CN108034686B - 一种含类胡萝卜素的组合物及含类胡萝卜素的组合物的制备方法 - Google Patents

一种含类胡萝卜素的组合物及含类胡萝卜素的组合物的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种含类胡萝卜素的组合物及含类胡萝卜素的组合物的制备方法，属于发酵工程领域。制备方法包括：于裂殖壶菌的发酵过程中加入激发剂，发酵结束后，收集菌体，分离出微生物油脂，得含类胡萝卜素的组合物。激发剂包括乙烯‑低极性油溶液和/或三孢布拉霉自溶后的发酵液滤液。该制备方法简单，成本低廉，通过于裂殖壶菌发酵过程中加入激发剂，刺激原本不生产类胡萝卜的裂殖壶菌产生天然类胡萝卜素，使裂殖壶菌发酵产物中既含DHA又含类胡萝卜素，不仅提高了裂殖壶菌的生产价值，还提高了DHA油脂的抗氧化能力。本发明提供的含类胡萝卜素的组合物同时含有丰富的DHA和类胡萝卜素，营养价值高，且氧化稳定性较强，便于储存运输。

Description

一种含类胡萝卜素的组合物及含类胡萝卜素的组合物的制备 方法
技术领域
本发明涉及发酵工程领域，且特别涉及一种含类胡萝卜素的组合物及含类胡萝卜素的组合物的制备方法，属于发酵工程领域。
背景技术
裂殖壶菌(Schizochytrium)又称裂壶藻，属于真菌门(Eumycota)、网粘菌纲、破囊壶菌目、破囊壶菌科的一类海洋真菌，单细胞、球形。裂殖壶菌发酵后能够产生DHA及蛋白质等物质。
二十二碳六烯酸(DHA)是一种具有重要生理功能的长链多不饱和脂肪酸，可以促进大脑和和视力发育，提高智力，因此广泛添加于婴幼儿奶粉中。此外， DHA具有预防及治疗心血管疾病、防止老年痴呆、抑制细胞癌变等生理功能，因而广泛应用于食品工业。
研究发现，裂殖壶菌能大量积累DHA，藻油中DHA含量较其它微藻高。作为一种多不饱和脂肪酸，二十二碳六烯酸油脂在长期储藏的过程中，由于温度、光照、氧气等因素的存在，易被氧化而变质。提高DHA油脂的氧化稳定性，是大规模工业化发酵生产DHA急需解决的技术问题。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种含类胡萝卜素的组合物的制备方法，该制备方法简单，成本低廉，通过于裂殖壶菌发酵过程中加入激发剂，刺激原本不生产类胡萝卜素的裂殖壶菌产生天然类胡萝卜素，使裂殖壶菌发酵产物中既含DHA 又含类胡萝卜素，不仅提高了裂殖壶菌的生产价值，还提高了含类胡萝卜素的组合物中DHA油脂的抗氧化能力。
本发明的第二目的在于提供一种含类胡萝卜素的组合物，该组合物同时含有丰富的DHA和类胡萝卜素，营养价值高，且氧化稳定性较强，便于储存运输。
本发明解决其技术问题是采用以下技术方案来实现的：
本发明提出一种含类胡萝卜素的组合物的制备方法，包括以下步骤：于裂殖壶菌的发酵过程中加入激发剂，发酵结束后，收集菌体，分离出微生物油脂，得含类胡萝卜素的组合物。
激发剂包括乙烯-低极性油溶液和/或三孢布拉霉自溶后的发酵液滤液。
其中，三孢布拉霉自溶后的后的除去菌体及菌丝的液体，是于三孢布拉霉培养过程中，采取一定方式，使菌体发生自溶，释放活性物质，过滤后得到的不含菌体和菌丝的滤液，该滤液中同时含有胞内和胞外活性物质。
本发明还提出一种含类胡萝卜素的组合物。
本发明较佳实施例中含类胡萝卜素的组合物及含类胡萝卜素的组合物的制备方法的有益效果是：
于裂殖壶菌的发酵过程中加入激发剂，可以刺激裂殖壶菌在产DHA的过程中同时生成天然类胡萝卜素，如β-胡萝卜素。由于类胡萝卜素具有抗氧化能力，从而可提高生成的DHA的抗氧化性能，以避免在生产或储存运输等环节出现 DHA氧化变质的情况，有效提高产品品质。制备方法简单且成本低廉。
本发明较佳实施例中的含类胡萝卜素的组合物同时含有丰富的DHA和β- 胡萝卜素，营养价值高，且氧化稳定性较强，便于储存运输。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
下面对本发明实施例的含类胡萝卜素的组合物及含类胡萝卜素的组合物的制备方法进行具体说明。
本发明实施例提供一种含类胡萝卜素的组合物，该组合物主要包括二十二碳六烯酸(DHA油脂)以及类胡萝卜素，其中，类胡萝卜素主要为β-胡萝卜素。
