CN116622788B - 一种裂殖壶菌发酵生产dha的方法 - Google Patents
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Classifications
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Abstract
本发明提供了一种裂殖壶菌发酵生产DHA的方法，涉及微生物发酵技术领域。包含以下步骤：菌种活化；摇瓶培养：将活化好的菌株转接至三角瓶的种子培养基中培养，得到种子液A；所述的种子液A转移到种子罐的种子培养基中培养，得种子液B；主发酵罐培养：将种子液B转接入主发酵罐的主发酵罐培养基中，分批补料培养；补料培养基以葡萄糖和甘油作为混合碳源，大豆水解液和玉米浆作为混合氮源，以氨水调节pH，发酵4‑5d。所得的产物生物量＞100g/L，总脂肪含量＞45%，DHA含量＞17%。本发明在保证产品品质的前提下降低了成本，具有极大的推广意义。
Description
技术领域
本发明涉及于微生物发酵技术领域，具体涉及一种裂殖壶菌发酵生产DHA的方法。
背景技术
二十二碳六烯酸 (cis-4，7，10，13，16，19-docosahexaenoicacid，简称 DHA，CAS号 ：6217-54-5) 属于多不饱和脂肪酸，具有十分重要的生理功能，是人体自身不能大量合成但又不可缺少的重要营养素。DHA 是人体大脑的主要组成成分之一，主要以磷脂的形式存在，约占脑细胞脂肪酸的 30％左右。DHA 具有抗凝血、抑制血小板凝集和血栓形成的作用，可以预防心肌梗塞等心血管疾病。DHA 是人视网膜组织的重要组成成分， 能促进视神经膜延伸，维持视觉正常功能。DHA 会抑制发炎前驱物质的形成，具有消炎作用。DHA能降低孕妇妊高症的风险，减少产后神经衰弱及抑郁症的发生。DHA 有抑制癌症的作用，能明显抑制肿瘤的产生、成长和转移。
近年来生产 DHA 的方法主要为发酵法。微生物主要是破囊壶菌、裂殖壶菌等海洋真菌。研究发现海洋微生物裂殖壶菌 (Schizochytrium) 细胞中能积累大量 DHA，而且具有培养周期短和不易受污染等优点，能够克服鱼油资源所面临的种种问题 ；同时裂殖壶菌来源的 DHA 被认证为安全的 DHA 新资源。裂殖壶菌又称裂壶藻，属于真菌门、卵菌纲、水霉目、破囊壶菌科的一类海洋真菌，单细胞、球形。
裂殖壶菌(Schizochytrium)作为藻油DHA的主要来源之一，属于异养型微生物，具有生长速度快、易培养、细胞脂肪酸含量高、DHA占比高等优势，已实现工业化生产培养用以提取高品质DHA。
中国发明专利申请CN114561434A公开了一种裂殖壶菌发酵生产EPA和DHA的方法，该方法是以裂殖壶菌为生产菌株，在发酵培养基中添加恩西地平，发酵生产多不饱和脂肪酸。通过激活裂殖壶菌部分ELO/DES途径，提高裂殖壶菌发酵产物中EPA和DHA含量，采用裂殖壶菌工程菌EDG为生产菌株，使发酵产物中EPA含量提高8.73倍，DHA含量提高1.15倍。
中国发明专利申请CN114525312A提供了一种使用裂殖壶菌发酵生产DHA的方法。该方法包括如下步骤：将裂殖壶菌接入发酵培养基中发酵；所述发酵体系中，包括碳源、氮源和无机盐；所述无机盐由磷酸盐和镁盐组成。使用了特定的不额外补充钠/氯离子的发酵培养基进行发酵培养，菌体生长代谢未受到影响，总油得到了明显的提高，同时也有效减少了氯离子对于设备的腐蚀问题。
但裂殖壶菌生长需要供给足够的碳氮源，目前生产中多使用葡萄糖、酵母抽提物、蛋白胨或单质氨基酸、纯品维生素复合物等进行培养，生产成本高，多用于保健食品，难以在水产养殖中大面积推广使用。
发明内容
