CN114302950A - 利用工程化储罐设计来优化裸藻发酵的方法 - Google Patents
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Abstract
本文中的实施例涉及以异养方式培养的方法。本文中的实施例涉及以异养方式培养裸藻属微生物、裂殖壶菌属微生物或小球藻属微生物的方法、系统和生物反应器，包括：在含有一种或多种碳源、一种或多种氮源和一种或多种盐的培养基中培养所述微生物；使pH维持在约2.0至约4.0之间；使温度维持在约20℃至约30℃；以及维持基本上无光的环境；其中所述培养分三个培育阶段进行。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求2019年6月28日所提交的美国临时申请第62/868,343号、2019年6月28日所提交的美国临时申请第62/868,589号和2019年12月30日所提交的美国临时申请第62/954,837号的权益，所述美国临时申请各自以全文引用的方式并入本文中。
发明内容
本文所述的实施方式涉及培养裸藻属微生物、裂殖壶菌属微生物或小球藻属微生物的方法。
本文所述的实施方式涉及以异养方式培养微生物的生物反应器，其包括：储罐，其被配置为容纳用于培养异养微生物的培养基和成分；供气系统，其被配置为将气体引入储罐，从而将储罐内的培养基与微生物混合；其中供气系统包括低压供气装置和高压供气装置。
本文所述的实施方式涉及一种以异养方式培养细小裸藻的方法，其包括：在含有一种或多种碳源、一种或多种氮源和一种或多种盐的培养基中培养细小裸藻；使pH维持在约2.0至约4.0之间；使温度维持在约20℃至约30℃；以及维持基本上无光的环境；其中所述培养分三个培育阶段进行。
细小裸藻，一种单细胞植鞭藻类原生生物，可容易使碳(例如葡萄糖和果糖)和氮(例如玉米浆、酵母提取物和无机氮源)代谢供细胞生长用，并且产生各种代谢物(例如蛋白质、裸藻淀粉/β-1,3葡聚糖，和脂质)。由于细小裸藻在生物技术和食品工业中具有独特潜力，因此为了生产供食品、饮品、保健食品和生物燃料制造使用的多不饱和脂肪酸、蛋白质和裸藻淀粉，已研究如何大规模培育这种微生物。
已证明培养基优化对于研发生物工艺来说极其关键，原因是其影响目标产物的产量和其生产成本。因此，非常需要优化培养基组分以支持微生物生长，同时产生所关注的产物。
细小裸藻已通过光合自养(即，在光和CO2存在下合成糖和其它有机分子)、在烧瓶、光合生物反应器和跑道池系统中培养。然而，露天的池塘系统由于在控制污染和培育参数方面存在限制而不适于裸藻培育。同样，尽管在光合生物反应器中能够精确地维持生长营养物的浓度和培育参数，但利用光合自养方法大规模培养这种微藻已经受到规模扩大的技术挑战和无菌运行大规模光合生物反应器的高成本的限制。由于光养培育裸藻产生生物质的产量因光限制而极低，因此异养培育已经被认为是行业中的首选方法。然而，仍非常需要更稳健的发酵工艺，其能够扩大到制造规模，同时维持在实验室规模下所获得的高产量和生产率。
本发明旨在克服本领域中的这些和其它缺陷。
因此，本申请包括一种以异养方式培养裸藻属微生物、裂殖壶菌属微生物或小球藻属微生物的方法，其包括：
第一步骤：在含有一种或多种碳源、一种或多种氮源和一种或多种盐的第一培养基中分批培养裸藻属微生物、裂殖壶菌属微生物或小球藻属微生物；以及
第二步骤：使用含有一种或多种碳源、一种或多种氮源和一种或多种盐的第二培养基分批加料培养裸藻属微生物、裂殖壶菌属微生物或小球藻属微生物。
在另一个实施方式中，所述方法进一步包括第三步骤：使用含有一种或多种碳源、一种或多种氮源和一种或多种盐的第三培养基连续地培养微生物。
本文所述实施方式的另一个方面是如本文所述的培养基。
本申请的又一个方面是以异养方式培养微生物的生物反应器。所述生物反应器包括：储罐，其被配置为容纳用于培养异养微生物的培养基和成分；供气系统，其被配置为将气体引入储罐中，从而使储罐内的培养基与微生物混合，其中所述供气系统包括低压供气装置和高压供气装置。
本申请的又另一个方面是用于生产生物质的系统。所述系统包括并联连接的多个生物反应器，各生物反应器包括：单独的储罐；多个输入系统，其被配置为将培养基、微生物和成分分别供应到每个生物反应器储罐中；供气系统，其被配置为将气体引入每个生物反应器储罐中，其中所述供气系统包括低压供气装置和高压供气装置。
本申请的又另一个方面是以异养方式培养微生物的方法。这种方法包括：在含有一种或多种碳源、一种或多种氮源、一种或多种糖、一种或多种醇、一种或多种油和一种或多种盐的培养基中培养微生物；使pH维持在约2.0至约4.0之间；使温度维持约20℃至约30℃；以及维持基本上无光的环境；其中所述培养是在储罐内进行，所述储罐被配置为容纳培养基、供气系统，所述供气系统被配置为将气体引入储罐中，从而能够使储罐内的培养基与微生物混合，其中所述供气系统包括低压供气装置和高压供气装置。
附图说明
图1描绘实施例3发酵的细小裸藻生长特征。
图2描绘实施例4发酵的细小裸藻生长特征。
图3呈现实施例6的100％新制培养基对照。每个周期的时间(h)位于x轴上，而y轴呈现DCW(g/L)、OD(600nm)、pH和细胞计数(细胞数/毫升)。
图4呈现实施例6的补充有葡萄糖的50％再循环混合型培养基。每个周期的时间(h)位于x轴上，而y轴呈现DCW(g/L)、OD(600nm)、pH和细胞计数(细胞数/毫升)。
图5A和5B是呈现培养基中的营养物概况的曲线图。图5A呈现100％新制生长培养基，而图5B呈现补充有葡萄糖的50％再循环混合型培养基中的随时间变化的营养物水平。x轴呈现时间(h)，以周期1、2和3指示。y轴呈现上清液中的葡萄糖、铵、硫酸铵和钾浓度(g/L)。
图6呈现实施例7中的100％新制培养基对照生物反应器。每个阶段的培育时间(h)位于x轴上，而y轴呈现DCW(g/L)、OD(600nm)、pH、葡萄糖(g/L)和细胞计数(细胞数/毫升)。培养阶段(分批、分批加料或连续)标识于图下方。
图7呈现实施例7中的再循环混合型培养基生物反应器。每个阶段的培育时间(h)位于x轴上，而y轴呈现DCW(g/L)、OD(600nm)、pH、葡萄糖(g/L)和细胞计数(细胞数/毫升)。培养阶段(分批、分批加料或连续)标识于图下方。
图8描绘细小裸藻使用混合型培养基连续发酵期间的生长数据。
图9描绘细小裸藻使用混合型培养基连续发酵的主要培育参数。
图10描绘细小裸藻使用混合型培养基连续发酵期间的加料、收获和生产率趋势。
图11描绘细小裸藻使用混合型培养基连续发酵期间的排气数据趋势。
图12描绘CEDEX生物分析仪对细小裸藻使用混合型培养基连续发酵期间所采集的样本进行的代谢物概况分析。
图13描绘细小裸藻使用新制培养基连续发酵期间的对照生长数据。
图14描绘细小裸藻使用新制培养基的对照连续发酵的主要培育参数。
图15描绘细小裸藻使用新制培养基连续发酵期间的对照加料、收获和生产率趋势。
图16描绘细小裸藻使用新制培养基连续发酵期间的对照排气数据数据。
图17描绘CEDEX生物分析仪对细小裸藻使用新制培养基连续发酵期间所采集的对照样本进行的代谢物概况分析。
图18是条形图，其展示在较低浓度的酸(0.0005g/L至0.05g/L)存在下、在48小时结束时的转化效率(wt％)和生物质产量/碳克数。
图19是条形图，其展示使用低浓度酸(0.0005g/L至0.05g/L)发酵48小时时间段期间的酸净消耗。
图20是曲线图，其描绘在低含量的酸(0.0005g/L至0.05g/L)存在下，葡萄糖浓度随时间的变化。
图21的曲线图A至E展示酸浓度随时间的变化(较高的酸浓度，2g/L至5g/L)(22A：丙酮酸盐；22B：苹果酸盐；22C：乳酸盐；22D：丁二酸盐；22E：反丁烯二酸盐)。
图22是条形图，其展示在含有葡萄糖(15g/L)的培养基中、在低浓度和更高浓度的酸存在下、在48小时结束时的净葡萄糖消耗的比较情况。
图23是曲线图，其展示在高含量的酸(2g/L至5g/L)存在下，葡萄糖浓度随时间的变化。
图24是曲线图，其展示当较高浓度的酸单独使用或与葡萄糖组合使用时，发酵期间的净生物质变化(g/L)。
图25是条形图，其展示在发酵期间使用较高浓度的酸时，在以下两种情况之间，酸部分对生物质的贡献的比较：单独的酸作为碳源，或随葡萄糖一起。
图26是细小裸藻在发酵期间所消耗的不同输入和潜在输出所利用的代谢路径的示意图。
图27是与所公开的实施方式一致的包括多个生物反应器储罐在内的生物反应器系统的示意图；
图28是与所公开的实施方式一致的示例性生物反应器储罐的横截面示意图；
图29是喷淋器栅格的俯视图，其可与和所公开的实施方式一致的图28的生物反应器储罐组合使用；以及
图30是表格，其展示在大型生产生物反应器储罐中使用精细喷淋器和粗糙喷淋器的生产测试结果。
图31呈现实施例14中的300L生物反应器储罐。运行的时间(h)位于x轴上，而y轴呈现DCW(g/L)、比消耗速率(mg/g,DCW/h)、生产率(g/L/h)和比生长速率(μ,1/h)。
图32呈现实施例14中的300L生物反应器储罐。运行的时间(h)位于x轴上，而y轴呈现DCW(g/L)、葡萄糖浓度(g/L)、加料速率(L/h)和容积(L)。
图33呈现实施例14中的300L生物反应器储罐。运行的时间(h)位于x轴上，而y轴呈现搅速(RPM)、pH、DO(％)和空气流速(slpm)。
图34呈现实施例14中的7000L生物反应器储罐。分批运行的时间(h)位于x轴上，而y轴呈现DCW(g/L)、葡萄糖浓度(g/L)和总DCW(kg)。
图35呈现实施例14中的7000L生物反应器储罐。分批运行的时间(h)位于x轴上，而y轴呈现DCW(g/L)、比消耗速率(mg/g,DCW/h)、生产率(g/L/h)和比生长速率(μ,1/h)。
图36呈现实施例14中的7000L生物反应器储罐。运行的时间(h)位于x轴上，而y轴呈现搅速(RPM)、pH、DO(％)和空气流速(m3/min)。
具体实施方式
除非另外指明，否则本章节和其它章节中所述的定义和实施方式旨在适用于本文所述的本申请的所有实施方式和方面，这些实施方式和方面适合于本领域技术人员所理解的实施方式和方面实施方式。
除非上下文另外明确规定，否则如本申请中所用，单数形式“一(a)”、“一(an)”和“所述(the)”包括多个提及物。因此，举例来说，提及“细胞”包括单个细胞以及相同或不同细胞中的两个或更多个细胞。
除非本公开的上下文另有说明，或与此类解释不一致，否则字词“约”当紧邻于一个数值之前时，意指所述值的正或负10％的范围，例如“约50”意指45到55，“约25,000”意指22,500到27,500等。举例来说，在例如“约49、约50、约55”等数值清单中，“约50”意指延伸到比前一值与后续值之间的区间的一半更小的范围，例如，大于49.5到小于52.5。另外，应根据本文所提供的术语“约”的定义来理解短语“小于约”某个值或“大于约”某个值。如本文所用，例如“基本上”、“约”和“大约”的程度术语意指所修饰术语的不明显改变最终结果的合理偏离量。
如本文所用，术语“和/或”意指所列项单独地或组合地存在或采用。实际上，此术语意指采用或存在所列项中的“至少一项”或“一项或多项”。
术语“分批”培养是指允许细胞消耗所有培养基直至生长停止(通常约2天)的培养。
与“包括(including)”、“含有(containing)”或“特征在于(characterized by)”同义的过渡术语“包含(comprising)”是包括性的或开放式的，并且不排除附加的、未列出的其它元素或方法步骤。相比之下，过渡短语“由……组成”排除权利要求中未指出的元素、步骤或成分。过渡短语“基本上由……组成”将权利要求的范围限制于指定的材料或步骤，以及“实质上不影响本发明的基本和新颖特征”的那些材料或步骤。在术语包含作为过渡短语使用的实施方式或权利要求书中，此类实施方式还能够设想成术语“包含”被术语“由……组成”或“基本上由……组成”替换。
术语“连续”培养是指培养方法，其中从培养物中移出一定体积的细胞和培养基，收获细胞并且用新培养基置换所移出的。连续培养实现了裸藻生产优化以及废弃物减少。加料是基于消耗速率以及与生长相同的收获速率，从而延长指数生长期，即，输入系统中的培养基的量与从系统中收获或移出的量匹配。使用连续系统的优点是能够实现自动化，甚至大规模生产，并且限制人为误差。
术语“离心分离液”或短语“用过的生长培养基”是指已用于细胞培养的培养基，即，其中的生长组分含量比培养初始时更低的培养基。用过的生长培养基也根据用于培养细胞之后的培养基中的碳水化合物含量来确定。
如本文中关于裸藻培养所用的术语“加料”和“加入”是指将含有营养物的培养基添加到培养物中。
如本文所用，术语“分批发酵”是指在容器中培育微生物的工艺，所述容器装填有碳和能源而无需添加或移出主要底物或产物流直至所述工艺完成为止。如本文所用，术语“分批培育”是指通过分批发酵进行培育。
如本文所用，术语“分批加料发酵”是指在容器中培育微生物的工艺，所述容器被频繁地或连续地加入含有生长限制营养物的加料溶液而不移出培养液。因此，培养物体积随着时间增加。如本文所用，术语“分批加料培育”是指通过分批加料发酵进行培育。
术语“收获的培养物”是指从一些或全部培养基中分离出的浓缩细胞。收获的培养物可用于接种另一个生物反应器或用于下游处理以产生经分离的生物质或纯化的油、蛋白质、β-葡聚糖或其它组分。
如本文中关于例如裸藻培养物所用的术语“收获”是指从一些或全部培养基中分离出裸藻细胞。术语“收获的培养物”是指分离出来的例如裸藻细胞。
如本文所用，术语“适合”意指特定化合物或条件的选择将取决于待执行的特定合成操作以及待转化的分子特性，但所述选择完全在本领域中经过训练的个人的技能范围内。
在提供值范围的情况下，旨在所述范围的上限与下限之间的每个中间值以及那个所述范围内的任何其它所述值或中间值都涵盖于本公开内。举例来说，如果陈述范围1mL至8mL，则旨在也明确公开2mL、3mL、4mL、5mL、6mL及7mL，以及大于或等于1mL的值的范围和小于或等于8mL的值的范围。
了解本申请的范围时，如本文所用的术语“包含”和其派生词旨在是开放式术语，其指明了存在所述特征、元素、组分、组、整数和/或步骤，但不排除其它未述特征、元素、组分、组、整数和/或步骤的存在。前述也适用于具有类似含义的词语，例如术语“包括”、“具有”和其派生词。如本文所用，术语“由……组成”和其派生词旨在是封闭式术语，其指明了存在所述特征、元素、组分、组、整数和/或步骤，但排除其它未述特征、元素、组分、组、整数和/或步骤的存在。如本文所用，术语“基本上由……组成”旨在指明了存在所述特征、元素、组分、组、整数和/或步骤，以及实质上不影响特征、元素、组分、组、整数和/或步骤的基本和新颖特征的那些。
如本文所用，术语“异养”、“异养环境”或派生词是指生物体(例如微生物，包括裸藻)处于使得其基本上完全从外源有机碳源获得营养物(例如碳水化合物、脂质、醇、羧酸、糖醇、蛋白质或其组合)的条件下。举例来说，裸藻是异养生物，其存在于基本上无光的环境中。
如本文所用，术语“光养”或派生词是指生物体(例如微生物，包括裸藻)处于使得其能够捕获光子以获取能量的条件下。举例来说，当生物体是光养时，其进行光合成来产生能量。
如本文所用，术语“母种培养物”是指随时间连续培养的细胞培养物，其中按进度而不依赖于本文所述的实验条件来移出或补充培养基和细胞。
“培育”、“培养”和“发酵”以及其变化形式意指通过使用培养条件来有意促进一个或多个细胞(例如细小裸藻)的生长和/或繁殖。预定的条件排除自然界中的微生物生长和/或繁殖(没有直接的人为干预)。术语“培育”和其变化形式是指通过使用预定的培养条件来有意促进一个或多个细胞生长(细胞尺寸、细胞含量和/或细胞活跃度的增加)和/或繁殖(细胞数量经由有丝分裂而出现的增加)。生长和繁殖的组合可以被称为增殖。一个或多个细胞可以是微生物(例如细小裸藻)的细胞。预定条件的实例包括生物反应器中使用成分确定的培养基(具有已知特征，例如pH、离子强度和碳源等)、指定的温度、氧张力、二氧化碳水平，和生长。
“干重”和“细胞干重”意指在相对缺乏水的情况下测定的重量。举例来说，提及微藻生物质包含指定百分比(以干重计)的特定组分意指所述百分比是基于基本上全部的水已去除之后的生物质重量来计算。干重的一种量度是每升所产生的干生物质克数(gDCW/L)。
“生长”意指细胞尺寸、总细胞含量和/或单个细胞的细胞质量或重量的增加，包括由于固定碳源转化成细胞内的油而出现的细胞重量的增加。
“增加的脂质产量”意指微藻培养物的脂质/油生产率增加，此能够如下实现：例如增加每升培养物中的细胞干重、增加含有脂质的细胞的百分比，和/或增加每单位时间每升培养体积的脂质总量。
“微藻生物质”、“藻生物质”和“生物质”意指通过微藻细胞生长和/或繁殖而产生的一种物质。生物质可以含有细胞和/或细胞内内容物以及细胞外物质。细胞外物质包括(但不限于)细胞分泌的化合物。
“微藻粉”是适合人类食用的干燥颗粒组合物，其包含微藻细胞，例如裸藻。
“微藻油”和“藻油”意指微藻细胞产生的任一种脂质组分，包括三酰基甘油(“TAG”)。
“油”意指生物体(包括微藻、其它植物和/或动物)产生的任何三酰基甘油(或三酸甘油酯油)。除非另外指明，否则有别于“脂肪”的“油”是指在正常的室温和压力下一般是液体的脂质。举例来说，“油”包括来源于植物的蔬菜油或籽油，包括(但不限于)来源于以下的油：大豆、油菜籽、菜籽、棕榈、棕榈仁、椰子、玉米、橄榄、葵花、棉籽、萼距花、花生、亚麻荠、芥菜籽、腰果、燕麦、羽扇豆、洋麻、金盏草、大麻、咖啡、亚麻仁、榛子、大戟、南瓜籽、芫荽、山茶、芝麻、红花、稻米、桐油树、可可、椰仁干、鸦片罂粟、蓖麻豆、碧根果、荷荷芭、麻风果、澳洲坚果、巴西坚果和鳄梨以及其组合。
“增殖”意指生长与繁殖的组合。
“繁殖”意指经由有丝分裂或其它细胞分裂而出现的细胞数目增加。
如本文所用，术语“基本上不含”是指光或组分的完全缺乏或几乎完全缺乏。举例来说，“基本上不含”水的组合物完全地缺乏水，或几乎完全地缺乏水以致效果与其完全缺乏水时相同。
提及体积比例时，“V/V”或“v/v”意指组合物中的一种物质的体积与组合物体积的比率。举例来说，提及包含5％v/v微藻油的组合物意指组合物体积的5％是由微藻油构成(例如具有100mm3体积的此类组合物将含有5mm3微藻油)，并且组合物的剩余体积(例如在实例中是95mm3)是由其它成分构成。
提及重量比例时，“W/W”或“w/w”意指组合物中的一种物质的重量与组合物重量的比率。举例来说，提及包含5％w/w微藻生物质的组合物意指组合物体积的5％是由微藻生物质构成(例如具有100mg重量的此类组合物将含有5mg微藻生物质)，并且组合物的剩余重量(例如在实例中是95mg)是由其它成分构成。
如本文所用且以gDCW/L/hr度量的术语“生物质生产率”是每小时每升培养物产生的干生物质克数，并且也称为体积生产率。
如本文所用，术语“化学恒定发酵”、“恒化发酵”或“连续发酵”是指在容器中培育微生物的工艺，其中连续地或半连续地向培养物中加入含有生长限制营养物的加料溶液，并且同时或立即或随后不久从其中收获含有细胞、代谢物、废产物和任何未用营养物的流出溶液。在这种类型的连续培养中，用作生长容器的容器称为恒化器。在恒化发酵中，连续地控制加料流速、底物浓度、pH、温度和氧水平。如本文所用，术语“化学恒定地培育”、“恒化培育”或“连续地培育”是指通过化学恒定发酵、恒化发酵或连续发酵进行的培育。
如本文所用，术语“葡萄糖限制的培育”是指细胞生长受到培养基中的葡萄糖浓度限制的条件。
如本文所用，术语“滞留时间”是一个生物反应器体积的加料培养基供应到生物反应器时的时间/持续时间。
如本文所用，术语“比葡萄糖摄取速率”是通过测定一小时内有多少克葡萄糖被消耗而产生1克干燥生物质来测得。用于测定比葡萄糖摄取速率的公式是
如本文所用，术语“比生长速率”是群体中的细胞数量增加的速率。用于测定比生长速率的公式是
最高速率称为μmax并且其单位是h-1。
如本文所用，术语“清除”是指细胞复制的速率比在恒化发酵期间移出的细胞低。
缩写“DW”是指蒸馏水。
缩写“PW”是指纯化水。
缩写“RPM”是指转数/分钟。
缩写“VVM”是指每分钟每个培养物体积的空气供应体积。
缩写“OUR”是指氧摄取/利用速率，其是每小时每升培养物消耗多少摩尔O2。
