CN104830736A - 一株戊糖片球菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一株戊糖片球菌及其应用。所述的戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus CS1406）保藏编号为CCTCC NO:M2015169，通过该菌株发酵或其游离细胞生物转化小麦胚芽中的对苯醌糖苷，生产2,6-二甲氧基对苯醌。本发明的戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）CS1406来源于传统自然发酵食品，属于公认安全微生物。该菌株易于培养和保藏，通过发酵小麦胚芽所得2,6-二甲氧基对苯醌为942.1μg/g。该发明为提高小麦胚芽的生物利用度提供新途径，具有重要应用前景。

Description

一株戊糖片球菌及其应用

技术领域

本发明涉及一株戊糖片球菌CS1406（Pediococcus pentosaceus CS1406）菌株，及其在生物转化小麦胚芽产2，6-二甲氧基对苯醌中的应用，属于工业微生物领域技术。

背景技术

醌类化合物是指分子中具有不饱和环二酮结构的一类天然色素有机化合物，主要分为苯醌、萘醌、菲醌和蒽醌四种类型。醌类化合物具有致泻、抗菌、止血、扩张冠状动脉及驱虫，缓解痉挛等生物活性，广泛存在于蓼科、茜草科、豆科、百合科芦荟、唇形科及一些低等植物中。研究结果表明，1, 4-对苯醌是一种具有广谱抗菌活性的化合物, 在很低浓度下即可杀灭多种致病性细菌、真菌等；在体外对多种肿瘤细胞具有很高的细胞毒作用，被认为是某些植物药具有的抗菌、抗肿瘤作用的活性成分之一，存在于许多昆虫和植物中。

小麦是世界上种植最广泛的粮食作物。小麦籽粒由果皮、种皮、糊粉层、胚乳及胚芽组成，小麦胚芽占小麦籽粒的3%左右，是小麦籽粒的生命源泉，是整个麦粒营养价值最高的部分，含有极丰富且优质的蛋白质、脂肪、多种维生素、矿物质及一些微量生理活性成分。上世纪90年代，匈牙利研究人员利用小麦胚芽发酵制备出一种抗癌辅助制剂Avemar，该制剂对人类多种癌症如结肠癌、宫颈癌等均具有显著抑制作用。小麦胚芽中主要抗癌活性成分为2-甲氧基对苯醌（2-MBQ）和2,6-二甲氧基对苯醌（2,6-DMBQ），通常与低聚糖结合成糖基化对苯醌。该化合物不能通过小肠壁被吸收，而是通过结肠中微生物源β-葡糖苷酶水解释放出来，发挥其生理活性。因此，如果能在体外有效地水解小麦胚芽中糖基型化合物，就可以显著增强小麦胚芽的生理活性。而酶水解有其独特的优势，不仅水解条件温和，而且多采用弱酸性缓冲溶液，且小麦胚芽中生理活性物质不易变性。目前获得高活性的β-葡糖苷酶主要有两种途径，一是来源于植物，二是来源于微生物。产β-葡糖苷酶的微生物包括细菌、酵母和霉菌。不同微生物源的β-葡糖苷酶具有底物选择性，微生物产生的β-葡糖苷酶属纤维素酶系中的一个组分，水解纤维素的β-葡糖苷酶能否水解植物中的糖缀合物，有关这方面的系统研究尚未见报道。

发明内容

本发明的一个目的是提供一株戊糖片球菌CS1406（Pediococcus pentosaceusCS1406） 菌株。为了实现本发明的技术目的，本发明采用的技术方案是：

一株戊糖片球菌CS1406（Pediococcus pentosaceus CS1406），保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国.武汉.武汉大学，保藏编号CCTCC NO: M 2015169，保藏日期2015年3月27日。

上述菌株由常熟理工学院发酵工程中心从自然发酵全麦面团中分离获得。

本发明的戊糖片球菌CS1406的生物学性质如下：

形态学特征：在MRS固体培养基上形成明显的菌落，37℃培养3天，圆形菌落，乳白色，光滑，凸起，边缘整齐，不透明，粘稠，革兰氏阳性，细胞球状，直径0.8~1.0μm。

培养特征：最适生长温度35～37℃，兼性厌氧，厌氧时生长良好；最适生长pH6.8～7.2。

本发明菌株在分离筛选时所用的富集培养基为5°Be′的麦芽汁培养基；分离培养基组成为：蛋白胨10 g/L，牛肉膏10 g/L，酵母膏5 g/L，葡萄糖20 g/L，吐温-80 10 g/L，磷酸氢二钾20 g/L，醋酸钠5 g/L，柠檬酸二铵2 g/L，硫酸镁0.5 g/L，硫酸锰0.25 g/L，碳酸钙20 g/L，水1L，pH6.2～6.4；菌株保藏在4℃冰箱中，培养基为MRS固体斜面培养基。

