CN108330120B - 好食脉孢菌生产复合酶并联产维生素b12的发酵方法 - Google Patents

好食脉孢菌生产复合酶并联产维生素b12的发酵方法 Download PDF

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Abstract

本公开提供了一种好食脉孢菌生产复合酶并联产维生素B12的发酵方法，属于微生物发酵技术领域，能够同时生产得到高含量的复合酶和维生素B12。所述方法采用好食脉孢菌进行发酵，包括一级种子培养、二级种子培养、发酵生产等步骤，并在发酵过程中补加营养液。本公开所述方法生产的复合酶可作为饲料复合酶，提高饲料利用率。该方法用于同时生产饲料复合酶和维生素B12。

Description

好食脉孢菌生产复合酶并联产维生素B12的发酵方法
技术领域
本发明涉及微生物发酵技术领域，尤其涉及一种好食脉孢菌生产复合酶并联产维生素B12的发酵方法。
背景技术
随着我国经济的快速发展，人民的生活水平不断提高。对食品的需要量日渐增加，促进了畜牧水产养殖业的迅速发展。然而随着人口增加和耕地面积的不断减少，出现了人畜争粮的现象，导致饲料价格居高不下，因此提供酶制剂提高畜禽饲料的利用率一直是动物营养科学的研究目标之一。解决方法之一便是添加外源酶和消除抗营养因子，如纤维素、半纤维素等就是饲料中的抗营养因子。另外，在饲料中添加蛋白酶(外源性消化酶)有利于提高饲料中蛋白质的可消化性。因此，在饲料中添加适量的与饲料日粮相匹配的复合酶制剂能明显提高饲料利用率。通常，合适的复合酶制剂包括纤维素酶、淀粉酶、蛋白酶等。
其中，目前对纤维素酶产生菌的研究多集中于木酶、曲霉和青霉等真菌，但这类菌有β-葡萄糖苷酶产量和酶活偏低、对葡萄糖的耐受性较差等缺点。
此外，维生素B12(VB12)又叫钴胺素，是唯一的一种需要肠道分泌物(内源因子)帮助才能被吸收的维生素，具有广泛的生理作用，可参与制造骨髓红细胞，防止恶性贫血；防止大脑神经受到破坏。目前，对VB12产生菌的研究多集中于放线菌、丙酸菌、诺卡式菌、棒状菌、芽孢杆菌、乙酸杆菌以及丁酸杆菌等。但目前的发酵方法由于发酵周期长、菌体量和产物积累量不一致等原因，导致VB12的生物发酵法生产成本过高。
因此，通过微生物发酵生产饲料复合酶制剂，并且进一步地，通过合适的培养条件提高复合酶的酶活，甚至同时联产维生素B12、改善VB12生产成本高的问题，具有很好的市场前景。
发明内容
本发明旨在提供一种好食脉孢菌生产复合酶并联产维生素B12的发酵方法，可同时得到高酶活且配比较为均衡的纤维素酶、木聚糖酶、中温淀粉酶、蛋白酶，并且还能够得到高含量的维生素B12。
本发明提供一种好食脉孢菌生产复合酶并联产维生素B12的发酵方法，其中，所述复合酶包括纤维素酶、木聚糖酶、中温淀粉酶、蛋白酶；
所述方法包括以下步骤：
1)选取菌种
所述好食脉孢菌的保藏编号为CICC12001；
2)一级种子培养
将菌种转移到一级种子罐中，在一级种子罐中培养20～24h，其中，温度28～30℃，风量1:0.6～1：0.8，罐压0.03～0.05Mpa；
一级种子培养基为：甜菜糖100g/L、玉米蛋白粉25g/L、玉米浆25g/L、KCl 2g/L、硫酸铵10g/L、硫酸镁2g/L、磷酸氢二钾12g/L、氯化钙1g/L；121-123℃温度下灭菌处理25min；
3)二级种子培养
在二级种子罐中培养6～8h，其中温度28～30℃,风量1：0.6～1：0.8，罐压0.03～0.05Mpa；
二级种子培养基为：甜菜糖100g/L、玉米蛋白粉25g/L、玉米浆25g/L、KCl 2g/L、硫酸铵10g/L、硫酸镁2g/L、磷酸氢二钾12g/L、氯化钙1g/L；；121-123℃温度下灭菌处理25min；
4)接种
将二级种子培养后的菌种用无菌水制成含量为107个/mL的孢子悬液，接种到灭菌的发酵培养基中；
5)发酵生产
在温度28～30℃、罐压0.02～0.05Mpa、风量1：0.6～1：0.8、溶氧≧30％、pH4.8～5.0的条件下发酵180～210小时，其中，在发酵过程中通过添加氨水调控pH，在发酵过程中添加营养液A或营养液B，营养液A的成分及重量百分比为槐糖40～50g/L、甜菜碱15～28g/L、玉米浆1.1～2.0g/L；营养液B的成分及重量百分比为纤维二糖10～15g/L、反玉米素0.1～0.5g/L、甜菜碱12～21g/L、玉米浆1.5～2.5g/L、栀子苷0.12～0.36g/L、碳酸氢钠0.01～0.03g/L、氧化镁0.01～0.03g/L；
发酵培养基的组成为：甜菜糖50g/L、玉米蛋白粉25g/L、KCl 1g/L、硫酸铵5g/L、硫酸镁1g/L、磷酸氢二钾6g/L、玉米浆25g/L、氯化钙0.5g/L、硫酸亚铁0.17g/L、氯化钴0.015g/L、硫酸锰0.02g/L；121-123℃温度下灭菌处理25min。