具体地，上述含类胡萝卜素的组合物为一种微生物油，其含有不低于35wt％的二十二碳六烯酸和不低于480ppm的类胡萝卜素。进一步地，上述微生物油含有不低于40wt％的二十二碳六烯酸和不低于720ppm的类胡萝卜素，更进一步地，上述微生物油含有不低于45wt％的二十二碳六烯酸和不低于960ppm的类胡萝卜素。
因裂殖壶菌能够大量积累DHA，在生产中通常以裂殖壶菌为菌种进行发酵，以得到DHA。但由于DHA易被氧化，不利于生产和运输储存。
鉴于此，本发明实施例中以裂殖壶菌为菌种进行发酵，然后在其发酵过程中加入激发剂以刺激裂殖壶菌在产DHA的过程中同时生成天然类胡萝卜素，如β- 胡萝卜素。由于类胡萝卜素具有抗氧化能力，从而可提高生成的DHA的抗氧化性能，以避免在生产或储存运输等环节出现DHA氧化变质的情况，有效提高产品品质。
具体地，该组合物的制备方法例如可以包括以下步骤：于裂殖壶菌的发酵过程中加入激发剂，发酵结束后，收集菌体，分离出微生物油脂，得含类胡萝卜素的组合物。
作为可选地，上述激发剂例如可以包括乙烯-低极性油溶液和/或三孢布拉霉自溶后的发酵液滤液。
其中，乙烯具有不溶于水的特点，若将其直接加入发酵液中，利用率极低。鉴于此，本实施例中将乙烯溶于极性较低的油后再加入发酵液中，可提高乙烯的溶解率。此外，因油能够被菌体裹挟利用，故上述操作还能够提高乙烯的利用率。
较佳地，低极性油溶液为乙烯-低极性植物油溶液，极性越低，乙烯的溶解度越大。更优地，乙烯-低极性植物油溶液为乙烯-葵花籽油溶液，葵花籽油溶液不仅极性较低，而且原料易得，成本较低，经济实惠。
具体地，乙烯-低极性油溶液可经以下步骤得到：取葵花籽油于密封压力罐中灭菌、冷却后备用。将标准纯度(浓度不低于99wt％)的液态乙烯以0.8-1MPa 的压力经灭菌气滤后通入油罐底部，溶解得到乙烯-低极性油溶液。油罐压力优选控制为0.55-0.65MPa，更优为0.6MPa。
三孢布拉霉能够产生类胡萝卜素，本发明实施例中利用三孢布拉霉的菌体自溶，然后对自溶所得的产物进行过滤，以得到含有三孢酸以及酶等物质的滤液，从而促进裂殖壶菌 发酵液中类胡萝卜素的产生。
菌体自溶是指菌体细胞在一定的条件，自身释放可水解细胞壁肽聚糖网络状结构的自溶酶，这些酶的表达导致了细菌细胞壁质的溶解和消失，形成一个细胞内物质向周围环境释放的过程。传统的菌体利用通常为利用其菌渣或者混养，前者通常是直接将菌体加入培养基中高温灭菌，导致活性物质失活，后者则可能影响菌株的正常生长，后处理麻烦。本发明实施例中通过采用三孢布拉氏霉菌在培养中发生自溶的方式，能够充分避免上述不利现象的发生。
上述三孢布拉霉自溶后的发酵液滤液可以经以下步骤得到：于三孢布拉霉的培养过程中，采取一定方式，如降低溶氧，升高温度，调节pH，使营养物质匮乏，增加无机盐添加量等，使菌体发生自溶，释放酶等活性物质。先第一次过滤去除自溶后的菌体及菌丝，再对第一次过滤后的滤液进行第二次无菌过滤，得到最终的滤液，该滤液中含有三孢酸，胞内胞外物质一同起作用。经检测，该滤液中类胡萝卜素含量为2ug/L，表明产品中类胡萝卜素不是补料带入，而是生产菌自身发酵产生。常规培养条件为：温度27℃，转速200-300rpm，pH值为6.5-7，发酵120h。值得说明的是，采取其他方式获得菌体自溶后的活性物质均属于本专利保护范围。
三孢布拉霉的培养过程包括：将三孢布拉霉正菌和三孢布拉霉负菌以重量比为1：4-6的比例接种于发酵罐中，培养。优选地，三孢布拉霉正菌与三孢布拉霉负菌在发酵罐中的接种量共计25-35wt％。接种时，三孢布拉霉正菌与三孢布拉霉负菌的生物量干重大于等于30g/L。
三孢布拉霉的发酵培养基中含有1.5-2.5wt％的葡萄糖、0.5-1.5wt％的淀粉、 1-2wt％的酵母浸膏、1.5-2.5wt％的黄豆饼粉、1.5-2.5wt％的葵花籽油以及 0.05-0.15wt％的磷酸二氢钾，pH为7.0±0.1。
其中，用于接种于发酵培养基中的三孢布拉霉正菌和三孢布拉霉负菌可经以下步骤得到：于26-30℃的PDA培养基中活化培养三孢布拉霉正菌和三孢布拉霉负菌5-7天，然后将三孢布拉霉正菌和三孢布拉霉负菌的孢子分别接种于种子培养基中，于26-30℃、200-240rpm、通气量为100-140L/min的条件下，继续培养42-54h。