缩写“CER”是指二氧化碳释放速率，其是每小时每升培养物产生多少摩尔CO2。
缩写“RQ”是指呼吸商数/系数，它其在呼吸期间所产生(例如由裸藻产生)的二氧化碳的体积与所消耗(例如被裸藻消耗)的氧气的体积的比率。
缩写“pO2”或“pO2”是指氧气分压并且是液体培养基上方的顶部空间的气相中的氧气浓度。
缩写“DO”是指溶氧并且是液体培养基中所溶解的氧气。
本文中收集了说明书、实施例和权利要求书中所用的某些术语。除非另外定义，否则本公开所用的所有技术和科学术语均具有与本公开所属领域的普通技术人员通常所了解相同的含义。
现将在下文中更充分地描述各个方面。然而，这些方面可以多种不同形式实施，并且不应被解释为限于本文所阐述的实施方式；相反，提供这些实施方式是为了使本公开透彻和完整并且将把本公开的范围充分地传达给本领域的技术人员。除非上下文另有说明，否则本发明的既定方面、特征、实施方式或参数的优先项和选项应被视为已经与本发明的所有其它方面、特征、实施方式和参数的任何和所有优先项和选项组合公开。
一种命名为细小裸藻(下文中称裸藻)的特定藻种属于一类单细胞微观藻，其常用作实验室研究和技术应用的候选物种。裸藻具有真核细胞所特有的代表性特征，例如线粒体、细胞核和溶酶体。裸藻的特征可进一步是其长鞭毛和红色大眼点。其独特之处在于其类似于植物，能够滋养自己(自养)，并且如同动物一般进食且消化外部食物来源(异养)。裸藻是一种被证实的用于研究的多方面模型生物体。通过优化使用单一滋养模式或两种滋养模式的天然能力，通过调整生产工艺中的关键参数能够引导裸藻产生目标化合物。这些关键调整可用于增强微生物的天然机制，促进有价值的产物快速生长和高效转化，而产生的废弃物极少。
细小裸藻具有规模化培育潜力，其利用其再循环物料、经由输入组分的高效转化来产生目标输出产物，从而最大化产量，这是工业降低成本的关键。可以操控与主要培养参数(如碳源和氮源，以及光及温度)有关的这些因素，以构建一组条件来专门用于必需的膳食增补剂(如油和蛋白质)的产品研发。为了大规模生产这些必需的营养物而在环境背景下设计的细小裸藻生长优化将经由藻类培养基回收来有助于限制废弃物且最大化效率。需要对环境友好的以工业规模生产营养物的替代解决方案，尽管这种解决方案不简单。藻类和其商业化废弃物能很好地化解这个危机，即减少工业废弃物足迹，同时充当膳食增补剂的有前景的营养源。
在鼓泡塔生物反应器中，细小裸藻使用生长培养基进行异养生长。鼓泡塔生物反应器是用于在液相中悬浮活细胞生长的高圆筒形生物反应器，其利用在塔底处喷射空气而在液体内形成气泡。气泡产生给混合形成了必要的液体扰动。鼓泡塔生物反应器的纵横比(容器高度与容器直径的比率)通常在4与6之间。在一些实施方式中，在多个生长周期阶段，实施细小裸藻细胞培养物的生产或使细胞从种子培养扩增到商业生产规模。这由以下组成：通过使用一系列发酵罐，以多个阶段将细小裸藻细胞培养物培养到必需的细胞密度和体积。为了优化生长和靶细胞组合物，配制用于生长细小裸藻细胞的初始生长培养基。将浓缩的加料培养基加入细小裸藻培养物中以提高初始生长培养基中的细胞浓度，所述浓缩的加料培养基可以是浓缩培养基成分的独特组合，或者是相同类型的组合的浓缩培养基成分的组，和/或单独的浓缩培养基成分。用于培养细小裸藻的生长培养基包含一种或多种可发酵碳源、一种或多种不可发酵碳源、一种或多种氮源、盐和矿物质的组合，以及维生素的组合。发酵罐系列包括总共12个鼓泡塔生物反应器(2×250L、2×500L、8×20,000L)并且从种子发酵罐串联连接到大型商业发酵罐以便增加容量。较小的250L和500L鼓泡塔生物反应器位于厂区中并且用于将实验室规模的细小裸藻培养从实验室规模达到中等规模，后者在位于厂区的20,000L鼓泡塔生物反应器中充当商业规模最终阶段的接种体或种子培养物。一旦20,000L鼓泡塔生物反应器中的生长周期完成，则首先将培养物输送到缓冲罐中，然后输送到大型碟片堆叠式离心机中进行细胞分离。回收的细胞在第二个好氧或厌氧发酵阶段中培育，或进行破碎以便回收蛋白质或β葡聚糖。主要发酵工艺的主要功能是产生主体成分1,3-β葡聚糖、蛋白质和脂质。
细小裸藻的第一阶段培育
第一阶段的培育阶段始于将100L到125L新制生长培养基接种于250L鼓泡塔生物反应器中。接种体或初始培养物体积在15L与25L之间的范围内并且可来源于实验室或在500L鼓泡塔生物反应器中生长的培养物。
培养物以分批模式生长，即，培养细胞正消耗营养物和尤其是主要碳源，而与培养物无任何外部相互作用。一旦达到碳源的下限阈值，则将浓缩的生长培养基成分加入培养物中以使生长或细胞增殖继续进行。浓缩的生长培养基加入培养物中的速率与细小裸藻细胞在指数生长期(基于培养物中的细胞湿重浓度)期间比碳源消耗速率匹配。在某些实施方式中，碳源的下限阈值是约2g/L至约10g/L、约3g/L至约9g/L、约4g/L至约8g/L，或约5g/L至约7g/L。在某些实施方式中，碳源的下限阈值是约6g/L至约14g/L、约7g/L至约13g/L、约8g/L至约12g/L，或约9g/L至约11g/L。
浓缩碳源经由专门的浓缩碳源加料管线加入，浓缩氮源经由专门的浓缩氮源加料管线加入，并且浓缩盐源经由专门的浓缩盐源加料管线加入。这些专门的浓缩成分加料管线经由气动致动式双座阀连接到鼓泡塔生物反应器的主要加料管线。双座阀能够让两种培养基成分加料流同时流动通过同一个阀而无交叉混合的风险。无菌/工艺用水也有其自身的专门加料管线连到厂区并且经由致动式双座阀连接到生物反应器主要加料管线。
浓缩培养基成分的加料速率是通过致动阀来调节，所述致动阀安装于与鼓泡塔生物反应器连接的主要加料管线上。这个阀连接到本地的可编程逻辑控制器(PLC)且通过其致动，所述可编程逻辑控制器利用计时器控制阀的脉冲频率且从而控制浓缩培养基成分加入到鼓泡塔生物反应器的加料速率。阀开启的频率调节浓缩生长培养基成分加入到培养物中的加料速率。分布式控制系统(DCS)通过致动连接浓缩生长培养基成分加料管线和鼓泡塔生物反应器主加料管路的双座阀来控制浓缩培养基成分加入的顺序。厂区中的培养物自动加料可按照加料进度执行。
将浓缩的生长培养基加入培养物中以匹配细小裸藻在指数生长期(基于培养物中的细胞湿重浓度)期间的比碳源消耗。浓缩培养基成分在生物反应器之间的输送和分布是经由双座阀组执行。
一旦培养物体积达到生物反应器最大工作体积的80％到90％，则经由连接两个容器的蒸汽预灭菌不锈钢编织软管输送管线(3/8")将生物反应器的一部分或全部内容物无菌输送到下一阶段的生物反应器(500L鼓泡塔生物反应器)。在一些实施方式中，最终的细胞湿重在5到250g/L(1.6到80g/L细胞干重)之间、5到80g/L(1.6到25.6g/L)之间、或30到60g/L细胞湿重(6.4到19.2g/L细胞干重)之间的范围内。将250L鼓泡塔生物反应器加压至约10psi至约15psi并且开启到无菌输送软管管线的阀，以便培养物从250L鼓泡塔生物反应器流到500L鼓泡塔生物反应器。
细小裸藻的第二阶段培育
第二阶段的培育阶段始于将100L到200L新制生长培养基接种于500L鼓泡塔生物反应器中。接种体培养物在15L与50L之间的范围内且来源于实验室或来源于250L生物反应器。初始培养物体积典型地在110L到125L之间。
培养物以分批模式培养，即，培养细胞正消耗营养物和主要碳源，而与培养物不发生外部相互作用。一旦达到碳源的下限阈值，则经由专门的加料管线加入浓缩的生长培养基成分以使生长或细胞增殖继续进行。基于培养物中的细胞湿重浓度，以与细小裸藻细胞在指数生长期期间的比碳源消耗速率匹配的速率将浓缩的生长培养基加入培养物中。在某些实施方式中，碳源的下限阈值是约2g/L至约10g/L、约3g/L至约9g/L、约4g/L至约8g/L，或约5g/L至约7g/L。在某些实施方式中，碳源的下限阈值是约6g/L至约14g/L、约7g/L至约13g/L、约8g/L至约12g/L，或约9g/L至约11g/L。
浓缩碳源经由专门的浓缩碳源加料管线加入，浓缩氮源经由专门的浓缩氮源加料管线加入，并且浓缩盐源经由专门的浓缩盐源加料管线加入。这些专门的浓缩成分加料管线经由气动致动式双座阀连接到与鼓泡塔生物反应器连接的主要加料管线。无菌/工艺用水也具有其自身的专门加料管线。
浓缩培养基成分的加料速率是通过致动阀来调节，所述致动阀安装于与鼓泡塔生物反应器连接的主要加料管线上。所述阀连接到本地的可编程逻辑控制器(PLC)并且通过其致动，所述可编程逻辑控制器利用计时器控制浓缩培养基成分加入到鼓泡塔生物反应器的脉冲频率。阀开启的频率调节浓缩生长培养基成分加入到培养物中的加料速率。分布式控制系统(DCS)通过致动连接浓缩生长培养基成分加料管线和鼓泡塔生物反应器主加料管路的双座阀来控制浓缩培养基成分加入的顺序。培养物的自动加料可按照加料进度控制。
基于培养物中的细胞湿重浓度，将浓缩的生长培养基加入培养物中以匹配细小裸藻在指数生长期期间的比碳源消耗。浓缩培养基成分从一个区域向鼓泡塔生物反应器的输送和分布是经由双座阀组执行。双座阀能够让两种培养基成分加料流同时流动通过同一个阀而无交叉混合的风险。
一旦培养物体积达到生物反应器最大工作体积的80％到90％，则生物反应器的一部分或全部内容物经由配备有离心泵的输送管线(2"不锈钢管道)无菌输送到20,000L鼓泡塔生物反应器。在一些情况下，将生物反应器的一部分或全部内容物无菌输送到处理较小研发批料的中试级离心机。在一些实施方式中，最终的细胞湿重在5到250g/L(1.6到80g/L细胞干重)之间、5到80g/L(1.6到25.6g/L)之间、或30到60g/L细胞湿重(6.4到19.2g/L细胞干重)之间的范围内。从控制室中的DCS(分布式控制系统)接口执行将500L生物反应器加压到约10psi至约15psi、致动阀和泵以将培养物从500L生物反应器输送到20,000L生物反应器的工艺。
细小裸藻的第三阶段培育
第三阶段的培育阶段始于使来自500L生物反应器的培养物的400L与900L之间范围内的接种体积和稍微浓缩的新制培养基的体积达到约3100L至3600L总体积。通常，初始体积的培养物是约3400L至4100L培养物。第三阶段培育生长至约30g/L至约100g/L的细胞湿重。
培养物以分批模式生长，直至主要碳源达到下限阈值浓度。一旦达到碳源下限阈值，则将浓缩碳源、浓缩氮源和浓缩盐从三个单独的储存容器加入到培养物中。将浓缩的生长营养物加入培养物中以匹配细小裸藻在指数生长期(基于培养的细小裸藻在取样时的葡萄糖水平和细胞湿重浓度的速率)对碳源的消耗(基于细胞湿重)。在某些实施方式中，碳源的下限阈值是约2g/L至约10g/L、约3g/L至约9g/L、约4g/L至约8g/L，或约5g/L至约7g/L。在某些实施方式中，碳源的下限阈值是约6g/L至约14g/L、约7g/L至约13g/L、约8g/L至约12g/L，或约9g/L至约11g/L。
为了控制细胞密度并且还为了控制细小裸藻细胞中的所需产物组成，调节浓缩培养基或浓缩培养基成分的任何组合加入到培养物中的速率。可以通过安装于鼓泡塔生物反应器上的在线工艺分析探针来测量培养物中的各种生长培养基成分和细胞组成。这些输出可以或可以不同时加以控制。
浓缩培养基或浓缩培养基成分的任何组合加入到培养物中的速率是通过线性或非线性自适应数字控制器来调节，所述自适应数字控制器是通过安装于单独的个人电脑上或作为分布式控制系统(DCS)模块安装的监控与数据采集(SCADA)系统执行。SCADA系统能够利用在线分析探针或经由使用者介面上的操作员数据输入项收集发酵工艺数据。
SCADA基于细胞密度、细胞中的产物组成、培养物中的关键培养基成分、pH和溶氧(DO)的在线输出测量值来执行非线性或线性实时自适应控制算法，以计算和优化浓缩培养基或浓缩培养基成分的任何组合加入到细小裸藻培养物中的加料速率和加料进度。培养物中的细胞密度是约0.1g细胞湿重至约150g细胞湿重。细胞的产物组成是约30％至约60％碳水化合物、约30％至约60％蛋白质和约0％至约20％油。培养物中的关键培养基成分是约0g/L至约40g/L葡萄糖、约0g/L至约5g/L酵母提取物、约0g/L至约7g/L硫酸铵、约0g/L至约5g/L钾，和约0g/L至约5g/L镁。pH是约2至约7。溶氧浓度是约0ppm至约10ppm。浓缩培养基或浓缩培养基成分的任何组合加入到细小裸藻培养物中的加料速率的调节是通过各类生长培养基成分的专门加料管线(其通过双座阀组连接到浓缩培养基成分储存容器)和位于鼓泡塔生物反应器专门用于各种生长培养基成分的加料管线上的高分辨高速泵执行。双座阀能够让两种培养基成分加料流同时流动通过同一个阀而无交叉混合的风险。阀组能够使浓缩的生长培养基成分同时且高效地分布到1个或多个鼓泡塔生物反应器中，同时使用最小的分布管道资源。
根据本文所述的一些实施方式，培养基中的溶氧(DO)是约15％至约100％。在一些实施方式中，DO值是约15％至约90％、约15％至约80％、约15％至约70％、约15％至约60％、约15％至约50％、约15％至约40％、约15％至约30％、约15％至约25％，或约15％至约20％。在本文所述方法的一些实施方式中，比耗氧量是约10mg O2/g DCW/h至30mg O2/g DCW/h，最优地是14mg O2/g DCW/h至20mg O2/g DCW/h。在本文所述方法的一些实施方式中，O2摄取速率是0.1mmol/L/h至40mmol/L/h。在本文所述方法的一些实施方式中，O2摄取速率是0.1mmol/L/h至20mmol/L/h。在本文所述方法的一些实施方式中，比CO2释放速率是10CO2/gDCW/h至40mg CO2/gDCW/h，最优地是20mg CO2/gDCW/h至25mg CO2/gDCW/h。在本文所述方法的一些实施方式中，CO2释放速率是0.1mmol/L/h至40mmol/L/h。在本文所述方法的一些实施方式中，CO2释放速率是0.1mmol/L/h至20mmol/L/h。
浓缩培养基成分从容量为1200L至10,000L不等的培养基储存容器输送到阀组，然后输送到专门的浓缩生长培养基成分加料管线，所述加料管线向主要生物反应器加料。
浓缩的培养基营养物依序脉冲加入到培养物中并且利用驱逐水驱逐出主要加料管线。培养物是基于自动脉冲加料进度加入到生物反应器中。加料进度是预设DCS方案中的指令集，其中详细说明了各种浓缩培养基营养物和驱逐水的加料频率和每次脉冲加料的预定体积。加料进度是基于细胞密度和/或关键培养基成分水平的加料频率。脉冲加料(或加料事件)到培养物中的时序和时间在DCS方案中预设。加料进度是其中输入有浓缩生长培养基的预计算体积的自动指令集，预计算体积是由加料计算器基于细胞湿重浓度计算。待加入的浓缩生长培养基体积可以一个单脉冲递送到生物反应器的培养物中或可以多个脉冲加入。生长培养基以多个脉冲加料的脉冲时序可以在让操作员与PLC建立联系的PLC使用者程序介面中设定。所述程序集成到PLC中。
本公开包括以异养方式培养裸藻属微生物、裂殖壶菌属微生物或小球藻属微生物的方法。
相应地，本申请包括以异养方式培养裸藻属微生物、裂殖壶菌属微生物或小球藻属微生物的方法，所述方法包括：第一步骤：在含有一种或多种碳源、一种或多种氮源和一种或多种盐的第一培养基中分批培养裸藻属微生物、裂殖壶菌属微生物或小球藻属微生物；以及第二步骤：利用含有一种或多种碳源、一种或多种氮源和一种或多种盐的第二培养基分批加料培养裸藻属微生物、裂殖壶菌属微生物或小球藻属微生物。
在一个实施方式中，所述方法进一步包括第三步骤：利用含有一种或多种碳源、一种或多种氮源和一种或多种盐的第三培养基连续培养裸藻属微生物、裂殖壶菌属微生物或小球藻属微生物。
本文所述的所有方法皆适用于裸藻属微生物、裂殖壶菌属微生物或小球藻属微生物。在一个实施方式中，所述微生物选自由以下组成的组：细小裸藻(Euglena gracilis)、血红裸藻(Euglena sanguinea)、静裸藻(Euglena deses)、易变裸藻(Euglenamutabilis)、梭形裸藻(Euglena acus)、绿裸藻(Euglena viridis)、鱼腥裸藻(Euglenaanabaena)、膝曲裸藻(Euglena geniculata)、尖尾裸藻(Euglena oxyuris)、近轴裸藻(Euglena proxima)、三棱裸藻(Euglena tripteris)、衣裸藻(Euglena chlamydophora)、光亮裸藻(Euglena splendens)、编织裸藻(Euglena texta)、中型裸藻(Euglenaintermedia)、多形裸藻(Euglena polymorpha)、带形裸藻(Euglena ehrenbergii)、粘着裸藻(Euglena adhaerens)、洁净裸藻(Euglena clara)、延长裸藻(Euglena elongata)、弹性裸藻(Euglena elastica)、矩圆裸藻(Euglena oblonga)、鱼形裸藻(Euglenapisciformis)、坎塔布裸藻(Euglena cantabrica)、颗粒裸藻(Euglena granulata)、钝顶裸藻(Euglena obtusa)、泽生裸藻(Euglena limnophila)、半色裸藻(Euglenahemichromata)、变异裸藻(Euglena variabilis)、尾裸藻(Euglena caudata)、极小裸藻(Euglena minima)、普通裸藻(Euglena communis)、放大裸藻(Euglena magnifica)、地生裸藻(Euglena terricola)、短尖裸藻(Euglena velata)、拒斥裸藻(Euglena repulsans)、棒形裸藻(Euglena clavata)、拉塔裸藻(Euglena lata)、结核裸藻(Euglenatuberculata)、坎塔布裸藻(Euglena cantabrica)、成梭裸藻(Euglena acusformis)、奥斯坦裸藻(Euglena ostendensis)、自养小球藻(Chlorella autotrophica)、拓殖小球藻(Chlorella colonials)、绿小球藻(Chlorella lewinii)、极微小球藻(Chlorellaminutissima)、垂体小球藻(Chlorella pituita)、类丽小球藻(Chlorellapulchelloides)、蛋白核小球藻(Chlorella pyrenoidosa)、圆形小球藻(Chlorellarotunda)、单生小球藻(Chlorella singularis)、富油小球藻(Chlorella sorokiniana)、变异小球藻(Chlorella variabilis)、涡旋小球藻(Chlorella volutis)、普通小球藻(Chlorella vulgaris)、聚集裂殖壶菌(Schizochytrium aggregatum)、蛞蝓形裂殖壶菌(Schizochytrium limacinum)、米氏裂殖壶菌(Schizochytrium minutum)，和其组合。在另一个实施方式中，所述微生物是细小裸藻。
培养基
本发明的实施方式涉及使用培养基以异养方式培养细小裸藻的方法，所述培养基含有以下各者的组合：一种或多种可发酵碳源、一种或多种不可发酵碳源、一种或多种氮源、盐和矿物质组合以及维生素组合。本发明的实施方式涉及使用含有碳源、氮源和盐的组合的培养基、以异养方式培养细小裸藻的方法。所述培养基利用细小裸藻的所有代谢潜力，包括好氧代谢与厌氧代谢。油、糖、醇、有机氮和无机氮源的组合提高了输入向输出的转化并且加快了微生物生长。
在实施方式中，以异养方式培养细小裸藻的方法包括在含有一种或多种碳源、一种或多种氮源和一种或多种盐的培养基中培养细小裸藻。
在实施方式中，碳源选自油、糖、醇、羧酸、阿魏酸(ferulic acid)和其组合。在实施方式中，油是来源于以下的油：大豆、油菜籽、菜籽、棕榈、棕榈仁、椰子、玉米、橄榄、葵花、棉籽、萼距花、花生、亚麻荠、芥菜籽、腰果、燕麦、羽扇豆、洋麻、金盏草、大麻、咖啡、亚麻仁、榛子、大戟、南瓜籽、芫荽、山茶、芝麻、红花、稻米、桐油树、可可、椰仁干、鸦片罂粟、蓖麻豆、碧根果、荷荷芭、麻风树、澳洲坚果、巴西坚果或鳄梨，以及其组合。在一个实施方式中，油是菜籽油。糖可以选自葡萄糖、果糖、半乳糖、乳糖、麦芽糖、蔗糖、糖蜜、甘油、木糖、右旋糖、蜂蜜、玉米糖浆和其组合。醇可以选自乙醇、甲醇、异丙醇和其组合。在某些实施方式中，碳源是葡萄糖。羧酸可以选自柠檬酸、柠檬酸盐、反丁烯二酸、反丁烯二酸盐、苹果酸、苹果酸盐、丙酮酸、丙酮酸盐、丁二酸、丁二酸盐、乙酸、乙酸盐、乳酸、乳酸盐和其组合。在优选实施方式中，碳源是葡萄糖与有机酸的组合，其中有机酸选自由丙酮酸、苹果酸、丁二酸、乳酸和反丁烯二酸组成的组。
