CN112940945B - 一种中国被毛孢发酵的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种中国被毛孢发酵的方法，包括将中国被毛孢的种子液按照10‑20％的重量比例接种到装有发酵培养基的气升式发酵罐中，通风比为1：0.5‑1.5vvm，罐压0.02～0.05Mpa，在15～20℃下发酵培养，在发酵中后期流加补充培养基、葡萄糖和氢气。本发明采用气升式发酵罐减少剪切力对菌丝体的损伤，菌体生长活性好，还原糖代谢速率快。采用全营养流加方式一方面解除底物反馈抑制，缩短延滞期；另一方面在发酵中后期及时补充营养物质，延长菌体生长时间。利用葡萄糖在线控制，提高底物利用率。方法比传统方法得率提高，菌丝体质量增加，菌丝体中的有效活性成分含量显著提升。
Description
技术领域
本发明涉及一种生物技术，尤其是一种中国被毛孢全营养流加脉冲式深层发酵的方法。
背景技术
中国被毛孢是从冬虫夏草的子座和菌核上分离的得到的冬虫夏草无性型世代。中国被毛孢中含有许多对身体有益的生理活性物质，如氨基酸，核苷，无机盐，生物碱和多糖等。具有调节机体免疫，抗肿瘤，抗菌，抗疲劳等功能。中国被毛孢被液体发酵培养后收获菌丝体，然后开发成药品和保健品。
中国被毛孢通常采用机械搅拌通风式发酵罐进行分批发酵培养。但是机械搅拌通风式发酵罐在使用过程中的高剪切力会对菌丝体产生破坏，造成菌体裂解。另外，分批发酵劳动量大，能源消耗大，生产强度低，严重制约了中国被毛孢生产效能的提高。发明专利：一种快速深层液态发酵生产中国被毛孢菌粉的方法(CN201610146343.8)中公开了一种半连续发酵(重复分批发酵)生产中国被毛孢的工艺，生产周期从25h延长至55h。同时该发明专利还指出中国被毛孢发酵前期收到严重的底物抑制和产物抑制。
发明内容
本发明要解决的是为了解决现有中国被毛孢发酵生产技术的不足，采用气升式发酵罐代替机械搅拌通风式发酵罐，在满足溶氧需求的同时，减少机械搅拌产生的剪切力对菌丝体的伤害。同时，对发酵培养基和发酵方法进行改进，一方面减少发酵前期的底物抑制，使菌丝体快速生长；另一方面在发酵中后期及时补充新鲜的培养基，为菌丝生长和产物代谢提供营养。
本发明为实现上述目标而采用的技术方案如下：
一种中国被毛孢全营养流加发酵的方法，中国被毛孢的种子液按照10-20％的重量比例接种到装有发酵培养基的气升式发酵罐中，通风比为1：0.5-1.5vvm，罐压0.02～0.05Mpa，在15～20℃下发酵培养，在发酵中后期流加补充培养基、葡萄糖和氢气。
上述的气升式发酵罐为专利号：ZL201922236548.7实用新型专利中实施例所述气升式发酵罐。
所述的流加补充培养基为：玉米粉1-3％、蛋白胨0.5-2％、酵母粉0.1-1％、麸皮1-3％、磷酸二氢钾0.1-0.5％、七水硫酸镁0.1-0.5％、消泡剂0.01-0.05％；调节pH值5.5-6.5。
优选流加补充培养基为：玉米粉1-3％、蛋白胨1-1.5％、酵母粉0.2-0.6％、麸皮0.8-2％、磷酸二氢钾0.4-0.5％、七水硫酸镁0.2-0.4％、消泡剂0.01-0.02％；调节pH值5.5-6.5。
所述的流加补充培养基在发酵的第10-22h之间，分2批次，流加补充培养基。
上述的需要流加的葡萄糖为质量浓度60％-80％的葡萄糖溶液。为了在单位体积内补充更多的葡萄糖，选择适宜的葡萄糖溶液浓度60％-80％，但是结合考虑葡萄糖的溶解度，溶液浓度超过80％后，葡萄糖容易在溶液中饱和，结晶析出。