本发明另一个目的是提供利用戊糖片球菌CS1406水解小麦胚芽糖苷，生产2,6-二甲氧基对苯醌中的应用。

本发明所述的戊糖片球菌CS1406在以脱脂小麦胚芽为转化底物，通过发酵法生物转化制备2,6-二甲氧基对苯醌。具体的应用方如下步骤：

（1）将菌株Pediococcus pentosaceus CS1406接种至Elliker液体培养基中，37℃，静止培养2～3d，

（2）将步骤（1）所培养菌株接入发酵培养基中，30～37℃,静止条件下发酵2～3d；发酵液进行离心，弃除沉淀，取上清液分离纯化得到2,6-二甲氧基对苯醌。

进一步的，所述的步骤（2）发酵培养是在35℃下进行，培养时间3d。

进一步的，所述的发酵培养基成分为：

蛋白胨10 g/L，牛肉膏10 g/L，酵母膏5 g/L，葡萄糖20 g/L，吐温-80 10 g/L，磷酸氢二钾20 g/L，醋酸钠5 g/L，柠檬酸二铵2 g/L，硫酸镁0.5 g/L，硫酸锰0.25 g/L，小麦胚芽粉75g，水1L，pH6.5～7.0。

又或者所述的应用包括如下步骤：

（1）将Pediococcus pentosaceus CS1406接种至Elliker液体培养基中，35～37℃,静止条件下发酵3～4d；发酵液进行离心，弃除上清液，收集湿菌体作为游离细胞；

（2）将步骤(1)液体发酵所得湿菌体1～10g，加入到50mL7.5%（w/w）的小麦胚芽溶液中，混匀，控制温度30～37℃，搅拌转速120r/min, 进行游离细胞转化反应1～10h；转化液进行离心，弃除沉淀，取上清液分离纯化得到2,6-二甲氧基对苯醌。

     进一步的，所述的步骤(2)反应温度为35℃，转化反应时间7h。

 本发明的有益效果在于：

本发明提供了一种戊糖片球菌，以戊糖片球菌为出发菌株生物催化小麦胚芽制备2,6-二甲氧基对苯醌；该菌株来源于传统的自然发酵食品，属于公认安全菌种，可以在食品中应用；该菌株在MRS固体培养基上生长良好，容易培养和保存，通过发酵所得的对苯醌含量可达942.1μg/g。

附图说明

图1为2,6-二甲氧基对苯醌标准品HPLC图谱。

图2为发酵液中2,6-二甲氧基对苯醌的HPLC图谱。

本发明涉及的生物材料，其分类命名为：戊糖片球菌CS1406（Pediococcus pentosaceus CS1406），保藏于中国典型培养物保藏中心（简称CCTCC），地址：中国.武汉.武汉大学，保藏编号CCTCC NO: M 2015169，保藏日期2015年3月27日。

具体实施方式

实施例1

本实施例说明戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）CS1406的筛选纯化及鉴定方法。

1、菌株的选育

用于菌株筛选的自然发酵全麦面团采自山东、河南等地。称取25g样品，无菌条件下，加入盛有225 mL麦芽汁的三角瓶中，25～28℃富集培养24 h。吸取1 mL培养液进行梯度稀释，稀释液均匀地涂布于已凝固的Elliker分离培养基上，35～37℃保温培养3～4天，挑取培养基中肉眼可见的菌落，进一步涂布于MRS固体培养基上，继续在35～37℃保温培养2～3天，直至获得单一菌落，转移至MRS固体斜面保藏培养基上。所述的Elliker分离培养基终浓度组成为：胰蛋白胨20.0g/L，酵母膏5.0g/L，明胶2.5g/L，葡萄糖5.0g/L，乳糖5.0g/L，蔗糖5.0g/L，氯化钠4.0g/L,乙酸钠1.5g/L，抗坏血酸0.5 g/L，琼脂2.0 g/L，pH6.8，水补足为1000mL；MRS固体培养基终浓度组成为：蛋白胨10 g/L，牛肉膏10 g/L，酵母膏5 g/L，葡萄糖20 g/L，吐温-80 10 g/L，磷酸氢二钾20 g/L，醋酸钠5 g/L，柠檬酸二铵2 g/L，硫酸镁0.5 g/L，硫酸锰0.25 g/L，琼脂2.0 g/L，pH6.5～7.0，水补足1000mL。

2、目标菌株的筛选

将初筛菌种接种至Elliker液体培养基进行活化，然后将种子培养液按5～10%接种量接入发酵培养基中，37℃、静止条件下发酵3d。发酵液进行离心，弃除沉淀，取上清液，用50ml氯仿萃取3次，萃取液减压蒸发浓缩，得到2,6-二甲氧基对苯醌粗品。浓缩物再用5ml甲醇溶解，用0.22μm滤膜过滤，采用高效液相色谱测定发酵产物中 2,6-二甲氧基对苯醌生成量，选择一株2,6-二甲氧基对苯醌产量高的酵母菌株为目标菌株。所述的发酵培养基终浓度组成为：蛋白胨10 g/L，牛肉膏10 g/L，酵母膏5 g/L，葡萄糖20 g/L，吐温-80 10 g/L，磷酸氢二钾20 g/L，醋酸钠5 g/L，柠檬酸二铵2 g/L，硫酸镁0.5 g/L，硫酸锰0.25 g/L，小麦胚芽粉75g，水1000mL，pH6.5～7.0。