在实施方式中，碳源的工作浓度是约0.0005g/L到约0.5g/L、约0.005g/L到约0.5g/L、约0.05g/L到约1g/L、约0.5g/L到约5g/L、约1g/L到约10g/L、约5g/L到约50g/L、约10g/L到约45g/L、约15g/L到约40g/L、约20g/L到约35g/L、约5g/L到约20g/L、约5g/L到约15g/L、约5g/L到约10g/L的浓度。在实施方式中，碳源的工作浓度是约15g/L的浓度。在实施方式中，碳源的工作浓度是约10g/L的浓度。在实施方式中，碳源的工作浓度是约5g/L的浓度。在实施方式中，碳源的工作浓度是约2g/L的浓度。在实施方式中，碳源的工作浓度是约1g/L的浓度。在实施方式中，碳源的工作浓度是约0.5g/L的浓度。在实施方式中，碳源的工作浓度是约0.1g/L的浓度。在实施方式中，碳源的工作浓度是约0.05g/L的浓度。在实施方式中，碳源的工作浓度是约0.005g/L的浓度。在实施方式中，碳源的工作浓度是约0.0005g/L的浓度。
在实施方式中，浓缩碳源的浓度是约55g/L到约500g/L、约60g/L到约450g/L、约65g/L到约400g/L、约70g/L到约350g/L、约75g/L到约300g/L、约80g/L到约250g/L、约95g/L到约200g/L，或约100g/L到约150g/L。在实施方式中，浓缩碳源的浓度是约300g/L。
在实施方式中，氮源选自由以下组成的组：酵母提取物、硫酸铵、甘氨酸、尿素、丙氨酸、天冬酰胺、玉米浆、肝脏提取物、牛肉浸膏、蛋白胨、脱脂牛奶、豆浆、胰蛋白胨、牛肉提取物、麦黄酮、植物源蛋白胨、豌豆蛋白质、糙米蛋白质、大豆蛋白胨、MSG、天冬胺酸、精氨酸、马铃薯汁和其组合。在某些实施方式中，氮源是酵母提取物。在某些实施方式中，氮源是硫酸铵。在某些实施方式中，氮源是酵母提取物与硫酸铵的组合。
在实施方式中，氮源的工作浓度是约1g/L到约15g/L、约1.5g/L到约12.5g/L、约2g/L到约10g/L、约2.5g/L到约8.5g/L、约3g/L到约8g/L、约3.5g/L到约7.5g/L、约4g/L到约7g/L、约4.5g/L到约6.5g/L、或约5g/L到约6g/L的浓度。在实施方式中，氮源的工作浓度是约10g/L的浓度。在实施方式中，氮源的工作浓度是约5g/L的浓度。在实施方式中，氮源的工作浓度是约2g/L的浓度。
在实施方式中，浓缩氮源的浓度是约34g/L到约100g/L、约36g/L到约190g/L、约38g/L到约180g/L、约40g/L到约170g/L、约42g/L到约160g/L、约44g/L到约150g/L、约46g/L到约140g/L、约48g/L到约130g/L、约50g/L到约120g/L、约52g/L到约110g/L、约54g/L到约100g/L、约56g/L到约90g/L、约58g/L到约80g/L，或约60g/L到约70g/L。在实施方式中，浓缩氮源的浓度是约50g/L到约250g/L、约55g/L到约240g/L、约65g/L到约220g/L、约75g/L到约200g/L、约80g/L到约190g/L、约85g/L到约180g/L、约90g/L到约170g/L、约95g/L到约160g/L、约100g/L到约150g/L、约105g/L到约140g/L、约110g/L到约130g/L、或约115g/L到约120g/L。在实施方式中，浓缩氮源的浓度是约48g/L。在实施方式中，浓缩氮源的浓度是约120g/L。
在实施方式中，盐选自硝酸铵、硝酸钠、磷酸二氢钾、硫酸镁、硫酸镁七水合物、氯化钙、氯化钙二水合物、硫酸钙、硫酸钙二水合物、碳酸钙、磷酸氢二铵、磷酸氢二钾，和其组合。在某些实施方式中，盐是磷酸二氢钾、硫酸镁、氯化钙和其组合。在优选实施方式中，盐是硫酸钙。
在实施方式中，盐源的工作浓度是约0.01g/L到约0.05g/L、约0.01g/L到约5g/L、约0.1g/L到约4.5g/L、约1g/L到约4g/L、约1.5g/L到约3.5g/L、或约2g/L到约3g/L的浓度。在实施方式中，盐源的工作浓度是约0.01g/L的浓度。在实施方式中，盐源的工作浓度是约0.025g/L的浓度。在实施方式中，盐源的工作浓度是约0.05g/L的浓度。在实施方式中，盐源的工作浓度是约0.1g/L的浓度。在实施方式中，盐源的工作浓度是约1g/L的浓度。
在实施方式中，浓缩盐源的浓度是约0.5g/L到约50g/L、约1g/L到约45g/L、约1.5g/L到约40g/L、约2g/L到约35g/L、约2.5g/L到约30g/L、约3g/L到约25g/L、约3.5g/L到约20g/L、约4g/L到约15g/L、约4.5g/L到约10g/L，或约5g/L到约8.5g/L。在实施方式中，浓缩盐源的浓度是约1g/L。在实施方式中，浓缩盐源的浓度是约10g/L。
在实施方式中，培养基进一步包含金属。金属选自氯化铁(III)、硫酸铁(III)、硫酸亚铁铵、硫酸铁铵、氯化锰、硫酸锰、硫酸锌、氯化钴、钼酸钠、氯化锌、硼酸、氯化铜、硫酸铜、七钼酸铵和其组合。
在实施方式中，培养基进一步包含维生素混合物。维生素混合物含有以下的组合：生物素(维生素B7)、硫胺(维生素B1)、核黄素(维生素B2)、烟酸(维生素B3)、泛酸(维生素B5)、吡哆醇(维生素B6)、氰钴维生素(维生素B12)、维生素C、维生素D、叶酸、维生素A、维生素B12、维生素E、维生素K和其组合。
在实施方式中，浓缩的生长培养基包含约300g/L到约500g/L葡萄糖、约150g/L酵母提取物、约48g/L到约200g/L硫酸铵、约10g/L到约200g/L磷酸二氢钾、约10g/L到约250g/L硫酸镁，和约1g/L到2g/L硫酸钙。
在实施方式中，新制生长培养基包含约10g/L到约20g/L葡萄糖、约2g/L到约5g/L酵母提取物、约2g/L到约7g/L硫酸铵、约1g/L到约5g/L磷酸二氢钾、约1g/L到约5g/L硫酸镁，和约0.1g/L到0.5g/L硫酸钙。
在实施方式中，稍微浓缩的新制培养基在新制生长培养基的浓度与浓缩培养基的浓度之间的范围内。
在实施方式中，培养基的pH是约2.5到约4。
培养基(也称为生长培养基)是含有为了生长或培养如本文所述的细胞而必需的组分的培养基。加料培养基是含有为了补充营养物而添加到培养物中的组分的培养基。加料培养基中的组分处于限制培养物稀释的工作浓度或浓缩水平下。加料培养基是含有为了补充营养物而添加到培养物中的组分的培养基。加料培养基中的组分处于限制培养物稀释的工作浓度或浓缩水平下。用过的培养基是已用于细胞培养的培养基，即，其中的培养组分的含量比培养开始时低的培养基。
其它培养基可以是培养基、加料培养基、再循环培养基、用过的培养基、补充的培养基，和其组合。培养基(也称为生长培养基)是含有为了生长或培养细胞而必需的组分的培养基。其还可称为生长培养基。加料培养基是含有为了补充营养物而添加到培养物中的组分的培养基。加料培养基中的组分处于限制培养物稀释的工作浓度或浓缩水平下。加料培养基是含有为了补充营养物而添加到培养物中的组分的培养基。用过的培养基是已用于细胞培养的培养基，即，其中的培养组分的含量比培养开始时低的培养基。
用过的培养基也根据用于培养细胞之后的培养基中的碳水化合物含量来确定。举例来说，用过的培养基可以含有小于约50、40、30、20、15、10、8、7、6、5、4、3、2.5、2、1.5、1、0.5、0.4、0.3、0.2、0.1g/L的总碳水化合物、单独碳水化合物(例如葡萄糖)，或单独碳水化合物组分(例如葡萄糖和麦芽糖)的任何组合。用过培养基中的碳水化合物的耗乏可以用培养或培养周期开始时的碳水化合物初始量的百分比表示。在一个实施方式中，用过的培养基包含的总碳水化合物是培养或培养周期开始时的量的小于约15、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1、0.9、0.8、0.7、0.6、0.5、0.4、0.3、0.2、0.1、0.05、0.01、0.005、0.001％。除碳水化合物之外，羧酸也是裸藻属微生物、裂殖壶菌属微生物或小球藻属微生物所利用的另一种碳。适用的羧酸包括柠檬酸、柠檬酸盐、反丁烯二酸、反丁烯二酸盐、苹果酸、苹果酸盐、丙酮酸、丙酮酸盐、丁二酸、丁二酸盐、乙酸、乙酸盐、乳酸和乳酸盐。在一个实施方式中，用过的培养基、再循环的培养基或混合式培养基包含小于约20、10、5、4、3、2、1、0.5、0.4、0.3、0.2或0.1g/L的羧酸。
再循环的培养基是用过的培养基，其用于培养细胞以便完成另一次传代、周期，或用于培养来自不同培养物、批次或株系的细胞。再循环的培养基是通过从源培养基中分离出所再循环的培养基而获得，其中源培养基处于停滞期、指数期或稳定期。再循环的培养基可以是唯一用过的培养基，或可以将其与培养基(新制生长培养基)混合且/或以用过培养基中耗尽的一种或多种组分补充。再循环的培养基可以通过从源培养基中分离出所再循环的培养基而获得，其中源培养基处于停滞期、指数期或稳定期。
混合式培养基(在本文中也称为混合型培养基或再循环的混合型培养基)是含有一定量的再循环培养基的培养基(例如新制培养基与再循环培养基的混合物)。在一些实施方式中，根据本文所述的方法使用混合式培养基。在一些实施方式中，混合式培养基包含约10％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99 2％、99.3％、99.4％、99.5％、99 6％、99.7％、99 8％、99 9％或99.99％的再循环培养基。在一些实施方式中，混合式培养基包含约10％到约75％的再循环培养基。在一些实施方式中，混合式培养基任选地补充有碳源。适合根据本发明的实施方式使用的培养基也可以发现于同在申请中的PCT/IB2019/055524中，所述文献于2019年6月28日提交并且于2020年1月2日作为WO/2020/003243公开，所述文献以全文引用的方式并入本文。
为了繁殖生物质，根据本发明的方法，在液体培养基中培养裸藻属微生物、裂殖壶菌属微生物和/或小球藻属微生物。在本发明的方法中，在含有一种或多种碳源、一种或多种氮源和/或一种或多种盐的培养基中以异养方式生长微藻物种。本文所述的培养基组分(例如碳源、氮源和/或盐)的浓度或量是指此类组分的总浓度或总量以及一种或多种单独来源(例如碳源、氮源和/或盐)的浓度或量。举例来说，如下文所述，可以将碳源供应到培养物中，以在培养基中提供约0.0005g/L到约50g/L的碳源浓度。此类浓度具体包括培养基中的总碳源浓度以及培养基中的一种或多种单独碳源的浓度(例如一种或多种有机酸的浓度)。
在实施方式中，第一培养基、第二培养基和第三培养基中的一种或多种碳源彼此独立地选自油、糖、醇、羧酸、马铃薯汁、阿魏酸和其组合。在实施方式中，油是来源于以下的油：大豆、油菜籽、菜籽、棕榈、棕榈仁、椰子、玉米、橄榄、葵花、棉籽、萼距花、花生、亚麻荠、芥菜籽、腰果、燕麦、羽扇豆、洋麻、金盏草、大麻、咖啡、亚麻仁、榛子、大戟、南瓜籽、芫荽、山茶、芝麻、红花、稻米、桐油树、可可、椰仁干、鸦片罂粟、蓖麻豆、碧根果、荷荷芭、麻风树、澳洲坚果、巴西坚果或鳄梨，以及其组合。在一个实施方式中，油是菜籽油。糖可以选自葡萄糖、果糖、半乳糖、乳糖、麦芽糖、蔗糖、糖蜜、甘油、木糖、右旋糖、蜂蜜、玉米糖浆和其组合。醇可以选自乙醇、甲醇、异丙醇和其组合。在某些实施方式中，碳源是葡萄糖。羧酸可以选自柠檬酸、柠檬酸盐、反丁烯二酸、反丁烯二酸盐、苹果酸、苹果酸盐、丙酮酸、丙酮酸盐、丁二酸、丁二酸盐、乙酸、乙酸盐、乳酸、乳酸盐和其组合。在一个实施方式中，第一培养基、第二培养基和第三培养基中的一种或多种碳源彼此独立地选自葡萄糖、右旋糖、果糖、糖蜜、甘油或其组合。
在实施方式中，第一培养基、第二培养基和第三培养基中的一种或多种氮源彼此独立地选自酵母提取物、硫酸铵、甘氨酸、尿素、丙氨酸、天冬酰胺、玉米浆、肝脏提取物、牛肉浸膏、蛋白胨、脱脂牛奶、豆浆、胰蛋白胨、牛肉提取物、麦黄酮、植物源蛋白胨、豌豆蛋白质、糙米蛋白质、大豆蛋白胨、MSG、天冬胺酸、精氨酸、马铃薯汁和其组合。在某些实施方式中，氮源是酵母提取物。在某些实施方式中，氮源是硫酸铵。在某些实施方式中，氮源是酵母提取物与硫酸铵的组合。在一个实施方式中，第一培养基、第二培养基和第三培养基中的一种或多种氮源彼此独立地选自酵母提取物、玉米浆、硫酸铵和谷氨酸单钠(MSG)。
在实施方式中，第一培养基、第二培养基和第三培养基中的一种或多种盐彼此独立地选自硝酸铵、硝酸钠、磷酸二氢钾、硫酸镁、硫酸镁七水合物、氯化钙、氯化钙二水合物、硫酸钙、硫酸钙二水合物、碳酸钙、磷酸氢二铵、磷酸氢二钾和其组合。在某些实施方式中，盐是磷酸二氢钾、硫酸镁、氯化钙和其组合。在一个实施方式中，第一培养基、第二培养基和第三培养基中的一种或多种盐彼此独立地选自磷酸二氢钾、硫酸镁、氯化钙、硫酸钙或其组合。
在实施方式中，培养基中的碳源浓度是约0.0005g/L到约50g/L、约0.0005g/L到约45g/L、约0.0005g/L到约40g/L、约0.0005g/L到约35g/L、约0.0005g/L到约20g/L、约0.0005g/L到约15g/L、约0.0005g/L到约10g/L、约0.0005g/L到约8g/L、约0.0005g/L到约5g/L、约0.0005g/L到约1g/L、约0.0005g/L到约0.5g/L、约0.0005g/L到约0.05g/L、约0.0005g/L到约0.005g/L,0.005g/L到约50g/L、约0.005g/L到约45g/L、约0.005g/L到约40g/L、约0.005g/L到约35g/L、约0.005g/L到约20g/L、约0.005g/L到约15g/L、约0.005g/L到约10g/L、约0.005g/L到约8g/L、约0.005g/L到约5g/L、约0.005g/L到约1g/L,or about0.005g/L到约0.5g/L,0.05g/L到约50g/L、约0.05g/L到约45g/L、约0.05g/L到约40g/L、约0.05g/L到约35g/L、约0.05g/L到约20g/L、约0.05g/L到约15g/L、约0.05g/L到约10g/L、约0.05g/L到约8g/L，或约0.05g/L到约5g/L。在实施方式中，培养基中的碳源浓度是约0.05g/L到约50g/L、约0.05g/L到约45g/L、约0.05g/L到约40g/L、约0.05g/L到约35g/L、约0.05g/L到约20g/L、约0.05g/L到约15g/L、约0.05g/L到约10g/L、约0.05g/L到约8g/L、约0.05g/L到约5g/L、约0.05g/L到约1g/L、约0.05g/L到约0.5g/L、约1g/L到约50g/L、约1g/L到约45g/L、约1g/L到约40g/L、约1g/L到约35g/L、约1g/L到约20g/L、约1g/L到约15g/L、约1g/L到约10g/L、约1g/L到约8g/L，或约1g/L到约5g/L。在实施方式中，培养基中的碳源浓度是约5g/L到约50g/L、约10g/L到约45g/L、约15g/L到约40g/L、约20g/L到约35g/L、约5g/L到约20g/L、约5g/L到约15g/L、约5g/L到约10g/L。在实施方式中，碳源的浓度是约15g/L的浓度。在实施方式中，碳源的浓度是约10g/L的浓度。在实施方式中，碳源的浓度是约8g/L的浓度。在实施方式中，碳源的浓度是约5g/L的浓度。在实施方式中，碳源的浓度是约4g/L的浓度。在实施方式中，碳源的浓度是约3g/L的浓度。在实施方式中，碳源的浓度是约2g/L的浓度。在实施方式中，碳源的浓度是约1g/L的浓度。在实施方式中，碳源的浓度是约0.5g/L的浓度。在实施方式中，碳源的浓度是约0.05g/L的浓度。
培养工艺
一般来说，加料细胞培养物可以分类成三种培养方式：分批、分批加料和连续培养。分批培养时，将大体积的营养物(培养基)添加到细胞群中。然后使细胞生长直至培养基中的输入耗尽、达到细胞的所需浓度且/或产生所需的产物为止。在此时收获细胞且可以重复所述工艺。分批加料培养时，以恒定速率添加培养基，或在需要时添加组分来维持细胞群。一旦细胞群已达到最大体积或完成产物形成，则可以收获大部分细胞，并且然后可以使用剩余细胞起始下一周期。分批加料可以持续进行直至发酵罐装满或几乎装满。一旦装满并且任选地达到目标密度，则可以开始对分批加料培养物进行连续或半连续培养，目的是维持培养物装满、达到目标密度。或者，可以收获所有或大部分培养物，并且任选地可以利用剩余培养物开始另外的培养。在连续培养期间，为了进行测量和/或收获培养物组分，定期移出固定体积的样品，并且将等体积的新制培养基同时或立即或随后不久(例如在随后的约1、约2、约3、约4、约5、约10、约15、约30或约60分钟内)添加到培养物中，由此瞬时增强营养物浓度并且稀释细胞浓度。连续培养时，在培养基中，在可以长时间添加到培养基中以及从培养基移出的条件下培养细胞。如此使营养物、生长因子和空间不耗竭。分批发酵、分批加料发酵或其组合之后可以进行连续培养，或者，替代地，可以直接接种连续培养物。
在一个实施方式中，以异养方式培养裸藻属微生物、裂殖壶菌属微生物或小球藻属微生物的方法是分批、分批加料或连续方法。在另一个实施方式中，以异养方式培养裸藻属微生物、裂殖壶菌属微生物或小球藻属微生物的方法是分批方法。在另一个实施方式中，以异养方式培养裸藻属微生物、裂殖壶菌属微生物或小球藻属微生物的方法是分批加料方法。在另一个实施方式中，以异养方式培养裸藻属微生物、裂殖壶菌属微生物或小球藻属微生物的方法是连续方法。
在一个实施方式中，方法包含在基本上无光的环境中以异养方式维持微生物。在另一个实施方式中，方法包含在完全无光的环境中以异养方式维持微生物。
微生物在培养时的生长经历不同时期：停滞期、log(对数)期或指数期、稳定期和死亡期。在停滞期期间，微生物正在成熟并且在代谢上活跃，但不主动分裂或再生。在对数期期间，微生物正在分裂，数目增加，例如倍增。若不限制生长，则倍增将以恒定速率继续进行，因此，细胞数目和群体增加速率均在每个连续的时间段倍增。针对此类型的指数生长，对细胞数目的自然对数相对于时间作图，产生直线。此直线的斜率是微生物的比生长速率，这是每个细胞每单位时间分裂次数的度量。视培养物的生长期而定，此直线的斜率或微生物的比生长速率为0.01h-1到0.04h-1不等。此生长的实际速率(即，直线的斜率)取决于生长条件，生长条件影响细胞分裂事件的频率和两个子细胞存活的概率。当培养基中的营养物耗尽而富含废弃物时，指数生长无法继续进行。在稳定期期间，生长速率与死亡速率相等或相似，这显示为生长曲线具有水平的线性部分。不希望受理论所束缚，这可以归因于生长限制因素，例如必需营养物的耗尽，和/或抑制性产物(例如有机酸)的形成。在死亡期，微生物死亡归因于例如缺乏营养物、pH高于或低于微生物的耐受范围，或其它不利条件。
当微生物培养达到稳定期时，培养物中的微生物浓度达到饱和。饱和是根据多种测量结果确定，包括光学密度、细胞湿重、细胞干重、细胞数目和/或时间。