本发明提供了一种好食脉孢菌生产复合酶并联产维生素B12的发酵方法，采用好食脉孢菌生产复合酶并联产维生素B12，通过一种菌种的发酵，同时产复合酶和维生素B12。与常规现有技术相比，在本发明所述方法中，酶产物中纤维素酶、木聚糖酶、中温淀粉酶、蛋白酶的酶活配比适宜，构成的复合酶可用作饲料复合酶制剂，提高饲料利用率。并且，还具有较高的VB12含量，发酵液在将复合酶提取分离后既可直接作为VB12原料源用作饲料添加剂、也可用于进一步提取分离VB12，降低了发酵生产VB12的成本。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明实施例提供一种好食脉孢菌生产复合酶并联产维生素B12的发酵方法，其中，所述复合酶包括纤维素酶、木聚糖酶、中温淀粉酶、蛋白酶；
所述方法包括以下步骤：
1)选取菌种
所述好食脉孢菌的保藏编号为CICC12001；
2)一级种子培养
将菌种转移到一级种子罐中，在一级种子罐中培养20～24h，其中，温度28～30℃，风量1:0.6～1：0.8，罐压0.03～0.05Mpa；
一级种子培养基为：甜菜糖100g/L、玉米蛋白粉25g/L、玉米浆25g/L、KCl 2g/L、硫酸铵10g/L、硫酸镁2g/L、磷酸氢二钾12g/L、氯化钙1g/L；121-123℃温度下灭菌处理25min；
3)二级种子培养
在二级种子罐中培养6～8h，其中温度28～30℃,风量1：0.6～1：0.8，罐压0.03～0.05Mpa；
二级种子培养基为：甜菜糖100g/L、玉米蛋白粉25g/L、玉米浆25g/L、KCl 2g/L、硫酸铵10g/L、硫酸镁2g/L、磷酸氢二钾12g/L、氯化钙1g/L；121-123℃温度下灭菌处理25min；
4)接种
将二级种子培养后的菌种用无菌水制成含量为107个/mL的孢子悬液，接种到发酵罐中已灭菌的发酵培养基中；
5)发酵生产
在温度28～30℃、罐压0.02～0.05Mpa、风量1：0.6～1：0.8、溶氧≧30％、pH4.8～5.0的条件下发酵180～210小时，其中，在发酵过程中通过添加氨水调控pH，在发酵过程中添加营养液A或营养液B，营养液A的成分及重量百分比为槐糖40～50g/L、甜菜碱15～28g/L、玉米浆1.1～2.0g/L；营养液B的成分及重量百分比为纤维二糖10～15g/L、反玉米素0.1～0.5g/L、甜菜碱12～21g/L、玉米浆1.5～2.5g/L、栀子苷0.12～0.36g/L、碳酸氢钠0.01～0.03g/L、氧化镁0.01～0.03g/L；
发酵培养基为：甜菜糖50g/L、玉米蛋白粉25g/L、KCl 1g/L、硫酸铵5g/L、硫酸镁1g/L、磷酸氢二钾6g/L、玉米浆25g/L、氯化钙0.5g/L、硫酸亚铁0.17g/L、氯化钴0.015g/L、硫酸锰0.02g/L；121-123℃温度下灭菌处理25min。
VB12应用范围广且市场需求量大，但目前对维生素B12产生菌的研究多集中于放线菌、丙酸菌、诺卡式菌、棒状菌、芽孢杆菌、乙酸杆菌以及丁酸杆菌等。由于发酵周期长、菌体量和产物积累量不一致等原因，导致生产成本过高。
现有技术中也提出过一种通过发酵联产VB12的方法——丙酸杆菌厌氧发酵法，但该方法在发酵时会产生大量的有机酸，有机酸对菌体会产生抑制作用，不利于提高VB12产量。
本发明实施例提供了一种好食脉孢菌生产复合酶并联产VB12的方法，采用好食脉孢菌同时生产复合酶和VB12，不仅酶产物中纤维素酶、木聚糖酶、中温淀粉酶、蛋白酶各酶的酶活均较高，且相互之间的配比适宜，构成的复合酶可用于饲料复合酶制剂，提高饲料利用率。同时还可得到较高含量的VB12，发酵液在将复合酶提取分离后既可直接作为VB12原料源用作饲料添加剂、也可用于进一步提取分离VB12，降低了发酵生产VB12的成本。
本发明实施例所述方法中适用的菌种选自保藏编号为CICC12001的为好食脉孢菌，保藏于中国工业微生物菌种保藏管理中心。
本发明实施例提供的好食脉孢菌生产复合酶并联产VB12的方法，实现了联产复合酶和VB12。
在本发明实施例所述方法中，在一级种子培养之前，还包括斜面培养，以活化菌种。
斜面培养的培养基组成为：马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂17g、加水至体积为1000mL、pH自然；121℃灭菌30min。
斜面培养的过程可以为：将菌种移接在斜面培养基上，置于恒温培养箱中28℃下培养3天。
具体地，斜面培养基的配制过程中，马铃薯需要去皮后切皮，而后加水煮沸，取4层纱布进行过滤。
斜面培养的过程中，培养3天后，斜面培养基上回生长出大量的孢子，此时视为培养成熟，可取出置于4℃冰箱中保存待用。
随后依次经过一级种子培养和二级种子培养，然后在发酵培养基中进行发酵生产。其中，一级种子培养的时间要大于二级种子培养的时间。具体的，一级种子培养的时间可以是二级种子培养的时间的约3～4倍左右。
进一步地，可以在一级种子培养罐中培养20～24h，然后在二级种子培养罐中培养6～8h。进一步优选地，可以在一级种子培养罐中培养22h，在二级种子培养罐中培养7h。
本发明实施例提供了一种好食脉孢菌生产复合酶并联产VB12的方法，采用好食脉孢菌同时生产复合酶和VB12，通过提供适宜的工艺，可同时得到高酶活的复合酶以及高含量的VB12。