本发明针对上述问题，提供了一种裂殖壶菌发酵生产DHA的方法，采用低成本的甘油代替补料碳源，使用酶解法制备豆粕水解液代替昂贵的酵母抽提物、蛋白质或单质氨基酸，使用副产玉米浆提供所需部分微量元素及维生素。在保证品质的前提下使生产成本降低了20%-30%，具有极大的推广意义。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
本发明提供了一种裂殖壶菌发酵生产DHA的方法，包含以下步骤：
1）菌种活化：取保存菌种至斜面试管，静置培养，待菌株长满整个斜面培养基停止培养得到活化好的菌株；
2）小体积培养：将步骤1）活化好的菌株转接至小体积培养容器的种子培养基中培养，得到种子液A；
3）种子扩大培养：将步骤2）所述的种子液A转移到种子罐的种子培养基中培养，得种子液B；
4）主发酵罐培养：将步骤3）所述的种子液B转接入主发酵罐的主发酵罐培养基中，分批补料培养；补料培养基以葡萄糖和甘油作为混合碳源，大豆水解液和玉米浆作为混合氮源，以氨水调节pH，发酵4-5d。
优选地，具体为：
1）菌种活化：取-75~-82℃冷冻保存菌种，解冻，无菌条件下，吸取45-55µL至斜面试管，静置培养2-3d，待菌株长满整个斜面培养基停止培养；
2）小体积培养：将步骤1）活化好的菌株转接至小体积培养容器的种子培养基中培养2-3d，得到种子液A；
3）种子扩大培养：将步骤2）所述的种子液A转移到种子罐的种子培养基中，培养1-2d，得种子液B；
4）主发酵罐培养：将步骤3）所述的种子液B转接入主发酵罐的主发酵罐培养基中，分批补料培养；补料培养基以葡萄糖和甘油作为混合碳源，大豆水解液和玉米浆作为混合氮源，以氨水调节pH，发酵4-5d。
优选地，步骤1）所述的斜面培养基可以包含以下组分：葡萄糖15-22g/L，酵母抽提物3-8 g/L，蛋白胨1-3 g/L，磷酸二氢钾 0.5-1.2g/L，硫酸镁0.2-0.8 g/L，玉米浆0.2-0.8g/L，琼脂粉10-20g/L 。
进一步地，步骤1）所述的斜面培养基可以包含以下组分：葡萄糖20g/L，酵母抽提物5 g/L，蛋白胨2 g/L，磷酸二氢钾 1g/L，硫酸镁0.5 g/L，玉米浆0.5 g/L，琼脂粉15g/L 。
优选地，步骤1）所述的解冻的具体条件可以为35-39℃下在金属浴中解冻。
优选地，步骤2）和步骤3）所述的种子培养基可以包含以下组分：葡萄糖 10-20g/L，酵母抽提物3-8 g/L，蛋白胨0.5-1.2g/L，大豆水解液3-8g/L，磷酸二氢钾0.5-1.2g/L，硫酸镁 0.3-0.8g/L，硫酸铵1.5-2.3g/L，氯化钙0.4-0.9g/L，碳酸钠0.5-1.4g/L，玉米浆 3-8g/L，海水晶8-15g/L，维生素混合液2-4mL/L，微量元素混合液1-3mL/L。
进一步地，步骤2）和步骤3）所述的种子培养基可以包含以下组分：葡萄糖 15g/L，酵母抽提物5 g/L，蛋白胨1g/L，大豆水解液5g/L，磷酸二氢钾 1g/L，硫酸镁 0.5 g/L，硫酸铵2g/L，氯化钙0.6 g/L，碳酸钠1 g/L，玉米浆 5g/L，海水晶10g/L，维生素混合液3mL/L，微量元素混合液2mL/L。
优选地，步骤2）所述的小体积培养容器的体积：步骤3）所述的种子罐的体积：步骤4）所述的主发酵罐的体积可以为1：80-110：900-1100。
进一步地，步骤2）所述的小体积培养容器的体积：步骤3）所述的种子罐的体积：步骤4）所述的主发酵罐的体积可以为1：90-105：950-1050。
进一步地，步骤2）所述的小体积培养容器的体积：步骤3）所述的种子罐的体积：步骤4）所述的主发酵罐的体积可以为1：100：1000。
进一步地，步骤2）所述的小体积培养容器的体积可以为5L；步骤3）所述的种子罐的体积可以为500L；步骤4）所述的主发酵罐的体积可以为5000L。
