CN103387427B - 截短侧耳素菌渣无害化处理的生物菌肥制造方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种截短侧耳素菌渣无害化处理的生物菌肥制造方法，包括截短侧耳素废菌渣无害化处理、细黄链霉菌生物菌肥制备，其中细黄链霉菌生物菌肥制备包括茄子瓶斜面种子培养、摇瓶液体种子培养、1500L种子罐培养、15000L发酵罐培养等步骤。本发明把残留在菌渣中的截短侧耳素去除，利用其基有的有机氮源及生长因子作为细黄链霉菌发酵培养基生产生物菌肥，使截短侧耳素废菌渣循环利用。
Description
技术领域
本发明涉及一种截短侧耳素菌渣无害化处理的生物菌肥制造方法。
背景技术
截短侧耳素菌渣是提取截短侧耳素后的发酵废菌丝体，其中含有大量的菌体蛋白,约占干重的40%以上，丰富的维生素、核酸、生长因子及培养基残留物等营养物质，同时也残留少量截短侧耳素（0.3%左右）。2002年，农业部、卫生部等部门联合发文，禁止未经处理的抗生素菌渣做饲料添加剂，抗生素菌渣按规定只能焚烧或深埋。目前我国提取截短侧耳素后的干废菌体约为15000吨，焚烧或深埋既增加生产成本，造成资源浪费、又污染环境。
发明内容
本发明的目的在于提供一种把残留在菌渣中的截短侧耳素去除，利用其基有的有机氮源及生长因子作为细黄链霉菌发酵培养基生产生物菌肥，使截短侧耳素废菌渣循环利用的截短侧耳素菌渣无害化处理的生物菌肥制造方法。
本发明的技术解决方案是：
一种截短侧耳素菌渣无害化处理的生物菌肥制造方法，其特征是：包括下列步骤：
（一）截短侧耳素废菌渣无害化处理
将蛋白质含量为41.62%、截短侧耳素残留量为0.236%的干菌渣100㎏投入1000L搪瓷反应罐中，加入含量1.7%的氨水400L，搅拌均匀，浸泡2h，然后通入蒸汽升温至95℃保温1h，自然冷却后，用HCl调制PH9.0，得到无害化处理后的截短侧耳素菌体溶液，待用；
（二）细黄链霉菌生物菌肥制备
A）茄子瓶斜面种子培养：
（1）取马铃薯200g，切成小块，加水400ml,煮烂后用二层纱布过滤，滤液中加入葡萄糖20g、琼脂20g，加蒸馏水至1000ml，分别装入250ml茄子瓶中，每瓶装量50ml，121～124℃灭菌30～40分钟；
（2）将灭菌后的茄子瓶及细黄链霉菌冷冻管放入无菌净化工作台，按无菌要求将0.1ml冷冻管种子接入茄子瓶中，涂布均匀，塞上棉塞，放入恒温室中，28±1℃ 培养5-7天；
B）摇瓶液体种子培养
（1）将玉米淀粉100g、葡萄糖90g、豆粕粉50g、蛋白胨20g、硫酸铵7.5g、硫酸镁2.5g、磷酸氢二钾1.0g投入配料桶中，加入蒸馏水，搅拌，用氢氧化钠溶液调PH7.8，再加入碳酸钙20g，搅拌均匀，定容至5000ml，然后分别装入1000ml三角瓶中，每瓶装量200ml,盖上8层纱布，121～124℃灭菌30～40分钟；
（2）将灭菌后的三角瓶及培养好的茄子瓶种子放入无菌净化工作台，按无菌要求将茄子瓶种子接入三角瓶中，每只茄子瓶接5只三角瓶，盖上纱布，放入旋转式摇床进行震荡培养，28±1℃培养32～36h；
C）1500L种子罐培养
（1）先将玉米淀粉8.4㎏、葡萄糖21.6㎏、豆粕粉16.8㎏、硫酸铵1.8㎏、硫酸镁0.72㎏投入1500L种子罐中，加入自来水，定容至1100L，加温到70℃，控制PH8.0-8.2，再加入碳酸钙4.8㎏、泡敌0.6㎏，通入蒸汽灭菌，灭菌温度118～122℃，冷却至28-30℃；