在本发明一实施例的方法中，在接种过程中，将二级种子培养后的菌种用无菌水制成含量为106～109个/mL的孢子悬液，接种到灭菌的发酵培养基中，例如可以制成107个/mL的孢子悬液、108个/mL的孢子悬液、或者109个/mL的孢子悬液。
接种量一般是指移入种子液的体积和接种后培养液体积的比例。接种量过大或者过小，均会影响发酵。本发明实施例的方法中，可以以20％～30％的接种量接种到灭菌的发酵培养基中，进行后续的发酵生产；进一步可以以28％～30％的接种量接种到灭菌的发酵培养基中，进行后续的发酵生产。
在本发明一实施例的方法中，可以在发酵过程中添加营养液。适用的营养液可以为营养液A，其成分及组成为槐糖40～50g/L、甜菜碱15～28g/L、玉米浆1.1～2.0g/L；或者可以为营养液B，其成分或组成为纤维二糖10～15g/L、反玉米素0.1～0.5g/L、甜菜碱12～21g/L、玉米浆1.5～2.5g/L、栀子苷0.12～0.36g/L、碳酸氢钠0.01～0.03g/L、氧化镁0.01～0.03g/L。
营养液A或营养液B可以在发酵过程中添加到发酵罐中。例如可以在发酵过程的0～18小时内添加到发酵罐中，例如可以在第1小时、第3小时、第6小时、或者第18小时添加到发酵罐内。
在发酵过程中添加营养液A的情况下，以发酵培养基的起始总重量计，营养液A的添加量为发酵培养基的起始总重量的40％～62％。
进一步的，营养液A可以分批多次添加到发酵罐中。例如可以分为4批依次在发酵过程的第3小时、第18小时、第60小时、第96小时添加到发酵罐中。
在本发明一优选实施例中，营养液A的添加分为四个阶段：第一阶段为发酵过程的第3小时，加入营养液A总量的20％；第二阶段为发酵过程的第18小时，加入营养液A总量的50％；第三阶段为发酵过程的第60小时，加入营养液A总量的20％；第四阶段为发酵过程的第96小时，加入营养液A总量的10％。
进一步地，营养液A成分及组成还可以包括反玉米素0.1g/L。也就是说，营养液A的成分及组成还可以为槐糖40～50g/L、甜菜碱15～28g/L、玉米浆1.1～2.0g/L、反玉米素0.1g/L。
在发酵过程中添加营养液B的情况下，营养液B的添加量为发酵培养基起始总重量的10～20％。
营养液B可以分批多次添加到发酵罐中。例如可以分为4批依次在发酵过程的第3小时、第18小时、第60小时、第96小时添加到发酵罐中。
在本发明一优选实施例中，营养液B的添加分为四个阶段：第一阶段为发酵过程的第3小时，加入营养液B总量的25％；第二阶段为发酵过程的第18小时，加入营养液B总量的35％；第三阶段为发酵过程的第60小时，加入营养液B总量的20％；第四阶段为发酵过程的第96小时，加入营养液B总量的20％。
微生物在进行发酵时都会产生多种产品，通过单一菌种发酵获取多产物，多数也会存在“此消彼长”的问题，提高了一种产物的产量的同时会降低其他产物的产量，难以实现多产物的产量均衡分配，均有提高。在这过程中通过单一菌种发酵获取多产物时，一般是通过膜分离等手段，将其他产物在发酵过程中及时隔离出去。而本发明实施例提供的采用好食脉孢菌通过发酵同时生产复合酶和VB12的方法，可同时得到高含量的复合酶以及VB12。
本发明实施例中适用的营养液对复合酶和VB12的产量具有很大影响，能够改变细胞膜的渗析性，促进细胞内外物质交换能力，从而提高发酵速率；可能还促进了菌种生长和发酵进程，进而提高了发酵产率。
在不同的发酵阶段菌体浓度是不同的，生长、代谢及生产状态也是不同的，因此掌握不同阶段中合适的添加方式和添加量比较重要。添加时机不当可能不仅没有提高产酶和VB12的效果，反而会抑制菌体生长，不利于产酶和VB12。因此，营养液的添加时机对产酶及VB12具有很大影响。本发明实施例所述方法中，发酵过程的第3小时、第18小时、第60小时、第96小时是比较重要的切入点。
下文以具体实施例进一步详细阐述本发明实施例所述的一种好食脉孢菌生产复合酶并联产维生素B12的发酵方法。
其中，所用菌种均为好食脉孢菌CICC12001，通过市售获得。
对比例1
1)斜面培养
从保菌管中刮一环菌种，移接在斜面培养基上，恒温培养箱中28℃下培养3天，斜面上生长出大量的孢子即为培养成熟，取出放于4℃冰箱保存备用；
斜面培养基的配制：马铃薯去皮200g切片加水1000ml,煮沸20min,用4层纱布过滤，加入葡萄糖20g,琼脂17g，补充体积至1000ml，pH自然，置于电炉上缓慢煮沸至琼脂溶化，分装试管，121℃灭菌30min。
2)接种
将菌种用无菌水制成含量为107个/mL的孢子悬液，然后以10％的接种量接种到灭菌的发酵培养基中；
3)发酵生产
在50L发酵罐中，温度28～30℃、罐压0.02～0.05Mpa、风量1：0.6～1：0.8、溶氧≧30％、pH4.8～5.0的条件下发酵180～210小时，在发酵过程中通过添加氨水调控pH；
发酵培养基的配制：甜菜糖50g/L、玉米蛋白粉25g/L、KCl 1g/L、硫酸铵5g/L、硫酸镁1g/L、磷酸氢二钾6g/L、玉米浆25g/L、氯化钙0.5g/L、硫酸亚铁0.17g/L、氯化钴0.015g/L、硫酸锰0.02g/L；121-123℃温度下灭菌处理25min；121-123℃温度下灭菌处理25min。