其中，种子培养基含有1.5-2.5wt％的葡萄糖、2.5-3.5wt％的豆饼粉、 0.5-1.5wt％的酵母粉、0.04-0.1wt％的磷酸二氢钾、0.005-0.015wt％的硫酸镁、 0.02-0.04wt％的谷氨酸钠和2.5-3.5wt％的葵花籽油。
上述激发剂可于裂殖壶菌发酵的任意时期加入，优选地，于裂殖壶菌的发酵中后期加入，该发酵中后期指发酵开始后的30h至发酵结束。更优地，激发剂于裂殖壶菌的发酵中期加入，发酵中期指发酵开始后的30-75h。值得说明的是，上述发酵中期和中后期均以发酵总周期为90h为例，实际生产中，可根据不同的发酵总周期对应确定发酵中期以及发酵后期的具体发酵时间。
激发剂例如可以采用匀速流加方式加入。当激发剂为乙烯-低极性油溶液时，乙烯-低极性油溶液的加入量例如可控制为裂殖壶菌的发酵液的0.1-0.5wt％，优选为0.1-0.2wt％，最优为0.2wt％，加入后，维持正常罐压即可；当激发剂为三孢布拉霉自溶后的发酵液滤液时，上述滤液的加入量例如可控制为裂殖壶菌的发酵液的0.05-0.2wt％，优选为0.1-0.2wt％，最优为0.2wt％；当激发剂为乙烯-低极性油溶液与三孢布拉霉自溶后的发酵液滤液的混合物时，混合物的加入量例如可控制为裂殖壶菌的发酵液的0.3-0.5wt％，例如可以是乙烯-低极性油溶液与三孢布拉霉自溶后的发酵液滤液的加入量均为0.15-0.25wt％。
承上，由于乙烯-低极性油溶液能够刺激裂殖壶菌产生天然类胡萝卜素，三孢布拉霉自溶后的发酵液滤液含有促进类胡萝卜素合成的代谢物，也能够刺激裂殖壶菌产生天然类胡萝卜素，将上述两种方法单独或共同结合于裂殖壶菌的发酵生产中，可使裂殖壶菌的发酵产物中的得到同时含有DHA油脂与类胡萝卜素的组合物，从而提高DHA油脂的抗氧化能力，以利于DHA油脂的生产加工及储存运输，大大提高产品品质。
发酵结束后，对发酵产物进行后处理，分离出微生物油脂，也即含类胡萝卜素的组合物。微生物油脂例如可以经以下步骤得到：于发酵液中加入破壁剂，对破壁产物进行萃取，收集萃取所得的油相，除去溶剂。其中，破壁剂可以为碱性蛋白酶(pH值为9-11)，萃取所用的萃取剂可以为正己烷。
较佳地，本发明实施例中的裂殖壶菌例如可以经以下步骤进行活化和培养：将裂殖壶菌菌种接种于活化培养基中，于26-30℃、180-220r/min的条件下培养 46-50h，得种子活化培养液。其中，活化培养基含有8-12g/L的葡萄糖、23-27g/L 的谷氨酸钠、8-12g/L的酵母浸膏、18-22g/L的氯化钠和0.3-0.7g/L的硫酸镁。
当种子活化培养液中的菌浓达5vt-10vt％时，按接种量(体积比)为8-12： 100的比例，将种子活化培养液接种于扩大培养基中，并于26-30℃、180-220r/min 的条件下培养46-50h，得种子扩大培养液。其中，扩大培养基含有38-42g/L的葡萄糖、23-27g/L的谷氨酸钠、8-12g/L的酵母浸膏、8-12g/L的氯化钠、3-7g/L 的硫酸镁、0.8-1.2g/L的磷酸二氢钾和0.3-0.7g/L的氯化钙。
按接种量(体积比)为8-12：100的比例，将种子扩大培养液接种于装有发酵培养基的发酵罐中发酵培养。发酵培养的工艺例如可以为：培养温度为 26-30℃，搅拌速度为130-170r/min、通气量为1.3-1.7vvm(L/L·min)，维持正常罐压，培养时间为90h。其中，发酵培养基含有38-42g/L的葡萄糖、28-32g/L 的谷氨酸钠、4-8g/L的酵母浸膏、3-7g/L的氯化钠、3-7g/L的硫酸镁、0.8-1.2g/L 的磷酸二氢钾、0.3-0.7g/L的氯化钙、0.3-0.7g/L的碳酸氢钠、6-10g/L的硫酸钠、 4-8g/L的硫酸铵和0.3-0.7g/L的氯化钾。发酵过程中通过流加葡萄糖以控制发酵液中葡萄糖浓度为10-20g/L。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