（2）接入8瓶摇瓶种子液，罐压0.03～0.05MPa，搅拌转速258rpm，通气量1:0.8～1，28±1℃培养28～32h；
D）15000L发酵罐培养
（1）首先将步骤（一）得到的无害化处理后的截短侧耳素菌体溶液泵入15000L发酵罐内，加入自来水，再将玉米淀粉70㎏、葡萄糖180㎏、豆粕粉80㎏、硫酸铵8.2㎏、硫酸镁6㎏投入种子罐中，用自来水定容至10000L，加温到70℃，控制PH8.0-8.2，再加入碳酸钙40㎏、泡敌6㎏，通入蒸汽灭菌，灭菌温度118～122℃，冷却至28-30℃；
（2）接入种子液，接种量为10%，罐压0.03～0.05MPa，搅拌转速196rpm ，发酵0-6h阶段的通气量为1:0.8，发酵7h-放罐阶段的通气量为1:1，培养温度28-30℃，培养时间40～48h；
（3）放罐标准：发酵液稠厚，还原糖0.2%以下，有效活菌数大于0.85亿/ml，即可放罐，装入容器中。
本发明把残留在菌渣中的截短侧耳素去除，利用其基有的有机氮源及生长因子作为细黄链霉菌发酵培养基生产生物菌肥，使截短侧耳素废菌渣循环利用。
截短侧耳素在碱性溶液中不稳定，在0.1N氢氧化铵溶液中加热1h活性损失94%，在1N氢氧化铵溶液中95℃保温1h活性全部失活。将截短侧耳素含量为0.236%的干菌渣在1.7%的氨水溶液中95℃加热1h,菌渣中残留截短侧耳素全部失活。清除截短侧耳素后的菌体含有丰富的蛋白质、核酸及生长因子，是生产细黄链霉菌生物菌肥的优质氮源，与豆粕粉搭配组成复合氮源，能显著促进细黄链霉菌生长代谢。同时，用氢氧化铵处理菌渣又增加了菌体中氮源含量，可减少发酵培养基中硫酸铵用量，此项发明开创了一条截短侧耳素废菌渣无害化处理及循环利用的新途径。
生物菌肥、生物有机肥作为当前农业部向全国重点推广的项目之一，是我国无公害蔬菜、绿色食品、有机食品必不可少的肥料。细黄链霉菌生物菌肥可用作拌种、浸种、穴施、追施、基施等,加入饼肥或土杂肥中作种肥或追肥等效果更好。在玉米、小麦、蔬菜等多种大田和经济作物上使用结果表明能够促进作物生长，提高产量并具有一定的抗病、驱虫作用，同时细黄链霉菌在发酵过程中产生生长激素和抗生素，转化土壤中的氮素和磷素物质，提高土壤肥力进而有促进作物生长作用。新疆搭载神舟九号飞船细黄链霉菌菌种返回地面后，通过对比分析实验，结果表明以此优良菌种用于生产生物肥和有机肥，将会大大降低生产成本，提高产品质量，对于改善新疆干旱半干旱地区盐碱化土壤环境有着重要意义，大力发展生物肥对于新疆农业来说显得尤为迫切。同时采用无害化处理的截短侧耳素废菌渣也可以用于细黄链霉菌生物菌肥的固体发酵及堆制菌肥生产，固体发酵及堆制菌肥生产设备投资少，生产成本低，更有利于在新疆地区推广应用。
下面结合实施例对本发明作进一步说明。
具体实施方式
一种截短侧耳素菌渣无害化处理的生物菌肥制造方法，包括下列步骤：
一、截短侧耳素废菌渣无害化处理方法
处理方法：将蛋白质含量为41.62%、截短侧耳素残留量为0.236%的干菌渣100㎏投入1000L搪瓷反应罐中，加入含量1.7%的氨水400L，搅拌均匀，浸泡2h，然后通入蒸汽升温至95℃保温1h，自然冷却后，用HCl调制PH9.0待用。经检测，处理后的菌渣及溶液中截短侧耳素全部失活，无截短侧耳素检出。