4)将所得发酵液进行离心，取上清液测纤维素酶、木聚糖酶、中温淀粉酶、蛋白酶的酶活，以及VB12的含量，结果列于表1。
其中，纤维素酶检测标准：Q/KRAB013-2014、木聚糖酶检测标准：GB/T23874-200、中温a-淀粉酶检测标准：GB1886.174-2016、蛋白酶检测标准：GB/T23527-2009、维生素B12的的检测标准GB/T5009.217-2008。
对比例2
1)斜面培养
从保菌管中刮一环菌种，移接在斜面培养基上，恒温培养箱中28℃下培养3天，斜面上生长出大量的孢子即为培养成熟，取出放于4℃冰箱保存备用；
斜面培养基的配制：马铃薯去皮200g切片加水1000ml,煮沸20min,用4层纱布过滤，加入葡萄糖20g,琼脂17g，补充体积至1000ml,PH自然，置于电炉上缓慢煮沸至琼脂溶化，分装试管，121℃灭菌30min。
2)一级种子培养
将菌种接种到一级种子罐中，在一级种子罐中培养20～24h，其中，温度28～30℃，风量1:0.6～1：0.8，罐压0.03～0.05Mpa；
一级种子培养基的配制：甜菜糖100g/L、玉米蛋白粉25g/L、玉米浆25g/L、KCl 2g/L、硫酸铵10g/L、硫酸镁2g/L、磷酸氢二钾12g/L、氯化钙1g/L；121-123℃温度下灭菌处理25min；
3)二级种子培养
转移到二级种子罐中，在二级种子罐中培养6～8h，其中温度28～30℃,风量1：0.6～1：0.8，罐压0.03～0.05Mpa；
二级种子培养基的配制为：甜菜糖100g/L、玉米蛋白粉25g/L、玉米浆25g/L、KCl2g/L、硫酸铵10g/L、硫酸镁2g/L、磷酸氢二钾12g/L、氯化钙1g/L；121-123℃温度下灭菌处理25min；
4)接种
将二级种子培养后的菌种用无菌水制成含量为107个/mL的孢子悬液，然后以20～30％的接种量接种到灭菌的发酵培养基中；
5)发酵生产
在50L发酵罐中，温度28～30℃、罐压0.02～0.05Mpa、风量1：0.6～1：0.8、溶氧≧30％、pH4.8～5.0的条件下发酵180～210小时，在发酵过程中通过添加氨水调控pH；
发酵培养基的组成为：甜菜糖50g/L、玉米蛋白粉25g/L、KCl 1g/L、硫酸铵5g/L、硫酸镁1g/L、磷酸氢二钾6g/L、玉米浆25g/L、氯化钙0.5g/L、硫酸亚铁0.17g/L、氯化钴0.015g/L、硫酸锰0.02g/L；121-123℃温度下灭菌处理25min；121-123℃温度下灭菌处理25min。
6)将所得发酵液进行离心，取上清液测纤维素酶、木聚糖酶、中温淀粉酶、蛋白酶的酶活，以及VB12的含量，结果列于表1。
实施例1
1)斜面培养
从保菌管中刮一环菌种，移接在斜面培养基上，恒温培养箱中28℃下培养3天，斜面上生长出大量的孢子即为培养成熟，取出放于4℃冰箱保存备用；
斜面培养基的配制：马铃薯去皮200g切片加水1000ml,煮沸20min,用4层纱布过滤，加入葡萄糖20g,琼脂17g，补充体积至1000ml,PH自然，置于电炉上缓慢煮沸至琼脂溶化，分装试管，121℃灭菌30min。
2)一级种子培养
将菌种接种到一级种子罐中，在一级种子罐中培养20～24h，其中，温度28～30℃，风量1:0.6～1：0.8，罐压0.03～0.05Mpa；
一级种子培养基为：甜菜糖100g/L、玉米蛋白粉25g/L、玉米浆25g/L、KCl 2g/L、硫酸铵10g/L、硫酸镁2g/L、磷酸氢二钾12g/L、氯化钙1g/L；121-123℃温度下灭菌处理25min；
3)二级种子培养
转移到二级种子罐中，在二级种子罐中培养6～8h，其中温度28～30℃,风量1：0.6～1：0.8，罐压0.03～0.05Mpa；
二级种子培养基为：甜菜糖100g/L、玉米蛋白粉25g/L、玉米浆25g/L、KCl 2g/L、硫酸铵10g/L、硫酸镁2g/L、磷酸氢二钾12g/L、氯化钙1g/L；121-123℃温度下灭菌处理25min；
4)接种
将二级种子培养后的菌种用无菌水制成含量为107个/mL的孢子悬液，然后以20～30％的接种量接种到灭菌的发酵培养基中；
5)发酵生产
在50L发酵罐中，温度28～30℃、罐压0.02～0.05Mpa、风量1：0.6～1：0.8、溶氧≧30％、pH4.8～5.0的条件下发酵180～210小时，在发酵过程中通过添加氨水调控pH；
在发酵过程中添加营养液A，营养液A的成分及组成为槐糖45g/L、甜菜碱15g/L、玉米浆1.5g/L；
营养液A的添加量为发酵培养基起始总重量的62％；
发酵培养基的组成为：甜菜糖50g/L、玉米蛋白粉25g/L、KCl 1g/L、硫酸铵5g/L、硫酸镁1g/L、磷酸氢二钾6g/L、玉米浆25g/L、氯化钙0.5g/L、硫酸亚铁0.17g/L、氯化钴0.015g/L、硫酸锰0.02g/L；121-123℃温度下灭菌处理25min；121-123℃温度下灭菌处理25min。
6)将所得发酵液进行离心，取上清液测纤维素酶、木聚糖酶、中温淀粉酶、蛋白酶的酶活，以及VB12的含量，结果列于表1。
实施例2
