CN108359608A - 一种高密度发酵培养纤细裸藻的方法 - Google Patents

一种高密度发酵培养纤细裸藻的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种高密度发酵培养纤细裸藻的方法，本发明通过对纤细裸藻发酵所用的营养液和培养条件进行优化，釆用传统的好氧发酵法，在3000L发酵罐（发酵前中期采用相对较高温）进行高密度培养，该培养方法既降低了发酵成本，又能降低发酵过程的控制难度，发酵结束后裸藻生物量干重能达到20～25g/L。远远优于传统自养培养方式，而且由于采用条件可控的培养设备，致使纤细裸藻生产的参数和质量都可控。

Description

一种高密度发酵培养纤细裸藻的方法
技术领域
本发明涉及一种裸藻的规模化生产方法，具体涉及一种高密度发酵培养纤细裸藻的方法，属于微生物（微藻）发酵领域。
背景技术
裸藻，又称眼虫，是由17世纪著名的生物学家列文虎克发现并命名，纤细裸藻属裸藻门，裸藻纲，裸藻目中的一种单细胞藻类，因除自身含有叶绿素能够进行光合作用外，还能够自主利用自然界有机碳源进行自主营养，具有动物和植物双重特性，裸藻细胞内含有丰富营养成分:维生素、矿物质、氨基酸、不饱和脂肪酸、叶绿素、黄体素、玉米黄质、GABA等59种人体每天必需的营养元素，均是维持人体健康所不可缺少的营养素，虽然早在2013年裸藻就已经被国家卫生部审批为功能性新资源食品原料，但目前工业化养殖技术一直被日本，美国垄断，国内一直还没有突破，裸藻作为食品原材料不仅具有全营养的特性，它还含有独特的裸藻多糖，其具有特殊的大分子多孔结构，可以吸附包裹人体中的有害物质如重金属、嘌呤、胆固醇、中性脂肪、酒精等将它们带出体外，因此具有抗氧化、抗病毒、清除自由基的作用。其抗癌、抗细菌活性，抗病毒(HIV)活性的能力也较为显著。在保护肝脏、缓和过敏性皮炎、抑制嘌呤吸收和预防改善痛风方面更是具有独特作用，又因裸藻同时具有动物和植物两种特性，除自身光合作用进行自养营养方式外，还能够通过摄取外界有机碳源进行异养生殖。
目前，国内纤细裸藻发酵的研究尚处于初级研究阶段，存在诸多问题如：缺乏高产藻株，目前国内很少有相关企业或院校持有具有规模化生产价值的裸藻藻种；大多研究型企业及院校的研究也还处在摇瓶及小规模实验阶段，几乎没有企业或高校能够进行裸藻的规模化生产；培养基的成本需要进一步降低；产物提取及后加工工艺需进一步优化。
在纤细裸藻高密度培养的工业化进程中，当前最迫切的任务有两个，一是能够筛选出高产藻株，二是通过发酵工艺的改变探索最适合纤细裸藻生长的发酵条件，攻克此两点能够为工业化生产的实现提供有力的保障。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供一种高密度发酵培养纤细裸藻的方法。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种高密度发酵培养纤细裸藻的方法，包括如下步骤：
（1）将纤细裸藻纯种接种至培养液中进行摇瓶培养，培养温度为25～35℃，培养转速为150～250rpm，培养时间为20～35h，得初步培养的纤细裸藻；
（2）将初步培养的纤细裸藻转接入营养液中进行恒温恒转速培养，培养温度为25～30℃，培养转速为150～250rpm，培养时间为16～20h，同时测定藻细胞的生物量干重；
（3）步骤（2）得到的藻液中藻细胞的生物量干重大于18～22g/L时，按步骤（1）的培养条件重复进行培养，直至藻种中纤细裸藻生物量干重达到10～12g/L；
（4）步骤（2）得到的藻液中藻细胞的生物量干重达到10～12g/L，直接接种到种子培养液中进行发酵异养培养，异养培养中维持pH值3.5～5.5，培养温度控制在25～35℃，通气量控制在0.3～0.5vvm，培养至发酵罐中营养液葡萄糖耗尽，停止培养；