将裂殖壶菌菌种接种于活化培养基中，于26℃、180r/min的条件下培养50h，得种子活化培养液。其中，活化培养基含有8g/L的葡萄糖、23g/L的谷氨酸钠、 8g/L的酵母浸膏、18g/L的氯化钠和0.3g/L的硫酸镁。
当种子活化培养液中的菌浓达5vt％时，按接种量(体积比)为8：100的比例，将种子活化培养液接种于扩大培养基中，并于26℃、180r/min的条件下培养50h，得种子扩大培养液。其中，扩大培养基含有38g/L的葡萄糖、23g/L的谷氨酸钠、8g/L的酵母浸膏、8g/L的氯化钠、3g/L的硫酸镁、0.8g/L的磷酸二氢钾和0.3g/L的氯化钙。
按接种量(体积比)为8：100的比例，将种子扩大培养液接种于装有发酵培养基的50mL的发酵罐中发酵培养。发酵培养的工艺为：培养温度为26℃，搅拌速度为130r/min、通气量为1.3vvm，正常罐压，培养时间为90h。其中，发酵培养基含有38g/L的葡萄糖、28g/L的谷氨酸钠、4g/L的酵母浸膏、3g/L的氯化钠、3g/L的硫酸镁、0.8g/L的磷酸二氢钾、0.3g/L的氯化钙、0.3g/L的碳酸氢钠、6g/L的硫酸钠、4g/L的硫酸铵和0.3g/L的氯化钾。发酵过程中控制发酵液中葡萄糖浓度为10g/L。
于发酵开始后的30h时，向上述发酵培养的发酵液中匀速流加乙烯-葵花籽油溶液，乙烯-葵花籽油溶液的加入量为裂殖壶菌的发酵液的0.1wt％。加入后，维持正常罐压。
发酵90h后，于发酵液中加入碱性蛋白酶进行破壁处理，然后用正己烷对破壁产物进行萃取，收集萃取所得的油相，除去溶剂，得含类胡萝卜素的组合物。
实施例2
将裂殖壶菌菌种接种于活化培养基中，于30℃、220r/min的条件下培养46h，得种子活化培养液。其中，活化培养基含有12g/L的葡萄糖、27g/L的谷氨酸钠、 12g/L的酵母浸膏、22g/L的氯化钠和0.7g/L的硫酸镁。
当种子活化培养液中的菌浓达10vt％时，按接种量(体积比)为12：100的比例，将种子活化培养液接种于扩大培养基中，并于30℃、220r/min的条件下培养46h，得种子扩大培养液。其中，扩大培养基含有42g/L的葡萄糖、27g/L 的谷氨酸钠、12g/L的酵母浸膏、12g/L的氯化钠、7g/L的硫酸镁、1.2g/L的磷酸二氢钾和0.7g/L的氯化钙。
按接种量(体积比)为12：100的比例，将种子扩大培养液接种于装有发酵培养基的50mL的发酵罐中发酵培养。发酵培养的工艺为：培养温度为30℃，搅拌速度为170r/min、通气量为1.7vvm，正常罐压，培养时间为90h。其中，发酵培养基含有42g/L的葡萄糖、32g/L的谷氨酸钠、8g/L的酵母浸膏、7g/L的氯化钠、7g/L的硫酸镁、1.2g/L的磷酸二氢钾、0.7g/L的氯化钙、0.7g/L的碳酸氢钠、10g/L的硫酸钠、8g/L的硫酸铵和0.7g/L的氯化钾。发酵过程中控制发酵液中葡萄糖浓度为20g/L。
于发酵开始后的75h时，向上述发酵培养的发酵液中匀速流加乙烯-葵花籽油溶液，乙烯-葵花籽油溶液的加入量为裂殖壶菌的发酵液的0.5wt％。加入后，维持正常罐压。
发酵90h后，于发酵液中加入碱性蛋白酶进行破壁处理，然后用正己烷对破壁产物进行萃取，收集萃取所得的油相，除去溶剂，得含类胡萝卜素的组合物。
实施例3
将裂殖壶菌菌种接种于活化培养基中，于28℃、200r/min的条件下培养48h，得种子活化培养液。其中，活化培养基含有10g/L的葡萄糖、25g/L的谷氨酸钠、 10g/L的酵母浸膏、20g/L的氯化钠和0.5g/L的硫酸镁。
当种子活化培养液中的菌浓达7.5vt％时，按接种量(体积比)为10：100 的比例，将种子活化培养液接种于扩大培养基中，并于28℃、200r/min的条件下培养48h，得种子扩大培养液。其中，扩大培养基含有40g/L的葡萄糖、25g/L 的谷氨酸钠、10g/L的酵母浸膏、10g/L的氯化钠、5g/L的硫酸镁、1.0g/L的磷酸二氢钾和0.5g/L的氯化钙。