上述的葡萄糖流加方法为：利用在线葡萄糖传感器检测发酵液中的葡萄糖浓度，当葡萄糖浓度低于0.5％时，向发酵罐中流加葡萄糖溶液，使发酵液中的葡萄糖浓度保持在0.5-1％。
所述的发酵培养基为葡萄糖0.5-2％、玉米粉0.2-1.5％、蛋白胨0.5-1％、酵母粉0.1-0.9％、麸皮0.2-2％、磷酸二氢钾0.3-0.5％、七水硫酸镁0.3-0.4％、消泡剂0.01-0.05％，低聚肽套餐0.5-4％；调节pH值5.0-6.5。
优选上述的发酵培养基成分为：葡萄糖0.5-1％、玉米粉0.5-1％、蛋白胨0.5-1％、酵母粉0.1-0.5％、麸皮0.2-0.5％、磷酸二氢钾0.3-0.5％、七水硫酸镁0.3-0.4％、消泡剂0.02-0.04％，低聚肽套餐0.5-3％；调节pH值5.0-6.5。
上述的低聚肽套餐包括，小麦肽、玉米肽、大豆肽、人参肽、深海鱼肽、阿胶肽、牡蛎肽、甲鱼肽中的一种或几种以任意比例组合，这些肽的分子量均低于3000Da。
优选上述种子培养条件为：接种量是10％，通风比为1：0.5vvm，罐压0.03Mpa，培养温度18～20℃，培养时间为7h。
上述的在发酵过程中流加补充氢气，使发酵液中氢气含量为0.4-0.8ppm。
上述的发酵中后期流加的补充的培养基与发酵培养基成分相同，培养基使用之前均需经过高压蒸汽灭菌。本发明所述的“％”均为质量百分含量。
与现有工艺相比，本发明有以下优点：
1.采用气升式发酵罐减少剪切力对菌丝体的损伤，菌体生长环境好，生长活性好，还原糖代谢速率快。
2.采用全营养流加方式一方面解除底物反馈抑制；另一方面在发酵中后期及时补充营养物质，延长菌体生长时间。
3.利用葡萄糖在线控制，减少底物浪费，提高底物利用率。
4.发酵过程中补充的低聚肽不仅可以为菌体生长提供简单、容易利用的速效氮源，还可以减少氧气对菌体细胞的过度氧化，减少超氧过氧自由基对菌体的损伤，减缓菌体衰老。
5.通入的氢气，能够减少超氧、过氧自由基对菌体的氧化损伤，使生产菌保持高活力。
具体实施方式
以下通过实施例对本发明进行进一步解释说明：
实施例1
以下实施例采用的中国被毛孢菌株为冬虫夏草(Cordyceps sinensis)，已于2020年10月29日在北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，其保藏号为CGMCC No.20759；
1.种子培养。将培养好的中国被毛孢菌株种子液种到种子培养基，接种量是10％，种子培养基组成为葡萄糖1％、蛋白胨0.8％、奶粉0.5％、麸皮1.5％、磷酸二氢钾0.3％、七水硫酸镁0.3％、消泡剂0.02％，调节pH值6.0；培养条件为：通风比为1：0.5vvm，罐压0.03Mpa，培养温度18～20℃，培养7h左右即可得到种子液。
2.发酵培养。将培养好种子液接种到灭菌后60L发酵培养基，接种量20％，发酵罐为100L的机械搅拌通风式式发酵罐。发酵培养基组成为：葡萄糖0.6％、玉米粉0.2％、蛋白胨0.8％、酵母粉0.2％、麸皮0.5％、磷酸二氢钾0.3％、七水硫酸镁0.3％、消泡剂0.02％；调节pH值6.0。通风比为1：1.5vvm，罐压0.06Mpa，在16℃下发酵培养。发酵培养至菌体得率不再增加，发酵结束。发酵结束分析发酵液成分。
实施例2
基本与实例1相同。不同之处在于发酵罐使用气升式发酵罐。气升式发酵罐为专利号：ZL201922236548.7，名称为“一种气升式氨基酸发酵罐”的实用新型专利实施例所述。
将实施例1与实施例2成分含量进行对比，结果见表1：
表1
有上表可知，采用气升式发酵罐比机械搅拌罐发酵周期平均缩短23％；菌体得率平均提高9％；其他指标也有明显提高。
实施例3