在本文所述的实施方式中，培养物或微生物具有最大的比生长速率(μmax，1/h)，即：0.001h-1至0.1h-1。在本文所述的实施方式中，培养物或微生物具有最大的比生长速率(μmax，1/h)，即：(h-1)0.001-0.09、0.001-0.08、0.001-0.07、0.001-0.06、0.001-0.05、0.001-0.04、0.001-0.03、0.001-0.02、0.001-0.01、0.002-0.09、0.002-0.08、0.002-0.07、0.002-0.06、0.002-0.05、0.002-0.04、0.002-0.03、0.002-0.02、0.002-0.01h-1、0.003-0.09、0.003-0.08、0.003-0.07、0.003-0.06、0.003-0.05、0.003-0.04、0.003-0.03、0.003-0.02、0.003-0.01、0.004-0.09、0.004-0.08、0.004-0.07、0.004-0.06、0.004-0.05、0.004-0.04、0.004-0.03、0.004-0.02、0.004-0.01、0.005-0.09、0.005-0.08、0.005-0.07、0.005-0.06、0.005-0.05、0.005-0.04、0.005-0.03、0.005-0.02、0.005-0.0、0.006-0.09、0.006-0.08、0.006-0.07、0.006-0.06、0.006-0.05、0.006-0.04、0.006-0.03、0.006-0.02，或0.006-0.01。在一些实施方式中，培养物或微生物具有最大的比生长速率(μmax，1/h)，即：约0.004h-1至0.062h-1。
在本文所述的实施方式中，加料是基于培养物中的细胞消耗速率。消耗速率是对碳源或葡萄糖在培养基中的数量的度量，其引起细胞生长减慢。消耗数据显示周期后期的细胞使用较少的糖，表明这些细胞在代谢上不大活跃。为了使指数生长期的细胞数目最大化，按照与细胞生长相同的速率收获细胞，从而允许指数生长期无限地延长。
连续培养时，从容器中移出培养物。可以在停滞期、指数期或稳定期移出培养物。在一实施方式中，在停滞期、指数期或稳定期从容器中移出培养物。在另一实施方式中，在停滞期从容器中移出培养物。在另一实施方式中，在指数期从容器中移出培养物。在另一实施方式中，在稳定期从容器中移出培养物。
连续培养时，也可以基于时间间隔从容器中移出培养物。在一实施方式中，在距离培养或培养周期开始或距离前一次添加培养基约或至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59或60分钟时，移出培养物。
连续培养时，从容器中移出培养物之后立即或迅速添加培养基。在一实施方式中，在培养物移出的约或至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、60、120或180分钟，添加培养基。
连续培养时，周期被定义为储罐或生物反应器的周转。监测并且控制储罐或生物反应器中的不同培养参数。这些参数包括温度、pH、充氧水平和搅拌。生物反应器或储罐可以是例如3L到20,000L。举例来说，生物反应器或储罐可以是3L到8L、36L、100L以及至多20,000L。也可以是较大型储罐，例如100,000L或更大。在一个实施方式中，储罐是至少100L、1,000L、10,000L或100,000L。在另一实施方式中，储罐是至多10,000L、100,000L、200,000L、500,000L或1,000,000L。周转被定义为将装有一种液体(例如第一培养基)的容器排空，并且用第二种液体(例如第二培养基)装填所述容器。后续的每次排空和装填代表着另一次周转。举例来说，周转率2、周转两次或周转2次表示将储罐排空且装填两次。在连续培养期间，源培养基的移出量与添加量基本上相等。连续培养的一次周转是容器的容积已去除并且已在容器中补充。在一个实施方式中，所述方法是在储罐或生物反应器中进行连续培养。在另一实施方式中，所述方法是在至多10,000L、100,000L、200,000L、500,000L或1,000,000L的储罐中进行连续培养。在另一实施方式中，所述方法是在至多3L、5L、8L、10L、20L、30L、35L、36L、40L或50L的生物反应器中进行连续培养。在另一个实施方式中，培养基在储罐或生物反应器中一天周转1、2、3或4次。在另一个实施方式中，培养基在75天内周转至多300次。在另一个实施方式中，培养基在75天内周转至少75、150、225或300次。在另一个实施方式中，所述方法是在储罐或生物反应器中进行连续培养，并且使裸藻属微生物、裂殖壶菌属微生物或小球藻属微生物生长至多约75天。在另一个实施方式中，所述方法是在储罐或生物反应器中进行连续培养，使裸藻属微生物、裂殖壶菌属微生物或小球藻属微生物生长至多约75天，并且培养基周转300次。在一个特定实施方式中，所述方法是在储罐中进行连续培养，使裸藻属微生物、裂殖壶菌属微生物或小球藻属微生物生长至多约75天，培养基周转300次。
分批加料和连续培养时，将培养基添加到培养物中。可以在停滞期、指数期和/或稳定期添加培养基。在一个实施方式中，在停滞期、指数期或稳定期将培养基添加到培养物中。在另一个实施方式中，在停滞期将培养基添加到培养物中。在另一个实施方式中，在指数期将培养基添加到培养物中。在另一个实施方式中，在稳定期将培养基添加到培养物中。添加到培养物中的培养基的适合组分在下文中详细地描述。
分批加料和连续培养时，还可以基于时间间隔将培养基添加到培养物中。在一个实施方式中，在距离培养或培养周期开始或距离前一次移出培养基约或至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59或60分钟时，添加培养基。在另一实施方式中，在距离培养或培养周期开始或距离前一次移出培养基约或至多10分钟、15分钟、30分钟、45分钟、60分钟、90分钟、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时或8小时时，添加培养基。在另一实施方式中，培养基添加的速率与通过培养而移出培养物的速率大致相同。
如以下实施例所论述，展示了在微藻(例如裸藻)的分批加料和连续培养期间补充羧酸(在本文中也被称作有机酸)。TCA周期中间物的这种补充(也称为回补补充)使微藻培养的生产率得到惊人且显著的提升。使用有机酸作为碳源引起转化效率提高且引起净生物质增加，并且能够使微藻(例如裸藻)生产氨基酸、裸藻淀粉、蜡酯、抗氧化剂和/或维生素的水平提高。
相应地，还涵盖了使微藻(例如裸藻)或其培养物的转化效率、净生物质、氨基酸生产、裸藻淀粉生产、蜡酯生产、抗氧化剂生产和维生素生产中的一者或多者增加的方法，这是通过向其培养物补充至少一种有机酸来实现的。
如本文所用，术语“转化效率”是指微生物在所用源培养基中消耗一定量的溶质而产生的生物质的百分比。当一定量的培养基组分产生的生物质越多时，转化效率越高。当一定量的培养基组分产生的生物质越少时，转化效率越低。因此，更高的“转化效率”表示溶质更多地转化成生物质。在一个实施方式中，培养基(任选地，混合式培养基、再循环的培养基或补充的培养基)中的细胞的转化效率是至少或约10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％(生物质重量/溶质重量)。在本公开的一些实施方式中，转化效率是约15到约75％、约20到约75％、约25到约75％、约30到约75％、约35到约75％、约40到约75％、约45到约75％、约50到约75％、约55到约75％、约60到约75％、约70到约75％、约25％到约75％。在一些实施方式中，转化效率是约30％到约60％。
如上文所论述，在分批加料和连续培养期间，向培养物中添加培养基以补充营养物。在实施方式中，在分批加料和连续培养时，向培养物中供应碳源以使得培养基或加料培养基中的碳源浓度达到约0.0005g/L到约50g/L、约0.0005g/L到约45g/L、约0.0005g/L到约40g/L、约0.0005g/L到约35g/L、约0.0005g/L到约20g/L、约0.0005g/L到约15g/L、约0.0005g/L到约10g/L、约0.0005g/L到约8g/L、约0.0005g/L到约5g/L、约0.0005g/L到约1g/L、约0.0005g/L到约0.5g/L、约0.0005g/L到约0.05g/L，或约0.0005g/L到约0.005g/L。在实施方式中，在分批加料和连续培养时，向培养物中供应碳源以使得培养基或加料培养基中的碳源浓度达到约0.005g/L到约50g/L、约0.005g/L到约45g/L、约0.005g/L到约40g/L、约0.005g/L到约35g/L、约0.005g/L到约20g/L、约0.005g/L到约15g/L、约0.005g/L到约10g/L、约0.005g/L到约8g/L、约0.005g/L到约5g/L、约0.005g/L到约1g/L，或约0.005g/L到约0.5g/L。在实施方式中，在分批加料和连续培养时，向培养物中供应碳源以使得培养基或加料培养基中的碳源浓度达到约0.05g/L到约50g/L、约0.05g/L到约45g/L、约0.05g/L到约40g/L、约0.05g/L到约35g/L、约0.05g/L到约20g/L、约0.05g/L到约15g/L、约0.05g/L到约10g/L、约0.05g/L到约8g/L、约0.05g/L到约5g/L、约0.05g/L到约1g/L，或约0.05g/L到约0.5g/L。在实施方式中，在分批加料和连续培养时，向培养物中供应碳源以使得培养基或加料培养基中的碳源浓度达到约1g/L到约50g/L、约1g/L到约45g/L、约1g/L到约40g/L、约1g/L到约35g/L、约1g/L到约20g/L、约1g/L到约15g/L、约1g/L到约10g/L、约1g/L到约8g/L、约1g/L到约5g/L。在实施方式中，在分批加料和连续培养时，向培养物中供应碳源以使得培养基或加料培养基中的碳源浓度达到约5g/L到约50g/L、约10g/L到约45g/L、约15g/L到约40g/L、约20g/L到约35g/L、约5g/L到约20g/L、约5g/L到约15g/L、约5g/L到约10g/L。在实施方式中，在分批加料和连续培养时，向培养物中供应碳源以使得培养基或加料培养基中的碳源浓度达到约15g/L。在实施方式中，在分批加料和连续培养时，向培养物中供应碳源以使得培养基或加料培养基中的碳源浓度达到约10g/L。在实施方式中，在分批加料和连续培养时，向培养物中供应碳源以使得培养基或加料培养基中的碳源浓度达到约8g/L。在实施方式中，在分批加料和连续培养时，向培养物中供应碳源以使得培养基或加料培养基中的碳源浓度达到约5g/L。在实施方式中，向培养物中供应碳源以使得培养基中的碳源浓度达到约4g/L。在实施方式中，在分批加料和连续培养时，向培养物中供应碳源以使得培养基或加料培养基中的碳源浓度达到约3g/L。在实施方式中，在分批加料和连续培养时，向培养物中供应碳源以使得培养基或加料培养基中的碳源浓度达到约2g/L。在实施方式中，在分批加料和连续培养时，向培养物中供应碳源以使得培养基或加料培养基中的碳源浓度达到约1g/L。在实施方式中，在分批加料和连续培养时，向培养物中供应碳源以使得培养基或加料培养基中的碳源浓度达到约0.5g/L。在实施方式中，在分批加料和连续培养时，向培养物中供应碳源以使得培养基或加料培养基中的碳源浓度达到约0.05g/L。适合的碳源描述如上且可以采取任何组合。在一些实施方式中，本公开实施方式的培养方法具有30mg/glc/gDCW/h至75mg/glc/gDCW/h、任选地40mg/glc/gDCW/h至55mg/glc/gDCW/h的比葡萄糖消耗速率。
在实施方式中，在分批加料和连续培养时，所添加(或补充)的碳源包括一种或多种有机酸(例如柠檬酸、柠檬酸盐、反丁烯二酸、反丁烯二酸盐、苹果酸、苹果酸盐、丙酮酸、丙酮酸盐、丁二酸、丁二酸盐、乙酸、乙酸盐、乳酸和乳酸盐)。在实施方式中，在分批加料和连续培养时，所添加的碳源由一种或多种有机酸组成。本文所述的有机酸可以采取质子化或去质子化形式。
在实施方式中，培养基中的氮源浓度是约1g/L到约15g/L、约1.5g/L到约12.5g/L、约2g/L到约10g/L、约2.5g/L到约8.5g/L、约3g/L到约8g/L、约3.5g/L到约7.5g/L、约4g/L到约7g/L、约4.5g/L到约6.5g/L，或约5g/L到约6g/L。在实施方式中，氮源的浓度是约10g/L的浓度。在实施方式中，氮源的浓度是约5g/L的浓度。在实施方式中，氮源的浓度是约2g/L的浓度。
在实施方式中，培养基中的盐源浓度为约0.01g/L到约0.05g/L、0.01g/L到约0.1g/L、约0.01g/L到约5g/L、约0.1g/L到约4.5g/L、约1g/L到约4g/L、约1.5g/L到约3.5g/L，或约2g/L到约3g/L。在实施方式中，盐源的浓度是约0.01g/L的浓度。在实施方式中，盐源的浓度是约0.025g/L的浓度。在实施方式中，盐源的浓度是约0.05g/L的浓度。在实施方式中，盐源的浓度是约0.1g/L的浓度。在实施方式中，盐源的浓度是约1g/L的浓度。
本发明的实施方式涉及使用培养基以异养方式培养细小裸藻的方法，所述培养基含有以下各者的组合：一种或多种可发酵碳源、一种或多种不可发酵碳源、一种或多种氮源、盐和矿物质组合以及维生素组合。本发明的实施方式涉及使用含有碳源、氮源和盐的组合的培养基、以异养方式培养细小裸藻的方法。所述培养基利用细小裸藻的所有代谢潜力，包括好氧代谢与厌氧代谢。油、糖、醇、有机氮和无机氮源的组合提高了输入向输出的转化并且加快了微生物生长。
在实施方式中，第一培养基、第二培养基和/或第三培养基中的任何一种或多种彼此独立地进一步包含痕量金属混合物和维生素混合物中的一者或多者。
在实施方式中，第一培养基进一步包含痕量金属混合物和维生素混合物中的一者或多者。
在实施方式中，第二培养基进一步包含痕量金属混合物和维生素混合物中的一者或多者。
在实施方式中，第三培养基进一步包含痕量金属混合物和维生素混合物中的一者或多者。
在实施方式中，痕量金属混合物包含以下中的一者或多者：氯化铁(III)、硫酸铁(III)、硫酸亚铁铵、硫酸铁铵、氯化锰、硫酸锰、硫酸锌、氯化钴、钼酸钠、氯化锌、硼酸、氯化铜、硫酸铜、七钼酸铵和其组合。
在实施方式中，培养基进一步包含维生素混合物。维生素混合物含有生物素(维生素B7)、硫胺(维生素B1)、核黄素(维生素B2)、烟酸(维生素B3)、泛酸(维生素B5)、吡哆醇(维生素B6)、氰钴维生素(维生素B12)、维生素C、维生素D、叶酸、维生素A、维生素B12、维生素E、维生素K和其组合。
在实施方式中，维生素混合物包含维生素B1、维生素B12、维生素B6和维生素B7中的一者或多者。
本领域的技术人员将认识到，一个发酵阶段中所用的培养基与其它发酵阶段中所用的培养基可以相同或可以不相同。因此，举例来说，当发酵期间使用第一培养基且发酵期间使用第二培养基时，其可以具有相同或基本上相同的配方，或其可以具有不同的配方。同样，当在本发明方法的单个步骤期间执行培养基的多次添加时，每次添加可以是相同或基本上相同的培养基或不同的培养基。本文中关于培养基的描述适用于本发明方法的任何步骤或阶段期间所使用的任何培养基。
培养基pH影响微生物在培养物中的生长。本领域技术人员能够使用有机酸(例如硝酸、氢氯酸、硫酸和柠檬酸)或碱(例如氢氧化钠、碳酸钠、磷酸和碳酸氢钠)容易地调节生长培养基的pH。培养基pH介于约2到约8、约2.5到约5、约2.5到约4、约2.5到约3.5之间。在一个实施方式中，培养基的pH维持在约2到约8之间，任选地在约2.5到约5之间，任选地在约2.5到约4之间，任选地在约2到约4之间。
生物反应器储罐系统
所公开的实施方式进一步包括生物反应器储罐系统设计，其使用流线型的高效发酵罐、按照生产规模来培养微生物。为了实现生产物料的高效周转和促进所有输入物代谢的好氧/厌氧区段建立，储罐设计包含的特征包括(但不限于)空气喷嘴、鼓泡石(也称为喷淋器，一些鼓泡石称为微喷淋器)和储罐纵横比定制。在一些实施方式中，鼓泡石与空气喷嘴均用于在储罐内部建立好氧区域并且使内容物提升的足够高以实现混合。当喷嘴与喷淋器均使用时，其它物料容易受到损害，而裸藻的生理学使得其能够幸免于喷嘴系统的较高压力。然而，应了解，生物反应器储罐的实施方式不限于培育裸藻，因为储罐设计可以有益于多种其它物料。一般来说，已发现使用喷淋器与喷嘴均改进了发酵工艺并且有助于产生更大的输出。
图27是生物反应器系统100的示意图，其包括多个储罐200。系统100被配置为生产呈输出微生物(例如藻类)形式的生物质。举例来说，系统100被配置为大规模生产裸藻。生物反应器系统100可包括加料系统250，其被配置为将例如培养基、微生物和各成分个别地提供到生物反应器储罐200和/或储罐组中的每一者中。生物反应器系统100进一步包括监测和控制系统300，其被配置为监测生物反应器系统100内的参数并且独立地控制生物反应器系统100的一个或多个特征，例如通过提供反馈控制。
在一个示例性实施方式中，生产系统可包括彼此连接的多个储罐。举例来说，生物反应器系统100可包括中试发酵罐230和生产发酵罐240。中试发酵罐230可包括例如有助于引发生物质生长的一个或多个相对较小储罐。中试发酵罐230可包括例如一组三个储罐，包括100L储罐、250L储罐和500L储罐。加料系统250可包括向中试发酵罐230提供物料(例如碳、盐和氮)的加料管线。管线252用于将接种体培养物从中试生物反应器区域230输送到生产型生物反应器240。
生产发酵罐240可包括彼此串联连接且与加料系统250经由多个生产加料管线254并联连接的多个储罐200的群组/组242。生产发酵罐240可具有比中试发酵罐230大得多的尺寸。举例来说，生产发酵罐240可具有15,000L至25,000L的尺寸。举例来说，发酵罐240可以是20,000L储罐。在其他实施方式中，一个或多个发酵罐240可以具有较大尺寸，例如50,000L、200,000L、500,000L或1,000,000L储罐。
中试发酵罐230可用于使微生物的培养从实验室规模达到中等规模，随后输送到用于大规模培养和输出的生产发酵罐240。在较大生产罐中经历生长周期之后，可以将培养物输送到生产后区域400，所述生产后区域可包括例如缓冲罐和用于分离细胞的大型碟片堆叠式离心机。回收的细胞可以在第二个好氧或厌氧发酵阶段中培育，或进行破碎以便回收蛋白质或β葡聚糖。在一些实施方式中，系统100在储罐230与240之间还可以包括尺寸中等的较小生产罐(未图示)。储罐230、240可以配置为低压或高压储罐。换句话说，可以基于所需生长参数来选择储罐230、240的操作压力。
图28是生物反应器储罐200的一个示例性实施方式的示意图。在一些实施方式中，储罐200可以被认为是鼓泡塔生物反应器。储罐200包括具有内部容积204的槽体202。储罐200被配置为容纳用于培养微生物(例如裸藻)的培养基和成分。储罐200进一步包括被配置为将气体引入储罐200中的供气系统210。虽然气体被描述为空气，但是应了解，可以经由供气系统210组件引入其它气体(例如氧气、氮气、氦气等)。供气系统210可以使内部容积204内的培养基与微生物混合。
在一个示例性实施方式中，供气系统210包括低压供气装置212与高压供气装置214。低压供气装置212可以是鼓泡装置，例如鼓泡石216。高压供气装置214可以是喷嘴218，所述喷嘴被配置为将气流导入储罐200的内部容积204内。
在一些实施方式中，槽体202可以根据微藻的最优经济生长来设计。虽然鼓泡塔生物反应器的典型纵横比是四到六，但是为了微生物(例如裸藻)的生长，储罐200可以包括约三的纵横比。此纵横比是实现最大化氧气输送的较高纵横比与安装和操作高鼓泡塔生物反应器所带来的成本之间的平衡。经济收益包括用于采购生物反应器和用于建造容纳生物反应器的厂区的资金成本降低。生物反应器越高，需要建造高大建筑物且有时候可能需要开挖的施工材料(钢梁、管道、绝热材料等)越多。在封闭储罐中培养微藻的主要优点是，藻类培养物被不想要的细菌、酵母和/或其它真菌污染的风险较低，而开放系统生物反应器(例如室外渠塘)则相反。另外，由于季节变化所致的温度扰动对培养物的生长没有影响。最后但同样重要的是，与较高的生物反应器相比，较矮的生物反应器更容易清洁并且更容易定期维护。
供气系统210，包括鼓泡石216和喷嘴218，可以是曝气系统，其被配置为建立将内部容积214内的物料充氧的氧气(或其它气体)气泡。曝气系统可以包括例如多个鼓泡石216。在一个示例性实施方式中，鼓泡石216具有小孔径，例如在20至30微米之间。这些鼓泡石可以被认为是由烧结不锈钢形成的微喷淋器。较小孔径可以提供较大的气泡表面积，已经发现这可促进储罐内更大的氧气输送。储罐200可以包括多个微喷淋器，这些微喷淋器可以位于喷淋器栅格中，如图29中所示。第一层喷淋器216延伸的方向可以不同于第二层喷淋器216A。举例来说，一些喷淋器216可以垂直于其它喷淋器216A。喷淋器216可以包括与喷淋器216A不同的孔径。
