CN106350473A - 一种饲用短乳杆菌的高密度发酵培养基及其发酵方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种饲用短乳杆菌的高密度发酵培养基及其发酵方法，属于益生菌发酵领域。短乳杆菌ZLB004在优化的高密度发酵培养基和发酵条件下，采用pH恒定控制补加葡萄糖策略，发酵液活菌数可达1010CFU/mL以上，较普通MRS培养基和常规方法培养的活菌数提高20倍以上，实现了短乳杆菌的高密度发酵，从而可以减少培养体积，降低生产成本，提高生产效率。

Description

一种饲用短乳杆菌的高密度发酵培养基及其发酵方法
技术领域
本发明涉及一种饲用短乳杆菌的高密度发酵培养基及其发酵工艺，属于益生菌发酵领域。
背景技术
短乳杆菌(Lactobacillus brevis)是普遍存在于人和动物肠道的有益乳酸杆菌，也是乳酸菌属中重要的种群之一，具有高产酸、解毒、抑菌和提高机体免疫能力等多种特性，在维持胃肠道微生态平衡、促进营养消化吸收、抑制致病菌感染及免疫调节、提高动物生长性能等方面具有重要作用。短乳杆菌ZLB004(L.brevis ZLB004)是分离自健康断奶仔猪肠黏膜中的一株优良益生菌，具有良好的耐酸性及胆盐耐受性，动物试验表明该菌在促进生长猪生长性能、改善肠道菌群及提高机体免疫力等方面具有良好的效果(刘辉等，2013，2015；liu等，2015)。
乳酸菌的培养一般采用液体培养基，但采用常规方法培养得到的发酵液中的菌体密度较低，一般只能达到107～109CFU/mL。其原因是，乳酸菌对营养物质和培养条件要求较高，并且在发酵过程中不断消耗营养底物和产生有机酸等代谢产物，抑制了菌体的生长繁殖。采用高密度发酵的方法，可以提高乳酸菌的菌体密度，从而可以减少培养体积或减少发酵次数，缩短生产周期，降低生产成本和提高生产效率。
发明内容
(一)要解决的技术问题
本发明的目的在于提供一种饲用短乳杆菌高密度发酵培养基。
本发明的另一目的是提供该高密度发酵培养基的发酵方法。
(二)技术方案
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
本发明提供一种短乳杆菌高密度发酵培养基，高密度发酵培养基的主要组成及含量比例如下：葡萄糖30～40g，牛肉蛋白胨30～40g，牛肉膏9～10g，酵母浸粉3.5～4.5g，乙酸钠4～6g，K2PO4·3H2O 1～3g，柠檬酸氢二铵1～3g，ZnSO4·7H2O 0.3～0.5g，MnSO4·H2O0.1～0.3g，吐温-80 1mL，蒸馏水1000mL。
优选地，所述短乳杆菌高密度发酵培养基其组成及含量比例如下：葡萄糖35g，牛肉蛋白胨35g，牛肉膏9.5g，酵母浸粉4g，乙酸钠5g，K2PO4·3H2O 2g，柠檬酸氢二铵2g，ZnSO4·7H2O 0.4g，MnSO4·H2O 0.2g，吐温-80 1mL，蒸馏水1000mL。
上述的饲用短乳杆菌高密度发酵培养基可用于短乳杆菌发酵，尤其是短乳杆菌ZLB004，保藏号为：CGMCC No.5760。
本发明还提供上述培养基的制备方法，其是将发酵培养基各成份按比例配制，混合均匀后调pH至6.5，高温灭菌。高温灭菌可按照本领域的常规方法进行。优选例如121℃灭菌15分钟。
本发明还提供一种短乳杆菌高密度发酵方法，其包括如下步骤：
(1)菌种的活化，将保藏的菌种于MRS液体培养基中培养活化；
(2)按上述方法制备发酵培养基；
(3)发酵：在发酵罐中装入50％-70％所述发酵培养基，接种5％-10％(V/V)种子液，控制罐温35～39℃，转速50-100rpm，维持恒定pH 5.2-5.5；当发酵至16-20小时时开始补料，向发酵罐中一次加入20mL补料液，之后每隔2小时进行一次补料，共补料5次；