1.种子培养。将培养好的中国被毛孢菌株种子液种到种子培养基，接种量是10％，种子培养基组成为葡萄糖1％、蛋白胨0.8％、奶粉0.5％、麸皮1.5％、磷酸二氢钾0.3％、七水硫酸镁0.3％、消泡剂0.02％，调节pH值6.0；培养条件为：通风比为1：0.5vvm，罐压0.03Mpa，培养温度18～20℃，培养7h左右即可得到种子液。
2.发酵培养。将培养种子液接种到灭菌后50L发酵培养基，接种量10％，发酵罐为100L的气升式发酵罐。发酵培养基组成为葡萄糖2％、玉米粉1.5％、蛋白胨1％、酵母粉0.5％、麸皮2％、磷酸二氢钾0.3％、七水硫酸镁0.3％、消泡剂0.03％；调节pH值6.5；通风比为1：0.5vvm，罐压0.04Mpa，在18℃下发酵培养。发酵培养至菌体得率不再增加，发酵结束。发酵结束分析发酵液成分。
上述的气升式发酵罐为一种气升式氨基酸发酵罐实用新型实施例所述，专利号：ZL201922236548.7。
实施例4
其余与实例三相同。
不同之处在于：发酵培养的第10h和第20h，一次性向发酵罐中5L流加补充培养基和低聚肽套餐。
上述的葡萄糖流加方法：当发酵液中葡萄糖浓度低于5g/L时，立即向发酵罐中流加80％的葡萄糖。为保证葡萄糖的利用率，发酵罐中葡萄糖浓度高于10g/L，停止继续流加。在发酵的第19h、第26h各补糖一次。
上述的补充培养基成分为：玉米粉1％、蛋白胨1％、酵母粉0.2％、麸皮0.8％、磷酸二氢钾0.4％、七水硫酸镁0.2％、消泡剂0.01％；调节pH值5.5。
上述的低聚肽套餐为1％的小麦肽、1％的玉米肽和2％的大豆肽胚制成的溶液。发酵过程中从第10h开始，每5h向发酵罐中1L的低聚肽套餐。
上述的在发酵过程的中后期通入氢气。从发酵的第18h开始，持续通入微量的氢气。氢气在发酵液中的浓度维持在0.6ppm左右。
实施例5
方法基本与实例3相同，不同之处在于：
1.种子培养。将培养好的中国被毛孢菌株种子液接种到种子培养基，接种量是20％，种子培养基组成为葡萄糖1％、蛋白胨0.8％、奶粉0.5％、麸皮1.5％、磷酸二氢钾0.3％、七水硫酸镁0.3％、消泡剂0.02％，调节pH值6.0；培养条件为：通风比为1：0.5vvm，罐压0.03Mpa，培养温度18～20℃，培养7h左右即可得到种子液。
2.发酵培养。将培养好种子液接种到灭菌后50L发酵培养基，接种量15％，发酵罐为100L的气升式发酵罐。发酵培养基组成为：葡萄糖0.8％、玉米粉0.8％、蛋白胨0.5％、酵母粉0.9％、麸皮0.5％、磷酸二氢钾0.5％、七水硫酸镁0.4％、消泡剂0.04％；调节pH值6.0。通风比为1：1.5vvm，罐压0.03Mpa，在16℃下发酵培养。第15h后，向发酵罐中5L流加补充培养基；第22h后，向发酵罐中5L流加补充培养基。
上述的葡萄糖流加时间点在发酵的第20h、第25h各补糖一次。
上述的补充培养基成分为：玉米粉2％、蛋白胨1％、酵母粉0.5％、麸皮2％、磷酸二氢钾0.5％、七水硫酸镁0.4％、消泡剂0.02％；调节pH值6.5。
上述的低聚肽套餐为0.8％的小麦肽、％的玉米肽和2％的大豆肽胚制成的溶液。发酵过程中从第10h开始，每5h向发酵罐中1L的低聚肽套餐。
上述的在发酵过程的中后期通入氢气。从发酵的第20h开始，持续通入微量的氢气。氢气在发酵液中的浓度维持在0.8ppm左右。
实施例6
基本与实例3一致，不同之处在于：
1.种子培养。将培养好的中国被毛孢菌株种子液种到种子培养基，接种量是15％，种子培养基组成为葡萄糖1％、蛋白胨0.8％、奶粉0.5％、麸皮1.5％、磷酸二氢钾0.3％、七水硫酸镁0.3％、消泡剂0.02％，调节pH值6.0；培养条件为：通风比为1：0.5vvm，罐压0.03Mpa，培养温度18～20℃，培养7h左右即可得到种子液。