优选地，步骤2）所述的种子培养基的体积：小体积培养容器的体积可以为1：4-5；进一步地，步骤2）所述的种子培养基的体积：小体积培养容器的体积可以为1：5。
优选地，步骤3）所述的种子培养基的体积：种子罐的体积可以为1：400-500；进一步地，步骤3）所述的种子培养基的体积：种子罐的体积可以为1：500。
优选地，步骤4）所述的主发酵罐培养基的体积：主发酵罐体积可以为2-3：5；进一步地，步骤4）所述的主发酵罐培养基的体积：主发酵罐体积可以为3：5。优选地，步骤2）和步骤3）所述的种子培养基的体积可以为1L。
优选地，步骤4）所述的主发酵罐培养基的体积可以为3000L。
优选地，步骤4）所述的主发酵罐培养基可以包含以下组分：葡萄糖 10-15g/L，甘油20-30g/L，大豆水解液15-30g/L，磷酸二氢钾 0.5-1g/L，硫酸镁 0.5 -1g/L，硫酸铵2-5g/L，氯化钙0.6-1 g/L，碳酸钠1-3 g/L，玉米浆 15-30g/L，维生素混合液0.2-0.6mL/L，微量元素混合液1-3mL/L。
进一步地，步骤4）所述的主发酵罐培养基可以包含以下组分：葡萄糖 14g/L，甘油25g/L，大豆水解液28g/L，磷酸二氢钾 0.7g/L，硫酸镁0.6g/L，硫酸铵4.5g/L，氯化钙0.75g/L，碳酸钠2.1g/L，玉米浆28g/L，维生素混合液0.5mL/L，微量元素混合液2mL/L。
优选地，上述维生素混合液可以包含以下组分：生物素0.01-0.2g/L，泛酸钙3-7g/L，腺苷1-3g/L，维生素B12 0.5-1.2g/L。
进一步地，上述维生素混合液可以包含以下组分：生物素0.1g/L，泛酸钙5g/L，腺苷2g/L，维生素B12 1g/L。
优选地，上述微量元素混合液可以包含以下组分：硫酸铜2-4g/L，硫酸亚铁4-6g/L，硫酸锌4-6g/L，钼酸钠1-3g/L，氯化锰0.2-0.6g/L。
进一步地，上述微量元素混合液可以包含以下组分：硫酸铜3g/L，硫酸亚铁5g/L，硫酸锌5g/L，钼酸钠2g/L，氯化锰0.4g/L。
优选地，步骤4）所述的补料培养基中葡萄糖和甘油的比例可以为1-1.5：1。
优选地，步骤4）所述的补料培养基中大豆水解液与玉米浆的比例可以为2：0.5。
优选地，步骤4）所述的补料培养基中氨水的浓度可以为18-25%。
优选地，步骤4）所述的以氨水调节pH的具体pH范围可以为7-8.5。
优选地，步骤4）所述的分批补料的过程中采用分段控制培养温度和甘油浓度的方法，具体参数为：
1）0-10h，温度为30-35℃，培养基中甘油浓度25-30 g/L；
2）10-30h，温度为30-35℃，培养基中甘油浓度15-20 g/L；
3）30-50h，温度为28-32℃，培养基中甘油浓度10-15 g/L；
4）50h-结束，温度为22-28℃，培养基中甘油浓度2-5 g/L。
进一步地，步骤4）所述的分批补料的过程中采用分段控制培养温度和甘油补料速度的方法，具体参数为：
1）0-10h，温度为33℃，培养基中甘油浓度25-30 g/L；
2）10-30h，温度为33℃，培养基中甘油浓度15-20 g/L；
3）30-50h，温度为30℃，培养基中甘油浓度10-15 g/L；
4）50h-结束，温度为25℃，培养基中甘油浓度2-5 g/L。
相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
1、采用低成本的甘油代替补料碳源，使用酶解法制备豆粕水解液代替昂贵的酵母抽提物、蛋白质或单质氨基酸，使用副产玉米浆提供所需部分微量元素及维生素。在保证品质的前提下降低了生产成本，具有极大的推广意义。
2、根据本发明提供的方法制备所得产物的生物量＞100g/L，总脂肪含量＞45%，DHA含量＞17%。
附图说明