（5）将步骤（4）种子罐中的藻液以5～10%的接种量接种到装有营养液的下一级发酵罐中进行发酵培养；培养条件为温度22～33℃，通气量0.3～0.5vvm，营养液中葡萄糖浓度通过流加的方式维持在30～50g/L，发酵过程中氮源浓度通过流加氮源溶液使其维持在15～25g/L， pH维持在3.5～5.5；当发酵罐中纤细裸藻生物量达到25-40g/L时，停止补料，至发酵终点糖含量耗至0g/L时，结束发酵。
根据本发明优选的，步骤（2）初步培养的纤细裸藻的接入量为营养液体积的5～10%。
根据本发明优选的，步骤（4）中，步骤（2）得到的藻液中藻细胞的生物量干重达到10～12g/L，直接接种到种子罐中进行发酵异养培养，藻液的接种量为种子培养液体积的5～10%。
根据本发明优选的，步骤（4）中，通过加入盐酸或液碱调节pH值在3.5～5.5。
根据本发明优选的，步骤（1）、（2）中的培养液组分相同，配方如下：硫酸铵0.8～1.2g/L、酵母抽提物10～25g/L、葡萄糖30～50g/L、酸二氢钾1.9～2.lg/L、硫酸镁1. 8～2.2g/L、氯化钙0.14～0.16g/L、硫酸钠5.0～10.0g/L、氯化钾0.6～0.8g/L、磷五水硫酸铜1.4～1.6mg/L、四水氯化锰1.68～1.72mg/L、二水钼酸钠0～0.05mg/L、六水氯化钴0～0.05mg/L、七水硫酸锌2.8～3.0mg/L。
根据本发明优选的，步骤（4）中的种子培养液与步骤（5）中的营养液相同，配方如下：葡萄糖50.0～70.0g/L、酵母抽提物2.9～3.lg/L、谷氨酸钠5.0～15.0g/L玉米浆干粉15～20g/L、硫酸镁1.8～2.2g/L、、磷酸二氢钾1.9～2.lg/L、氯化钙0.14～0.16g/L、硫酸钠5.0～10.0g/L、氯化钾0.6～0.8g/L、五水硫酸铜1.4～1.6mg/L、七水硫酸锌2.8～3.0mg/L、硫酸铵0.8～1.2g/L、二水钼酸钠0～0.05mg/L、四水氯化锰1.68～1.72mg/L、六水氯化钴0～0.05mg/L。
根据本发明优选的，步骤（5）中，所述的氮源溶液为酵母抽提物、玉米浆干粉、谷氨酸钠或蛋白胨中的一种或两种以上混合；通过流加盐酸或液碱的方法调节pH。
根据本发明优选的，步骤（4）和（5）中用于调节营养液pH的盐酸的浓度为10～15%（V/V），液碱的浓度为30～40%（W/V）。
根据本发明优选的，流加葡萄糖溶液的浓度为700～750g/L，氮源溶液的浓度为200～500g/L。
根据本发明优选的，步骤（4）中发酵异养培养用的种子罐体积为200L，罐体装液量为150L。
根据本发明优选的，步骤（5）中所述的发酵罐的体积为3000L，罐体装液量为1500L。
1、本发明通过对纤细裸藻发酵所用的营养液和培养条件进行优化，釆用传统的好氧发酵法，在3000L发酵罐（发酵前中期采用相对较高温）进行高密度培养，该培养方法既降低了发酵成本，又能降低发酵过程的控制难度，发酵结束后裸藻生物量干重能达到20～25g/L。远远优于传统自养培养方式，而且由于采用条件可控的培养设备，致使纤细裸藻生产的参数和质量都可控。
2、本发明采用创新方法通过研发和优化异养发酵培养工艺对其进行规模化培养，通过改变培养工艺改善其细胞内特定的功能性营养物质，从而达到规模化生产。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1
配制培养基
摇瓶培养基的配制方法如下：将配方中的组分四水氯化锰、七水硫酸锌、五水硫酸铜、二水钼酸钠、六水氯化钴称量后，用无菌水充分溶解，制备成母液，酸性条件下（pH 3.5~5.5），121℃高温高压灭菌20min；其他成分称量之后，用无菌水充分溶解后分装至摇瓶，121℃高温高压灭菌20min。