包括鼓泡石216和喷嘴218的供气系统210可以是配置成将储罐200内的物料混合的搅拌系统以及配置成将氧气提供到储罐200内的物料中的曝气系统。生物反应器中的整体混合典型地通过机械搅拌器产生，所述机械搅拌器由叶轮、变速箱和传动装置(电动机)组成。根据所公开的实施方式，整体混合在示例性实施方式中是经由喷嘴218、通过空气搅拌而非机械搅拌来提供(例如由于细胞的脆弱性)。然而，在一些实施方式中，可以在系统100中建构一定的机械搅拌水平以进一步促进混合。喷嘴218可以是例如文丘里喷嘴(Venturi nozzles)，其通过产生定向的大空气射流以诱导定向的整体混合流动来提供容器中的总体紊流式整体混合。空气射流设计成产生不损伤微生物细胞的剪切速率。在使用再循环回路的情况下，空气喷射混合需要的能量输入可以低于机械搅拌式储罐或容器。在一个示例性实施方式中，喷射嘴218位于鼓泡石216上方并且成约45度角度指向上方。在一个实施方式中，喷嘴218位于鼓泡石216上方两英尺。
在一些实施方式中，鼓泡石216也可以促成储罐200内的混合。举例来说，鼓泡石216可以包括孔径比其它喷淋器更大的一些喷淋器。孔径较大的喷淋器可以促成混合，而孔径较小的喷淋器可以集中于提供高氧气速率。在一个示例性实施方式中，顶层喷淋器216向第一方向延伸并且包括约5微米到10微米的孔径，而底层喷淋器向第二垂直方向延伸并且包括约20微米到70微米的较大孔径。
在一些实施方式中，喷嘴218可以配置成枢转以改变气流方向。以这种方式能够更精确地控制混合。每个喷嘴218可以配置成以约0.1升/分钟的流速供应气流。每个喷嘴218可以位于储罐200的底部附近，优选地位于喷淋器216上方。
加料系统250向储罐200的内部容积204提供物料。加料系统250可包括例如多个供应管210，所述供应管提供一种或多种成分用于储罐200内的微生物(例如裸藻)的生长。举例来说，加料系统250可包括例如供水系统、藻类接种系统、无菌加料组分系统和/或再循环的培养基系统。在一些实施方式中，加料系统的组件可以是独立可控的。在一些实施方式中，加料系统250可以包括向一个或多个储罐200供料的一个或多个独立可控歧管。在一些实施方式中，储罐200的每个组242可以包括可控歧管和加料管线。在其他实施方式中，每个储罐200(例如每个储罐230和/或240)可以包括可以独立可控的相关歧管。
加料系统250允许同时实施不同的加料策略并且减少流体输送瓶颈。浓缩培养基成分的操控和混合允许产生具有定制组成的浓缩培养基流以加入裸藻培养物中，并且提升一种目标产物的生产而超越其它产物。加料系统250支持以比储罐更少的加料管线来实施，并且支持不连续的脉冲加料直至连续收获系统。增加流体输送灵活性、同时降低资金成本的双座阀组的设计和配置将此变成可能。
在至少一些实施方式中，储罐200进一步包括监测和控制系统300。监测系统300可包括例如反馈控制器310和输入控制器320。监测系统300还可以包括一个或多个传感器330，所述传感器配置成产生指示储罐200的性能参数的信号。参数可包括例如生物反应器内的pH、溶氧(DO)、细胞密度、流明水平、葡萄糖水平、温度、生物反应器中的培养体积、氮水平(例如铵、谷氨酸盐)、培养基组成、残余分子氧；生物反应器排气中的二氧化碳水平；和其组合。传感器330可以向反馈控制器310提供信号。反馈控制器310可以向使用者和/或输入控制器320提供输出。输入控制器320可以接收人工或自动化指令以便调节储罐200或加料系统250的输入参数。举例来说，输入控制器320可以调节物料加入储罐200的加料速率。在另一个实施例中，输入控制器320可以调节供气系统210，例如通过调节空气压力、喷嘴218的角度或另一种空气供应参数。监测系统300还可以被配置成将储罐200中的温度维持在20℃到约35℃之间。
视微藻所处的条件而定，裸藻代谢能够是厌氧的或好氧的。基于代谢的观点，油和醇作为输入是在厌氧条件下代谢。其余输入是在好氧条件下代谢最高效。为了支持生长，发酵罐标准只能是好氧的。所公开的实施方式提供的条件允许在储罐200内建立好氧区段与厌氧区段。举例来说，喷嘴218产生的空气流可以建立高混合区段(例如喷嘴周围)和低混合区段(例如由于线性空气流和流动方向所引起的停滞区域)。高混合区域的充氧可以大于低混合区域的充氧。结果，储罐内的一些区域可以包括好氧状态的裸藻，而其它区段包括厌氧状态的裸藻。已经发现这种双重状态方式促进裸藻的高效生长。好氧状态与厌氧状态均允许调节细胞中的β-葡聚糖含量且有助于实现最优细胞含量。好氧条件和厌氧条件影响了细胞β-葡聚糖和油含量。完整的好氧条件促进葡萄糖向β-葡聚糖的生物合成和油(蜡酯)向β-葡聚糖的转化。厌氧条件触发β-葡聚糖向油(蜡酯)的转化。容器中的好氧条件与厌氧条件的共存允许调节细胞中的β-葡聚糖和油(蜡酯)含量且因此调节培养物生物质。
在本文所述的实施方式中，培养基进入容器中的速率与收获培养物的速率相同。在收获期间，从培养基中分离出细胞并且然后将过量使用的培养基循环回到原始容器中。可以实施的收获技术实施例包括离心收获、碟片堆叠、倾析器、膜脱水步骤到细胞分离、根据比重或通过化学处理进行沉降，或低剪切细胞分离器(微滤)。为了使所用培养基再循环回到培养物中，连续回路是无菌的。举例来说，可以捕集所收获培养基的可用部分且加热且/或过滤用于灭菌。
培养和收获过程可以基于连续的周期进行，包括周期周转的裕度(例如储罐装填和耗尽，或在连续方式时的储罐的容积被移出时的次数)。根据所公开的实施方式，系统100被配置成高周转。举例来说，当细胞复制增加时，周转可以一天发生多达4次，或在低复制时间段期间，周转可以低到每48小时一次。上文中还关于本文所述的发酵方法描述了适合的周转。
在实施方式中，所述方法进一步包括控制温度、搅拌和/或空气流速。发酵温度在约20℃到约30℃之间，任选地是约28℃。可以利用任何适合方法实现搅拌，包括(但不限于)机械搅拌和/或曝气(例如通过使用培养容器内的喷淋器和/或喷嘴)。根据本文所述的本实施方式和任何其它实施方式的搅拌速率是约20rpm到约120rpm，任选地是约50rpm到约180rpm，任选地是约50rpm，并且任选地是约180rpm，任选地是约60rpm到约120rpm，任选地是约70rpm到约100rpm，任选地是约70rpm，任选地是约100rpm。根据本文所述的本实施方式或任何其它实施方式的空气流速在约0.2vvm到约1.0vvm之间，任选地是约0.2vvm。在一些实施方式中，温度可以在本文所述方法的整个步骤中保留恒定。在其它实施方式中，在本文所述方法的步骤期间或步骤之间，温度可以变化。
在另一个实施方式中，所述方法进一步包括：在第一、第二和第三发酵步骤中的每一个步骤期间，使pH维持在约2.0到约4.0之间；在第一、第二和第三发酵步骤中的每一个步骤期间，使温度维持约20℃到约30℃；以及在第一、第二和第三发酵步骤中的每一个步骤期间，维持基本上无光的环境。任选地，pH在约2.8到约3.2之间，溶氧在约1ppm到约2ppm之间，并且温度在约27℃到约29℃之间。
通用培养条件
在另一个实施方式中，分批培养裸藻属微生物、裂殖壶菌属微生物或小球藻属微生物的第一步骤包括：获得裸藻属微生物、裂殖壶菌属微生物或小球藻属微生物细胞；将裸藻属微生物、裂殖壶菌属微生物或小球藻属微生物细胞输送到具有最大培养容积的生物反应器中；以及培养裸藻属微生物、裂殖壶菌属微生物或小球藻属微生物细胞，直至碳源、氮源或两者均下降到细胞生长受到限制的水平。
在另一个实施方式中，碳源是葡萄糖并且培养裸藻属微生物、裂殖壶菌属微生物或小球藻属微生物直至葡萄糖水平限制细胞生长。
在另一个实施方式中，碳源是葡萄糖并且培养裸藻属微生物、裂殖壶菌属微生物或小球藻属微生物直至葡萄糖水平下降而低于5g/L。
在另一个实施方式中，第二步骤进一步包括：在分批加料培养裸藻属微生物、裂殖壶菌属微生物或小球藻属微生物之后，从生物反应器中移出培养物；以及将分批加料培养裸藻属微生物、裂殖壶菌属微生物或小球藻属微生物的步骤重复执行一次或多次。
在另一个实施方式中，连续培养裸藻属微生物、裂殖壶菌属微生物或小球藻属微生物的第三步骤包括：以加料流速将第三培养基频繁地或连续地添加到生物反应器中；以及按照与加料流速相同的流速从生物反应器中频繁地或连续地收获培养物。
在某些实施方式中，加料流速在频繁或连续加料期间保持恒定。在其它实施方式中，在频繁或连续加料期间，加料流速是可变的。尽管加料流速在发酵期间可以变化，但加料流速和连续收获流速按照基本上相同的速率变化，使得所培养的裸藻属微生物、裂殖壶菌属微生物或小球藻属微生物的总体积在频繁或连续加料期间保持基本上相同。
在实施方式中，获得裸藻属微生物、裂殖壶菌属微生物或小球藻属微生物细胞包括培养所述微生物。
在实施方式中，培养裸藻属微生物、裂殖壶菌属微生物或小球藻属微生物细胞包括按照每毫升约1x105个细胞到约5x107个细胞、任选地按照每毫升约1x105个细胞到约1x107个细胞、任选地按照每毫升约2x105个细胞到约5x106个细胞、任选地按照每毫升约2.5x105个细胞到约3x106个细胞、任选地按照每毫升约1.5x107个细胞到约2.5x107个细胞用细小裸藻细胞接种生长培养基。
在另一个实施方式中，在分批培养的裸藻属微生物、裂殖壶菌属微生物或小球藻属微生物加料的第二步骤完成时测定为所培养的裸藻属微生物、裂殖壶菌属微生物或小球藻属微生物的gDCW/L的细胞密度比分批培养细小裸藻的第一步骤结束时测定为gDCW/L的细胞密度高至少1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2或2.5倍。
在另一个实施方式中，在分批培养的裸藻属微生物、裂殖壶菌属微生物或小球藻属微生物加料的第二步骤完成时测定为所培养的裸藻属微生物、裂殖壶菌属微生物或小球藻属微生物的gDCW/L的细胞密度比分批培养裸藻属微生物、裂殖壶菌属微生物或小球藻属微生物的第一步骤结束时测定为gDCW/L的细胞密度高至少2.0倍。
在另一个实施方式中，分批培养裸藻属微生物、裂殖壶菌属微生物或小球藻属微生物的第一步骤进行1天到7天，并且分批培养的裸藻属微生物、裂殖壶菌属微生物或小球藻属微生物加料的第二步骤进行1天到7天。
在另一个实施方式中，连续培养裸藻属微生物、裂殖壶菌属微生物或小球藻属微生物的第三步骤包括实现稳态条件。
在另一个实施方式中，连续培养裸藻属微生物、裂殖壶菌属微生物或小球藻属微生物的第三步骤进行1天到30天。
在另一个实施方式中，在分批培养裸藻属微生物、裂殖壶菌属微生物或小球藻属微生物的第一步骤期间测定为gDCW/L/h的生产率在0.1与0.3之间。
在另一个实施方式中，在分批培养的裸藻属微生物、裂殖壶菌属微生物或小球藻属微生物的第二步骤期间测定为gDCW/L/h的生产率在0.5与0.8之间。
在另一个实施方式中，在连续培养裸藻属微生物、裂殖壶菌属微生物或小球藻属微生物的第三步骤期间测定为gDCW/L/h的生产率在0.4与0.9之间。在另一个实施方式中，在连续培养裸藻属微生物、裂殖壶菌属微生物或小球藻属微生物的第三步骤期间测定为gDCW/L/h的生产率在0.4与0.9、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.5、3.0或4.0之间。在另一个实施方式中，在连续培养裸藻属微生物、裂殖壶菌属微生物或小球藻属微生物的第三步骤期间测定为gDCW/L/h的生产率是至少0.9、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.5、3.0或4.0。
在另一个实施方式中，在分批培养裸藻属微生物、裂殖壶菌属微生物或小球藻属微生物的第一步骤、分批加料培养微生物的第二步骤和连续培养裸藻属微生物、裂殖壶菌属微生物或小球藻属微生物的第三步骤的整个期间测定为gDCW/L/h的总生产率在0.4与0.9之间。在另一个实施方式中，在分批培养裸藻属微生物、裂殖壶菌属微生物或小球藻属微生物的第一步骤、分批加料培养微生物的第二步骤和连续培养裸藻属微生物、裂殖壶菌属微生物或小球藻属微生物的第三步骤的整个期间测定为gDCW/L/h的总生产率是在0.4与0.9、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.5、3.0或4.0之间。在另一个实施方式中，在分批培养裸藻属微生物、裂殖壶菌属微生物或小球藻属微生物的第一步骤、分批加料培养微生物的第二步骤和连续培养裸藻属微生物、裂殖壶菌属微生物或小球藻属微生物的第三步骤的整个期间测定为gDCW/L/h的总生产率至少是0.9、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.5、3.0或4.0。
细小裸藻的收获
一旦培养物体积达到生物反应器最大工作容积的80％到90％，则将生物反应器的一部分或全部内容物无菌输送到缓冲罐或容积缓冲容器，随后从用过的生长培养基中分离出细小裸藻细胞。培育也可以连续模式操作。也就是说，细胞培养物是按照范围在0.01h-1与0.05h-1之间的稀释速率连续地输送。最终细胞湿重或触发连续培育的细胞湿重一般在30g/L到60g/L细胞湿重(6.4g/L到19.2g/L细胞干重)之间的范围内。在一些实施方式中，最终的细胞湿重在5到250g/L(1.6到80g/L细胞干重)之间、5到80g/L(1.6到25.6g/L)之间、或30到60g/L细胞湿重(6.4到19.2g/L细胞干重)之间的范围内。含有待收获的细小裸藻培养物的鼓泡塔生物反应器可以加压或可以不加压，以提高培养物从生产型鼓泡塔生物反应器离开的体积速率。还可以利用正排量泵将细小裸藻培养物从鼓泡塔生物反应器输出以便收获。
细小裸藻细胞可以如下沉降于缓冲罐中：添加浓酸(例如磷酸)或浓碱(例如氢氧化钠)来调节pH以及诱导细胞絮凝，加快细胞沉降。一旦缓冲罐达到使得细胞充分絮凝的预定液位或容积，则经由配备有变速离心泵的2英寸输送管线将所收获的培养物按照50到60L/min的流速从缓冲罐输送到大规模碟片堆叠式离心机。
离心所产生的细胞糊或细胞泥可以输送到二级发酵鼓泡塔生物反应器或输送到细胞储罐。离心分离液(用过的生长培养基)可以直接再循环回到生产型鼓泡塔生物反应器中且/或输送到液体过滤和灭菌单元。经过滤和灭菌的用过的生长培养基在需要之前储存于预灭菌的容器中并且可以并入或可以不并入新的生长培养基批料中。
考虑到所有商业规模的鼓泡塔生物反应器的组合总容量(从作为种子的250L细小裸藻培育开始)，细小裸藻培育的总体比例放大系数是640倍。假定生长周期是8天，则所估计的当前生产率在24天周期中是270kg细胞干重。即每年2.6公吨的细小裸藻(干重基)。
本公开的方面还包括收获通过本文所述的培养裸藻属微生物、裂殖壶菌属微生物或小球藻属微生物的方法所生产的裸藻属微生物、裂殖壶菌属微生物或小球藻属微生物细胞和/或产物。相应地，本发明的各方面还涉及根据本文所述的方法收获的裸藻属微生物、裂殖壶菌属微生物或小球藻属微生物细胞和/或产物，以及包含此类所收获的裸藻属微生物、裂殖壶菌属微生物或小球藻属微生物细胞和/或产物的组合物。
裸藻属微生物、裂殖壶菌属微生物或小球藻属微生物细胞和/或产物涵盖裸藻属微生物、裂殖壶菌属微生物或小球藻属微生物生物质；裸藻属微生物、裂殖壶菌属微生物或小球藻属微生物生物质的提取物；以及裸藻属微生物、裂殖壶菌属微生物或小球藻属微生物发酵的细胞内与细胞外产物。包含此类所收获的裸藻细胞和/或产物的组合物包括(但不限于)食物(即，旨在或预期作为营养和/或热量来源被动物摄入的任何组合物)、食物产品、食物添加剂、食物增补剂、化妆品、化妆品增补剂、纤维(例如生物塑料)、植物肥料和/或生物燃料。此类组合物包括(但不限于)粉(例如微藻粉)、油(例如微藻油)、保健食品组合物(例如增补剂、维生素增补剂、蛋白质增补剂、蛋白质粉末、油等)。
在一些实施方式中，相较于其它培养方法生产的裸藻属微生物、裂殖壶菌属微生物或小球藻属微生物细胞，本文所述的裸藻属微生物、裂殖壶菌属微生物或小球藻属微生物培养方法所生产的裸藻属微生物、裂殖壶菌属微生物或小球藻属微生物细胞在细胞中具有增加的蛋白质浓度。来自藻类的高蛋白质生物质是有利于纳入食物产品中的物质。本发明方法还可以提供具有一定量的蛋白质的生物质，如作为细胞干重％所度量，所述量选自由以下组成的组：约20％到约60％、约25％到约55％、约30％到约50％，和约35％到约45％。
在实施方式中，相较于其它培养方法生产的裸藻属微生物、裂殖壶菌属微生物或小球藻属微生物细胞，本文所述的裸藻属微生物、裂殖壶菌属微生物或小球藻属微生物培养方法所生产的裸藻属微生物、裂殖壶菌属微生物或小球藻属微生物细胞在细胞中具有增加的油浓度。
下文所阐述的实施例还描述了示例性培养基和其组分以及示例性培养条件和方法。以下实施例是为了说明本发明的实施方式、但并不旨在限制其范围而提供。
实施例
实施例1：种子/分批培养基的制备
为了优化细小裸藻培养基组成(碳、氮、盐、痕量金属和维生素)，执行多次摇瓶和分批发酵实验，测试49种不同的培养基组成。所测试的碳源包括葡萄糖(10g/L、15g/L和20g/L)、果糖(10g/L和20g/L)和糖蜜(10g/L和20g/L)。所测试的氮和其他组分包括：酵母提取物(2g/L、5g/L、10g/L)、乙醇(2g/L、5g/L、10g/L)、植物油(2g/L、5g/L、10g/L)、KH2PO4、MgSO4.7H2O、CaCl2、2H2O、痕量金属和维生素，和其组合。还测试了混合型培养基。为了提高经由分批加料或恒化(连续加料和收获)发酵而产生的裸藻生物质的生产率(gDCW/L/hr)，最初通过分批发酵来开始细小裸藻的异养培育，以便确定细小裸藻在特定生长培养基中的生长特征。表1中反映了所用生长培养基的组成。此生长培养基的组成在摇瓶规模与生物反应器规模上均经过实验优化，并且相较于其它培养基组成，细小裸藻的生长速率更快并且目标产物(即，蛋白质、油和裸藻淀粉)的产量提高。表1中提及的维生素混合物和痕量金属混合物的组成分别如表2和表3中所示。
表1：种子/分批生长培养基的组成和制备。
表2：维生素混合物(2500x)的组成和制备
表3：痕量金属混合物(2500x)和(500x)的组成和制备
在分批加料发酵的情况下，5倍浓缩的种子/分批生长培养基用作加料培养基，其中葡萄糖浓度是75g/L。制备2.5L加料培养基以便实施分批加料发酵。
在恒化发酵的情况下，3倍浓缩的种子/分批生长培养基用作加料培养基，其中葡萄糖浓度是45g/L。制备8L加料培养基以便实施恒化发酵。
实施例2：种子接种体的制备
表1中所述的种子/分批培养基用于制备种子接种体。细小裸藻的母种培养物(每毫升约2千万个细胞，200mL到500mL于1L摇瓶中)已经随着时间得到维持。向这种培养物中常规地加入100mL种子/分批培养基(每4天一次)。一旦母种培养物的体积达到500mL，则从摇瓶中收获300mL培养物(细胞和培养基)并且所得培养物(约200mL)继续以如上文所述的类似方式加料。
种子接种体制备的简要说明如下：第4天，在定期加入到细小裸藻的母种培养物中之前，用50mL来自母种培养物的培养液接种150mL种子/分批培养基。
所得培养物(约200mL)在28℃、150rpm下培育3到4天。
培养状态通过显微镜检查，并且已证实活跃移动的细长细胞对于接种来说是最佳的。
所得培养物的细胞密度是通过自动化细胞计数器来测定。细胞密度为每毫升约1500至2500万个细胞的种子接种体适于接种生物反应器。
实施例3：包括分批和分批加料发酵的多阶段发酵
方法
细小裸藻的发酵分两个步骤实施：如下文所述的初始分批发酵阶段，随后是如本文所述的分批加料发酵阶段。