图1为裂殖壶菌显微镜照片。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐明本发明。下述实施例仅为本发明的优选实施例，并非全部。基于以下实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的其它实施例都属于本发明的保护范围。本发明中使用的原料均为普通市售产品，对其来源不做具体限定。实施例中所用的技术和科学术语为本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的含义。
实施例1
1）配置培养基
维生素混合液：生物素0.1g/L，泛酸钙5g/L，腺苷2g/L，维生素B12 1g/L。
微量元素混合液：硫酸铜3g/L，硫酸亚铁5g/L，硫酸锌5g/L，钼酸钠2g/L，氯化锰0.4g/L。
斜面培养基：葡萄糖20g/L，酵母抽提物5 g/L，蛋白胨2 g/L，磷酸二氢钾 1g/L，硫酸镁0.5 g/L，玉米浆0.5 g/L，琼脂粉15g/L 。
种子培养基：葡萄糖 15g/L，酵母抽提物5 g/L，蛋白胨1g/L，大豆水解液5g/L，磷酸二氢钾 1g/L，硫酸镁 0.5 g/L，硫酸铵2g/L，氯化钙0.6 g/L，碳酸钠1 g/L，玉米浆 5g/L，海水晶10g/L，维生素混合液3mL/L，微量元素混合液2mL/L。
主发酵罐培养基：葡萄糖 14g/L，甘油25g/L，大豆水解液28g/L，磷酸二氢钾0.7g/L，硫酸镁0.6g/L，硫酸铵4.5g/L，氯化钙0.75 g/L，碳酸钠2.1g/L，玉米浆28g/L，维生素混合液0.5mL/L，微量元素混合液2mL/L。
补料培养基：甘油300g/L，葡萄糖400g/L，大豆水解液300g/L，玉米浆100g/L，20%氨水调节pH至7-8.5。
2）菌种活化：取-80℃冷冻保存裂殖壶菌，于37℃金属浴中解冻，然后在无菌条件下，吸取50µL至斜面试管（内含斜面培养基），静置培养2-3d，待菌株长满整个斜面停止培养;
3）小体积培养：将步骤2）活化好的菌株转接至5L三角瓶中（内有种子培养基1L）培养2-3d，得到种子液A；
4）种子扩大培养：将步骤3）所述的种子液A转移到500L种子罐（内有种子培养基1L）中，培养1-2d，得种子液B；
5）主发酵罐培养：将步骤4）所述的种子液B转接入5000L主发酵罐的主发酵罐培养基中，发酵罐培养基的体积为3000L，分批补料培养发酵4-5d；
分批补料的过程中采用分段控制培养温度和甘油浓度的方法，具体参数为：
a. 0-10h，温度为33℃，培养基中甘油浓度25-30 g/L；
b. 10-30h，温度为33℃，培养基中甘油浓度15-20 g/L；
c. 30-50h，温度为30℃，培养基中甘油浓度10-15 g/L；
d. 50h-结束，温度为25℃，培养基中甘油浓度2-5 g/L。
对比例1
按照中国发明专利CN201510524747.1中实施例1的方法进行。
(1) 配制培养基
摇瓶培养基的配制方法如下 ：将配方中的组分四水氯化锰、七水硫酸锌、五水硫酸铜、二水钼酸钠、六水氯化钴称量后，用无菌水充分溶解，制备成母液，酸性条件下，121℃高压蒸汽灭菌 20min ；其他成分称量之后，用无菌水充分溶解后分装至摇瓶，121℃高压蒸汽灭菌 20min。
摇瓶培养基配方如下 ：葡萄糖 45g/L、酵母抽提物 10g/L、硫酸钠 8.0g/L、氯化钾0.7g/L、硫酸镁 2.0g/L、磷酸二氢钾 2.0g/L、氯化钙 0.15g/L、硫酸铵 1.0g/L、四水氯化锰1.7mg/L、七水硫酸锌 3.0mg/L、五水硫酸铜 1.5mg/L、二水钼酸钠 0.05mg/L、六水氯化钴0.05mg/L。
发酵罐培养基的配制方法如下 ：将配方中的所有组分按比例称量后，用无菌水充分溶解，121℃高压蒸汽灭菌 20min，降温后备用。