按接种量(体积比)为10：100的比例，将种子扩大培养液接种于装有发酵培养基的50mL的发酵罐中发酵培养。发酵培养的工艺为：培养温度为28℃，搅拌速度为150r/min、通气量为1.4vvm，正常罐压，培养时间为90h。其中，发酵培养基含有40g/L的葡萄糖、30g/L的谷氨酸钠、6g/L的酵母浸膏、5g/L的氯化钠、5g/L的硫酸镁、1.0g/L的磷酸二氢钾、0.5g/L的氯化钙、0.5g/L的碳酸氢钠、8g/L的硫酸钠、6g/L的硫酸铵和0.5g/L的氯化钾。发酵过程中控制发酵液中葡萄糖浓度为15g/L。
于发酵开始后的52.5h时，向上述发酵培养的发酵液中匀速流加乙烯-葵花籽油溶液，乙烯-葵花籽油溶液的加入量为裂殖壶菌的发酵液的0.2wt％。加入后，维持正常罐压。
发酵90h后，于发酵液中加入碱性蛋白酶进行破壁处理，然后用正己烷对破壁产物进行萃取，收集萃取所得的油相，除去溶剂，得含类胡萝卜素的组合物。
实施例4
本实施例与实施例3的区别在于：乙烯-葵花籽油溶液于发酵开始后的85h 时加入至发酵液中。
实施例5
本实施例与实施例3的区别在于：乙烯-葵花籽油溶液于发酵开始后的15h 时加入至发酵液中。
实施例6
本实施例与实施例1的区别在于：于发酵开始后的30h时，向发酵培养的发酵液中匀速流加三孢布拉霉自溶后的发酵液滤液，上述滤液的加入量为裂殖壶菌的发酵液的0.05wt％。
三孢布拉霉自溶后的发酵液滤液经以下步骤得到：于26℃的PDA培养基中活化培养三孢布拉霉正菌和三孢布拉霉负菌7天，然后将三孢布拉霉正菌和三孢布拉霉负菌的孢子分别接种于种子培养基中，于26℃、200rpm、通气量为 100L/min的条件下，继续培养54h。然后将培养后的三孢布拉霉正菌和三孢布拉霉负菌以重量比为1：4的比例接种于发酵培养基中，于温度为27℃、转速为 300rpm、pH值为6.5的条件下培养24h后，将温度升高至35℃培养，转速降低至150rpm，pH值降低至5，继续培养72h使菌体自溶，第一次过滤除去自溶后的菌体及菌丝，然后再对滤液进行第二次无菌过滤，获得菌液。接种于发酵培养基的过程中，三孢布拉霉正菌与三孢布拉霉负菌的接种量共计25wt％，三孢布拉霉正菌与三孢布拉霉负菌的生物量干重均不低于30g/L。
种子培养基含有1.5wt％的葡萄糖、2.5wt％的豆饼粉、0.5wt％的酵母粉、0.04wt％的磷酸二氢钾、0.005wt％的硫酸镁、0.02wt％的谷氨酸钠和2.5wt％的葵花籽油。发酵培养基中含有1.5wt％的葡萄糖、0.5wt％的淀粉、1wt％的酵母浸膏、 1.5wt％的黄豆饼粉、1.5wt％的葵花籽油以及0.05wt％的磷酸二氢钾。
实施例7
本实施例与实施例2的区别在于：于发酵开始后的75h时，向发酵培养的发酵液中匀速流加三孢布拉霉自溶后的发酵液滤液，上述滤液的加入量为裂殖壶菌的发酵液的0.1wt％。
三孢布拉霉自溶后的发酵液滤液经以下步骤得到：于30℃的PDA培养基中活化培养三孢布拉霉正菌和三孢布拉霉负菌5天，然后将三孢布拉霉正菌和三孢布拉霉负菌的孢子分别接种于种子培养基中，于30℃、240rpm、通气量为 140L/min的条件下，继续培养42h。然后将培养后的三孢布拉霉正菌和三孢布拉霉负菌以重量比为1：6的比例接种于发酵培养基中，于温度为27℃、转速为 200rpm、pH值为7的条件下培养24h后，将温度升高至32℃培养，转速降低至 100rpm，pH值升高至9，继续培养72h使菌体自溶，第一次过滤除去自溶后的菌体及菌丝，然后再对滤液进行第二次无菌过滤，获得菌液。接种于发酵培养基过程中，三孢布拉霉正菌与三孢布拉霉负菌的接种量共计35wt％，三孢布拉霉正菌与三孢布拉霉负菌的生物量干重均不低于30g/L。
种子培养基含有2.5wt％的葡萄糖、3.5wt％的豆饼粉、1.5wt％的酵母粉、0.1wt％的磷酸二氢钾、0.015wt％的硫酸镁、0.04wt％的谷氨酸钠和3.5wt％的葵花籽油。发酵培养基中含有2.5wt％的葡萄糖、1.5wt％的淀粉、2wt％的酵母浸膏、 2.5wt％的黄豆饼粉、2.5wt％的葵花籽油以及0.15wt％的磷酸二氢钾。
实施例8
本实施例与实施例3的区别在于：于发酵开始后的52.5h时，向发酵培养的发酵液中匀速流加三孢布拉霉自溶后的发酵液滤液，上述滤液的加入量为裂殖壶菌的发酵液的0.2wt％。