摇瓶培养基配方如下：葡萄糖45g/L、硫酸铵1.0g/L、酵母抽提物10g/L、磷酸二氢钾2.0g/L、硫酸镁2.0g/L、硫酸钠8.0g/L、氯化钙0.15g/L、氯化钾0.7g/L、、四水氯化锰1.7mg/L、二水钼酸钠0.05mg/L、七水五水硫酸铜1.5mg/L、硫酸锌3.0mg/L、六水氯化钴0.05mg/L。
发酵罐培养基的配制方法如下：将配方中的所有组分按比例称量后，用无菌水充分溶解，121℃高压蒸汽灭菌20min，降温后备用。
发酵罐培养基配方如下：葡萄糖70.0g/L、磷酸二氢钾2.0g/L、谷氨酸钠10.0g/L、玉米浆干粉15g/L、硫酸镁2.0g/L、酵母抽提物3.0g/L、硫酸钠8.0g/L、氯化钾0.7g/L、硫酸铵1.0g/L、氯化钙0.15g/L、五水硫酸铜1.5mg/L、七水硫酸锌3.0mg/L、四水氯化锰1.7mg/L、二水钼酸钠0.05mg/L、六水氯化钴0.05mg/L。
高密度发酵培养纤细裸藻的方法，具体步骤如下：
1、取保藏于超低温冰箱的甘油管得纯化纤细裸藻藻种，接种至2支装有50mL营养液的250mL三角揺瓶中置于摇床培养，培养条件为： 温度25℃、转速150rpm，培养周期24h；然后以5%的藻液接种量接种至300支装有50mL营养液的250mL三角揺瓶中传代摇瓶培养19.5h，在摇床中以同样得温度和转速，测定纤细裸藻的生物量干重为11.5g/L时，收集藻液。
2、将揺瓶中得藻液按照10%的按种量按种到装有150L发酵罐营养液的200L一级种子发酵罐中进行发酵培养，培养条件为：温度28℃，通气量0.5vvm， pH在3.5～4.0（利用10%盐酸和30%液碱对pH进行调控），培养48~50h，期间当营养液中中葡萄糖浓度低于5g/L时，停止发酵。
3、将一级种子罐中的藻液150L全部接种至装有1500L发酵罐培养基的3000L下一级发酵罐中进行发酵培养，培养条件为：温度28℃，通气量0.5vvm， pH在3.5～4.0（利用10%盐酸和30%液碱对pH进行调控）。发酵至55h时开始流加葡萄糖溶液（750g/L）和混合氮源溶液（230g/L），混合氮源溶液包含30g/L酵母抽提物、100g/L谷氨酸钠、100g/L玉米浆干粉，培养过程中每隔3h取样检测发酵液中葡萄糖和总氮含量，通过控制流加速率保持发酵液中葡萄糖浓度始终30～50g/L、总氮含量维持在15～25g/L，发酵培养至115h时，结束发酵。通过冷冻干燥检测放罐时发酵液中细胞干重为21.9g/L。
实施例2
一种高密度发酵培养纤细裸藻的方法，按实施例1的方法进行，不同之处在于：
将实施例1一级种子罐中的培养后的藻液150L全部接种至装有1500L营养液的3000L下一级发酵罐中进行发酵培养，培养条件为：温度28℃，通气量0.5vvm，pH在4.5～5.5（利用10%盐酸和30%液碱对pH进行调控）。发酵至60h时开始流加葡萄糖溶液（750g/L）和混合氮源溶液（230g/L），混合氮源溶液包含30g/L酵母抽提物、100g/L谷氨酸钠、100g/L玉米浆干粉，培养过程中每隔3h取样检测发酵液中葡萄糖和总氮含量，通过控制流加速率保持发酵液中葡萄糖浓度始终30～50g/L、总氮含量维持在15～25g/L。继续培养37h，结束发酵。经检测，放罐时发酵液中细胞干重达到28.5g/L。

Claims (10)

1.一种高密度发酵培养纤细裸藻的方法，包括如下步骤：
（1）将纤细裸藻纯种接种至培养液中进行摇瓶培养，培养温度为25～35℃，培养转速为150～250rpm，培养时间为20～35h，得初步培养的纤细裸藻；
（2）将初步培养的纤细裸藻转接入营养液中进行恒温恒转速培养，培养温度为25～30℃，培养转速为150～250rpm，培养时间为16～20h，同时测定藻细胞的生物量干重；