(4)终止发酵：当发酵液pH不再降低时，终止发酵。
其中，步骤(1)菌种的活化方法是：将-80℃保藏的菌种接种于10mLMRS液体培养基中，37℃培养24小时后，以1％接种量转接于MRS液体培养基中，培养18～24小时，传代培养2次得到活化的菌种，
MRS液体培养基组成如下：葡萄糖20g，蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母浸粉5g，乙酸钠5g，K2HPO4·3H2O 2g，柠檬酸氢二铵2g，MgS04·7H2O 0.58g，MnS04·H2O 0.19g，吐温-801mL，蒸馏水1000m1，pH 6.5，121℃灭菌15分钟。
其中，步骤(3)维持pH保持5.2-5.5是通过流加中和剂的方法进行控制的，所述中和剂是25％的氨水溶液。
其中，步骤(3)补料液的成分为葡萄糖溶液，其浓度为700g/L。
当发酵液pH不再降低时，终止发酵，得到短乳杆菌的高密度发酵液。发酵活菌数可以达到1010CFU/mL以上。
本发明的高密度发酵培养基及其发酵方法适用于其它乳酸菌，但为达到最好的发明效果，优选适用于短乳杆菌ZLB004(Lactobacillus brevis ZLB004)。本发明的短乳杆菌ZLB004(Lactobacillus brevis ZLB004))是分离自健康断奶仔猪肠黏膜中的一株优良益生菌，现保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏号为：CGMCC No.5760。
(三)有益效果
本发明采用pH恒定控制补加葡萄糖策略，能够在控制发酵液的pH的同时进行补料，从而解除乳酸的反馈抑制作用，延长了菌体生长对数期，使用本发明的高密度发酵培养基及其发酵方法发酵的短乳杆菌，菌体密度显著提高，活菌数不低于1.76×1010CFU/mL，较普通MRS培养基和常规方法培养的活菌数提高了20倍以上，实现了短乳杆菌的高密度发酵；本发明的发酵培养基及其发酵方法可以缩短生产周期，减少培养体积，从而降低生产成本、提高生产效率。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明，应理解，本发明要求保护的范围不受所述具体实施方案的限制，本发明提供的具体实施例仅作为进一步说明本发明的例子，本领域技术人员参照本案说明书的描述可以很容易对本发明的具体实施方式进行修改或者对部分技术特征进行等同替换，这些无需创造性劳动的改进和替换也应落入本发明所附权利要求书的保护范围之内。
本发明下列实施例所用的仪器型号、试剂及其来源如下：
发酵罐：Eppendorf公司BioFlo/Celligen 115型；
冷却水循环机：北京长流科学仪器公司LX-300型；
生物安全柜：新加坡艺思高科技有限公司AB2-S型；
生化培养箱：上海智城分析仪器制造有限公司ZHWY-2102型；
酵母浸粉、牛肉膏、牛肉蛋白胨购自北京奥博星生物技术责任有限公司，其他试剂均购自北京化学试剂公司。
实施例1：短乳杆菌ZLB004的高密度发酵培养基及发酵比较
1、短乳杆菌ZLB004的高密度发酵培养基组分及其含量为：
葡萄糖30g，牛肉蛋白胨30g，牛肉膏9g，酵母浸粉3.5g，乙酸钠4g，K2PO4·3H2O 1g，柠檬酸氢二铵1g，ZnSO4·7H2O 0.3g，MnSO4·H2O 0.1g，吐温-80 1mL，蒸馏水1000mL。
2、高密度发酵与常规方法发酵的比较