三孢布拉霉自溶后的发酵液滤液经以下步骤得到：于28℃的PDA培养基中活化培养三孢布拉霉正菌和三孢布拉霉负菌6天，然后将三孢布拉霉正菌和三孢布拉霉负菌的孢子分别接种于种子培养基中，于28℃、220rpm、通气量为 120L/min的条件下，继续培养48h。然后将培养后的三孢布拉霉正菌和三孢布拉霉负菌以重量比为1：5的比例接种于发酵培养基中，于温度为27℃、转速为 250rpm、pH值为6.8的条件下培养24h后，将温度升高至30℃培养，转速降低至80rpm，pH值升高至8，继续培养72h使菌体自溶，第一次过滤除去自溶后的菌体及菌丝，然后再对滤液进行第二次无菌过滤，获得菌液。接种于发酵培养基过程中，三孢布拉霉正菌与三孢布拉霉负菌的接种量共计30wt％，三孢布拉霉正菌与三孢布拉霉负菌的生物量干重均不低于30g/L。
种子培养基含有2.0wt％的葡萄糖、3.0wt％的豆饼粉、1.0wt％的酵母粉、0.07wt％的磷酸二氢钾、0.01wt％的硫酸镁、0.03wt％的谷氨酸钠和3.0wt％的葵花籽油。发酵培养基中含有2.0wt％的葡萄糖、1.0wt％的淀粉、1.5wt％的酵母浸膏、2.0wt％的黄豆饼粉、2.0wt％的葵花籽油以及0.10wt％的磷酸二氢钾。
实施例9
本实施例与实施例8的区别在于：三孢布拉霉自溶后的发酵液滤液于发酵开始后的85h时加入至发酵液中。
实施例10
本实施例与实施例8的区别在于：三孢布拉霉自溶后的发酵液滤液于发酵开始后的15h时加入至发酵液中。
实施例11
本实施例与实施例6的区别在于：于发酵开始后的30h时，向发酵培养的发酵液中匀速流加三孢布拉霉自溶后的发酵液滤液以及乙烯-葵花籽油溶液。上述滤液与乙烯-葵花籽油溶液的加入量分别为裂殖壶菌的发酵液的0.15wt％和 0.15wt％。
实施例12
本实施例与实施例7的区别在于：于发酵开始后的75h时，向发酵培养的发酵液中匀速流加三孢布拉霉自溶后的发酵液滤液以及乙烯-葵花籽油溶液。上述滤液与乙烯-葵花籽油溶液的加入量分别为裂殖壶菌的发酵液的0.25wt％和 0.25wt％。
实施例13
本实施例与实施例8的区别在于：于发酵开始后的52.5h时，向发酵培养的发酵液中匀速流加三孢布拉霉自溶后的发酵液滤液以及乙烯-葵花籽油溶液。上述滤液与乙烯-葵花籽油溶液的加入量分别为裂殖壶菌的发酵液的0.2wt％和 0.2wt％。
实施例14
本实施例与实施例13的区别在于：三孢布拉霉自溶后的发酵液滤液以及乙烯-葵花籽油溶液于发酵开始后的85h时加入至发酵液中。
实施例15
本实施例与实施例13的区别在于：三孢布拉霉自溶后的发酵液滤液以及乙烯-葵花籽油溶液于发酵开始后的15h时加入至发酵液中。
试验例1
以实施例1为试验组，设置对照组1-4，其中，对照组1-4与实施例1的区别在于乙烯-葵花籽油溶液的加入量分别为裂殖壶菌的发酵液的0.2wt％、 0.3wt％、0.4wt％和0.5wt％。
对比实施例1所得的含类胡萝卜素的组合物与对照组1-4所得的含类胡萝卜素的组合物中DHA(wt％)与类胡萝卜素总量(ppm)的含量，其结果如表1 所示。
表1 DHA和类胡萝卜素的含量
Figure BDA0001545409980000101
由表1可以看出，对照组1的含类胡萝卜素的组合物所含的DHA以及类胡萝卜素总量均较实施例1及其他对照组高，因此可以得出本发明实施例中当激发剂仅为乙烯-葵花籽油溶液时，乙烯-葵花籽油溶液的最适加入量为0.2wt％。
此外，按上述方法对实施例1-2以及实施例4-5进行乙烯-葵花籽油溶液的最适添加量的测定试验，其结果同样显示乙烯-葵花籽油溶液的最适加入量为 0.2wt％。
试验例2
以实施例7为试验组，设置对照组1-4，其中，对照组1-4与实施例7的区别在于三孢布拉霉自溶后的发酵液滤液的加入量分别为裂殖壶菌的发酵液的 0.05wt％、0.15wt％、0.2wt％和0.25wt％。
对比实施例7所得的含类胡萝卜素的组合物与对照组1-4所得的含类胡萝卜素的组合物中DHA(wt％)与类胡萝卜素总量(ppm)的含量，其结果如表2 所示。
表2 DHA和类胡萝卜素的含量
Figure BDA0001545409980000102
由表2可以看出，对照组3的类胡萝卜素含量明显较其他对照组高，可以得出本发明实施例中当激发剂仅为三孢布拉霉自溶后的发酵液滤液时，三孢布拉霉自溶后的发酵液滤液的最适加入量为0.2wt％。