发酵罐培养基配方如下 ：葡萄糖 80.0g/L、玉米浆干粉 15g/L、酵母抽提物3.0g/L、谷氨酸钠 10.0g/L、硫酸钠 8.0g/L、氯化钾 0.7g/L、硫酸镁 2.0g/L、磷酸二氢钾2.0g/L、氯化钙 0.15g/L、硫酸铵 1.0g/L、四水氯化锰 1.7mg/L、七水硫酸锌 3.0mg/L、五水硫酸铜 1.5mg/L、二水钼酸钠 0.05mg/L、六水氯化钴 0.05mg/L。
(2) 取保藏于超低温冰箱的甘油管裂殖壶菌ATCC20888菌种，接种至2支装50mL摇瓶培养基的 250mL 揺瓶中，在25℃的揺床中以 150rpm 的转速培养24h ；然后以5％的接种量接种至300支装有50mL培养基的250mL揺瓶中传代培养，在25℃的揺床中以150rpm 的转速培养19.5h，测定种子液中的细胞干重为18.7g/L，收集种子液。
(3) 将揺瓶种子液按照 10％的按种量按种到装有150L发酵罐培养基的200L一级种子罐中进行发酵培养，培养温度为28℃，通气量为0.5vvm，整个发酵过程利用30％氨水控制发酵液的pH在 5.5 -6.0 之间，发酵至 35 - 45h、期间发酵液中葡萄糖含量低于 5g/L时，停止发酵。
(4) 将一级种子罐中的种子液 150L 全部接种至装有 1500L 发酵罐培养基的3000L发酵罐中进行发酵培养，培养温度为 28℃，通气量为 0.5vvm，整个发酵过程利用30％氨水控制发酵液的 pH 在 5.5-6.0 之间。发酵至 20h 时开始流加 750g/L 的葡萄糖溶液和 230g/L的混合氮源溶液 (该溶液包含 30g/L酵母抽提物、100g/L谷氨酸钠、100g/L玉米浆干粉 )，隔 3h 取样检测发酵液中葡萄糖和总氮含量，通过流加速率控制发酵液中葡萄糖浓度始终维持在 30-50g/L、总氮含量维持在 15-25g/L，发酵培养至 115h 时，结束发酵。
对比例2
步骤1）-4）与实施例1相同
5）主发酵罐培养：将步骤4）所述的种子液B转接入5000L主发酵罐的主发酵罐培养基中，发酵罐培养基的体积为3000L，培养发酵4-5d。
对比例3
1）配置培养基
种子培养基配方如下 ：葡萄糖 45g/L、酵母抽提物 10g/L、硫酸钠 8.0g/L、氯化钾0.7g/L、硫酸镁 2.0g/L、磷酸二氢钾 2.0g/L、氯化钙 0.15g/L、硫酸铵 1.0g/L、四水氯化锰1.7mg/L、七水硫酸锌 3.0mg/L、五水硫酸铜 1.5mg/L、二水钼酸钠 0.05mg/L、六水氯化钴0.05mg/L。
发酵罐培养基配方如下 ：葡萄糖 80.0g/L、玉米浆干粉 15g/L、酵母抽提物3.0g/L、谷氨酸钠 10.0g/L、硫酸钠 8.0g/L、氯化钾 0.7g/L、硫酸镁 2.0g/L、磷酸二氢钾2.0g/L、氯化钙 0.15g/L、硫酸铵 1.0g/L、四水氯化锰 1.7mg/L、七水硫酸锌 3.0mg/L、五水硫酸铜 1.5mg/L、二水钼酸钠 0.05mg/L、六水氯化钴 0.05mg/L。
其余与实施例1相同。
如下表1为实施例1、对比例1-3所得产物的生物量、总脂肪量以及DHA含量。
表1. 实施例及对比例产物的生物量、总脂肪量以及DHA含量
本发明提供的方法，实施例1制备所得产物的生物量为125.02g/L，总脂肪量为49.30%，DHA含量为19.56%，显著高于对比例1-3；本发明的技术方案采用低成本的甘油代替补料碳源，使用酶解法制备豆粕水解液代替昂贵的酵母抽提物、蛋白质或单质氨基酸，使用副产玉米浆提供所需部分微量元素及维生素；在保证品质的前提下降低了生产成本，效果良好。
最后应当说明的是，以上内容仅用以说明本发明的技术方案，而非对本发明保护范围的限制，本领域普通技术人员对本发明技术方案进行的简单修改或者等同替换均不脱离本发明的保护范围。
