CN106754838B - 一种提高黑曲霉产蛋白酶能力的方法 - Google Patents

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Abstract

一种提高黑曲霉产蛋白酶能力的方法，将黑曲霉菌株通过斜面培养，摇瓶培养，种子罐培养，制得种子液，再经含有肌醇的发酵培养基进行发酵培养，获得高酶活的蛋白酶，本发明在发酵培养基中添加了生长因子源肌醇，提高黑曲霉的生命强度，增加蛋白酶的生产活力，从根本上提高蛋白酶的发酵水平，获得的蛋白酶酶活为10000‑20000U/g，蛋白酶酶活增加了100‑300％，具有良好的稳定性，同时，本发明利用液态发酵的方法，具有发酵时间短，机械化程度高，便于自动控制，容易获得高活力的蛋白酶产品，生产效率高的优点。

Description

一种提高黑曲霉产蛋白酶能力的方法
技术领域
本发明属于蛋白酶的生产领域，具体涉及一种提高黑曲霉产蛋白酶能力的方法。
背景技术
在工业用酶当中，蛋白酶是应用最广的一种，约占整个酶制剂产量的60％以上，广泛应用于食品、饲料、纺织等领域。
生产用蛋白酶主要来源于动物的脏器和微生物生长分泌产生，许多微生物都具有产蛋白酶的能力，目前研究和应用较多的是产蛋白酶真菌，以黑曲霉最为常用。
现有技术中生产的蛋白酶多采用固态发酵，然而，随着食品、畜牧业等行业的不断发展，蛋白酶的需求量也不断上升，由于受酶活及酶适用条件的限制，仍无法满足工业生产的需求。
发明内容
本发明的目的在于提供一种提高黑曲霉产蛋白酶能力的方法，采用液态发酵的方法，利用肌醇提高黑曲霉的产蛋白酶能力，获得的蛋白酶酶活为10000-20000U/g，蛋白酶酶活增加了100-300％。
为了达到上述目的，本发明提供的技术方案如下：
一种提高黑曲霉生产蛋白酶能力的方法，包括以下步骤：
1)斜面培养
将黑曲霉菌株接种到固体斜面培养基上，28～30℃下恒温培养24-48h；
2)摇瓶培养
取步骤1)中培养后的黑曲霉菌株，接种到种子培养基中，置于温度28～30℃，150-220r/min条件下摇瓶培养24-48h；
3)种子罐培养
取步骤2)中摇瓶培养后的黑曲霉菌株，按照接种量3-6％的比例接入种子罐培养基中，于28～30℃、转速150-250rpm条件下培养48-72h，获得种子液；
4)发酵培养
取步骤3)中的种子液，按照接种量3-6％的比例接入发酵培养基，进行好氧发酵，获得蛋白酶；其中，发酵培养基中含有肌醇0.1-1wt.％。
本发明获得的蛋白酶酶活为10000-20000U/g。
进一步，步骤1)中的斜面培养基的组分及配制过程为：按重量份，马铃薯100-200份，葡萄糖10-20份，琼脂10-20份，MgSO4 0.2-1.0份，NaCl 0.5-1份，FeSO4 0.002-0.05份，K2HPO4 0.3-1.2份，将上述各组分溶于1000-1500份水中，混合均匀，自然pH值，于110-130℃灭菌20-30min。
优选的，步骤2)中摇瓶种子培养基的组分及配制过程为：按重量份，蛋白胨10-15份，酵母提取物5-8份，NaCl 5-10份，将上述组分溶于1000-1500ml水中，自然pH值，于110-130℃灭菌20-30min。
优选的，步骤3)中所述种子罐培养基的组分及配制过程为：按质量百分数，麸皮2-5％，豆粕3-8％，KH2PO4 0.2-0.5％，水85-95％，自然pH值，110-130℃灭菌20-30min。
进一步，步骤4)中发酵培养基的组分及配制过程为：按质量百分数，麸皮2-5％，豆粕3-5％，玉米粉2-4％，KH2PO4 0.3-0.8％，肌醇0.1-1％，水85-95％，自然pH值，110-130℃灭菌20-30min。
进一步，步骤4)中，好氧发酵条件为：30-45℃、自然pH值，通风量0.02-0.35vvm，转速为150-250rpm，发酵时间为48-72h。
本发明在发酵培养基中添加了肌醇作为产蛋白酶的生长因子，肌醇广泛存在于各种天然动物、植物及微生物，是一种“生物活素”，参与生物体内的新陈代谢活动，具有与维生素B1和生物素相类似的作用，可以提高黑曲霉的生命强度，促进黑曲霉的生长发育，提高蛋白酶的发酵水平，缩短发酵时间，在发酵培养中加入0.1-1％的肌醇后，获得的蛋白酶酶活可以较原来提高100-300％。
与现有技术相比，本发明的有益效果：
1)本发明对黑曲霉菌株产酶培养基添加了生长因子源，可以提高黑曲霉的生命强度，增加蛋白酶酶活，从根本上提高蛋白酶的发酵水平。
2)本发明对黑曲霉菌株产酶培养基添加了生长因子源后，所生产的蛋白酶酶活由原来的5000U/ml增加到10000-20000U/ml，增长率为100-300％，并且，对于蛋白酶酶活的提高，具有良好的稳定性。
3)本发明采用液态发酵的方法，具有机械化程度高，便于自动控制，容易获得高活力的蛋白酶产品，生产效率高。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明作进一步说明。
实施例1一种提高黑曲霉产蛋白酶能力的方法，包括以下步骤：
1)斜面培养
将自然提取的黑曲霉菌株接种于固体斜面培养基上，37℃下恒温培养48h；
其中，固体斜面培养基的组成及配制为：马铃薯(去皮)100g，葡萄糖10g，琼脂10g，MgSO4 0.2g，NaCl 0.5g，FeSO4 0.002g，K2HPO4 0.3g，将上述各组分溶于1000ml水中，自然pH值，121℃灭菌30min。
2)摇瓶培养