2.1高密度发酵主要步骤如下
(1)将-80℃保藏的短乳杆菌ZLB004菌种接种于MRS液体培养基中，37℃培养24小时后，以1％接种量转接于MRS液体培养基中，培养18小时，如此传代培养2次后得到活化的菌种；
(2)将发酵培养基各成份按比例配制，混合均匀后，用10％氢氧化钠溶液调pH至6.5，121℃下灭菌15分钟；
(3)在发酵罐中装入50％发酵培养基，以5％(V/V)的接种量将步骤(1)所得的种子液接种于步骤(2)的发酵培养基中；
(4)发酵，控制罐温35℃，转速50rpm，自动流加25％氨水溶液控制pH保持在5.2；当发酵至16h时开始补料，向发酵罐中一次加入700g/L的葡萄糖补料液20mL，之后每隔2小时进行一次补料，共补料5次；
(5)当发酵液pH不再降低，终止发酵，即得短乳杆菌活菌数达2.00×1010CFU/mL的发酵液。
2.2对照实验1：
将-80℃保藏的短乳杆菌ZLB004菌种接种于MRS液体培养基中，37℃培养24小时后，以1％接种量转接于MRS液体培养基中，培养18小时，如此传代培养2次后作为种子液，以5％接种量转接于装有50％MRS培养基的发酵罐中，35℃，转速50rpm，培养16小时，终止发酵，得到短乳杆菌活菌数为8.32×108CFU/mL。
2.3对照实验2：
将-80℃保藏的短乳杆菌ZLB004菌种接种于MRS液体培养基中，37℃培养24小时后，以1％接种量转接于MRS液体培养基中，培养18小时，如此传代培养2次后作为种子液，以5％接种量转接于装有50％MRS培养基的发酵罐中，35℃，转速50rpm，自动流加25％氨水溶液控制pH保持在5.2；当发酵至16h时开始补料，向发酵罐中一次加入700g/L的葡萄糖补料液20mL，之后每隔2小时进行一次补料，共补料5次；当发酵液pH不再降低，终止发酵，得到短乳杆菌活菌数为3.63×109CFU/mL。
2.4结果分析
应用本发明的高密度发酵培养基及其发酵方法，可以得到短乳杆菌活菌数为2.00×1010CFU/mL的发酵液，而应用常规发酵培养基(MRS培养基)及其发酵方法，得到的短乳杆菌活菌数为8.32×108CFU/mL。实验证明本发明的发酵培养基及其发酵方法得到的短乳杆菌活菌数为常规方法的24倍，实现了短乳杆菌的高密度发酵。
实施例2：短乳杆菌ZLB004的高密度发酵培养基及发酵比较
1、短乳杆菌ZLB004的高密度发酵培养基组分及其含量为：
葡萄糖40g，牛肉蛋白胨40g，牛肉膏10g，酵母浸粉4.5g，乙酸钠6g，K2PO4·3H2O3g，柠檬酸氢二铵3g，ZnSO4·7H2O 0.5g，MnSO4·H2O 0.3g，吐温-80 1mL，蒸馏水1000mL。
2、高密度发酵与常规方法发酵的比较
2.1高密度发酵主要步骤如下
(1)将-80℃保藏的短乳杆菌ZLB004菌种接种于MRS液体培养基中，37℃培养24小时后，以1％接种量转接于MRS液体培养基中，培养24小时，如此传代培养2次后得到活化的菌种；
(2)将发酵培养基各成份按比例配制，混合均匀后，用10％氢氧化钠溶液调pH至6.5，121℃下灭菌15分钟；
(3)在发酵罐中装入70％发酵培养基，以10％(V/V)的接种量将步骤(1)所得的种子液接种于步骤(2)的发酵培养基中；
(4)发酵，控制罐温39℃，转速100rpm，自动流加25％氨水溶液控制pH保持在5.5；当发酵至20小时时开始补料，向发酵罐中一次加入700g/L的葡萄糖补料液20mL，之后每隔2小时进行一次补料，共补料5次；
(5)当发酵液pH不再降低，终止发酵，即得短乳杆菌活菌数达1.76×1010CFU/mL的发酵液。
2.2对照实验1
