冷却至室温后调节pH至5.5～6.5，在5000～5500g下离心8～12min，取上清液，备用。
在本发明提供的促进棕榈酸生物合成的方法中，所述乳酸的添加量为0.5～8.0mL/L。
在本发明提供的促进棕榈酸生物合成的方法中，所述发酵培养基包括：淀粉水解液200.0～300.0mL/L，硝酸铵0.0～10.0g/L，硫酸铵0.0～10.0mL/L，豆粕水解液10.0～100.0mL/L，玉米浆3.0～8.0g/L，谷氨酸钠5.0～10.0g/L，硫酸镁0.5～3.0g/L，碳酸氢钙1.0～5.0g/L，磷酸二氢钾1.0～3.0g/L，硝酸钠5.0～10.0g/L。
在本发明提供的促进棕榈酸生物合成的方法中，裂殖壶菌体内的油脂占细胞干重的含量超过80％，棕榈酸占总油脂的含量超过65％。
在本发明提供的促进棕榈酸生物合成的方法中，裂殖壶菌的发酵过程包括以下步骤：
S1、将裂殖壶菌的菌种使用种子培养基培养成种子液；
S2、将种子液按照体积百分比3％～10％接入发酵培养基中进行发酵培养；
S3、发酵培养过程中，前24h的培养温度25～28℃，在第20～24h向发酵培养基中添加0.5～8.0mL/L的无菌乳酸，并保持恒定转速180～200rpm；发酵培养24h后，培养温度为30～34℃，转速调至220～250rpm，并保持恒定；
S4、发酵培养完成后，收集菌体，并对菌体进行油脂提取。
在本发明的方法中，所述步骤S1中使用的种子培养基包括：葡萄糖40.0g/L～60.0g/L，酵母粉5.0g/L～10.0g/L，蛋白胨1.0g/L～5.0g/L，硫酸镁0.5g/L～2.0g/L，碳酸氢钙0.2g/L～1.0g/L，磷酸二氢钾1.0g/L～3.0g/L，氯化钠1.0g/L～5.0g/L。种子液的培养条件为：向种子培养基中接入裂殖壶菌，接种量体积百分比为1％～8％，在摇床转速180rpm～300rpm、培养温度28℃～34℃的条件下进行摇瓶培养20h～24h，获得种子液。
在本发明提供的促进棕榈酸生物合成的方法中，淀粉水解液的制备包括：
(1)每升水中混入淀粉300g，加入高温α-淀粉酶(酶活力为20，000U/mL)催化热水浴液化过程；液化时间为30min，液化温度为95℃，液化酶的添加量为0.035mL/100g(淀粉)，液化初始pH为5.5；
(2)将液化得到的醪液冷却到设定的糖化温度后，加入糖化酶(酶活力≥100,000U/mL)，保温进行糖化；糖化化时间为5h，糖化化温度为60℃，糖化酶的添加量为0.03uL/100g(淀粉)，糖化初始pH为4.5。
实施本发明，具有如下有益效果：通过廉价碳氮源的选择，使裂殖壶菌油脂含量提高明显，棕榈酸含量较高，向发酵培养基中添加乳酸后，乳酸可被裂殖壶菌有效转化为用于脂肪酸合成的碳骨架，有效促进棕榈酸含量的进一步提高，同时，乳酸也有效的调节了发酵培养体系中的pH在一个较为稳定的范围。本发明具有降低发酵成本，效率高，且易于工业化生产等优点。
具体实施方式
下面将结合实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。
由于棕榈酸在生物能源，化工领域和医药食品等领域具有较好的应用价值和前景，但是现有技术对于如何低成本的大量获得棕榈酸仍然没有较好的办法。本发明的主要创新点在于，利用裂殖壶菌生长较快、油脂含量高、油脂成分简单、棕榈酸含量较高等特点，通过优化碳源、氮源组合，流加乳酸等方式，在大幅降低生产成本的同时，提高油脂成分特别是棕榈酸的合成积累。
实施例1
裂殖壶菌发酵产棕榈酸的生产方法，包括以下步骤：
(1)配制种子培养基，灭菌备用
种子培养基包括：葡萄糖40.0g/L，酵母粉5.0g/L，蛋白胨1.0g/L，硫酸镁0.5g/L，碳酸氢钙0.2g/L，磷酸二氢钾1.0g/L，氯化钠1.0g/L。
(2)配制发酵培养基，灭菌备用