1)斜面培养
从保菌管中刮一环菌种，移接在斜面培养基上，恒温培养箱中28℃下培养3天，斜面上生长出大量的孢子即为培养成熟，取出放于4℃冰箱保存备用；
斜面培养基的配制：马铃薯去皮200g切片加水1000ml,煮沸20min,用4层纱布过滤，加入葡萄糖20g,琼脂17g，补充体积至1000ml,PH自然，置于电炉上缓慢煮沸至琼脂溶化，分装试管，121℃灭菌30min。
2)一级种子培养
将菌种接种到一级种子罐中，在一级种子罐中培养20～24h，其中，温度28～30℃，风量1:0.6～1：0.8，罐压0.03～0.05Mpa；
一级种子培养基为：甜菜糖100g/L、玉米蛋白粉25g/L、玉米浆25g/L、KCl 2g/L、硫酸铵10g/L、硫酸镁2g/L、磷酸氢二钾12g/L、氯化钙1g/L；121-123℃温度下灭菌处理25min；
3)二级种子培养
转移到二级种子罐中，在二级种子罐中培养6～8h，其中温度28～30℃,风量1：0.6～1：0.8，罐压0.03～0.05Mpa；
二级种子培养基为：甜菜糖100g/L、玉米蛋白粉25g/L、玉米浆25g/L、KCl 2g/L、硫酸铵10g/L、硫酸镁2g/L、磷酸氢二钾12g/L、氯化钙1g/L；121-123℃温度下灭菌处理25min；
4)接种
将二级种子培养后的菌种用无菌水制成含量为107个/mL的孢子悬液，然后以20～30％的接种量接种到灭菌的发酵培养基中；
5)发酵生产
在50L发酵罐中，温度28～30℃、罐压0.02～0.05Mpa、风量1：0.6～1：0.8、溶氧≧30％、pH4.8～5.0的条件下发酵180～210小时，在发酵过程中通过添加氨水调控pH；
在发酵过程中添加营养液A，营养液A的成分及组成为槐糖50g/L、甜菜碱28g/L、玉米浆2.0g/L；
营养液A的添加量为发酵培养基起始总重量的40％；
发酵培养基的组成为：甜菜糖50g/L、玉米蛋白粉25g/L、KCl 1g/L、硫酸铵5g/L、硫酸镁1g/L、磷酸氢二钾6g/L、玉米浆25g/L、氯化钙0.5g/L、硫酸亚铁0.17g/L、氯化钴0.015g/L、硫酸锰0.02g/L；121-123℃温度下灭菌处理25min；121-123℃温度下灭菌处理25min。
6)将所得发酵液进行离心，取上清液测纤维素酶、木聚糖酶、中温淀粉酶、蛋白酶的酶活，以及VB12的含量，结果列于表1。
实施例3
1)斜面培养
从保菌管中刮一环菌种，移接在斜面培养基上，恒温培养箱中28℃下培养3天，斜面上生长出大量的孢子即为培养成熟，取出放于4℃冰箱保存备用；
斜面培养基的配制：马铃薯去皮200g切片加水1000ml,煮沸20min,用4层纱布过滤，加入葡萄糖20g,琼脂17g，补充体积至1000ml,PH自然，置于电炉上缓慢煮沸至琼脂溶化，分装试管，121℃灭菌30min。
2)一级种子培养
将菌种接种到一级种子罐中，在一级种子罐中培养20～24h，其中，温度28～30℃，风量1:0.6～1：0.8，罐压0.03～0.05Mpa；
一级种子培养基为：甜菜糖100g/L、玉米蛋白粉25g/L、玉米浆25g/L、KCl 2g/L、硫酸铵10g/L、硫酸镁2g/L、磷酸氢二钾12g/L、氯化钙1g/L；121-123℃温度下灭菌处理25min；
3)二级种子培养
转移到二级种子罐中，在二级种子罐中培养6～8h，其中温度28～30℃,风量1：0.6～1：0.8，罐压0.03～0.05Mpa；
二级种子培养基为：甜菜糖100g/L、玉米蛋白粉25g/L、玉米浆25g/L、KCl 2g/L、硫酸铵10g/L、硫酸镁2g/L、磷酸氢二钾12g/L、氯化钙1g/L；121-123℃温度下灭菌处理25min；
4)接种
将二级种子培养后的菌种用无菌水制成含量为107个/mL的孢子悬液，然后以20～30％的接种量接种到灭菌的发酵培养基中；
5)发酵生产
在50L发酵罐中，温度28～30℃、罐压0.02～0.05Mpa、风量1：0.6～1：0.8、溶氧≧30％、pH4.8～5.0的条件下发酵180～210小时，在发酵过程中通过添加氨水调控pH；
在发酵过程中添加营养液A，营养液A的成分及组成为槐糖40g/L、甜菜碱20g/L、玉米浆1.1g/L；
营养液A的添加量为发酵培养基起始总重量的60％；
发酵培养基的组成为：甜菜糖50g/L、玉米蛋白粉25g/L、KCl 1g/L、硫酸铵5g/L、硫酸镁1g/L、磷酸氢二钾6g/L、玉米浆25g/L、氯化钙0.5g/L、硫酸亚铁0.17g/L、氯化钴0.015g/L、硫酸锰0.02g/L；121-123℃温度下灭菌处理25min；121-123℃温度下灭菌处理25min。
6)将所得发酵液进行离心，取上清液测纤维素酶、木聚糖酶、中温淀粉酶、蛋白酶的酶活，以及VB12的含量，结果列于表1。
实施例4
1)斜面培养
从保菌管中刮一环菌种，移接在斜面培养基上，恒温培养箱中28℃下培养3天，斜面上生长出大量的孢子即为培养成熟，取出放于4℃冰箱保存备用；
斜面培养基的配制：马铃薯去皮200g切片加水1000ml,煮沸20min,用4层纱布过滤，加入葡萄糖20g,琼脂17g，补充体积至1000ml,PH自然，置于电炉上缓慢煮沸至琼脂溶化，分装试管，121℃灭菌30min。