3、菌株的鉴定

对上述菌株的16SrDNA部分的序列的测定及比对分析，鉴定为戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）CS1406，经微生物保藏程序的鉴定和保藏，将其分类命名为（Pediococcus pentosaceus）CS1406，其保藏编号为CCTCC M 2015169。

实施例2

本实施例说明戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）CS1406的培养及生物转化制备2,6-二甲氧基对苯醌中的应用。

从MRS斜面培养基上挑取1环菌接入Elliker液体培养基中，37℃，静止培养2d，将种子培养液按5%接种量接入发酵培养基中，37℃、静止条件下发酵4d。发酵液进行离心，弃除沉淀，取上清液，用50ml氯仿萃取3次，萃取液减压蒸发浓缩，得到2,6-二甲氧基对苯醌粗品。浓缩物再用5ml甲醇溶解，用0.22μm滤膜过滤，采用高效液相色谱法测定发酵产物中 2,6-二甲氧基对苯醌生成量893.0μg/g。

实施例3

本实施例说明戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）CS1406的培养及生物转化制备2,6-二甲氧基对苯醌中的应用。

从MRS斜面培养基上挑取1环菌接入Elliker液体培养基中，37℃，静止培养2d，将种子培养液按10%接种量接入发酵培养基中，35℃、静止条件下发酵3d。发酵液进行离心，弃除沉淀，取上清液，用50ml氯仿萃取3次，萃取液减压蒸发浓缩，得到2,6-二甲氧基对苯醌粗品。浓缩物再用5ml甲醇溶解，用0.22μm滤膜过滤，采用高效液相色谱法测定发酵产物中 2,6-二甲氧基对苯醌生成量942.1μg/g。

实施例4

本实施例说明戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）CS1406游离细胞生物转化制备2,6-二甲氧基对苯醌中的应用。

从MRS斜面培养基上挑取1环菌接入Elliker液体培养基中，37℃，静止培养3d发酵液进行离心，弃除上清液，收集湿菌体。在50mL7.5%（w/w）的小麦胚芽溶液中加入10g湿菌体，混匀，控制温度35℃，搅拌转速50r/min, 进行转化反应7h。反应液进行离心，弃除沉淀，取上清液，采用高效液相色谱法测定转化液中 2,6-二甲氧基对苯醌生成量为681.5μg/g。

实施例5

从MRS斜面固体培养基上挑取1环菌接入Elliker液体培养基中，37℃，静止培养3d。发酵液进行离心，弃除上清液，收集湿菌体。在50mL7.5%（w/w）的小麦胚芽溶液中加入1g湿菌体，混匀，控制温度37℃，搅拌转速120r/min, 进行转化反应5h。反应液进行离心，弃除沉淀，取上清液，采用高效液相色谱法测定转化液中 2,6-二甲氧基对苯醌生成量为317.2μg/g。

HPLC测定条件为：流动相为75%甲醇溶液，流速0.8mL/min，检测波长288nm，柱温30℃，进样量10μL，进样前用0.22μm滤膜过滤。其检测图谱如附图1和2所示。

Claims (7)

1.一株戊糖片球菌，其特征在于，其分类命名为Pediococcus pentosaceus CS1406，保藏编号为CCTCC NO: M2015169。

2.根据权利要求1所述的Pediococcus pentosaceus CS1406在发酵生产2,6-二甲氧基对苯醌中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的应用包括如下步骤：

（1）将菌株Pediococcus pentosaceus CS1406接种至Elliker液体培养基中，37℃，静止培养2～3d，

（2）将步骤（1）所培养菌株接入发酵培养基中，30～37℃,静止条件下发酵2～3d；发酵液进行离心，弃除沉淀，取上清液分离纯化得到2,6-二甲氧基对苯醌。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于所述的步骤（2）发酵培养是在35℃下进行，培养时间3d。

5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的发酵培养基成分为：

蛋白胨10 g/L，牛肉膏10 g/L，酵母膏5 g/L，葡萄糖20 g/L，吐温-80 10 g/L，磷酸氢二钾20 g/L，醋酸钠5 g/L，柠檬酸二铵2 g/L，硫酸镁0.5 g/L，硫酸锰0.25 g/L，小麦胚芽粉75g，水1L，pH6.5～7.0。

6. 根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的应用包括如下步骤：

（1）将Pediococcus pentosaceus CS1406接种至Elliker液体培养基中，35～37℃,静止条件下发酵3～4d；发酵液进行离心，弃除上清液，收集湿菌体作为游离细胞；

（2）将步骤(1)液体发酵所得湿菌体1～10g，加入到50mL7.5%（w/w）的小麦胚芽溶液中，混匀，控制温度30～37℃，搅拌转速120r/min, 进行游离细胞转化反应1～10h；转化液进行离心，弃除沉淀，取上清液分离纯化得到2,6-二甲氧基对苯醌。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于所述的步骤(2)反应温度为35℃，转化反应时间7h。