此外，按上述方法对实施例6-7以及实施例9-10进行三孢布拉霉自溶后的发酵液滤液的最适添加量的测定试验，其结果同样显示三孢布拉霉自溶后的发酵液滤液的最适加入量为0.2wt％。
试验例3
以实施例13为试验组，设置对照组1-4，其中，对照组1-4与实施例8的区别在于三孢布拉霉自溶后的发酵液滤液的加入量分别为裂殖壶菌的发酵液的 0.1wt％、0.15wt％、0.25wt％和0.3wt％且乙烯-葵花籽油溶液的加入量分别为裂殖壶菌的发酵液的0.1wt％、0.15wt％、0.25wt％和0.3wt％。
对比实施例13所得的含类胡萝卜素的组合物与对照组1-4所得的含类胡萝卜素的组合物中DHA(wt％)与类胡萝卜素总量(ppm)的含量，其结果如表3 所示。
表3 DHA和类胡萝卜素的含量
Figure BDA0001545409980000111
由表3可以看出，实施例13的类胡萝卜素含量明显较其他对照组高，说明本发明实施例中当激发剂为乙烯-低极性油溶液与三孢布拉霉自溶后的发酵液滤液的混合物时，其中三孢布拉霉自溶后的发酵液滤液的最适加入量为0.2wt％，乙烯-葵花籽油溶液的最适加入量为0.2wt％。
此外，按上述方法对实施例6-7以及实施例9-10进行三孢布拉霉自溶后的发酵液滤液的最适添加量的测定试验，其结果同样显示三孢布拉霉自溶后的发酵液滤液的最适加入量为0.2wt％，乙烯-葵花籽油溶液的最适加入量为0.2wt％。
试验例4
对比实施例8、实施例9和实施例10所得的含类胡萝卜素的组合物中DHA (wt％)与类胡萝卜素总量(ppm)的含量，其结果如表4所示。其中，实施例 8中三孢布拉霉自溶后的发酵液滤液于发酵中期加入，实施例9中三孢布拉霉自溶后的发酵液滤液于发酵后期加入，实施例10中三孢布拉霉自溶后的发酵液滤液于发酵前期加入。
表4 DHA和类胡萝卜素的含量
Figure BDA0001545409980000121
由表4可以看出，三孢布拉霉自溶后的发酵液滤液于发酵不同时期加入后所得的组合物中DHA含量均相差不大，但类胡萝卜素总量相差明显。其中，三孢布拉霉自溶后的发酵液滤液于发酵中期加入较发酵前期和发酵后期加入所得的组合物中类胡萝卜素总量含量明显更高，
可以得出本发明实施例中当激发剂仅为三孢布拉霉自溶后的发酵液滤液时，上述液体的最佳加入时期为发酵中期。
此外，按上述方法分别对实施例3-5以及实施例13-15所得的含类胡萝卜素的组合物中DHA(wt％)与类胡萝卜素(ppm)的含量，其结果显示当激发剂仅为乙烯-葵花籽油溶液时，乙烯-葵花籽油溶液的最佳加入时期为发酵中期；当激发剂为乙烯-低极性油溶液与三孢布拉霉自溶后的发酵液滤液的混合物时，三孢布拉霉自溶后的发酵液滤液与乙烯-低极性油溶液的最佳加入时期均为发酵中期。
承上，本发明实施例中激发剂的最佳加入时期为发酵中期。
试验例5
以实施例3、实施例8和实施例13为例，设置对照组，对照组在裂殖壶菌的发酵过程中未加入激发剂，对比实施例3、实施例8、实施例13和对照组所得的含类胡萝卜素的组合物中DHA(wt％)与类胡萝卜素总量(ppm)的含量，其结果如表5所示。其中，实施例3中激发剂仅含有乙烯-葵花籽油溶液，实施例8中激发剂仅含有三孢布拉霉自溶后的发酵液滤液，实施例13中激发剂同时含有除去菌体及菌丝的液体与乙烯-葵花籽油溶液。
表5 DHA和类胡萝卜素的含量
Figure BDA0001545409980000122
由表5可以看出，实施例3、实施例8和实施例13所得的组合物中DHA含量均相差不大，但类胡萝卜素总量含量相差明显，其中实施例13所得的组合物中DHA含量及类胡萝卜素总量含量均较实施例3和实施例8更高。说明激发剂中同时含有三孢布拉霉自溶后的发酵液滤液与乙烯-葵花籽油溶液较仅含有三孢布拉霉自溶后的发酵液滤液或乙烯-葵花籽油溶液能获得抗氧化能力更强的含类胡萝卜素的组合物。
此外，3组实施例所得的组合物中类胡萝卜素总量含量均远大于对照组，说明在裂殖壶菌的发酵过程中加入激发剂有利于提高组合物的抗氧化能力。
试验例6