将-80℃保藏的短乳杆菌ZLB004菌种接种于MRS液体培养基中，37℃培养24小时后，以1％接种量转接于MRS液体培养基中，培养24小时，如此传代培养2次后作为种子液，以10％接种量转接于装有70％MRS培养基的发酵罐中，39℃，转速100rpm，培养20小时，终止发酵，得到短乳杆菌活菌数为7.85×108CFU/mL。
2.3对照实验2
将-80℃保藏的短乳杆菌ZLB004菌种接种于MRS液体培养基中，37℃培养24小时后，以1％接种量转接于MRS液体培养基中，培养24小时，如此传代培养2次后作为种子液，以10％接种量转接于装有70％MRS培养基的发酵罐中，39℃，转速100rpm，自动流加25％氨水溶液控制pH保持在5.5；当发酵至20小时时开始补料，向发酵罐中一次加入700g/L的葡萄糖补料液20mL，之后每隔2小时进行一次补料，共补料5次；当发酵液pH不再降低，终止发酵，得到短乳杆菌活菌数为2.69×109CFU/mL。
2.4结果分析
应用本发明的高密度发酵培养基及其发酵方法，可以得到短乳杆菌活菌数为1.76×1010CFU/mL的发酵液，而应用常规发酵培养基(MRS培养基)及其发酵方法，得到的短乳杆菌活菌数为7.85×108CFU/mL。实验证明本发明的发酵培养基及其发酵方法得到的短乳杆菌活菌数为常规方法的22倍，实现了短乳杆菌的高密度发酵。
实施例3：短乳杆菌ZLB004的高密度发酵培养基及发酵比较
1、短乳杆菌ZLB004的高密度发酵培养基组分及其含量为：
葡萄糖35g，牛肉蛋白胨35g，牛肉膏9.5g，酵母浸粉4g，乙酸钠5g，K2PO4·3H2O 2g，柠檬酸氢二铵2g，ZnSO4·7H2O 0.4g，MnSO4·H2O 0.2g，吐温-80 1mL，蒸馏水1000mL。
2、高密度发酵与常规方法发酵的比较
2.1高密度发酵主要步骤如下
(1)将-80℃保藏的短乳杆菌ZLB004菌种接种于MRS液体培养基中，37℃培养24小时后，以1％接种量转接于MRS液体培养基中，培养21小时，如此传代培养2次后得到活化的菌种；
(2)将发酵培养基各成份按比例配制，混合均匀后，用10％氢氧化钠溶液调pH至6.5，121℃下灭菌15分钟；
(3)在发酵罐中装入60％发酵培养基，以7.5％(V/V)的接种量将步骤(1)所得的种子液接种于步骤(2)的发酵培养基中；
(4)发酵，控制罐温37℃，转速75rpm，自动流加25％氨水溶液控制pH保持在5.35；当发酵至18小时时开始补料，向发酵罐中一次加入700g/L的葡萄糖补料液20mL，之后每隔2h进行一次补料，共补料5次；
(5)当发酵液pH不再降低，终止发酵，即得短乳杆菌活菌数达2.33×1010CFU/mL的发酵液。
2.2对照实验1
将-80℃保藏的短乳杆菌ZLB004菌种接种于MRS液体培养基中，37℃培养24小时后，以1％接种量转接于MRS液体培养基中，培养21小时，如此传代培养2次后作为种子液，以7.5％接种量转接于装有60％MRS培养基的发酵罐中，37℃，转速75rpm，培养18小时，终止发酵，得到短乳杆菌活菌数为1.06×109CFU/mL。
2.3对照实验2
将-80℃保藏的短乳杆菌ZLB004菌种接种于MRS液体培养基中，37℃培养24小时后，以1％接种量转接于MRS液体培养基中，培养21小时，如此传代培养2次后作为种子液，以7.5％接种量转接于装有60％MRS培养基的发酵罐中，37℃，转速75rpm，自动流加25％氨水溶液控制pH保持在5.35；当发酵至18小时时开始补料，向发酵罐中一次加入700g/L的葡萄糖补料液20mL，之后每隔2小时进行一次补料，共补料5次；当发酵液pH不再降低，终止发酵，得到短乳杆菌活菌数为4.60×109CFU/mL。