2)一级种子培养
将菌种接种到一级种子罐中，在一级种子罐中培养20～24h，其中，温度28～30℃，风量1:0.6～1：0.8，罐压0.03～0.05Mpa；
一级种子培养基为：甜菜糖100g/L、玉米蛋白粉25g/L、玉米浆25g/L、KCl 2g/L、硫酸铵10g/L、硫酸镁2g/L、磷酸氢二钾12g/L、氯化钙1g/L；121-123℃温度下灭菌处理25min；
3)二级种子培养
转移到二级种子罐中，在二级种子罐中培养6～8h，其中温度28～30℃,风量1：0.6～1：0.8，罐压0.03～0.05Mpa；
二级种子培养基为：甜菜糖100g/L、玉米蛋白粉25g/L、玉米浆25g/L、KCl 2g/L、硫酸铵10g/L、硫酸镁2g/L、磷酸氢二钾12g/L、氯化钙1g/L；121-123℃温度下灭菌处理25min；
4)接种
将二级种子培养后的菌种用无菌水制成含量为107个/mL的孢子悬液，然后以20～30％的接种量接种到灭菌的发酵培养基中；
5)发酵生产
在50L发酵罐中，温度28～30℃、罐压0.02～0.05Mpa、风量1：0.6～1：0.8、溶氧≧30％、pH4.8～5.0的条件下发酵180～210小时，在发酵过程中通过添加氨水调控pH；
在发酵过程中添加营养液A，营养液A的成分及重量百分比为槐糖405g/L、甜菜碱15g/L、玉米浆1.5g/L；
营养液A的添加量为发酵培养基起始总重量的62％；
在发酵过程的第3小时，加入营养液A总量的20％；发酵过程的第18小时，加入营养液A总量的50％；发酵过程的第60小时，加入营养液A总量的20％；发酵过程的第96小时，加入营养液A总量的10％；
发酵培养基的组成为：甜菜糖50g/L、玉米蛋白粉25g/L、KCl 1g/L、硫酸铵5g/L、硫酸镁1g/L、磷酸氢二钾6g/L、玉米浆25g/L、氯化钙0.5g/L、硫酸亚铁0.17g/L、氯化钴0.015g/L、硫酸锰0.02g/L；121-123℃温度下灭菌处理25min；121-123℃温度下灭菌处理25min。
6)将所得发酵液进行离心，取上清液测纤维素酶、木聚糖酶、中温淀粉酶、蛋白酶的酶活，以及VB12的含量，结果列于表1。
实施例5
1)斜面培养
从保菌管中刮一环菌种，移接在斜面培养基上，恒温培养箱中28℃下培养3天，斜面上生长出大量的孢子即为培养成熟，取出放于4℃冰箱保存备用；
斜面培养基的配制：马铃薯去皮200g切片加水1000ml,煮沸20min,用4层纱布过滤，加入葡萄糖20g,琼脂17g，补充体积至1000ml,PH自然，置于电炉上缓慢煮沸至琼脂溶化，分装试管，121℃灭菌30min。
2)一级种子培养
将菌种接种到一级种子罐中，在一级种子罐中培养20～24h，其中，温度28～30℃，风量1:0.6～1：0.8，罐压0.03～0.05Mpa；
一级种子培养基为：甜菜糖100g/L、玉米蛋白粉25g/L、玉米浆25g/L、KCl 2g/L、硫酸铵10g/L、硫酸镁2g/L、磷酸氢二钾12g/L、氯化钙1g/L；121-123℃温度下灭菌处理25min；
3)二级种子培养
转移到二级种子罐中，在二级种子罐中培养6～8h，其中温度28～30℃,风量1：0.6～1：0.8，罐压0.03～0.05Mpa；
二级种子培养基为：甜菜糖100g/L、玉米蛋白粉25g/L、玉米浆25g/L、KCl 2g/L、硫酸铵10g/L、硫酸镁2g/L、磷酸氢二钾12g/L、氯化钙1g/L；121-123℃温度下灭菌处理25min；
4)接种
将二级种子培养后的菌种用无菌水制成含量为107个/mL的孢子悬液，然后以20～30％的接种量接种到灭菌的发酵培养基中；
5)发酵生产
在50L发酵罐中，温度28～30℃、罐压0.02～0.05Mpa、风量1：0.6～1：0.8、溶氧≧30％、pH4.8～5.0的条件下发酵180～210小时，在发酵过程中通过添加氨水调控pH；
在发酵过程中添加营养液B，营养液B的成分及组成为纤维二糖10g/L、反玉米素0.1g/L、甜菜碱12g/L、玉米浆1.5g/L、栀子苷0.12g/L、碳酸氢钠0.01g/L、氧化镁0.01g/L；
营养液B的添加量为发酵培养基起始总重量的20％；
发酵培养基的组成为：甜菜糖50g/L、玉米蛋白粉25g/L、KCl 1g/L、硫酸铵5g/L、硫酸镁1g/L、磷酸氢二钾6g/L、玉米浆25g/L、氯化钙0.5g/L、硫酸亚铁0.17g/L、氯化钴0.015g/L、硫酸锰0.02g/L；121-123℃温度下灭菌处理25min；121-123℃温度下灭菌处理25min。
6)将所得发酵液进行离心，取上清液测纤维素酶、木聚糖酶、中温淀粉酶、蛋白酶的酶活，以及VB12的含量，结果列于表1。
实施例6
1)斜面培养
从保菌管中刮一环菌种，移接在斜面培养基上，恒温培养箱中28℃下培养3天，斜面上生长出大量的孢子即为培养成熟，取出放于4℃冰箱保存备用；
斜面培养基的配制：马铃薯去皮200g切片加水1000ml,煮沸20min,用4层纱布过滤，加入葡萄糖20g,琼脂17g，补充体积至1000ml,PH自然，置于电炉上缓慢煮沸至琼脂溶化，分装试管，121℃灭菌30min。