细小裸藻的分批发酵始于将200mL种子接种体无菌输送到含有2.5L种子/分批培养基的5L生物反应器中。因此，分批发酵开始时的培养物体积是2.7L。种子接种体的细胞密度在理想情况下应接近于每毫升1500到2500万个细胞，原因是发酵开始时(‘0’小时)的细胞密度应是每毫升约1-2x106个细胞(或者，600nm光学密度(OD600或OD600)应是约0.5到1.0，或细胞湿重(WCW)应是约2到4g/L)。在以下参数下进行分批发酵：28℃的温度，使用1MNaOH控制的pH 3.2，使用竖直扁平刀片(2)叶轮以70rpm搅拌，空气流速为0.2vvm，并且在此操作中不控制DO。在分批发酵期间，在‘0’、‘24’、‘48’和‘72’小时，每天收集25至30mL样品一次。72小时之后停止收集，因为分批发酵3天之后，在生物反应器中检测不到葡萄糖。通过显微镜检查细胞形态/污染并且通过自动化细胞计数器、分光光度计(OD600)和细胞湿重(离心)来监测细胞生长。分批发酵完成之后，所有湿细胞生物质(WCW)冷冻干燥过夜以测量生物质的细胞干重(DCW)。为了计算相关因子，即，1WCW＝0.32DCW，将所有WCW值(g/L)相对于DCW值(g/L)作图。发酵液中的葡萄糖浓度(g/L)是通过YSI自动分析仪测量。依据分批发酵期间所收集的数据计算细小裸藻的生长特性，即，比葡萄糖摄取速率(qs，gglu/gDCW/hr)、基于葡萄糖的干生物质产量(Yxs，gDCW/gglu)和最大比生长速率(μmax，1/h)。
在分批发酵期间，在‘0’、‘24’、‘48’和‘72’小时，每天收集25至30mL样品一次。72小时之后停止收集，因为分批发酵3天之后，在生物反应器中检测不到葡萄糖。通过显微镜检查细胞形态/污染并且通过自动化细胞计数器、分光光度计(OD600)和细胞湿重(离心)来监测细胞生长。分批发酵完成之后，所有湿细胞生物质(WCW)冷冻干燥过夜以测量生物质的细胞干重(DCW)。为了计算相关因子，即，1WCW＝0.32DCW，将所有WCW值(g/L)相对于DCW值(g/L)作图。发酵液中的葡萄糖浓度(g/L)是通过YSI自动分析仪测量。依据分批发酵期间所收集的数据计算细小裸藻的生长特性，即，比葡萄糖摄取速率(qs，gglu/gDCW/hr)、基于葡萄糖的干生物质产量(Yxs，gDCW/gglu)和最大比生长速率(μmax，1/h)。
在自动化细胞计数的情况下，将10μL样品装载到制造商所提供的可再用载玻片的两侧，然后将所述载玻片插入Countess II FL自动化细胞计数器中。“自动聚焦”是通过机器/装置自动调节。20到30秒之后，一旦此举完成，则按压“计数(COUNT)”按钮。如果细胞计数逾500万个细胞/毫升，则稀释样品。
在利用分光光度计进行600nm光学密度(OD)测量的情况下，必要时稀释样品以使OD600值保持在0.2到0.7之间。DI/DW用作空白对照。
在WCW情况下，将25mL样品转移到预称重的50mL法尔康管(falcon tube)中。以5000rpm将管离心10分钟。弃置上清液且细胞团用25mL DI/DW洗涤一次。在相同设置下将管再次离心。弃置上清液且对含有集结粒的管称重。
含有湿细胞的管(测量WCW之后)在-20℃(冷冻机)中最少保存整夜。样品在冷冻干燥器中干燥整夜，且对管中的干燥生物质称重。
葡萄糖浓度如下测定：获取上清液样品且利用YSI分析仪器(YSI 2950)测量，以便测定样品中的葡萄糖含量。更具体地说，将1.5mL样品在微量离心管(Eppendorf tube)中以10,000rpm离心3分钟。收集上清液且装载到YSI机器上。仪器能够检测0.05g/L到9g/L范围内的葡萄糖。其测量实验样品中的葡萄糖且将其与标准进行比较以便测定所存在的葡萄糖的量。
在初始分批发酵阶段期间，在葡萄糖浓度下降到低于5g/L之后(即，在培育48到72小时之后，此视接种体密度而定)，通过向生物反应器中添加5x加料培养基来起始分批加料发酵阶段，以便维持葡萄糖限制的细小裸藻培养条件。加料培养基的流速(F(毫升/小时))通过考虑以下各项来计算：比底物摄取速率(qs＝0.05gglu/gDCW/hr)(其使用公式
计算)、培养物体积(V＝L)、干细胞密度(X＝gDCW/L)(将测得的WCW乘以系数0.32)，和加料培养基中的葡萄糖浓度(Sf＝75g/L)。比生长摄取速率保持恒定，而细胞密度、培养物体积和葡萄糖浓度变量在整个发酵期间发生变化。因此，在整个发酵期间，加料速率发生变化。用于计算加料流速的公式是
将加料培养基连续地添加到生物反应器中直至培养物体积达到其最大限度。分批加料发酵期间的培育参数与用于分批发酵的培育参数相同。加料72小时之后，当生物反应器几乎加满时，停止培育。通过离心收获发酵液并且将生物质冷冻干燥以便测定蛋白质、油和裸藻淀粉含量。发酵结束时测量总生物质浓度。通过近红外光谱法(NIR)测定生物质的蛋白质和油含量。利用β聚糖检验试剂盒(Megazyme)测定裸藻淀粉(β-1,3-葡聚糖)。
结果
图1和表4展示在含有碳(葡萄糖)、氮(硫酸铵和酵母提取物)、不同盐、维生素和痕量金属的优化培养基存在下进行的发酵的细小裸藻生长特征，如实施例1中所述。第0小时到第72小时实施分批发酵(如上文所述)，并且第73小时到第144小时实施分批加料发酵。在这个实验中，培育开始时的细胞数目、OD600和WCW分别测定为1.04×106个细胞/毫升、0.39和1.42g/L(表4)。初始葡萄糖浓度测定为13.06g/L。培育72小时之后，当生物反应器中的葡萄糖浓度下降到1.73g/L时，开始供应浓缩的加料培养基(5倍的含有75g/L葡萄糖的分批培养基)。加料培养基在分批加料培育期间的流速(毫升/小时)是基于上述公式计算。72小时之后，按照13.32毫升/小时的流速供应加料培养基，第93.5小时和120小时时分别增加到26.19毫升/小时和43.37毫升/小时(表4)。由于细胞密度和培养物体积在培育期间增加，因此改变加料流速。然而，为了计算加料流速，使底物摄取速率保持恒定为0.05gglu/gDCW/hr。
分批加料培育结束时，最终培养物体积达到约4.52L并且干细胞密度是26.25gDCW/L。在此分批加料发酵的情况下，生物反应器中的葡萄糖浓度在加料期间维持低于2g/L。初始分批阶段期间的生产率是0.129gDCW/L/hr，然而葡萄糖未被完全消耗，并且第72小时时，生物反应器中有1.73g/L葡萄糖可供利用。尽管如此，相对于实施例3中的分批发酵，此发酵中的生产率(0.182gDCW/L/hr(总体)和0.656gDCW/L/hr(仅分批加料阶段))增加。在这种情况下，分批加料发酵获得的生产率(总体)比分批发酵高约41.5％。
表4：细小裸藻在分批加料发酵期间的生长特征。
实施例4：包括分批、分批加料和恒化发酵的多阶段发酵
方法
如同实施例3的发酵，按照多个步骤对细小裸藻进行此多阶段发酵，第一步骤是如实施例3中所述的分批发酵阶段，第二步骤是如实施例3中所述的分批加料发酵阶段，并且第三步骤是如本文所述的恒化发酵阶段。
在初始分批发酵阶段期间，在生物反应器中的葡萄糖浓度下降到低于5g/L之后，利用分批加料模式、按照如实施例3中所述计算的加料流速添加3x加料培养基，以便增加培养物体积(高达生物反应器容积的75％至80％)并且改善细胞密度(15gDCW/L到20gDCW/L，比分批阶段结束时所测量的生物质高约2倍)。分批加料加料2至3天之后，当生物反应器的容积达到其最大限度(在5L情况下为3.75L到4.0L)时，开始恒化发酵(即，连续加料和收获)。恒化发酵期间的加料和收获流速(F(mL/hr))是基于稀释速率(D＝0.025h-1)和培养物体积(V＝3.75L到4.0L)计算。用于计算加料流速的公式是
根据分批发酵来计算最大生长速率(μmax)。在恒化发酵期间，稀释速率(D)应维持低于μmax。由于μmax经计算是约0.03h-1到0.04h-1，因此将D设定为0.025h-1以避免清除。基于D来计算加料流速。
在恒化发酵期间，一般在5到10个滞留时间(rt＝1/D)之后实现稳态条件，在稳态条件下，不出现底物、产物或生物质的聚集。然而，仅在D低于最大比生长速率(μmax)时实现稳态。如果D超过μmax，则发生细胞清除。由于在恒化发酵期间维持生物反应器容积恒定非常重要，因此泵(加料和收获)必须正确地校准。
结果
图2显示细小裸藻的发酵，其中典型的分批发酵实施0到48小时，分批加料发酵进行49到96小时，并且恒化发酵进行97到192小时，然而到171小时，培养基完全消耗。我们最初按照实施例3中所述的程序开始分批发酵。在这个特定实验中，培育开始时的细胞数目、OD600和WCW分别测量为1.815×106个细胞/毫升、0.628和2.27g/L(表5)。初始葡萄糖浓度测定为13.0g/L。然而，培育48小时之后，当生物反应器中的葡萄糖浓度下降到3.39g/L时，开始供应浓缩的加料培养基(3倍的含有45g/L葡萄糖的分批培养基)。加料培养基在分批加料培育期间的流速(毫升/小时)是基于公式
计算。48小时之后，按照17.93毫升/小时的流速供应加料培养基，第72小时时增加到36.6毫升/小时(表5)。由于细胞密度和培养物体积在培育期间增加，因此加料流速改变。然而，为了计算加料流速，使底物摄取速率保持恒定为0.05gglu/gDCW/hr。
表5：细小裸藻在实施例4的发酵期间的生长特征。
实施例5：发酵模式的比较。
生物质
一般来说，分批加料发酵在培育结束时产生高细胞密度。另一方面，恒化培育产生更高的生产率。然而，由于用于清洁、灭菌和配置的停工时间缩短，因此连续培育通常使得上游成本更低。如表6中所反映，在此研究中观察到生物质生产率在分批加料发酵与恒化发酵之间的差异不是很大。在分批加料发酵的情况下，生产率是0.656gDCW/L/hr，而在恒化发酵期间，生产率是0.56gDCW/L/hr至0.74gDCW/L/hr。然而，增加稀释速率预期可增强细胞生长速率，因此使得恒化发酵期间的细胞密度和/或生产率提高，从而提高生物质生产率。另外，重复进行的分批加料发酵可以提高细胞生长速率且因此使得恒化发酵期间的细胞密度和/或生产率更高。惊人地，分批发酵、分批加料发酵与恒化发酵的组合使得恒化器中的初始生物质增加并且因此增加总体生产率。
表6.实施例5发酵期间的生产率。
发酵产物
不同的发酵模式还影响油和蛋白质的产量，如表7中所示。
表7.实施例5发酵期间的油和蛋白质产量。
| 发酵模式 | 油(％) | 蛋白质(％) |
| 分批 | 9.4 | 43.8 |
| 分批加料 | 10.0 | 27.4 |
| 恒化 | 12.5 | 37.1 |
实施例6：使用再循环培养基进行的其它发酵研究
在向分批式生物反应器中的培育裸藻的再循环培养基中增补碳源期间监测营养培养基
这项研究是探究将增补碳源的再循环培养基的烧瓶规模实施例按规模扩大到3L生物反应器。在此实验中，为了了解使用葡萄糖、铵、硫酸铵和钾的速率，还进行营养监测。
方法和物料
种子制备和再循环培养基的产生
在配有排气盖的2x 500mL带挡板烧瓶中，通过将50mL细小裸藻细胞从母种培养物接种到150mL新制培养基中来制备种子培养物。在振荡培养箱(28℃，120rpm)中保持培养物3天。培育结束时，将所有细胞接种到含有2.5L新制培养基(根据表1-3(无油))的3L生物反应器中。发现反应器中的初始细胞计数是约1.5×106个细胞/毫升。如实施例3中所述，使用YSI分析仪器测试葡萄糖水平。
在整个实验中，生物反应器的培育是在28℃下使用80rpm的叶轮速度和0.4vvm的空气流速进行。通过连续添加1M NaOH直至发酵结束来维持所用培养基的pH。实验进行至培养基中的葡萄糖水平非常低为止(即，≤1g/L)。进行72小时的此周期表示为周期0。在此周期结束时，所有发酵培养基(约2.6L)都收集于2x 3L无菌瓶中。含有活细胞的200mL此培养基用作起始下一周期的接种体。将约1600mL含有活生物质的培养基在无菌离心瓶中离心(5000rpm，10分钟)以产生供下一周期(第1周期或C1)所需的再循环培养基(用过的培养基)。C1结束时重复采用类似方式产生用过的培养基和种子接种体用于第2周期(C2)且随后用于第三周期(C3)。
为了分析不同的发酵参数，在整个实验中，在0、24、48和(如果适用)72小时，从反应器(对照和再循环)中取出30mL样品。使用5mL样品测定细胞计数和OD(在600nm)。用重量分析法如下测定细胞干重(DCW)。将25mL生物质收集于50mL预称重的离心管中。然后以5000rpm将管离心10分钟。分离上清液并且将含有集结粒的管冷冻干燥，以计算DCW。将通过25mL培养基离心而获得的5mL上清液添加到15mL预称重的管中并且冷冻干燥，以测定溶质质量。类似地，使用5mL测定葡萄糖、铵和钾并且弃置剩余上清液(如果有)。
再循环混合型培养基的循环
实验处理
维持如上文所列的发酵条件。进行三个周期的培养，每个周期48小时，维持来自前一个周期的200mL接种体以繁殖下一次培养(来自第1周期的种子用于起始第2周期)。
对照
对照处理是由2.5L新制培养基和200mL种子培养物(接种体)组成，如先前所论述(不含油)。每天在无菌条件下取样以监测细胞计数、OD、葡萄糖浓度、铵浓度、钾浓度、细胞干重和上清液干重。通过使用培养基中的铵含量数据，通过将所述数据乘以132/36(它是硫酸铵与铵之间的化学计量关系，基于其相应的分子量)来获得硫酸铵浓度。每个周期结束时，使用NIR测量脂质、蛋白质和裸藻淀粉。每个周期结束时获得的生物质用作起始下一个周期的接种体。
再循环的混合型培养基
使用来自前一个周期的用过的无细胞培养基作为后一个周期的用过的无细胞培养基，即，第1周期使用前导周期中所产生的用过的无细胞培养基；第2周期使用第1周期中所产生的用过的无细胞培养基，并且第3周期使用第2周期所产生的用过的无细胞培养基。在无菌条件下将1250mL用过的无细胞培养基加回到生物反应器中。类似地，将1250mL新制培养基添加到生物反应器中，产生2.7L总体积(此包括200mL接种体)。每天在无菌条件下取样以监测细胞计数、葡萄糖浓度、铵浓度、钾浓度、细胞干重和上清液干重。利用培养基中的铵含量数据来获得硫酸铵浓度。通过使用培养基中的铵含量数据，通过将所述数据乘以132/36(它是硫酸铵与铵之间的化学计量关系，基于其相应的分子量)来获得硫酸铵浓度。在YSI 2950仪器上测量葡萄糖、铵和钾含量。铵和钾含量的测定方式与葡萄糖相同，其中以铵和钾而非葡萄糖作为标准。
每个周期结束时，使用NIR测量脂质、蛋白质和裸藻淀粉。如前所述在无菌条件下收获所有生物质，在离心之后收获用过的无细胞培养基并且与新制培养基组合用于后续周期中。在6x 250mL无菌离心瓶中，以5000rpm离心10分钟。离心结束时，在无菌条件下将上清液收集于3L无菌瓶中。然后将1250mL所得上清液输送到含有等体积的新制ASAF6培养基的生物反应器中。
数据分析
生物质干重
干燥生物质是指已经冷冻干燥以便去除样品中的水分子的生物质。干燥生物质的制备如上文所述。本领域的技术人员能够容易地认识到适于干燥生物质的不同方法，例如可以使用烘箱干燥。培养物随时间(天)变化的细胞生物质干重是细胞生长的度量。细胞生长可能归因于细胞较多，即复制，或归因于细胞的组成变化，即细胞内产生碳水化合物、蛋白质或脂质。
上清液干重
在以上实施例中从集结的细胞中去除上清液，这是通过将其从集结的细胞中倾析出来并且将其冷冻干燥来实现。此工艺涉及将细胞上清液在80℃下冷冻10分钟到12小时，随后将样品放在冷冻干燥器中处于真空下。由此去除冷冻的水分子。保留下来的是干燥溶质，所述干燥溶质存在于培养基中。溶质是化合物，即培养基的组分以及细胞的潜在分泌物质，即废弃产物。随着培养基的组分被使用，溶质含量将随着时间降低，例如作为主要碳源的葡萄糖。
测定效率
转化效率是培养基效率的一种度量。转化效率定义为所产生的生物质的量除以培养基中所消耗的溶质的总量。通过在周期结束时获取生物质的总质量并且减去培养物在开始时的初始总生物质来计算所产生的生物质。溶质消耗的总量是按照培养物在开始时的总溶质减去最后一天的总溶质来计算。转化效率如下测定：
转化效率＝(周期结束时产生的总生物质/周期结束时消耗的总溶质)*100％
所产生的总生物质
每个周期所产生的总生物质如下测定：
每个周期所产生的总生物质＝周期结束时的总生物质干重-周期开始时的总生物质干重
消耗的总溶质
每个周期消耗的总溶质如下测定：
每个周期消耗的总溶质＝周期开始时的初始溶质重量-周期结束时的最终溶质重量
总产量
总产量是输入中有多少转化成生物质的度量。在此计算中，一个周期中所产生的生物质的量是通过将每个周期结束时的干燥生物质(克)从周期开始时的初始生物质干重(克)中减去来测定。然后将此量除以所用输入的总质量(克)，即，存在于生长培养基中的所有组分。细胞干重定义为生物质干重。总产量如下测定：
总产量(gDCW/g输入)＝周期中所产生的生物质总质量(细胞干重)(gDCW)/所用输入的总质量(g输入)
补充产量
补充产量的计算类似于总产量，然而，其不是所用输入的总质量，而是混合型培养基中来自新补充培养基的总质量。在此计算中，一个周期中所产生的生物质的量是通过将每个周期结束时的干燥生物质(克)从周期开始时的初始生物质干重(克)中减去来测定。然后将此量除以所用补充输入的总质量(克)，即，所添加的新制生长培养基中存在的所有组分。细胞干重定义为生物质干重。补充培养基产量如下测定：
补充产量(gDCW/gS输入)＝周期中所产生的生物质的总质量(细胞干重)(gDCW)/来自周期中所用的新制生长培养基的输入的总质量(gS输入)
基于葡萄糖的产量
由于葡萄糖是主要碳源并且就质量而言构成培养基的2/3，因此还根据葡萄糖利用来报告产量。其定义为一个周期所产生的生物质干重除以那个周期中使用了多少葡萄糖。其按照培养物或生长培养基的质量(即，克)或克/升(浓度)来度量。基于葡萄糖(浓度)的产量如下测定：
基于葡萄糖(浓度)的产量＝(周期结束时的细胞浓度(g/L)-周期开始时的细胞浓度(g/L))/(周期开始时的葡萄糖浓度(g/L)-周期结束时的葡萄糖浓度(g/L)。
结果和讨论
表8和表9呈现对照生物反应器的原始数据，而表10和表11呈现混合型培养基生物反应器的原始数据。细胞生长是按照OD(600nm)、细胞计数和细胞干重来测定。一般来说，再循环培养基生物反应器与对照组的OD、细胞计数和DCW(g/L)随着时间增加(图3和图4)。在所有情况下，对照生物反应器样品稍微高于再循环培养基的测量结果，但所产生的生物质的量在总体上类似。
表8：对照培养基在所有3个周期的生长参数OD、细胞计数和葡萄糖。
表9：生物反应器中的对照培养基在所有3个周期的生长参数DCW(g/L)、残余溶质(g/L)、总DCW、总体积和总溶质含量。
表10：混合型培养基在所有3个周期的生长参数OD、细胞计数和葡萄糖。
表11：生物反应器中的混合型培养基在所有3个周期的生长参数DCW(g/L)、残余溶质(g/L)、总DCW、总体积和总溶质含量。
对照生物反应器和混合型培养基生物反应器中的营养物概况分别见于图5A和图5B中。葡萄糖消耗显示100％新制生长培养基对照以及葡萄糖补充的50％再循环培养基中的葡萄糖均降低，第48小时观察到接近0g/L含量，并且在所有周期皆发现此趋势(图5A和图5B)。对照生物反应器和再循环培养基生物反应器中的铵浓度随着时间减小，并且在所有3个周期中皆发现了此趋势。再循环生物反应器在每个周期开始时的铵含量小于新制生长培养基对照生物反应器中的铵含量。由于硫酸铵浓度是依据铵含量推测而来，因此在对照生物反应器与再循环培养基生物反应器中均观察到类似趋势。再循环培养基生物反应器中的硫酸铵浓度是对照生物反应器的约一半，表明到每个周期结束时，细胞利用了生长培养基中的大部分氮。对照生物反应器中的钾含量在第1周期和第2周期发生变化，其中在第1周期的第24小时发现含量最低，并且在第1周期的第48小时和第2周期发现含量最高。然而，在第3周期的第48小时，钾含量降低至接近0g/L含量。再循环培养基生物反应器中的钾含量出现类似的变化，其中钾含量在第1周期的第24小时最低，钾含量在第1周期的第48小时以及第2周期的第24小时最高。第3周期截至第48小时再次出现接近0g/L的钾含量。
计算新制对照培养基和补充葡萄糖的50％再循环培养基在所有周期的转化效率，如下表12中所示。在所有周期期间，补充葡萄糖的50％再循环培养基的转化效率(43％)高于新制对照培养基(36％)。再循环培养基在第2周期中具有最高的转化效率48％。如果采用的新制培养基是控制效率，则补充葡萄糖的50％再循环培养基在总体上是以119％效率操作。将此分批实施例与实施例3和实施例4进行比较，其中这个实施例考察再循环培养基并且已按照转化效率来显示，效率高于对照，这类似于实施例3和实施例4中的分批阶段。
表12：生物反应器规模的再循环培养基实验的转化效率。按照分批方式培养细胞并且补充葡萄糖以使葡萄糖含量等于100％新制对照培养基中的含量。