2.4结果分析
应用本发明的高密度发酵培养基及其发酵方法，可以得到短乳杆菌活菌数为2.33×1010CFU/mL的发酵液，而应用常规发酵培养基(MRS培养基)及其发酵方法，得到的短乳杆菌活菌数为1.06×109CFU/mL。实验证明本发明的发酵培养基及其发酵方法得到的短乳杆菌活菌数约为常规方法的22倍，实现了短乳杆菌的高密度发酵。在饲用乳酸菌生产中，高密度发酵的实现和应用，将大大减少培养体积或发酵次数，缩短生产周期，降低生产成本和提高生产效率，能够更好地满足饲用乳酸菌制剂的市场需求，保障畜禽的安全健康生产。

Claims (9)

1.一种饲用短乳杆菌高密度发酵培养基，其组成及含量比例如下：葡萄糖30～40g，牛肉蛋白胨30～40g，牛肉膏9～10g，酵母浸粉3.5～4.5g，乙酸钠4～6g，K2PO4·3H2O 1～3g，柠檬酸氢二铵1～3g，ZnSO4·7H2O 0.3～0.5g，MnSO4·H2O 0.1～0.3g，吐温-80 1mL，蒸馏水1000mL。
2.根据权利要求1所述的饲用短乳杆菌高密度发酵培养基，其特征在于，其组成及含量比例如下：葡萄糖35g，牛肉蛋白胨35g，牛肉膏9.5g，酵母浸粉4g，乙酸钠5g，K2PO4·3H2O2g，柠檬酸氢二铵2g，ZnSO4·7H2O 0.4g，MnSO4·H2O 0.2g，吐温-80 1mL，蒸馏水1000mL。
3.权利要求1或2所述的饲用短乳杆菌高密度发酵培养基在短乳杆菌发酵中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述菌种为短乳杆菌ZLB004，保藏号为：CGMCC No.5760。
5.一种制备权利要求1或2所述培养基的方法，其特征在于，将发酵培养基各成份按比例配制，混合均匀后调pH至6.5，高温灭菌。
6.一种短乳杆菌高密度发酵方法，其包括如下步骤：
(1)菌种的活化，将保藏的菌种于MRS液体培养基中培养活化；
(2)按权利要求5所述的方法制备发酵培养基；
(3)发酵：在发酵罐中装入50％-70％所述发酵培养基，接种5％-10％(V/V)种子液，控制罐温35～39℃，转速50-100rpm，维持恒定pH 5.2-5.5；当发酵至16-20小时时开始补料，向发酵罐中一次加入20mL补料液，之后每隔2小时进行一次补料，共补料5次；
(4)终止发酵：当发酵液pH不再降低时，终止发酵。
7.根据权利要求6所述的短乳杆菌高密度发酵方法，其特征在于，其中步骤(1)菌种的活化：将-80℃保藏的菌种接种于10mLMRS液体培养基中，37℃培养24小时后，以1％接种量转接于MRS液体培养基中，培养18～24小时，传代培养2次得到活化的菌种，
MRS液体培养基组成如下：葡萄糖20g，蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母浸粉5g，乙酸钠5g，K2HPO4·3H2O 2g，柠檬酸氢二铵2g，MgS04·7H2O 0.58g，MnS04·H2O 0.19g，吐温-80 1mL，蒸馏水1000m1，pH 6.5，121℃灭菌15分钟。
8.根据权利要求6或7所述的短乳杆菌高密度发酵方法，其特征在于，所述步骤(3)维持pH保持5.2-5.5是通过流加中和剂的方法进行控制的，所述中和剂是25％的氨水溶液。
9.根据权利要求6或7所述的短乳杆菌高密度发酵方法，其特征在于，所述步骤(3)补料液的成分为葡萄糖溶液，其浓度为700g/L。
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