2)一级种子培养
将菌种接种到一级种子罐中，在一级种子罐中培养20～24h，其中，温度28～30℃，风量1:0.6～1：0.8，罐压0.03～0.05Mpa；
一级种子培养基为：甜菜糖100g/L、玉米蛋白粉25g/L、玉米浆25g/L、KCl 2g/L、硫酸铵10g/L、硫酸镁2g/L、磷酸氢二钾12g/L、氯化钙1g/L；121-123℃温度下灭菌处理25min；
3)二级种子培养
转移到二级种子罐中，在二级种子罐中培养6～8h，其中温度28～30℃,风量1：0.6～1：0.8，罐压0.03～0.05Mpa；
二级种子培养基为：甜菜糖100g/L、玉米蛋白粉25g/L、玉米浆25g/L、KCl 2g/L、硫酸铵10g/L、硫酸镁2g/L、磷酸氢二钾12g/L、氯化钙1g/L；121-123℃温度下灭菌处理25min；
4)接种
将二级种子培养后的菌种用无菌水制成含量为107个/mL的孢子悬液，然后以20～30％的接种量接种到灭菌的发酵培养基中；
5)发酵生产
在50L发酵罐中，温度28～30℃、罐压0.02～0.05Mpa、风量1：0.6～1：0.8、溶氧≧30％、pH4.8～5.0的条件下发酵180～210小时，在发酵过程中通过添加氨水调控pH；
在发酵过程中添加营养液B，营养液B的成分及组成为纤维二糖15g/L、反玉米素0.5g/L、甜菜碱21g/L、玉米浆2.5g/L、栀子苷0.36g/L、碳酸氢钠0.03g/L、氧化镁0.03g/L；
营养液B的添加量为发酵培养基起始总重量的10％；
发酵培养基的组成为：甜菜糖50g/L、玉米蛋白粉25g/L、KCl 1g/L、硫酸铵5g/L、硫酸镁1g/L、磷酸氢二钾6g/L、玉米浆25g/L、氯化钙0.5g/L、硫酸亚铁0.17g/L、氯化钴0.015g/L、硫酸锰0.02g/L；121-123℃温度下灭菌处理25min；121-123℃温度下灭菌处理25min。
6)将所得发酵液进行离心，取上清液测纤维素酶、木聚糖酶、中温淀粉酶、蛋白酶的酶活，以及VB12的含量，结果列于表1。
实施例7
1)斜面培养
从保菌管中刮一环菌种，移接在斜面培养基上，恒温培养箱中28℃下培养3天，斜面上生长出大量的孢子即为培养成熟，取出放于4℃冰箱保存备用；
斜面培养基的配制：马铃薯去皮200g切片加水1000ml,煮沸20min,用4层纱布过滤，加入葡萄糖20g,琼脂17g，补充体积至1000ml,PH自然，置于电炉上缓慢煮沸至琼脂溶化，分装试管，121℃灭菌30min。
2)一级种子培养
将菌种接种到一级种子罐中，在一级种子罐中培养20～24h，其中，温度28～30℃，风量1:0.6～1：0.8，罐压0.03～0.05Mpa；
一级种子培养基为：甜菜糖100g/L、玉米蛋白粉25g/L、玉米浆25g/L、KCl 2g/L、硫酸铵10g/L、硫酸镁2g/L、磷酸氢二钾12g/L、氯化钙1g/L；121-123℃温度下灭菌处理25min；
3)二级种子培养
转移到二级种子罐中，在二级种子罐中培养6～8h，其中温度28～30℃,风量1：0.6～1：0.8，罐压0.03～0.05Mpa；
二级种子培养基为：甜菜糖100g/L、玉米蛋白粉25g/L、玉米浆25g/L、KCl 2g/L、硫酸铵10g/L、硫酸镁2g/L、磷酸氢二钾12g/L、氯化钙1g/L；121-123℃温度下灭菌处理25min；
4)接种
将二级种子培养后的菌种用无菌水制成含量为107个/mL的孢子悬液，然后以20～30％的接种量接种到灭菌的发酵培养基中；
5)发酵生产
在50L发酵罐中，温度28～30℃、罐压0.02～0.05Mpa、风量1：0.6～1：0.8、溶氧≧30％、pH4.8～5.0的条件下发酵180～210小时，在发酵过程中通过添加氨水调控pH；
在发酵过程中添加营养液B，营养液B的成分及组成为纤维二糖10～15g/L、反玉米素0.2g/L、甜菜碱15g/L、玉米浆1.5g/L、栀子苷0.15g/L、碳酸氢钠0.02g/L、氧化镁0.02g/L；
营养液B的添加量为发酵培养基起始总重量的20％；
发酵过程的第3小时，加入营养液B总量的25％；发酵过程的第18小时，加入营养液B总量的35％；发酵过程的第60小时，加入营养液B总量的20％；发酵过程的第96小时，加入营养液B总量的20％；
发酵培养基的组成为：甜菜糖50g/L、玉米蛋白粉25g/L、KCl 1g/L、硫酸铵5g/L、硫酸镁1g/L、磷酸氢二钾6g/L、玉米浆25g/L、氯化钙0.5g/L、硫酸亚铁0.17g/L、氯化钴0.015g/L、硫酸锰0.02g/L；121-123℃温度下灭菌处理25min；121-123℃温度下灭菌处理25min。
6)将所得发酵液进行离心，取上清液测纤维素酶、木聚糖酶、中温淀粉酶、蛋白酶的酶活，以及VB12的含量，结果列于表1。
表1 50L发酵罐的发酵生产结果
Figure GDA0003022771190000171
Figure GDA0003022771190000181