二、细黄链霉菌生物菌肥生产技术
1、茄子瓶斜面种子培养
（1）培养基：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂20g。
取马铃薯200g，切成小块，加水400ml,煮烂后用二层纱布过滤，滤液中加入葡萄糖20g、琼脂20g，加蒸馏水至1000ml，分别装入250ml茄子瓶中，每瓶装量50ml，121～124℃，灭菌30～40分钟。
（2）工艺条件：将灭菌后的茄子瓶及细黄链霉菌冷冻管放入无菌净化工作台，按无菌要求将0.1ml冷冻管种子接入茄子瓶中，涂布均匀，塞上棉塞，放入恒温室中，28±1℃ 培养5-7天。
（3）质量标准：斜面产生粉白带微红色的孢子层，在菌层表面产生浅茶色小露珠，并放出清凉的香味，镜检孢子丝单叉分枝，无杂菌。
2、摇瓶液体种子培养
（1）培养基：玉米淀粉100g，葡萄糖90g，豆粕粉50g，蛋白胨20g，硫酸铵7.5g，硫酸镁2.5g，磷酸氢二钾1.0g，碳酸钙20g，PH7.8。
将玉米淀粉、葡萄糖、豆粕粉、蛋白胨、硫酸铵、硫酸镁、磷酸氢二钾等培养基投入配料桶中，加入蒸馏水，搅拌，用氢氧化钠溶液调PH7.8，最后加入碳酸钙，搅拌均匀，定容至5000ml。然后分别装入1000ml三角瓶中，每瓶装量200ml,盖上8层纱布，121～124℃，灭菌30～40分钟。
（2）工艺条件：将灭菌后的三角瓶及培养好的茄子瓶种子放入无菌净化工作台，按无菌要求将茄子瓶种子接入三角瓶中，每只茄子瓶接5只三角瓶，盖上纱布，放入旋转式摇床进行震荡培养，28±1℃培养32～36h。
（3）质量标准：培养液稠厚，镜检观察全部为整齐粗壮的营养体，无杂菌，具有清凉的香味。
3、1500L种子罐培养
（1）培养基：玉米淀粉8.4㎏，葡萄糖21.6㎏，豆粕粉16.8㎏，硫酸铵1.8㎏，硫酸镁0.72㎏，碳酸钙4.8㎏，泡敌（消泡剂）0.6㎏，PH8.0-8.2。
先将玉米淀粉、葡萄糖、豆粕粉、硫酸铵、硫酸镁等培养基投入1500L种子罐中，加入自来水，定容至1100L，加温到70℃，控制消前PH8.0-8.2，再加入碳酸钙和消泡剂，通入蒸汽灭菌，灭菌温度118～122℃，冷却至28-30℃。
（2）工艺条件：接入8瓶摇瓶种子液，罐压0.03～0.05MPa，搅拌转速258rpm ，通气量（发酵液:通入的空气）1:0.8～1（体积：体积/min），28±1℃培养28～32h。
（3）质量标准：培养液稠厚，生长旺盛，镜检观察菌丝舒展，全部为整齐粗壮的营养体，无短枝菌丝，无杂菌，具有清凉的香味。
4、15000L发酵罐培养
（1）先将步骤（一）得到的全部“无害化处理后的截短侧耳素菌体溶液”泵入15000L发酵罐内，加入自来水，再将玉米淀粉70㎏、葡萄糖180㎏、豆粕粉80㎏、硫酸铵8.2㎏、硫酸镁6㎏投入种子罐中，用自来水定容至10000L，加温到70℃，控制PH8.0-8.2，再加入碳酸钙40㎏、泡敌6㎏，通入蒸汽灭菌，灭菌温度118～122℃，冷却至28-30℃；
（2）工艺条件：接入种子液，接种量约为10%，罐压0.03～0.05MPa，搅拌转速196rpm ，发酵0-6h通气量为1:0.8（体积：体积/min），发酵7h-放罐通气量为1:1（体积：体积/min），培养温度28-30℃，培养时间40～48h。