发酵培养基包括：淀粉水解液200.0mL/L，硝酸铵10.0g/L，豆粕水解液30.0mL/L，玉米浆3.0g/L，谷氨酸钠5.0g/L，硫酸镁0.5g/L，碳酸氢钙1.0g/L，磷酸二氢钾1.0g/L，硝酸钠5.0g/L。淀粉水解液选用还原糖浓度300.0g/L的木薯淀粉水解液。
(3)制备种子液
向种子培养基中接入裂殖壶菌，接种量体积百分比为1％，在摇床转速250rpm、培养温度28℃的条件下进行摇瓶培养24h，获得种子液。
(4)发酵培养
将种子液按照体积百分比10％接入发酵培养基中进行发酵培养；发酵过程中，在发酵的前24h，培养温度25℃，并保持恒定转速180rpm；发酵培养24h后，培养温度为30℃，转速调至250rpm，并保持恒定；
在发酵的第20h，向发酵培养基中添加3.0mL/L的无菌乳酸；
(5)收集菌体、分离油脂
发酵培养50h后，收集菌体，干燥菌体后采用溶剂提取的方式萃取油脂，结果如表1所示，其中，生物量是单位体积培养液获得的细胞干重，油脂含量是分离所得的油脂占细胞干重的质量百分比，饱和脂肪酸含量是饱和脂肪酸占总油脂的质量百分比，棕榈酸含量是棕榈酸占总油脂的质量百分比。
表1 实施例1的培养结果
实施例2
裂殖壶菌发酵产棕榈酸的生产方法，包括以下步骤：
(1)配制种子培养基，灭菌备用
种子培养基包括：葡萄糖50.0g/L，酵母粉6.0g/L，蛋白胨2.0g/L，硫酸镁0.8g/L，碳酸氢钙0.4g/L，磷酸二氢钾1.2g/L，氯化钠1.5g/L。
(2)配制发酵培养基，灭菌备用
发酵培养基包括：淀粉水解液250.0mL/L，硝酸铵8.0g/L，硫酸铵2g/L，豆粕水解液70.0mL/L，玉米浆4.0g/L，谷氨酸钠6.0g/L，硫酸镁0.8g/L，碳酸氢钙1.5g/L，磷酸二氢钾1.2g/L，硝酸钠6.0g/L。淀粉水解液选用还原糖浓度280.0g/L的玉米淀粉水解液。
(3)制备种子液
向种子培养基中接入裂殖壶菌，接种量体积百分比为5％，在摇床转速200rpm、培养温度34℃的条件下进行摇瓶培养22h，获得种子液。
(4)发酵培养
将种子液按照体积百分比8％接入发酵培养基中进行发酵培养；发酵过程中，在发酵的前24h，培养温度26℃，并保持恒定转速190rpm；发酵培养24h后，培养温度为31℃，转速调至240rpm，并保持恒定；
在发酵的第22h，向发酵培养基中添加2.0mL/L的无菌乳酸；
(5)收集菌体、分离油脂
发酵培养50h后，收集菌体，干燥菌体后采用溶剂提取的方式萃取油脂，结果如表2所示。
表2 实施例2的培养结果
实施例3
裂殖壶菌发酵产棕榈酸的生产方法，包括以下步骤：
(1)配制种子培养基，灭菌备用
种子培养基包括：葡萄糖60.0g/L，酵母粉8.0g/L，蛋白胨3.0g/L，硫酸镁1.0g/L，碳酸氢钙0.5g/L，磷酸二氢钾1.5g/L，氯化钠2.0g/L。
(2)配制发酵培养基，灭菌备用
发酵培养基包括：淀粉水解液300.0mL/L，硝酸铵6.0g/L，硫酸铵5.0g/L，豆粕水解液10.0mL/L，玉米浆6.0g/L，谷氨酸钠8.0g/L，硫酸镁1.0g/L，碳酸氢钙2.0g/L，磷酸二氢钾1.5g/L，硝酸钠7.0g/L。淀粉水解液选用还原糖浓度250.0g/L的土豆淀粉水解液。
(3)制备种子液
向种子培养基中接入裂殖壶菌，接种量体积百分比为3％，在摇床转速220rpm、培养温度30℃的条件下进行摇瓶培养23h，获得种子液。
(4)发酵培养
将种子液按照体积百分比6％接入发酵培养基中进行发酵培养；发酵过程中，在发酵的前24h，培养温度27℃，并保持恒定转速180rpm；发酵培养24h后，培养温度为32℃，转速调至230rpm，并保持恒定；
发酵过程中，在发酵的第20h，向发酵培养基中添加0.5mL/L的无菌乳酸；
(5)收集菌体、分离油脂
发酵培养50h后，收集菌体，干燥菌体后采用溶剂提取的方式萃取油脂，结果如表3所示。
表3 实施例3的培养结果
实施例4
裂殖壶菌发酵产棕榈酸的生产方法，包括以下步骤：
(1)配制种子培养基，灭菌备用
种子培养基包括：葡萄糖50.0g/L，酵母粉10.0g/L，蛋白胨4.0g/L，硫酸镁1.2g/L，碳酸氢钙0.6g/L，磷酸二氢钾2.0g/L，氯化钠3.0g/L。