Claims (6)
1.一种裂殖壶菌发酵生产DHA的方法，其特征在于，包含以下步骤：
1）菌种活化：取保存菌种至斜面试管，静置培养，待菌株长满整个斜面培养基停止培养得到活化好的菌株；
2）小体积培养：将步骤1）活化好的菌株转接至小体积培养容器的种子培养基中培养，得到种子液A；
3）种子扩大培养：将步骤2）所述的种子液A转移到种子罐的种子培养基中培养，得种子液B；
4）主发酵罐培养：将步骤3）所述的种子液B转接入主发酵罐的主发酵罐培养基中，分批补料培养；补料培养基以葡萄糖和甘油作为混合碳源，大豆水解液和玉米浆作为混合氮源，以氨水调节pH，发酵4-5d；
步骤2）和步骤3）所述的种子培养基包含以下组分：葡萄糖10-20g/L，酵母抽提物3-8g/L，蛋白胨0.5-1.2g/L，大豆水解液3-8g/L，磷酸二氢钾0.5-1.2g/L，硫酸镁0.3-0.8g/L，硫酸铵1.5-2.3g/L，氯化钙0.4-0.9g/L，碳酸钠0.5-1.4g/L，玉米浆3-8g/L，海水晶8-15g/L，维生素混合液2-4mL/L，微量元素混合液1-3mL/L；
步骤4）所述的主发酵罐培养基由以下组分组成：葡萄糖14g/L，甘油25g/L，大豆水解液28g/L，磷酸二氢钾0.7g/L，硫酸镁0.6g/L，硫酸铵4.5g/L，氯化钙0.75g/L，碳酸钠2.1g/L，玉米浆28g/L，维生素混合液0.5mL/L，微量元素混合液2mL/L；
步骤2）-步骤4）所述的维生素混合液由以下组分组成：生物素0.01-0.2g/L，泛酸钙3-7g/L，腺苷1-3g/L，维生素B120.5-1.2g/L；所述的微量元素混合液由以下组分组成：硫酸铜2-4g/L，硫酸亚铁4-6g/L，硫酸锌4-6g/L，钼酸钠1-3g/L，氯化锰0.2-0.6g/L；
步骤4）所述的分批补料的过程中采用分段控制培养温度和甘油浓度的方法，具体参数为：
a.0-10h，温度为33℃，培养基中甘油浓度25-30g/L；
b.10-30h，温度为33℃，培养基中甘油浓度15-20g/L；
c.30-50h，温度为30℃，培养基中甘油浓度10-15g/L；
d.50h-结束，温度为25℃，培养基中甘油浓度2-5g/L。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1）所述的斜面培养基包含以下组分：葡萄糖15-22g/L，酵母抽提物3-8g/L，蛋白胨1-3g/L，磷酸二氢钾0.5-1.2g/L，硫酸镁0.2-0.8g/L，玉米浆0.2-0.8g/L，琼脂粉10-20g/L。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2）所述的小体积培养容器的体积：步骤3）所述的种子罐的体积：步骤4）所述的主发酵罐的体积为1：80-110：900-1100。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2）所述的种子培养基的体积：小体积培养容器的体积为1：4-5；步骤3）所述的种子培养基的体积：种子罐的体积为1：400-500。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤4）所述的主发酵罐培养基的体积：主发酵罐体积为2-3：5。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤4）所述的补料培养基中葡萄糖和甘油的比例为1-1.5：1；步骤4）所述的补料培养基中大豆水解液与玉米浆的比例为2：0.5；步骤4）所述的补料培养基中氨水的浓度为18-25%，所述的pH范围为7-8.5。
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