100％新制对照培养基的总产量和基于葡萄糖的产量显示于下文的表13中并且补充葡萄糖的50％再循环培养基的补充培养基产量和基于葡萄糖的产量显示于表14中。
表13：100％新制生长培养基总产量和基于葡萄糖浓度的产量的汇总。
表14：补充葡萄糖的50％再循环培养基补充产量和基于葡萄糖浓度的产量的汇总。
随着周期进展，100％新制生长培养基的总产量从0.296降到0.203，然而第1周期与第2周期相当类似。发现基于葡萄糖的产量在第1周期与第2周期具有相同的趋势，类似地分别为0.60和0.59，并且在第3周期降低到0.41。结果，对照组的平均总产量是0.263，而基于葡萄糖的产量是0.54。
将此与补充葡萄糖的50％再循环培养基比较时，所有周期的补充培养基产量和基于葡萄糖的产量更高。补充培养基产量随着周期发生变化，第1周期为0.411，第2周期为0.435，第3周期为最低0.306且所有周期平均为0.384。再循环培养基的基于葡萄糖的产量也随着周期发生变化，第1周期为0.66，第2周期为0.71且第3周期为0.50，所有周期平均为0.62。
总体上，补充葡萄糖的50％再循环培养基(混合型培养基)的总产量和基于葡萄糖浓度的产量高于100％新制生长培养基。这表明基于所补充的输入或所用葡萄糖的总量而产生的生物质的量高于补充葡萄糖的50％混合型培养基。不希望受理论所束缚，混合式培养基的产量较高可以归因于裸藻细胞的独特代谢。裸藻可能分泌出的“废弃”产物，例如乙酸、乳酸、反丁烯二酸、苹果酸、丙酮酸或丁二酸，能够代谢并且适用作培养源。即使考虑葡萄糖的添加量，混合型培养基的产量仍然更大，表明与新制培养基相比，裸藻细胞能够更好地利用混合型培养基产生生物质。此体现为其在7.92L中产生28g生物质，相比之下，新制培养基在7.92L中产生23.7g生物质。
基于NIR结果(表15)，观察到每个周期和条件的总生物质存在明显的趋势。与100％新制生长培养基对照相比，补充葡萄糖的50％再循环培养基生物反应器中的裸藻淀粉(β-1,3-葡聚糖)的量增加。这是因为碳与氮的比率变得更高，这支持裸藻中的碳水化合物、β-1,3-葡聚糖的形成。就蛋白质来说，在所有周期中，100％新制生长培养基样品中的蛋白质百分比更高。由此预期，此培养基中的碳与氮的比率比在再循环培养基条件下低。在再循环条件与对照条件之间，每个周期的脂质含量类似。第一周期中观察到的脂质的量最低，第2周期和第3周期的量增加。
表15：实施例6混合型培养基和对照样品中所收集的生物质的NIR结果。
实施例7：在生物反应器中连续培养期间使用监测培养裸藻时的培养基成分以补
充耗尽的碳源
在此研究中，探究生物反应器中的补充葡萄糖的培养基，所述生物反应器经历所有三种不同培养方式：分批、分批加料和连续加料方式。将100％新制生长培养基与50％混合型培养基在分批、分批加料和连续培养阶段期间进行比较。
方法和物料
制备用过的培养基(3天分批发酵)
如实施例6中所列，进行种子制备和再循环培养基的产生。
为了产生再循环培养基供后续加料样式用，将0.2L活跃生长的细小裸藻细胞接种于两个4L烧瓶中，所述烧瓶含有3L如实施例6中概述的培养基。生物反应器在28℃下培育，直至培养基中的所有葡萄糖达到近似0g/L为止。使用与实施例3概述相同的方法，通过YSI分析仪器(YSI 2950)测量葡萄糖消耗。在YSI 2950仪器上测量铵和钾含量。铵和钾含量的测定方式与实施例3所述的葡萄糖测定方式相同，其中以铵和钾而非葡萄糖作为标准。
整个期间维持0.4vvm的空气流速和80rpm的叶轮速度。使用1M NaOH溶液将培养基的pH调节到3.2。在培育结束时，在无菌条件下从生物反应器收获生物质并且在5000rpm下离心10分钟。将5L所得无细胞上清液(也称为用过的培养基)无菌输送到10L烧瓶中。
实验处理
进行两次处理，检查培养物在分批、分批加料和连续分批发酵条件下的生长。在指定为实验混合型培养基生物反应器和新制生长培养基对照生物反应器的6L生物反应器中进行处理。两种培养物各自在28℃、0.4vvm、80rpm的叶轮速度和通过自动添加1M NaOH而维持在3.2的pH下培养。实施例7使用的培养基组成如下表16中所示。最初，在含有1250mL培养基A的两个反应器中，通过接种活跃生长的细小裸藻细胞而进行分批发酵。在48小时结束时，向混合型培养基生物反应器中加入培养基D直到最终工作容积为2.5L。类似地，在对照生物反应器的情况下，使用培养基C填充到2.5L的最终容积。由此起始分批加料发酵，所述分批加料发酵再进行24小时。分批加料结束时，在生物反应器中通过使用培养基D(混合型培养基生物反应器)和培养基C(对照生物反应器)将工作容积再调节到2.5L。相应培养基按照75mL/hr的流速连续地加入到系统中。两种储罐也按照类似的流速(即，75mL/hr)设置连续收获。连续发酵维持5天。在整个实验期间，在无菌条件下每24小时收集样品以测量细胞计数、细胞干重(DCW)、OD、溶质和葡萄糖浓度(g/L)。利用与实施例3概述相同的方法，通过YSI分析仪器(YSI 2950)测量葡萄糖消耗。
在连续周期结束时，使用NIR测定脂质、蛋白质和碳水化合物。碳水化合物百分比如下测定：
100％-蛋白质(％)-脂质(％)＝碳水化合物百分比。
表16：实施例7培养基方案汇总
数据分析
如实施例6概述获取生物质干重。
如实施例6中所述获取上清液干重。
还计算实施例6中所测定的其它参数。
结果和讨论
表17和表18呈现对照生物反应器的原始数据，而表19和表20呈现混合型培养基生物反应器的原始数据。依据OD(600nm)、细胞计数、细胞干重、葡萄糖消耗和pH测定细胞生长(图6和图7)。就对照与混合型培养基来说，分批生物质和细胞计数增加直至周期结束为止。随后生物质和细胞计数降低以便起始分批加料，然后到第24小时时稍微增加。就100％新制对照培养基来说，细胞干重在120小时的连续阶段期间保持恒定。就混合型培养基生物反应器来说，细胞干重在连续阶段期间随着时间稍微降低。对照组的OD和细胞计数遵循相同趋势，在开始不同并且在阶段结束时稳定。混合型培养基生物反应器中的OD和细胞计数在连续阶段期间显示较大可变性。这些结果表明，需要针对混合型培养基生物反应器优化培养基移出和添加速率，然而，在实验过程中仍然产生生物质。对照培养基与混合型培养基中的葡萄糖消耗类似，其中在分批阶段中降低，在分批加料阶段中增加并且在连续阶段中保持恒定。pH在两种条件下保持恒定，如通过添加1M NaOH所控制。
表17：所有3个培育阶段的对照培养基生长参数DCW(g/L)、600nm OD、细胞计数、溶质、加料速率和所添加的体积、反应器容积和收获的体积。
表18：生物反应器中的对照培养基在各阶段的培养参数总DCW、所收获的生物质的总DCW、在连续阶段累积的总DCW、反应器中的溶质、所收获的生物质的溶质和生物反应器的总溶质。
表19：所有3个培育阶段的混合型培养基生长参数DCW(g/L)、600nm OD、细胞计数、溶质、加料速率和所添加的体积、反应器容积和收获的体积。
表20：生物反应器中的混合型培养基在各阶段的生长参数总DCW、所收获的生物质的总DCW、在连续阶段累积的总DCW、反应器中的溶质、所收获的生物质的溶质和生物反应器的总溶质。
NIR结果见于实施例7的表21中。在分批阶段期间，对照培养基与混合型培养基之间观察到类似的结果。在分批加料阶段期间，混合型培养基样品中的脂质减少而碳水化合物增加，而对照样品中的蛋白质增加。在连续阶段期间，对照样品中的蛋白质随着时间稍微增加，而脂质降低并且碳水化合物保持相似。在混合型培养基样品中观察到与对照条件类似的趋势，其中与对照样品相比，脂质轻微增加。两种条件均具有小于5％的脂质、33％到41％的蛋白质和59％到64％的碳水化合物。这表明使用包含50％再循环培养基的混合型培养基在连续发酵培养时得到与100％新制生长培养基对照类似的生物质组成。其还显示恒定加料速率期间的生产率。在下一个实施例中，加料速率适于每12小时时间范围内的细胞生长。
表21：在实施例7实验条件和时间点的蛋白质、脂质和碳水化合物(carbs)含量的NIR结果汇总。
与短周期时长和长周期时长相比，中等时长(即3到4天)培养基具有更高的转化效率。当考察所有周期结束的时间(即，所有周期结束时)时，其也具有更高的转化效率，原因在于其实施起来比其它周期天数的时长更好。周期天数长的时长随着周期次数增加而出现降低的转化效率。
实施例8：与对照试验相比，使用再循环/混合型培养基对细小裸藻的连续培育
1.背景：
在此实验中，使用混合(再循环)培养基的连续发酵用于分批、分批加料和连续形式的三步骤工艺中。将这些结果与添加新制培养基而非混合式混合物的对照实验进行比较。
2.方法：
2.1.母种培养物的维持和种子接种体的制备：
表1到表3中所述的种子/分批/加料培养基用于维持母种培养物和制备种子接种体。细小裸藻的母种培养物[约20到40g/L细胞湿重(WCW)，200到500mL培养液于1L摇瓶中]已经在我们的实验室中维持很长一段时间。此培养物每周用100mL种子/分批/加料培养基加料三次。一旦母种培养物的体积达到500mL，则从摇瓶中收获300mL培养液并且如上文所述继续向所得培养物(约200mL)中加料。
种子接种体的制备简要说明如下。
将50mL细小裸藻母种培养物接种于500mL摇瓶中的150mL种子/分批/加料培养基中。还向摇瓶中添加80μL的2500x维生素混合物。在28℃、150rpm下进行种子繁殖48到72小时。
种子接种体的状态通过显微镜检查，并且已证实活跃移动的细长细胞对于接种来说是最佳的。
所得培养物的细胞密度是通过WCW测定(将20mL培养液离心，弃置上清液且将细胞集结粒称重以测定WCW)。
使用细胞密度为约20到40g/L WCW的种子接种体，按照生物反应器规模起始发酵。
2.2.连续发酵：
为了使用再循环培养基进行裸藻培养、同时维持与新制或常规培养基相似或更好的生物质产量和生产率，在此研究中进行连续/恒化发酵。
制备所有培养基和浓缩储备溶液并且在实验开始之前进行高压蒸汽灭菌。在整个实验(即，维持母种培养物、种子繁殖和连续发酵)期间使用复合培养基(即，含有葡萄糖、酵母提取物、硫酸铵、一系列盐、一系列维生素、一系列痕量金属盐、植物油，pH调节到3.2)。维生素混合物和痕量金属混合物的组成分别如表2和表3中所示，并且种子/分批/加料/复合培养基的组成如表1中所示。
最初以分批培育模式起始连续发酵。种子接种体的细胞密度应该是20到40g/LWCW，使得发酵开始(‘0’小时)的细胞浓度是约OD600(600nm光学密度)：0.5到2.0或WCW：2到4g/L。连续发酵的培育参数如下：温度28℃、pH 3.2、使用拉什顿(rushton)涡轮叶轮进行300-600rpm搅拌、空气流速0.4-2vvm，和使用搅拌和空气产生的20％DO/pO2。在发酵期间，每12小时常规地收集30mL样品。取样之后立即通过显微镜分析试样的细胞形态，通过pH计分析试样的pH，通过分光光度计分析试样的细胞密度(OD600)，并且将20mL培养液(WCW)离心，通过YSI分析试样的葡萄糖浓度。通过CEDEX生物分析仪和HPLC进一步分析样品，以测定代谢物浓度。将经由WCW测量而获得的细胞集结粒在-80℃下冷冻直至那些样品的细胞干重(DCW)被测定为止。还通过将已知量的上清液冷冻干燥(即，在经由离心去除细胞集结粒之后)来测量培养液中的总溶质浓度。
进行发酵36到48小时之后，观察到生物反应器中的葡萄糖浓度具有限制性(即，0到5g/L)。在将培育转换成实际的连续模式(即，按照相似的流速连续加料和收获，以便维持培养物体积恒定)之前，经由分批加料模式(即，按照恒定流速向生物反应器中供应加料培养基)再继续培育2天。一旦分批阶段的葡萄糖浓度接近5g/L，则按照恒定流速添加加料培养基(即，含有15g/L葡萄糖)而不从生物反应器收获培养液。使用指数加料公式计算加料培养基的流速(F，毫升/小时)，所述公式是基于分批阶段结束时的细胞密度(X＝gDCW/L，最初按照WCW乘以系数0.32来测得)和培养物体积(V＝L)，以及恒定的比葡萄糖摄取速率(qs＝0.07gglu/gDCW/hr)和加料培养基中的葡萄糖浓度(Sf＝15g/L)。用于计算分批加料阶段的加料流速的公式如下：
为了制备用于连续发酵的混合型培养基以起始连续发酵，收获1.5L发酵液并且在无菌条件下离心以回收再循环培养基。一旦回收，则将培养基与新制培养基(未添加2500x维生素混合物)在无菌条件下混合(1:1)。然后将混合型培养基按照一定的稀释速率添加到生物反应器中以起始连续发酵。在此实验中，为了起始加料，将稀释速率(D)设定为0.02h-1，其低于细胞清除发生时的临界稀释(Dcrit)/最大比生长速率(μmax)。为了连续地收获发酵液且维持培养物体积恒定，将生物反应器中可供使用的金属汲取管的一端按照预定的体积标记设定，而另一端附接到硅胶管，所述硅胶管插入蠕动泵中用于连续地抽取预设体积的发酵液。基于预定的稀释速率(D＝0.02h-1)和培养物体积(V＝2.5L)来计算连续发酵期间的加料速率(F，mL/hr)。用于计算连续阶段的加料流速的公式是：F(mL/h)＝V.D.1000。
为了在连续发酵期间实现稳态和维持细胞密度恒定，每12个小时改变加料速率。此与实施例7不同之处在于，连续阶段期间的加料速率是恒定的。基于目标细胞密度(即，分批加料阶段结束时的WCW，恒定)、当前加料速率(即，最后12小时加入混合型培养基的速率)、当前细胞密度(即，测量的当前WCW)来开发加料速率计算器。每12个小时使用表22中的公式[D＝(B*C)/A]计算新的加料速率。10/18是仪器转换因子(即，在18ml/hr下为10％)。每种新的加料速率意指为了解释新速率，也同时改变稀释速率。在12小时的时间跨度内，所收获的发酵液在0.2L到1.86L范围内。
表22：在连续发酵期间使用的加料速率计算器
除在连续发酵阶段期间维持细胞密度恒定之外，另一个主要目标是使用混合型培养基提高裸藻生物质的生产率。因此，开始研究比生长/稀释速率高于最大比生长/临界稀释速率对培养裸藻的影响(即，观察细胞清除对代谢物概况的影响达到何种程度)。根据莫劳德公式(Monod equation)，已知生物体的比生长速率通常随着生物反应器中的营养物浓度增加而增加。因此，通过每12小时添加浓缩的葡萄糖溶液(200g/L)而将生物反应器中的葡萄糖浓度调节到约10g/L。表23中的公式[D＝(C-B)*(A/200)*1000]用于确定浓缩的葡萄糖溶液加入生物反应器中的必需量。
表23：连续发酵期间使用的浓缩葡萄糖添加计算器
| 参数 | 值 | 单位 | 备注 |
| 当前培养物体积 | A | L | 2.5L，恒定 |
| 当前葡萄糖浓度 | B | g/L | 测得 |
| 目标葡萄糖浓度 | C | g/L | 10g/L，恒定 |
| 必需的体积 | D＝(C-B)*(A/200)*1000 | mL | 计算 |
3.结果和讨论：
尽管制备了200mL种子接种体，但仅添加100mL至1.5L分批培养基中。分批阶段开始时的培养物体积是1.6L。种子培养物接种之前，将600μL的2500x维生素混合物(即，1.5L分批培养基所需量的维生素)添加到接种烧瓶中。发酵“0”小时(即，刚好在种子接种之后)的细胞密度是OD600～2和WCW～3.7g/L(表24)。“0”小时的葡萄糖浓度经YSI测定为13.5g/L，但其应该是15g/L，原因在于培养基中的葡萄糖浓度因100mL种子接种体添加到生物反应器中而被稀释。分批培育36小时之后，生物反应器中的葡萄糖浓度测定为5g/L，并且细胞密度增加到OD600～12.57和WCW～22.75g/L(表24)。在此实验中观察到葡萄糖消耗速率更快，这归因于在发酵开始时接种了浓度更高的种子接种体的事实。
表24：细小裸藻的生长和使用混合型培养基连续发酵期间的培养条件
然而，在分批阶段结束时(第36小时)，开始按照52.1mL/hr的恒定加料速率添加加料培养基，使得生物反应器中的细胞密度能够进一步增加。在48小时期间内添加总共2.5L加料培养基，使培养物体积达到4L。在此实验中，为了计算加料速率，将比葡萄糖/底物摄取速率设定为0.07gglu/gDCW/hr，但实验室中进行的所有先前分批加料实验均考虑0.05gglu/gDCW/hr的值。比葡萄糖摄取速率考虑较高值的原因是向细胞提供足量的葡萄糖以使细胞按照其最大的生长速率生长。因此，分批加料阶段结束时(即，培育的第84小时时)实现WCW～35g/L的细胞密度(表24)。尽管如此，仍在第72小时时观察到WCW～38.6的较高细胞密度(表24)，证明细胞密度因生物反应器中无可用的葡萄糖而降低。另外，此数据显示，分批加料阶段期间的残余葡萄糖浓度低(表24)，即使在考虑了较高值的比葡萄糖摄取速率之后仍然低。此结果表明使用了葡萄糖浓度较高的加料培养基。
在分批加料阶段结束时(第84小时)，使用蠕动泵在无菌条件下收获约1.5L发酵液，同时证实了生物反应器中的培养物体积是2.5L。为了确保无菌，硅胶管的一端连接到生物反应器中可用的汲取管且另一端连接到收集容器。然后将收获的发酵液在无菌条件下输送到无菌摇瓶，进行离心以回收再循环培养基并且按照1:1比率与新制加料培养基混合。然后以50毫升/小时的速率将混合型培养基添加到生物反应器中以满足0.02h-1的预设稀释速率并且以相同速率将发酵液添加到生物反应器中以维持生物反应器中恒定的培养物体积。在此研究中，每12小时改变加料速率，目的是在连续发酵期间维持恒定的细胞密度(即，分批加料阶段结束时的WCW)。然而，观察到在84到204小时培育期间，加料速率连续地降低(从50毫升/小时降到17.2毫升/小时)(表25)。因此，发现那些相应时点的稀释速率也降低。然而，除极少的初始取样点之外，能够维持细胞密度接近初始值(在第84小时，35g/L WCW)(表24)。
观察到在84到204小时的培育期间，残余葡萄糖浓度几乎是零(表24)。然后考虑细胞生长是否因生物反应器中没有足量的葡萄糖可控利用而受到阻碍的问题。由于确保高生产率是主要关注的，因此决定添加浓缩的葡萄糖(200g/L)以维持约10g/L的葡萄糖水平，并且确保细胞生长不会因生物反应器中缺乏碳源而受到限制。第204小时时，按照特定的加料速率首次将浓缩的葡萄糖连同混合型培养基一起添加。因此，一旦生物反应器中的葡萄糖浓度在每个取样时间都维持在约10g/L，就观察到加料速率/稀释速率增加。由于实施了此方法，因此最终实现了较高的细胞密度和生物质生产率。在发酵的第252小时时，测得最高的细胞密度约58g/L WCW(表24)和最高的生产率约2.3gWCW/L/小时(约0.74gDCW/L/小时)(表25)。较高的生产率(约2g WCW/L/小时)维持60小时(即，从第276小时到第336小时)(表25)。另外，观察到细胞缓慢地清除，最终降低了细胞密度和生物质生产率。
图8显示了细小裸藻在连续发酵期间在混合培养基上的生长。在此，裸藻的两种主要生长参数(即，WCW、OD600)连同连续培育过程中的葡萄糖消耗概况一起呈现。清楚地观察到，由于当混合培养基供应时没有足量的葡萄糖可供利用(估计其含有约7.5g/L葡萄糖)，因此细胞生长从第72/84小时到第204小时受到限制。一般来说，分批加料使用浓缩的原料(葡萄糖浓度比分批培养基高5到50倍)。意识到此潜在事实之后，通过添加浓缩的葡萄糖溶液(即，200g/L)而使生物反应器中的葡萄糖维持在约10g/L。由于葡萄糖加入，因此细胞密度从第204小时(34g/L)到第252小时(57.8g/L)增大，然而细胞密度开始再次下降(表24)。这可能是由于混合培养基按照较高稀释速率添加导致细胞清除。另外，这些结果显示，生物反应器中的残余葡萄糖水平从第252小时开始升高。
图9显示连续发酵期间所涉及的主要培育参数的概况。在此研究中，由于为了控制pO2/DO水平而仅供应空气，因此自动地使气体混合物维持在21％(即，空气含有约21％O2)。为了将pO2/DO水平控制在20％，考虑经由添加空气(1～5L/min)和搅拌(300～600rpm)来实现串级控制。尽管培育开始时的搅拌速度为300rpm，但其在分批加料和连续加料期间几乎增加到其最高水平以便满足最低的pO2/DO要求(即，20％)。类似地，在发酵过程期间自动地增加空气流速(图11)。在将生物反应器灭菌之前，当利用空气将溶氧探针校准到100％时，任何发酵通常都以pO2/DO水平接近于100％表示。根据此实验的pO2/DO概况，注意到接种开始时的DO水平是约65％，尽管这并不是一个重要的问题。然而，需要提及的是，一旦种子接种到生物反应器中，通常观察到DO水平急剧降低(即，5～10％)。根据此pO2/DO概况，清楚地观察到细胞从第108小时到第204小时缺乏葡萄糖或任何其它碳源。然而，通过将浓缩的葡萄糖供应到生物反应器，一旦葡萄糖浓度维持在约10g/L，则观察到DO水平向设定点(即，20％)缓慢衰减。然而，即使葡萄糖浓度维持在约10g/L之后，从第372小时再次观察到DO水平升高。由于细胞代谢发生了变化(即，细胞移动极低，并且生长几乎停止)，这有可能会发生。