2.发酵培养。将培养好种子液接种到灭菌后50L发酵培养基，接种量20％，发酵罐为100L的气升式发酵罐。发酵培养基组成为：葡萄糖0.6％、玉米粉0.2％、蛋白胨0.8％、酵母粉0.2％、麸皮0.5％、磷酸二氢钾0.3％、七水硫酸镁0.3％、消泡剂0.02％；调节pH值6.0。通风比为1：1.5vvm，罐压0.06Mpa，在16℃下发酵培养。第12h后，向发酵罐中5L流加补充培养基；第20h后，向发酵罐中5L流加补充培养基。
上述的上述的葡萄糖流加时间点在发酵的第22h、第26h各补糖一次。
上述的补充培养基成分为：玉米粉3％、蛋白胨1.5％、酵母粉0.6％、麸皮2％、磷酸二氢钾0.4％、七水硫酸镁0.2％、消泡剂0.02％；调节pH值6.0。
将实施例3-6进行成分对比，对比结果见表2：
表2
实验结果表明改变发酵过程中补料的方式，使菌体得率显著提高，较不补料平均增加64％，较机械搅拌罐不补料提高68％。菌体内的有效成分也显著提高。
小结：从上述实验结果表中可以发现本发明工艺比传统工艺得率提高，菌丝体质量增加，菌丝体中的有效生理活性成分(核苷，氨基酸和醇类等)含量增加。说明本发明的介绍的工艺比传统工艺具有明显优势。
Claims (4)
1.一种中国被毛孢发酵的方法，其特征在于该方法包括以下步骤：中国被毛孢的种子液按照10-20％的重量比例接种到装有发酵培养基的气升式发酵罐中，通风比为1：0.5-1.5vvm，罐压0.02～0.05Mpa，在15～20℃下发酵培养，在发酵中后期流加补充培养基、葡萄糖和氢气，所述的流加补充培养基为：玉米粉1-3％、蛋白胨0.5-2％、酵母粉0.1-1％、麸皮1-3％、磷酸二氢钾0.1-0.5％、七水硫酸镁0.1-0.5％、消泡剂0.01-0.05％；调节pH值5.5-6.5；所述的葡萄糖流加方法为：利用在线葡萄糖传感器检测发酵液中的葡萄糖浓度，当葡萄糖浓度低于0 .5％时，向发酵罐中流加葡萄糖溶液，使发酵液中的葡萄糖浓度保持在0.5-1％；所述的流加补充培养基为：玉米粉1-3％、蛋白胨1-1.5％、酵母粉0.2-0.6％、麸皮0.8-2％、磷酸二氢钾0.4-0.5％、七水硫酸镁0.2-0 .4％、消泡剂0 .01-0.02％；调节pH值5.5-6.5；所述流加的葡萄糖为：质量浓度为60％-80％的葡萄糖溶液；所述的发酵条件为通风比为1：0 .5-1.5vvm，罐压0.03-0.04Mpa，发酵温度为16-18℃，发酵时间为28-32h；所述的流加补充氢气，使发酵液中氢气含量为0.4-0.8ppm。
2.如权利要求1所述的中国被毛孢发酵的方法，其特征在于所述的流加补充培养基在发酵的第10-22h之间，分2批次，流加补充培养基。
3. 如权利要求1所述的中国被毛孢发酵的方法，其特征在于所述的发酵培养基为葡萄糖0.5-2％、玉米粉0.2-1 .5％、蛋白胨0.5-1％、酵母粉0.1-0 .9％、麸皮0.2-2％、磷酸二氢钾0.3-0.5％、七水硫酸镁0.3-0.4％、消泡剂0.01-0.05％，低聚肽套餐0.5-4％；调节pH值5.0-6.5。
4.如权利要求1所述的中国被毛孢发酵的方法，其特征在于所述的种子液通过种子培养获得，采用的种子培养基组成为：葡萄糖1％、蛋白胨0.8％、奶粉0.5％、麸皮1.5％、磷酸二氢钾0.3％、七水硫酸镁0.3％、消泡剂0.02％，调节pH值6.0。
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