如上表所示，实施例1～7与对比例1～2相比，不仅纤维素酶、木聚糖酶、中温淀粉酶、蛋白酶的酶活，以及VB12的含量均有所提高，其中VB12的含量最高提高了约102％。并且减小了复合酶中各酶的酶活差异，如对比例1中，木聚糖酶的酶活高达2632，而纤维素酶仅有863，相差1769。由此可见，本发明实施例提供的采用好食脉孢菌同时生产复合酶和VB12的发酵方法，通过对发酵方法的改进和调整，同时提高了复合酶中各酶的酶活及VB12的含量，且各酶的酶活之间比例适宜，使得得到的复合酶可用作饲料复合酶，用于提高饲料利用率；而VB12的含量较高，使得发酵液在提取分离复合酶后，可用于饲料，也可作为VB12源用于提取分离纯的VB12，降低了VB12的生产成本。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应所述以权利要求的保护范围为准。

Claims (7)

1.一种好食脉孢菌生产复合酶并联产维生素B12的发酵方法，其特征在于，所述复合酶包括纤维素酶、木聚糖酶、中温淀粉酶、蛋白酶；
所述方法包括以下步骤：
1)选取菌种
所述好食脉孢菌的保藏编号为CICC12001；
2)一级种子培养
将菌种转移到一级种子罐中，在一级种子罐中培养20～24h，其中，温度28～30℃，风量1:0.6～1：0.8，罐压0.03～0.05Mpa；
一级种子培养基的组成为：甜菜糖100g/L、玉米蛋白粉25g/L、玉米浆25g/L、KCl 2g/L、硫酸铵10g/L、硫酸镁2g/L、磷酸氢二钾12g/L、氯化钙1g/L；121-123℃温度下灭菌处理25min；
3)二级种子培养
在二级种子罐中培养6～8h，其中温度28～30℃，风量1：0.6～1：0.8，罐压0.03～0.05Mpa；
二级种子培养基为：甜菜糖100g/L、玉米蛋白粉25g/L、玉米浆25g/L、KCl 2g/L、硫酸铵10g/L、硫酸镁2g/L、磷酸氢二钾12g/L、氯化钙1g/L；121-123℃温度下灭菌处理25min；
4)接种
将二级种子培养后的菌种用无菌水制成含量为107个/mL的孢子悬液，接种到发酵罐中的发酵培养基中；
5)发酵生产
在温度28～30℃、罐压0.02～0.05Mpa、风量1：0.6～1：0.8、溶氧≧30％、pH4.8～5.0的条件下发酵180～210小时，其中，在发酵过程中通过添加氨水调控pH，在发酵过程中添加营养液A或营养液B，营养液A的成分及组成主要为槐糖40～50g/L、甜菜碱15～28g/L、玉米浆1.1～2.0g/L；营养液B的成分及组成为纤维二糖10～15g/L、反玉米素0.1～0.5g/L、甜菜碱12～21g/L、玉米浆1.5～2.5g/L、栀子苷0.12～0.36g/L、碳酸氢钠0.01～0.03g/L、氧化镁0.01～0.03g/L；
其中，营养液A或营养液B分为四个阶段在发酵过程的第3小时、第18小时、第60小时、第96小时添加到发酵罐中；
发酵培养基的组成为：甜菜糖50g/L、玉米蛋白粉25g/L、KCl 1g/L、硫酸铵5g/L、硫酸镁1g/L、磷酸氢二钾6g/L、玉米浆25g/L、氯化钙0.5g/L、硫酸亚铁0.17g/L、氯化钴0.015g/L、硫酸锰0.02g/L；121-123℃温度下灭菌处理25min。
2.根据权利要求1所述的一种好食脉孢菌生产复合酶并联产维生素B12的发酵方法，其特征在于，在发酵过程中添加营养液A，营养液A的添加量为发酵培养基起始总重量的40％～62％。
3.根据权利要求2所述的一种好食脉孢菌生产复合酶并联产维生素B12的发酵方法，其特征在于，营养液A的添加分为四个阶段：第一阶段为发酵过程的第3小时，加入营养液A总量的20％；第二阶段为发酵过程的第18小时，加入营养液A总量的50％；第三阶段为发酵过程的第60小时，加入营养液A总量的20％；第四阶段为发酵过程的第96小时，加入营养液A总量的10％。
4.根据权利要求1所述的一种好食脉孢菌生产复合酶并联产维生素B12的发酵方法，其特征在于，所述营养液A的成分及组成还包括反玉米素0.1g/L。
5.根据权利要求1所述的一种好食脉孢菌生产复合酶并联产维生素B12的发酵方法，其特征在于，在发酵过程中添加营养液B，营养液B的添加量为发酵培养基起始总重量的10～20％。
6.根据权利要求4所述的一种好食脉孢菌生产复合酶并联产维生素B12的发酵方法，其特征在于，营养液B的添加分为四个阶段：第一阶段为发酵过程的第3小时，加入营养液B总量的25％；第二阶段为发酵过程的第18小时，加入营养液B总量的35％；第三阶段为发酵过程的第60小时，加入营养液B总量的20％；第四阶段为发酵过程的第96小时，加入营养液B总量的20％。
7.根据权利要求1～5任一项所述的一种好食脉孢菌生产复合酶并联产维生素B12的发酵方法，其特征在于，在一级种子培养之前还包括斜面培养，所述斜面培养包括：将菌种移接在斜面培养基上，置于恒温培养箱中28℃下培养3天；
斜面培养基的组成为：马铃薯200g/L、葡萄糖20g/L、琼脂17g/L、pH自然；121℃灭菌30min。
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