CN105838654B - 一种嗜酸乳杆菌高密度液体培养方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种嗜酸乳杆菌高密度液体培养方法，包括以下步骤：将嗜酸乳杆菌经过三角瓶培养基以及种子罐培养基扩繁后进入发酵罐，发酵18h，培养温度为35℃，搅拌转速200rpm，pH采用2mol/L的NaOH通过种子罐补碱泵自动控制在7.3，并且通入氮气与氢气的混合气体(氮气体积/氢气体积＝10：1)维持发酵罐压力0.05MPa，期间每隔30min取样一次并检查葡萄糖残余浓度，通过发酵罐上的补料泵补充葡萄糖维持发酵罐内葡萄糖浓度2g/L。本发明方法通过控制葡萄糖浓度来协调菌体生长，并且合适的pH值与还原性气体氢气的浓度，有效的提高了嗜酸乳杆菌的培养浓度。

Description

一种嗜酸乳杆菌高密度液体培养方法
技术领域
本发明属于生物技术中的发酵工艺领域，涉及一种嗜酸乳杆菌高密度液体培养方法。
背景技术
嗜酸乳杆菌是乳酸菌的一种，对人体和动物健康有益的微生物，在自然界中广泛存在。嗜酸乳杆菌在食品行业主要用于酸奶、奶粉、饮料等行业添加，同时可以用于医药领域，在动物饲料领域可以作为动物饲料添加剂。由于嗜酸乳杆菌能定值与大多数动物体内，其能分泌的多种抗菌物质可以减少致病菌的繁殖，其分泌的多糖类物质可以提高动物机体免疫，所以应用广泛，在保证人类健康，动物减少抗生素用量等方面具有积极的意义。
嗜酸乳杆菌的高密度液体培养受到培养基、以及培养条件的限制，如发酵过程中产生大量的乳酸以及抗菌物质抑制自身的繁殖，如何通过对培养基优化降低原材料成本，以及工艺的优化克服嗜酸乳杆菌在增殖过程中分泌乳酸和抗菌物质，从而实现更加高密度的培养方式具有重要的社会和经济价值。
发明内容
本发明的目的是提供一种嗜酸乳杆菌高密度液体培养方法，以解决现有技术中存在的问题。
为达到上述目的，本发明采用的技术方案是：一种嗜酸乳杆菌高密度液体培养方法，包括如下步骤：
A)三角瓶种子培养
将MRS平板培养24小时的嗜酸乳杆菌(中国工业微生物菌种保藏管理中心，CICC6074)接种一个菌落进入250ml三角瓶培养基中，所述三角瓶培养基装瓶量为0.8(培养基体积/三角瓶容积)，灭菌消毒温度为115℃，20min，接种嗜酸乳杆菌后，培养条件为36℃静止培养18h，即为种子液。
B)种子罐培养
种子罐体积为8L，装载种子罐培养基5.6L，灭菌消毒温度为115℃，20min；将三角瓶种子培养得到的所述种子液按照3％的接种体积比(即168ml)接种进入种子罐，发酵培养条件为36℃，搅拌转速100rpm，pH采用2mol/L的NaOH通过种子罐补碱泵自动控制在7.3，并且通入氮气与氢气的混合气体(氮气体积/氢气体积＝10：1)维持种子罐压力在0.05MPa，培养17h，即一级种子液。
C)发酵罐培养
发酵罐体积为200L，装载发酵罐培养基120L，灭菌消毒温度为115℃，20min；将种子罐培养得到的所述一级种子液全部泵入发酵罐，发酵培养条件为35℃，搅拌转速200rpm，pH采用2mol/L的NaOH通过种子罐补碱泵自动控制在7.3，并且通入氮气与氢气的混合气体(氮气体积/氢气体积＝10：1)维持发酵罐压力在0.05MPa，培养18h，期间每隔30min取样一次并检查葡萄糖残余浓度，通过发酵罐上的补料泵补充葡萄糖维持发酵罐内葡萄糖浓度在2g/L。
优选地，所述三角瓶培养基的配方为：乳清粉10g/L，豆粕粉20g/L，葡萄糖20g/L，MgSO4·7H2O 1.0g/L，Tween-80 1.0g/L，ZnSO4·7H2O 0.01g/L，MnSO4·6H2O 0.06g/L。
优选地，所述种子罐培养基的配方为：乳清粉10g/L，豆粕粉20g/L，葡萄糖20g/L，MgSO4·7H2O 1.0g/L，Tween-80 1.0g/L，ZnSO4·7H2O 0.01g/L，MnSO4·6H2O 0.06g/L。
优选地，所述发酵罐培养基的配方为：乳清粉10g/L，豆粕粉30g/L，葡萄糖5g/L，MgSO4·7H2O 1.0g/L，Tween-80 1.0g/L，ZnSO4·7H2O 0.01g/L，MnSO4·6H2O 0.06g/L。
与现有技术相比，本发明方法通过控制葡萄糖浓度来协调菌体生长，并且合适的pH值与还原性气体氢气的浓度，有效的降低了发酵液中抑菌物质丙酸、醋酸浓度(1.2g/L，1.4g/L)，提高了嗜酸乳杆菌的培养浓度。
附图说明
图1是本发明的发酵工艺流程图；
图2是本发明发酵罐中嗜酸乳杆菌的增殖进程图；
图3是本发明方法与现有技术方法培养18h后发酵液中丙酸、醋酸、乳酸的含量对比。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明一种嗜酸乳杆菌高密度液体培养方法作进一步的详细说明。
一种嗜酸乳杆菌高密度液体培养方法，包括如下步骤：
A)三角瓶种子培养
将MRS平板培养24小时的嗜酸乳杆菌(中国工业微生物菌种保藏管理中心，CICC6074)接种一个菌落进入250ml三角瓶培养基中，所述三角瓶培养基装瓶量为0.8(培养基体积/三角瓶容积)，灭菌消毒温度为115℃，20min，接种嗜酸乳杆菌后，培养条件为36℃静止培养18h，即为种子液；所述三角瓶培养基的配方为：乳清粉10g/L，豆粕粉20g/L，葡萄糖20g/L，MgSO4·7H2O1.0g/L，Tween-80 1.0g/L，ZnSO4·7H2O 0.01g/L，MnSO4·6H2O0.06g/L。
B)种子罐培养
种子罐体积为8L，装载种子罐培养基5.6L，灭菌消毒温度为115℃，20min；将三角瓶种子培养得到的所述种子液按照3％的接种体积比(即168ml)接种进入种子罐，发酵培养条件为36℃，搅拌转速100rpm，pH采用2mol/L的NaOH通过种子罐补碱泵自动控制在7.3，并且通入氮气与氢气的混合气体(氮气体积/氢气体积＝10：1)维持种子罐压力在0.05MPa，培养17h，即一级种子液；所述种子罐培养基的配方为：乳清粉10g/L，豆粕粉20g/L，葡萄糖20g/L，MgSO4·7H2O 1.0g/L，Tween-80 1.0g/L，ZnSO4·7H2O 0.01g/L，MnSO4·6H2O0.06g/L。
C)发酵罐培养
发酵罐体积为200L，装载发酵罐培养基120L，灭菌消毒温度为115℃，20min；将种子罐培养得到的所述一级种子液全部泵入发酵罐，发酵培养条件为35℃，搅拌转速200rpm，pH采用2mol/L的NaOH通过种子罐补碱泵自动控制在7.3，并且通入氮气与氢气的混合气体(氮气体积/氢气体积＝10：1)维持发酵罐压力在0.05MPa，培养18h，期间每隔30min取样一次并检查葡萄糖残余浓度，通过发酵罐上的补料泵补充葡萄糖维持发酵罐内葡萄糖浓度在2g/L；所述发酵罐培养基的配方为：乳清粉10g/L，豆粕粉30g/L，葡萄糖5g/L，MgSO4·7H2O1.0g/L，Tween-80 1.0g/L，ZnSO4·7H2O 0.01g/L，MnSO4·6H2O0.06g/L。
D)将上述每隔30min获得样品进行MRS平板计数培养，并绘制成其发酵生长曲线，在18h结束时菌体浓度最高达到了8×1010cfu/mL的菌体浓度(见图2)。
E)对发酵液中丙酸、醋酸、乳酸进行测定分析，测定方法参照国标GB2023-80，GB/T1628.3-2000，GB/T17815-1999；对照组(A组)采用常规方法培养，培养基为MRS培养基，37℃静止培养18h；结果参见图3，其中A组为现有技术方法，B组为本发明方法。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围的内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求所界定的保护范围为准。