将步骤1)中培养的黑曲霉菌接种到装有种子培养基的三角瓶中，置于温度37℃，200r/min条件下摇瓶培养48h。
种子培养基的组成及配制为：蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 8g，将上述组分溶于1000ml水中，自然pH值，121℃灭菌30min。
3)制备种子液
取步骤2)中摇瓶培养后的种子液按照接种量的3％接种到20L的种子罐培养基中，于37℃、转速200rpm条件下培养60h，获得种子液。
其中，种子罐培养基的组成及配制为：麸皮3％，豆粕粉5％，KH2PO40.5％，水91.5％，自然pH值，121℃灭菌30min；
4)发酵培养
取步骤3)中种子罐培养后的种子液按接种量3％的比例接入发酵罐中，于37℃、自然pH值，通风量0.05vvm，转速为200rpm的条件下，好氧发酵，发酵时间60h。
其中，发酵罐培养基的组成及配制为：麸皮2.5％，豆粕粉3％，玉米粉3％，KH2PO40.8％，肌醇0.2％，溶于水中，自然pH值，121℃灭菌30min；
以不加肌醇的发酵培养基作为空白对照组，发酵培养基中加入0.2％肌醇后，对8个生产批次所获得的蛋白酶酶活进行测定，蛋白酶酶活测定方法：参考国家标准GBT28715-2012中酸性蛋白酶酶活的测定，结果参见表1：
表1
Figure BDA0001214654540000041
由表1可知，黑曲霉发酵培养基中加入0.2％肌醇后，连续8批产酶酶活相比未加肌醇的对照组均提高180％以上，具有很高的稳定性。
实施例2一种提高黑曲霉产蛋白酶能力的方法，包括以下步骤：
1)斜面培养
将黑曲霉菌株接种于固体斜面培养基上，37℃下恒温培养48h；
其中，斜面培养基的组成及配制为：马铃薯(去皮)150g，葡萄糖10g，琼脂10g，MgSO4 0.2g，NaCl 0.5g，FeSO4 0.002g，K2HPO4 0.3g，将上述各组分溶于1000ml水中，自然pH值，121℃灭菌30min。
2)摇瓶培养
将步骤1)中斜面培养的菌株接种到装有种子培养基的三角瓶中，置于温度37℃200r/min条件下发酵48h。
其中，种子培养基的组成及配制为：蛋白胨12g，酵母提取物6g，NaCl 5g，将上述组分溶于1000ml水中，自然pH值，121℃灭菌30min；
3)种子罐培养
取步骤2)中摇瓶培养后的种子液按照接种量的5％接入20L的种子罐培养基中，于37℃、转速200rpm条件下培养60h。
其中，种子罐培养基的组成及配制为：麸皮4％，豆粕4％，KH2PO40.2％，其余为水，自然pH值，121℃灭菌30min；
4)发酵培养
取步骤3)中种子罐培养后的种子液按接种量的5％的比例接入发酵罐，于37℃、自然pH值，通风量0.05vvm，转速为200rpm的条件下，好氧发酵，发酵时间60h。
发酵罐培养基的组成及配制为：麸皮3％，豆粕4％，玉米粉4％，肌醇0.4％，KH2PO40.3％，其余为水，自然pH值，121℃灭菌30min；
以不加肌醇作为空白对照组，在发酵培养基中加入0.4％肌醇后，对8个生产批次所获得的蛋白酶酶活进行测定，蛋白酶酶活测定方法：参考国家标准GBT28715-2012酸性蛋白酶酶活的测定，结果参见表2：
表2
Figure BDA0001214654540000051
由表2可知，黑曲霉发酵培养基中加入0.4％肌醇后，连续8批产酶酶活相比未加肌醇的对照组均提高190％以上，具有很高的稳定性。
实施例3一种提高黑曲霉产蛋白酶能力的方法，包括以下步骤：
1)斜面培养
将黑曲霉菌株接种于固体斜面培养基上，37℃下恒温培养48h；
其中，斜面培养基的组成及配制为：马铃薯(去皮)150g，葡萄糖10g，琼脂10g，MgSO4 0.2g，NaCl 0.5g，FeSO4 0.002g，K2HPO4 0.3g，将上述各组分溶于1000ml水中，自然pH值，121℃灭菌30min。
2)摇瓶培养
将步骤1)中斜面培养的菌株接种到装有种子培养基的三角瓶中，置于温度37℃200r/min条件下发酵48h。
其中，种子培养基的组成及配制为：蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 8g，将上述组分溶于1000ml水中，自然pH值，121℃灭菌30min。
3)种子罐培养
取步骤2)中摇瓶培养后的种子液按照接种量的6％接入20L的种子罐中，于37℃、转速200rpm条件下培养72h。
其中，种子罐培养基的组成及配制为：麸皮4％，豆粕3％，KH2PO40.2％，其余为水，自然pH值，121℃灭菌30min。
4)发酵培养
取步骤3)中种子罐培养后的种子液按接种量的6％的比例接入发酵罐，于37℃、自然pH值，通风量0.05vvm，转速为200rpm的条件下，好氧发酵，发酵时间72h。
发酵罐培养基的组成及配制为：麸皮5％，豆粕3％，玉米粉3％，肌醇0.8％，KH2PO40.3％，余量为水，自然pH值，121℃灭菌30min。
以不加肌醇作为空白对照组，在发酵培养基中加入0.8％肌醇，对8个生产批次所获得的蛋白酶酶活进行测定，蛋白酶酶活测定方法：参考国家标准GBT28715-2012酸性蛋白酶酶活的测定，结果参见表3：
表3
Figure BDA0001214654540000061
Figure BDA0001214654540000071
由表3可知，黑曲霉发酵培养基中加入0.8％肌醇后，连续8批产酶其酶活相比未加肌醇组均提高200％以上，具有很高的稳定性。