(2)配制发酵培养基，灭菌备用
发酵培养基包括：淀粉水解液300.0mL/L，硝酸铵7.0g/L，硫酸铵6.0g/L，豆粕水解液50.0mL/L，玉米浆5.0g/L，谷氨酸钠6.0g/L，硫酸镁1.5g/L，碳酸氢钙3.0g/L，磷酸二氢钾2.0g/L，硝酸钠8.0g/L。淀粉水解液为木薯淀粉水解液与玉米淀粉水解液按照体积比1∶1混合而成，木薯淀粉水解液还原糖浓度250.0g/L，玉米淀粉水解液还原糖浓度250.0g/L，
(3)制备种子液
向种子培养基中接入裂殖壶菌，接种量体积百分比为6％，在摇床转速300rpm、培养温度32℃的条件下进行摇瓶培养20h，获得种子液。
(4)发酵培养
将种子液按照体积百分比3％接入发酵培养基中进行发酵培养；发酵过程中，在发酵的前24h，培养温度28℃，并保持恒定转速200rpm；发酵培养24h后，培养温度为33℃，转速调至220rpm，并保持恒定；
发酵过程中，在发酵的第21h，向发酵培养基中添加4.0mL/L的无菌乳酸；
(5)收集菌体、分离油脂
发酵培养50h后，收集菌体，干燥菌体后采用溶剂提取的方式萃取油脂，结果如表4所示。
表4 实施例4的培养结果
实施例5
裂殖壶菌发酵产棕榈酸的生产方法，包括以下步骤：
(1)配制种子培养基，灭菌备用
种子培养基包括：葡萄糖60.0g/L，酵母粉6.0g/L，蛋白胨5.0g/L，硫酸镁1.5g/L，碳酸氢钙0.8g/L，磷酸二氢钾2.5g/L，氯化钠3.5g/L。
(2)配制发酵培养基，灭菌备用
发酵培养基包括：淀粉水解液250.0mL/L，硝酸铵5.0g/L，硫酸铵8.0g/L，豆粕水解液80.0mL/L，玉米浆8.0g/L，谷氨酸钠7.0g/L，硫酸镁2.0g/L，碳酸氢钙4.0g/L，磷酸二氢钾2.5g/L，硝酸钠10.0g/L。淀粉水解液为玉米淀粉水解液与土豆淀粉水解液按照体积比1∶2混合而成，玉米淀粉水解液还原糖浓度280.0g/L，土豆淀粉水解液还原糖浓度280.0g/L，
(3)制备种子液
向种子培养基中接入裂殖壶菌，接种量体积百分比为7％，在摇床转速260rpm、培养温度30℃的条件下进行摇瓶培养24h，获得种子液。
(4)发酵培养
将种子液按照体积百分比7％接入发酵培养基中进行发酵培养；发酵过程中，在发酵的前24h，培养温度25℃，并保持恒定转速180rpm；发酵培养24h后，培养温度为32℃，转速调至230rpm，并保持恒定；
发酵过程中，在发酵的第23h，向发酵培养基中添加5.0mL/L的无菌乳酸；
(5)收集菌体、分离油脂
发酵培养50h后，收集菌体，干燥菌体后采用溶剂提取的方式萃取油脂，结果如表5所示。
表5 实施例5的培养结果
实施例6
裂殖壶菌发酵产棕榈酸的生产方法，包括以下步骤：
(1)配制种子培养基，灭菌备用
种子培养基包括：葡萄糖50.0g/L，酵母粉8.0g/L，蛋白胨2.0g/L，硫酸镁1.8g/L，碳酸氢钙1.0g/L，磷酸二氢钾2.8g/L，氯化钠4.0g/L。
(2)配制发酵培养基，灭菌备用
发酵培养基包括：淀粉水解液200.0mL/L，硝酸铵8.0g/L，硫酸铵4.0g/L，豆粕水解液60.0mL/L，玉米浆7.0g/L，谷氨酸钠6.0g/L，硫酸镁2.5g/L，碳酸氢钙4.5g/L，磷酸二氢钾2.8g/L，硝酸钠6.0g/L。淀粉水解液为木薯淀粉水解液与土豆淀粉水解液按照体积比2∶1混合而成，木薯淀粉水解液还原糖浓度300.0g/L，土豆淀粉水解液还原糖浓度300.0g/L，
(3)制备种子液
向种子培养基中接入裂殖壶菌，接种量体积百分比为5％，在摇床转速240rpm、培养温度28℃的条件下进行摇瓶培养22h，获得种子液。
(4)发酵培养
将种子液按照体积百分比4％接入发酵培养基中进行发酵培养；发酵过程中，在发酵的前24h，培养温度27℃，并保持恒定转速200rpm；发酵培养24h后，培养温度为30℃，转速调至240rpm，并保持恒定；