重复实施实施例1-15，以试验例5中的对照组为对照，于常温下(25℃) 储藏，定时取样，测定样品中的过氧化值POV，其结果如表6所示，其中实施例为实施例1-15测定后的平均值。
表6 过氧化值POV
Figure BDA0001545409980000131
由表6可以看出，对照组(发酵过程中未加有激发剂)得到的DHA油脂，随着储藏时间的延长POV值不断升高。实施例在发酵过程中加入激发剂后得到的含类胡萝卜素的组合物，由于类胡萝卜素的存在，在12个月的储藏期内，POV 值无明显变化，氧化稳定性较原有DHA油脂明显提高，从而利于产品的提取以及储存运输。
综上所述，本发明实施例的含类胡萝卜素的组合物的制备方法简单，成本低廉，通过于裂殖壶菌发酵过程中加入激发剂，刺激原本不生产类胡萝卜的裂殖壶菌产生天然类胡萝卜素，使裂殖壶菌发酵产物中既含DHA又含类胡萝卜素，不仅提高了裂殖壶菌的生产价值，还提高了DHA油脂的抗氧化能力。由上述方法得到的含类胡萝卜素的组合物同时含有丰富的DHA和类胡萝卜素，营养价值高，且氧化稳定性较强，便于储存运输。
以上所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

Claims (14)

1.一种含类胡萝卜素的组合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：于裂殖壶菌的发酵过程中加入激发剂，发酵结束后，收集菌体，分离出微生物油脂，得含类胡萝卜素的组合物；
所述激发剂为三孢布拉霉自溶后的发酵滤液或者
为乙烯-低极性油溶液和三孢布拉霉自溶后的发酵液滤液。
2.根据权利要求1所述的含类胡萝卜素的组合物的制备方法，其特征在于，所述激发剂于所述裂殖壶菌的发酵中后期加入，发酵总周期为90h，所述发酵中后期为发酵开始后的30h至发酵结束。
3.根据权利要求2所述的含类胡萝卜素的组合物的制备方法，其特征在于，所述激发剂于所述裂殖壶菌的发酵中期加入，所述发酵中期为发酵开始后的30-75h。
4.根据权利要求1所述的含类胡萝卜素的组合物的制备方法，其特征在于，所述激发剂为所述乙烯-低极性油溶液，所述乙烯-低极性油溶液的加入量为所述裂殖壶菌的发酵液的0.1-0.5wt％。
5.根据权利要求4所述的含类胡萝卜素的组合物的制备方法，其特征在于，所述乙烯-低极性油溶液的加入量为所述裂殖壶菌的发酵液的0.1-0.2wt％。
6.根据权利要求4或5所述的含类胡萝卜素的组合物的制备方法，其特征在于，所述乙烯-低极性油溶液为乙烯-低极性植物油溶液。
7.根据权利要求6所述的含类胡萝卜素的组合物的制备方法，其特征在于，所述乙烯-低极性植物油溶液为乙烯-葵花籽油溶液。
8.根据权利要求1所述的含类胡萝卜素的组合物的制备方法，其特征在于，所述激发剂为所述三孢布拉霉自溶后的发酵液滤液，所述滤液的加入量为所述裂殖壶菌的发酵液的0.05-0.2wt％。
9.根据权利要求8所述的含类胡萝卜素的组合物的制备方法，其特征在于，所述滤液的加入量为所述裂殖壶菌的发酵液的0.1-0.2wt％。
10.根据权利要求1所述的含类胡萝卜素的组合物的制备方法，其特征在于，所述激发剂为所述乙烯-低极性油溶液与所述三孢布拉霉自溶后的发酵液滤液的混合物，所述混合物的加入量为所述裂殖壶菌的发酵液的0.3-0.5wt％。
11.根据权利要求1所述的含类胡萝卜素的组合物的制备方法，其特征在于，所述三孢布拉霉自溶后的发酵液滤液经以下步骤得到：于三孢布拉霉的培养过程中，使三孢布拉霉菌体自溶，过滤，得除去菌体和菌丝的滤液。
12.一种含类胡萝卜素的组合物，其特征在于，经如权利要求1-11任一项所述的制备方法制备而得，所述组合物为微生物油，所述微生物油含有不低于35wt％的二十二碳六烯酸和不低于480ppm的类胡萝卜素。
13.根据权利要求12所述的含类胡萝卜素的组合物，其特征在于，所述微生物油含有不低于40wt％的所述二十二碳六烯酸和不低于720ppm的所述类胡萝卜素。
14.根据权利要求13所述的含类胡萝卜素的组合物，其特征在于，所述微生物油含有不低于45wt％的所述二十二碳六烯酸和不低于960ppm的所述类胡萝卜素。
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