Claims (7)

1.一种提高黑曲霉产蛋白酶能力的方法，包括以下步骤：
1)斜面培养
将黑曲霉菌株接种到固体斜面培养基上，28～30℃下恒温培养24-48h；所述固体斜面培养基组成为：按重量份，马铃薯100-200份，葡萄糖10-20份，琼脂10-20份，MgSO4 0.2-1.0份，NaCl 0.5-1份，FeSO40.002-0.05份，K2HPO4 0.3-1.2份；
2)摇瓶培养
取步骤1)中培养后的黑曲霉菌株，接种到种子培养基中，置于温度28～30℃，150-220r/min条件下摇瓶培养24-48h；
3)种子罐培养
取步骤2)中摇瓶培养后的黑曲霉菌株，按照接种量3-6％的比例接入种子罐培养基中，于28～30℃、转速150-250rpm条件下培养48-72h，获得种子液；
4)发酵培养
取步骤3)中的种子液，按照接种量3-6％的比例接入发酵培养基，进行好氧发酵，获得蛋白酶；其中，发酵培养基中含有肌醇0.1-1wt.％。
2.根据权利要求1所述的提高黑曲霉产蛋白酶能力的方法，其特征在于，获得的蛋白酶酶活为10000-20000U/g。
3.根据权利要求1所述的提高黑曲霉产蛋白酶能力的方法，其特征在于，步骤1)中的固体斜面培养基的配制过程为：将固体斜面培养基各组分溶于1000-1500份水中，混合均匀，自然pH值，于110-130℃灭菌20-30min。
4.根据权利要求1所述的提高黑曲霉产蛋白酶能力的方法，其特征在于，步骤2)中摇瓶种子培养基的组分及配制过程为：按重量份，蛋白胨10-15份，酵母提取物5-8份，NaCl 5-10份，将上述组分溶于1000-1500份水中，自然pH值，于110-130℃灭菌20-30min。
5.根据权利要求1所述的提高黑曲霉产蛋白酶能力的方法，其特征在于，步骤3)中所述种子罐培养基的组分及配制过程为：按质量百分数，麸皮2-5％，豆粕3-8％，KH2PO4 0.2-0.5％，水85-95％，自然pH值，110-130℃灭菌20-30min。
6.根据权利要求1所述的提高黑曲霉产蛋白酶能力的方法，其特征在于，
步骤4)中发酵培养基的组分及配制过程为：按质量百分数，麸皮2-5％，豆粕3-5％，玉米粉2-4％，KH2PO4 0.3-0.8％，肌醇0.1-1％，水85-95％，自然pH值，110-130℃灭菌20-30min。
7.根据权利要求1-6任一项所述提高黑曲霉产蛋白酶能力的方法，其特征在于，步骤4)中，好氧发酵条件为：30-45℃、自然pH值，通风量0.02-0.35vvm，转速为150-250rpm，发酵时间为48-72h。
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