在发酵的第22h，向发酵培养基中添加6.0mL/L的无菌乳酸；
(5)收集菌体、分离油脂
发酵培养50h后，收集菌体，干燥菌体后采用溶剂提取的方式萃取油脂，结果如表6所示。
表6 实施例6的培养结果
实施例7
裂殖壶菌发酵产棕榈酸的生产方法，包括以下步骤：
(1)配制种子培养基，灭菌备用
种子培养基包括：葡萄糖60.0g/L，酵母粉10.0g/L，蛋白胨4.0g/L，硫酸镁2.0g/L，碳酸氢钙0.6g/L，磷酸二氢钾3.0g/L，氯化钠5.0g/L。
(2)配制发酵培养基，灭菌备用
发酵培养基包括：淀粉水解液300.0mL/L，硫酸铵10.0g/L，豆粕水解液100.0mL/L，玉米浆8.0g/L，谷氨酸钠10.0g/L，硫酸镁3.0g/L，碳酸氢钙5.0g/L，磷酸二氢钾3.0g/L，硝酸钠8.0g/L。淀粉水解液为木薯淀粉水解液、玉米淀粉水解液、土豆淀粉水解液按照体积比1∶1∶1混合而成，木薯淀粉水解液还原糖浓度250.0g/L，玉米淀粉水解液还原糖浓度250.0g/L，土豆淀粉水解液还原糖浓度250.0g/L，
(3)制备种子液
向种子培养基中接入裂殖壶菌，接种量体积百分比为8％，在摇床转速180rpm、培养温度32℃的条件下进行摇瓶培养22h，获得种子液。
(4)发酵培养
将种子液按照体积百分比5％接入发酵培养基中进行发酵培养；发酵过程中，在发酵的前24h，培养温度28℃，并保持恒定转速200rpm；发酵培养24h后，培养温度为34℃，转速调至250rpm，并保持恒定；
在发酵的第24h，向发酵培养基中添加8.0mL/L的无菌乳酸；
(5)收集菌体、分离油脂
发酵培养50h后，收集菌体，干燥菌体后采用溶剂提取的方式萃取油脂，结果如表7所示。
表7 实施例7的培养结果
显然，上面描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
Claims (4)
1.一种促进棕榈酸生物合成的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、将裂殖壶菌的菌种使用种子培养基培养成种子液；
S2、将种子液按照体积百分比3％～10％接入发酵培养基中进行发酵培养；发酵培养基中添加淀粉水解液、豆粕水解液；所述淀粉水解液使用的淀粉为木薯淀粉、玉米淀粉、土豆淀粉中的至少一种；所述淀粉水解液中还原糖浓度为 250.0～300.0g/L；
S3、发酵培养过程中，前24h的培养温度25～28℃，在第20～24h向发酵培养基中添加0.5～8.0mL/L的无菌乳酸，并保持恒定转速180～200rpm；发酵培养24h后，培养温度为30～34℃，转速调至220～250rpm，并保持恒定；
S4、发酵培养完成后，收集菌体，并对菌体进行油脂提取。
2.根据权利要求1所述的促进棕榈酸生物合成的方法，其特征在于，所述豆粕水解液的制备过程包括：
每升水中混入豆粕粉120～160g，充分搅拌后常压下煮沸50～70min，待冷却至室温后调节pH至5.5～6.5，在5000～5500g下离心8～12min，取上清液，备用。
3.根据权利要求1所述的促进棕榈酸生物合成的方法，其特征在于，所述发酵培养基包括：淀粉水解液200.0～300.0mL/L，硝酸铵0.0～10.0g/L，硫酸铵0.0～10.0mL/L，豆粕水解液10.0～100.0mL/L，玉米浆3.0～8.0g/L，谷氨酸钠5.0～10.0g/L，硫酸镁0.5～3.0g/L，碳酸氢钙1.0～5.0g/L，磷酸二氢钾1.0～3.0g/L，硝酸钠5.0～10.0g/L。
4.根据权利要求1所述的促进棕榈酸生物合成的方法，其特征在于，裂殖壶菌体内的油脂占细胞干重的含量超过80％，棕榈酸占总油脂的含量超过65％。
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Also Published As
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