Claims (1)

1.一种嗜酸乳杆菌高密度液体培养方法，其特征在于，包括如下步骤：
A)三角瓶种子培养
将MRS平板培养24小时的嗜酸乳杆菌接种一个菌落进入250ml三角瓶培养基中，所述嗜酸乳杆菌来自中国工业微生物菌种保藏管理中心，CICC6074，所述三角瓶培养基装瓶量为0.8，即培养基体积/三角瓶容积＝0.8，灭菌消毒温度为115℃，20min，接种嗜酸乳杆菌后，培养条件为36℃静止培养18h，即为种子液；所述三角瓶培养基的配方为：乳清粉10g/L，豆粕粉20g/L，葡萄糖20g/L，MgSO4·7H2O 1.0g/L，Tween-80 1.0g/L，ZnSO4·7H2O 0.01g/L，MnSO4·6H2O 0.06g/L；
B)种子罐培养
种子罐体积为8L，装载种子罐培养基5.6L，灭菌消毒温度为115℃，20min；将三角瓶种子培养得到的所述种子液按照3％的接种体积比接种进入种子罐，发酵培养条件为36℃，搅拌转速100rpm，pH采用2mol/L的NaOH通过种子罐补碱泵自动控制在7.3，并且通入氮气体积/氢气体积＝10：1的混合气体维持种子罐压力在0.05MPa，培养17h，即一级种子液；所述种子罐培养基的配方为：乳清粉10g/L，豆粕粉20g/L，葡萄糖20g/L，MgSO4·7H2O 1.0g/L，Tween-80 1.0g/L，ZnSO4·7H2O 0.01g/L，MnSO4·6H2O 0.06g/L；
C)发酵罐培养
发酵罐体积为200L，装载发酵罐培养基120L，灭菌消毒温度为115℃，20min；将种子罐培养得到的所述一级种子液全部泵入发酵罐，发酵培养条件为35℃，搅拌转速200rpm，pH采用2mol/L的NaOH通过种子罐补碱泵自动控制在7.3，并且通入氮气体积/氢气体积＝10：1的混合气体维持发酵罐压力在0.05MPa，培养18h，期间每隔30min取样一次并检查葡萄糖残余浓度，通过发酵罐上的补料泵补充葡萄糖维持发酵罐内葡萄糖浓度在2g/L；所述发酵罐培养基的配方为：乳清粉10g/L，豆粕粉30g/L，葡萄糖5g/L，MgSO4·7H2O 1.0g/L，Tween-801.0g/L，ZnSO4·7H2O 0.01g/L，MnSO4·6H2O 0.06g/L。
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