（3）放罐标准：发酵液稠厚，还原糖0.2%以下，有大量孢子产生，有效活菌数（cfu）大于0.85亿/ml，具有清凉的香味，即可放罐，装入25L消过毒的塑料桶中供使用。或采用低温浓缩（不超过60℃）至发酵液体积的1/3，装桶，便于产品的运输。
Claims (1)
1.一种截短侧耳素菌渣无害化处理的生物菌肥制造方法，其特征是：包括下列步骤：
（一）截短侧耳素废菌渣无害化处理
将蛋白质含量为41.62%、截短侧耳素残留量为0.236%的干菌渣100㎏投入1000L搪瓷反应罐中，加入含量1.7%的氨水400L，搅拌均匀，浸泡2h，然后通入蒸汽升温至95℃保温1h，自然冷却后，用HCl调制pH9.0，得到无害化处理后的截短侧耳素菌体溶液，待用；
（二）细黄链霉菌生物菌肥制备
A）茄子瓶斜面种子培养：
（1）取马铃薯200g，切成小块，加水400ml,煮烂后用二层纱布过滤，滤液中加入葡萄糖20g、琼脂20g，加蒸馏水至1000ml，分别装入250ml茄子瓶中，每瓶装量50ml，121～124℃灭菌30～40分钟；
（2）将灭菌后的茄子瓶及细黄链霉菌冷冻管放入无菌净化工作台，按无菌要求将0.1ml冷冻管种子接入茄子瓶中，涂布均匀，塞上棉塞，放入恒温室中，28±1℃ 培养5-7天；
B）摇瓶液体种子培养
（1）将玉米淀粉100g、葡萄糖90g、豆粕粉50g、蛋白胨20g、硫酸铵7.5g、硫酸镁2.5g、磷酸氢二钾1.0g投入配料桶中，加入蒸馏水，搅拌，用氢氧化钠溶液调pH7.8，再加入碳酸钙20g，搅拌均匀，定容至5000ml，然后分别装入1000ml三角瓶中，每瓶装量200ml,盖上8层纱布，121～124℃灭菌30～40分钟；
（2）将灭菌后的三角瓶及培养好的茄子瓶种子放入无菌净化工作台，按无菌要求将茄子瓶种子接入三角瓶中，每只茄子瓶接5只三角瓶，盖上纱布，放入旋转式摇床进行震荡培养，28±1℃培养32～36h；
C）1500L种子罐培养
（1）先将玉米淀粉8.4㎏、葡萄糖21.6㎏、豆粕粉16.8㎏、硫酸铵1.8㎏、硫酸镁0.72㎏投入1500L种子罐中，加入自来水，定容至1100L，加温到70℃，控制pH8.0-8.2，再加入碳酸钙4.8㎏、泡敌0.6㎏，通入蒸汽灭菌，灭菌温度118～122℃，冷却至28-30℃；
（2）接入8瓶摇瓶种子液，罐压0.03～0.05MPa，搅拌转速258rpm，通气量1:0.8～1，28±1℃培养28～32h；
D）15000L发酵罐培养
（1）首先将步骤（一）得到的无害化处理后的截短侧耳素菌体溶液泵入15000L发酵罐内，加入自来水，再将玉米淀粉70㎏、葡萄糖180㎏、豆粕粉80㎏、硫酸铵8.2㎏、硫酸镁6㎏投入种子罐中，用自来水定容至10000L，加温到70℃，控制pH8.0-8.2，再加入碳酸钙40㎏、泡敌6㎏，通入蒸汽灭菌，灭菌温度118～122℃，冷却至28-30℃；
（2）接入种子液，接种量为10%，罐压0.03～0.05MPa，搅拌转速196rpm ，发酵0-6h阶段的通气量为1:0.8，发酵7h-放罐阶段的通气量为1:1，培养温度28-30℃，培养时间40～48h；
（3）放罐标准：发酵液稠厚，还原糖0.2%以下，有效活菌数大于0.85亿/ml，即可放罐，装入容器中。
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