（3）步骤（2）得到的藻液中藻细胞的生物量干重大于18～22g/L时，按步骤（1）的培养条件重复进行培养，直至藻种中纤细裸藻生物量干重达到10～12g/L；
（4）步骤（2）得到的藻液中藻细胞的生物量干重达到10～12g/L，直接接种到种子培养液中进行发酵异养培养，异养培养中维持pH值3.5～5.5，培养温度控制在25～35℃，通气量控制在0.3～0.5vvm，培养至发酵罐中营养液葡萄糖耗尽，停止培养；
（5）将步骤（4）种子罐中的藻液以5～10%的接种量接种到装有营养液的下一级发酵罐中进行发酵培养；培养条件为温度22～33℃，通气量0.3～0.5vvm，营养液中葡萄糖浓度通过流加的方式维持在30～50g/L，发酵过程中氮源浓度通过流加氮源溶液使其维持在15～25g/L， pH维持在3.5～5.5；当发酵罐中纤细裸藻生物量达到25-40g/L时，停止补料，至发酵终点糖含量耗至0g/L时，结束发酵。
2.根据权利要求1所述的高密度发酵培养纤细裸藻的方法，其特征在于，步骤（2）初步培养的纤细裸藻的接入量为营养液体积的5～10%。
3.根据权利要求1所述的高密度发酵培养纤细裸藻的方法，其特征在于，步骤（4）中，步骤（2）得到的藻液中藻细胞的生物量干重达到10～12g/L，直接接种到种子罐中进行发酵异养培养，藻液的接种量为种子培养液体积的5～10%。
4.根据权利要求1所述的高密度发酵培养纤细裸藻的方法，其特征在于，步骤（4）中，通过加入盐酸或液碱调节pH值在3.5～5.5。
5.根据权利要求1所述的高密度发酵培养纤细裸藻的方法，其特征在于，步骤（1）、（2）中的培养液组分相同，配方如下：硫酸铵0.8～1.2g/L、酵母抽提物10～25g/L、葡萄糖30～50g/L、酸二氢钾1.9～2.lg/L、硫酸镁1. 8～2.2g/L、氯化钙0.14～0.16g/L、硫酸钠5.0～10.0g/L、氯化钾0.6～0.8g/L、磷五水硫酸铜1.4～1.6mg/L、四水氯化锰1.68～1.72mg/L、二水钼酸钠0～0.05mg/L、六水氯化钴0～0.05mg/L、七水硫酸锌2.8～3.0mg/L。
6.根据权利要求1所述的高密度发酵培养纤细裸藻的方法，其特征在于，步骤（4）中的种子培养液与步骤（5）中的营养液相同，配方如下：葡萄糖50.0～70.0g/L、酵母抽提物2.9～3.lg/L、谷氨酸钠5.0～15.0g/L玉米浆干粉15～20g/L、硫酸镁1.8～2.2g/L、、磷酸二氢钾1.9～2.lg/L、氯化钙0.14～0.16g/L、硫酸钠5.0～10.0g/L、氯化钾0.6～0.8g/L、五水硫酸铜1.4～1.6mg/L、七水硫酸锌2.8～3.0mg/L、硫酸铵0.8～1.2g/L、二水钼酸钠0～0.05mg/L、四水氯化锰1.68～1.72mg/L、六水氯化钴0～0.05mg/L。
7.根据权利要求1所述的高密度发酵培养纤细裸藻的方法，其特征在于，步骤（5）中，所述的氮源溶液为酵母抽提物、玉米浆干粉、谷氨酸钠或蛋白胨中的一种或两种以上混合；通过流加盐酸或液碱的方法调节pH。
8.根据权利要求1所述的高密度发酵培养纤细裸藻的方法，其特征在于，步骤（4）和（5）中用于调节营养液pH的盐酸的浓度为10～15%（V/V），液碱的浓度为30～40%（W/V）。
9.根据权利要求1所述的高密度发酵培养纤细裸藻的方法，其特征在于，流加葡萄糖溶液的浓度为700～750g/L，氮源溶液的浓度为200～500g/L。
10.根据权利要求1所述的高密度发酵培养纤细裸藻的方法，其特征在于，步骤（4）中发酵异养培养用的种子罐体积为200L，罐体装液量为150L；步骤（5）中所述的发酵罐的体积为3000L，罐体装液量为1500L。
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