表25.细小裸藻在混合培养基上连续发酵和生物质生产率的关键参数
在此研究中，为了在连续阶段期间维持生物反应器中恒定的细胞密度，在整个实验中改变加料速率，这与实施例7不同，在实施例7中，加料速率是恒定的。在分批加料阶段(从第36小时到第84小时)期间，按照52.1mL/hr的恒定加料速率添加加料培养基(表25)。然而，为了起始连续加料和收获，将加料速率预设为50mL/hr(即，当培养物体积是2.5L时，稀释速率是0.02h-1)。随后每12小时改变加料速率以维持35g/L的WCW(即，连续阶段开始时的细胞密度)。图10中的结果显示加料速率从第84小时到第204小时连续降低。然而，当生物反应器中的葡萄糖浓度在每个取样点都维持在约10g/L时，加料速率开始增加。然而，培育324小时之后，培养物不可能按照较高加料速率保持加料。似乎是培养物被过量加料并且细胞最终从生物反应器中清除。在此研究中，在20天期间内收获总共29.2L发酵液，但连续加料与收获始于惊人的2.5L培养物体积。这是运行连续发酵的最重要优点之一。除此重大的成就之外，实现了显著的生物质生产率。实现2.31gWCW/L/小时(0.74gDCW/L/小时)的生产率，这是使用混合培养基迄今为止最高的生物质生产率。连续发酵相较于分批发酵的优势是20天期间收获的生物质的量。所述量每天变化，然而在生产率高的时间期间，收获的生物质更多，以便使容器保持在稳态，即35WCW g/L。由于我们的加料速率每12小时发生适应性变化，因此生产率可能较高(根据细胞密度)，如果细胞密度增加，则我们的稀释速率增加。同样，如果生物质减少，则稀释速率或加料速率会降低以试图使其保持在其稳态。以前是固定稀释速率(加料速率)，意味着我们对整个期间的生长差异未加以利用。通过适应性加料，保持细胞生长且提高生产率(相较于此前的操作，如实施例7)。另外，添加浓缩的葡萄糖(204小时时间点之后)，这对细胞生物质产生直接的影响。这些变化允许收获比此前所证实的更多的生物质和更高的生产率。
图11显示细小裸藻使用混合培养基连续发酵期间的空气流动和排气概况。在此研究中，经由级联方式将空气供应到生物反应器中，即，在控制面板上设定1到5L/min的空气流速并且系统自动地调节其要求以便维持生物反应器中的最低pO2/DO水平(即，20％)。此研究显示，在细胞以指数方式生长的分批加料阶段期间，需要最高的空气水平(即，3.9L/min)。另外，观察到在培育第60小时时，搅拌速度尽管减小到最低水平(即，300rpm)直至搅拌速度在第156小时增加到600rpm，但也是足够的高(表24)。然而，这些结果显示，一旦混合培养基开始添加到生物反应器中，则空气供应的需求最小。由于培养基中没有足量的葡萄糖可供利用，因此这可能会发生。然而，一旦生物反应器中的葡萄糖水平维持在约10g/L，则空气供应自动地增加，但其在培育第372小时再次下降到最低水平。基于空气流动和排气概况，显而易见的是，细胞在培育372个小时之后变得无活力。然而，这些结果显示，排气数据(即，OUR、CER和RQ)依赖于供应到系统中的空气，原因在于OUR、CER和RQ增大的同时，需要的空气量更高，且反之亦然。OUR表示氧摄取/利用率，其是每小时每升培养物消耗多少摩尔O2。CER是二氧化碳释放速率，其是每小时每升培养物产生多少摩尔CO2。RQ是呼吸商数/系数，其是在呼吸期间，裸藻所产生的二氧化碳体积相对于裸藻所消耗的氧气体积的比率。考察OUR概况时，然而，在混合培养基的连续加料期间获得一些负值。这是由于测得排出O2值稍微高于气体混合物(即，21％)。在连续加料和收获开始时(121到204小时)获得负值，然而生物反应器中的葡萄糖浓度由于再循环培养基(含有约7g/L葡萄糖)的加料而极低。当其达到约10g/L的维持性葡萄糖浓度时，细胞开始利用葡萄糖，排出O2(％)值开始减小(利用氧气)，并且排出CO2(％)值作为副产物而增大(产生CO2)。由于裸藻是微藻，因此其有能力使用CO2作为能量源并且产生O2。在排气分析的情况下，共同趋势是排出O2值减小、排出CO2增加且反之亦然。需要更多实验来确定当向生物反应器中供应纯CO2的同时，减少生物反应器中的有机碳源时的结果。
不希望受理论所束缚，观察到O2水平提高而CO2量减小的一种解释可以是，在应激或碳饥饿条件下，异养裸藻能够利用CO2作为碳源，这是出乎意外的。这表明存在一种路径或裸藻中的能量产生路径能够在质体中发挥作用，而不仅仅在全功能叶绿体中发挥作用，这在光条件下可以见到。作为比较，在不存在碳限制的对照实验中，未观察到O2存在负值。另外，已经证明以异养方式生长的细小裸藻细胞能够固定CO2。这通常在限制营养物的条件下进行并且充当补充TCA中间物的方式并且能够引起特定的氨基酸产生。
图12显示细小裸藻连续发酵期间的代谢物概况。根据此数据，观察到Ca+在发酵过程中没有发生太多的消耗，这表明此实验中使用的复合培养基中的CaSO4可能减少。我们实验室在化学成分确定的培养基(CDM)中进行CaSO4优化的结果也证实了这个观察结果。考察此数据，清楚地观察到细胞在分批阶段和分批加料阶段期间消耗磷酸盐与镁。然而，一旦混合培养基开始添加到生物反应器中，则发现两种组分均累积。因此，当生物反应器中的葡萄糖浓度维持在约10g/L时，两种组分均急剧减少。似乎是细胞快速地消耗了磷酸盐与镁以便满足由于葡萄糖的加入的生长速率。然而，磷酸盐与镁从第264小时开始均再次增加。然而，磷酸盐水平从第372小时再次降低，这是无法解释的。还通过HPLC分析所有样品中的丁二酸盐/丁二酸含量。这些结果显示，从发酵开始时，即0时，存在约0.4g/L丁二酸盐。虽然我们的培养基中不添加丁二酸盐，但不希望受理论所束缚，对于酵母提取物来说，其可以是此前实验中所见的0.4g/L，在实验的过程中有微小变化。在此实验中，在一些发酵时间点，丁二酸盐水平稍微降低，但发酵结束时增加回至约0.4g/L。另外，通过CEDEX分析所有样品中的乙酸盐、乳酸盐、乙醇和丙酮酸盐含量。然而，结果显示这些物质在所有样品中低于检测极限。
细小裸藻的连续培育作为对照
1.背景：
在此实验中，使用新制培养基的连续发酵用于分批、分批加料和连续形式的三步骤工艺中。将这些结果与上述再循环(混合)实验进行比较，其中添加混合培养基而非新制培养基。
2.方法：
2.1.母种培养物的维持和种子接种体的制备与上文在实施例8中关于混合培养基所述相同。
2.2.连续发酵：
在此研究中进行连续/恒化发酵，以便研究在每培育12小时改变稀释/加料速率的同时，细胞生长/密度是否能够维持在恒定水平。试图建立细胞生长处于恒定的比生长速率并且所有培养物参数(即，培养物体积、溶氧浓度、营养物和产物浓度、pH、细胞密度等)保持恒定的稳态。此实验开始之前，制备所有培养基和相关储备液/试剂以顺利地完成目标。在整个实验(即，维持母种培养物、种子繁殖和连续发酵)期间使用复合培养基(即，含有葡萄糖、酵母提取物、硫酸铵、一系列盐、一系列维生素、一系列痕量金属盐，和植物油，pH调节到3.2)。维生素混合物和痕量金属混合物的组成分别如表2和表3中所示并且种子/分批/加料/复合培养基的组成如表1中所示。
最初按照分批培育模式起始连续发酵。种子接种体的细胞密度应该是20到40g/LWCW，使得发酵开始(‘0’小时)的细胞浓度是约OD600(600nm光学密度)：0.5到2.0或WCW：2到4g/L。连续发酵的培育参数如下：温度28℃、pH 3.2、300-600rpm搅拌、0.4-2vvm空气流速，和20％DO/pO2。在发酵期间，每12小时常规地收集30mL样品。取样之后立即通过显微镜分析样品的细胞形态，通过pH计分析样品的pH，通过分光光度计分析样品的细胞密度(OD600)，并且将已知量的培养液(WCW)离心，通过YSI分析样品的葡萄糖浓度。通过CEDEX生物分析仪和HPLC进一步分析样品以测定代谢物浓度。将经由WCW测量而获得的细胞集结粒在-80℃下冷冻直至那些样品的细胞干重(DCW)被测定为止。还通过将已知量的上清液冷冻干燥(即，在经由离心去除细胞集结粒之后)来测量培养液中的总溶质浓度。
按照分批模式运行发酵36到48小时之后，尽管观察到生物反应器中的葡萄糖浓度具有限制性(即，0到5g/L)，但经由分批加料模式再培育2天(即，加料培养基按照恒定流速供应到生物反应器中)，随后将培育切换为实际的连续模式(即，连续加料与收获按照相似的流速进行以便维持培养物体积恒定)。一旦分批阶段的葡萄糖浓度接近5g/L，则按照恒定流速添加加料培养基(即，含有15g/L葡萄糖)而不从生物反应器收获培养液。使用指数加料公式计算加料培养基的流速(F，毫升/小时)，所述公式是基于分批阶段结束时的细胞密度(X＝gDCW/L，最初按照WCW乘以系数0.32来测得)和培养物体积(V＝L)，以及恒定的比葡萄糖摄取速率(qs＝0.07gglu/gDCW/hr)和加料培养基中的葡萄糖浓度(Sf＝15g/L)。用于计算分批加料阶段的加料流速的公式如下：
F(mL/hr)x 1000
根据莫劳德公式，已经充分证实，生物体的比生长速率通常随着生物反应器中的营养物浓度增加。另外，由于多次观察到在裸藻分批加料发酵期间，即使在经由以上论述的指数加料公式连续添加加料培养基之后，生物反应器中的葡萄糖水平受到限制，因此决定通过每培育12小时添加浓缩的葡萄糖溶液(200g/L)来维持生物反应器中的葡萄糖浓度于约10g/L。此与混合实施例不同之处在于，直至培育的第204小时时才加入浓缩的葡萄糖。表26中的公式[h＝(g-f)*(e/200)*1000]用于确定在分批加料和连续加料阶段期间必需加入生物反应器中的浓缩葡萄糖溶液的量。
表26：分批加料和连续发酵期间使用的浓缩葡萄糖添加计算器
| 参数 | 值 | 单位 | 备注 |
| 当前培养物体积 | e | L | 2.5L，恒定 |
| 当前葡萄糖浓度 | f | g/L | 测得 |
| 目标葡萄糖浓度 | g | g/L | 10g/L，恒定 |
| 必需的体积 | h＝(g-f)*(e/200)*1000 | mL | 计算 |
在此实验中，为了起始加料，我们将稀释速率(D)设定为0.03h-1，其低于细胞清除发生时的临界稀释(Dcrit)/最大比生长速率(μmax)。这不同于混合培养基实施例，因为稀释速率被降低以试图阻止清除。为了连续地收获发酵液且维持培养物体积恒定，将生物反应器中可供使用的金属汲取管的一端按照预定的体积标记设定，而另一端附接到硅胶管，所述硅胶管插入蠕动泵中用于连续地抽取预设体积的发酵液。基于预定的稀释速率(D＝0.03h-1)和培养物体积(V＝2.5L)来计算连续发酵期间的加料速率(F，mL/hr)。用于计算连续阶段的加料流速的公式如下：
F(mL/hr)＝V.D.1000
在此研究中，每12小时改变加料速率以便在连续发酵期间实现稳态和维持恒定的细胞密度。除维持恒定的细胞密度之外，我们的主要目标之一是提高裸藻生物质的生产率。因此，探究比生长/稀释速率高于最大比生长/临界稀释速率对培养裸藻的影响(即，观察细胞清除对代谢物概况的影响达到何种程度)。基于目标细胞密度(即，分批加料阶段结束时的WCW，恒定)、当前加料速率(即，加料培养基在最后12小时加入的速率)、当前细胞密度(即，测量的当前WCW)来开发加料速率计算器。每12个小时使用表27中的公式[d＝(b*c)/a]计算新的加料速率。然而，显而易见的是稀释速率由于加料速率改变而同时改变。
表27：在连续发酵期间使用的加料速率计算器
3.结果和讨论：
尽管制备了200mL种子培养物，但仅添加100mL至1.5L分批培养基中。因此，分批阶段开始时的培养物体积是1.6L。种子培养物接种之前，将600μL的2500x维生素混合物(即，1.5L分批培养基所需量的维生素)添加到接种烧瓶中。发酵“0”小时(即，刚好在种子接种之后)的细胞密度是OD600～1.36和WCW～11.55g/L(表28)。因为12小时样品中所测定的WCW是3.6g/L，所以测量“0”小时样品的WCW时可能存在误差(即，离心管中的水可能未完全去除)，这是很合理的。“0”小时的葡萄糖浓度通过YSI测定为13.54g/L，但其应该是15g/L。这发生的原因可能是培养基中的葡萄糖浓度由于生物反应器中接种了100mL种子接种体而被稀释。然而，培育36小时之后(即，在分批阶段结束时)，生物反应器中的葡萄糖浓度测定为7.63g/L并且细胞密度增加到OD600～8.89和WCW～16.2g/L(表28)。
表28：细小裸藻的生长和使用混合培养基连续发酵期间的培养条件
分批阶段完成之后，当生物反应器中的葡萄糖浓度接近约5g/L时，按照52.1毫升/小时的恒定加料速率添加加料培养基。在48小时期间内添加总共2.5L加料培养基，使培养物体积达到4L。在此实验中，为了计算加料速率，将比葡萄糖/底物摄取速率设定为0.07gglu/gDCW/hr，但我们实验室中进行的所有先前分批加料实验均考虑0.05gglu/gDCW/hr的值。比葡萄糖摄取速率考虑较高值的原因是向细胞提供足量的葡萄糖以使细胞按照其最大的生长速率生长。另外，每12小时添加浓缩的葡萄糖溶液(200g/L)以将生物反应器中的葡萄糖浓度维持在约10g/L，使得细胞生长不会因缺乏葡萄糖而受到限制。因此，分批加料阶段结束时(即，培育的第84小时时)实现OD600～37.69和WCW～57.85g/L的细胞密度。另外，这使得细胞密度比早先进行的其它分批加料发酵的细胞密度高得多。出现此结果的原因可能在于每培育12小时将生物反应器中的葡萄糖浓度调节到约10g/L。然而，此数据显示，即使在考虑较高的比葡萄糖摄取速率且维持生物反应器中的约10g/L葡萄糖之后，分批加料阶段结束时的残余葡萄糖浓度仍然是约1g/L(表28)。此结果表明，在对分批加料培养物进行指数级加料期间，维持的葡萄糖甚至高于约10g/L。
在分批加料阶段结束时，使用蠕动泵收获了约1.5L发酵液，同时证实了生物反应器中的培养物体积是2.5L。为了确保无菌，硅胶管的一端连接到生物反应器中可用的汲取管且另一端连接到收集容器。然后以75毫升/小时的速率将加料培养基添加到生物反应器中以满足0.03h-1的预设稀释速率并且以相同速率收获发酵液以维持培养物体积恒定。在连续加料阶段期间，每12小时改变加料速率，目的是维持约50g/L WCW的恒定细胞密度，但是发酵第84小时时的WCW是57.85g/L。这归因于在分批加料阶段期间实现了WCW。然而，观察到加料速率在84到168小时的培育期间连续提高(从75毫升/小时到180毫升/小时)(表29)。实际上，预期加料速率从培育的第120小时开始高于180毫升/小时，然而，鉴于附接到生物反应器的泵的限制，因此上限是180毫升/小时。
由此在发酵的第144小时时产生约71.6g/L WCW的细胞密度(表29)和约5gWCW/L/小时的生产率(约1.6gDCW/L/小时)(表29)。另外，较高的生产率水平(约2gWCW/L/小时)维持了108个小时(即，从发酵的第96小时到第204小时)(表29)。最初假定这些较高的细胞密度和生产率实现的原因是从分批加料阶段开始时将生物反应器中的葡萄糖浓度调节为约10g/L。然而，这些生产率值比预期高得多，并且有前景的这种结果与早先经由裸藻的分批发酵所计算的生长特征数据(即，最大比生长速率、产量等)不匹配。然而，注意到硅胶管(即，加料培养基经其添加到生物反应器中)附接到与生物反应器连接的第2个加料瓶的错误接口(即，由于每个10L瓶中仅能制备7L培养基，因此在连续加料期间必须更换加料瓶)，这意味着加料培养基有25到30个小时(即，大约从发酵的第125个小时到150个小时)未被抽入生物反应器，原因在于这个故障是在25到30小时之后被鉴定出来。然而，在那个时间段期间添加浓缩的葡萄糖溶液(200g/L)会产生高的细胞密度和生产率。归因于细胞从生物反应器中清除，因此较高的生产率衡量标准不能够维持较长的时间段。这种清除使得细胞密度和生物质生产率降低。
图13显示裸藻的2种主要生长参数(即，WCW、OD600)以及连续培育过程中的葡萄糖消耗概况。我们清楚地观察到，细胞密度(OD600和WCW)保持增加直到发酵的第144小时并且随后开始降低直到发酵结束为止。然而，这些结果显示，由于在连续阶段期间，残余葡萄糖浓度是至少约2g/L，因此，细胞因生物反应器中没有可供利用的葡萄糖而无应激。然而，细胞密度从培育的第156小时开始急剧减小，这可能归因于加料培养基按照高加料速率供应。第156小时设定的稀释速率是0.072h-1，这比裸藻的最大比生长速率(μmax)高得多，并且这可能引起细胞快速清除。因此，在发酵的后期阶段期间，生物反应器中的葡萄糖水平测定为较高的。然而，关于细胞密度(即，OD600和WCW值)在第120小时为何突然下降，未找出合理的理由。
图14显示连续发酵期间所涉及的主要培育参数的概况。在此研究中，由于为了控制pO2/DO水平而仅供应大气空气，因此使气体混合物维持在21％(即，空气含有约21％O2)。为了将pO2/DO水平控制在20％，考虑经由添加空气(1～5L/min)和搅拌(300～600rpm)来实现串级控制。尽管培育开始时的搅拌速度为300rpm，但其在分批加料和连续加料期间几乎增加到其最高水平以便满足最低的pO2/DO要求(即，20％)。类似地，在发酵过程期间自动地增加或减小空气流速(图16)。图14清楚地显示细胞正按指数模式生长直到发酵的第132小时为止。一旦加料培养基开始按照高的加料/稀释速率供应，则发生细胞清除并且细胞OUR减小(图16)，这引起生物反应器中的pO2/DO水平升高。在此时间期间，细胞中可能会发生其它代谢变化。
表29.细小裸藻连续发酵和生物质生产率的关键参数
在此研究中，为了维持生物反应器中恒定的细胞密度，在整个实验中改变加料速率，相对于在连续阶段期间保持恒定加料速率的实施例4来说，这是一种改进。在分批加料阶段(从第36小时到第84小时)期间，按照52.1mL/hr的恒定加料速率添加加料培养基(表29)。然而，为了起始连续加料和收获，将加料速率预设为75mL/hr(即，当培养物体积是2.5L时，稀释速率是0.03h-1)。随后每12小时改变加料速率以维持50g/L的WCW(即，但连续阶段开始时的细胞密度是WCW～57.85g/L)。图15中的结果显示，从第84小时到第132小时，加料速率连续增加。然而，加料速率从发酵的第192小时开始急剧降低。培育156小时后，观察到生产率降低。然而，培育192小时之后，不可能按照较高的加料速率保持向培养物加料。似乎是培养物被过量加料并且细胞最终从生物反应器中清除。在此研究中，在13天期间内收获总共23L发酵液，但连续加料与收获始于2.5L培养物体积。这是运行连续发酵的最重要优点之一。
图16显示细小裸藻连续发酵期间的空气流速和废气概况。在此研究中，经由级联方式将空气供应到生物反应器中，即，在控制面板上设定1到5L/min的空气流速并且系统自动地调节其要求以便维持生物反应器中的最低pO2/DO水平(即，20％)。此研究显示，在细胞以指数方式生长的分批加料阶段期间，需要最高的空气水平(即，3.72L/min)。另外，观察到尽管搅拌速度减小了一点，但在培育的第72小时，搅拌速度也是足够高的，随后在第96小时，搅拌速度增加到600rpm。这些结果显示，一旦我们开始严格地稀释培养物，对空气供应的需求最小。基于空气流速和排气概况，细胞在培育168个小时之后变得无活力。然而，这些结果显示，排气数据(即，OUR、CER和RQ)依赖于供应到系统中的空气，原因在于OUR、CER和RQ增大的同时，需要的空气量更高，且反之亦然。
图17显示细小裸藻连续发酵期间的代谢物概况。根据此数据，观察到Ca+在发酵过程期间的消耗极少(即，相较于培育0小时时的初始浓度，144小时之后消耗约30％)，这表明来自复合培养基的CaSO4可能减少。考察此数据，观察到细胞在分批阶段和分批加料阶段期间消耗磷酸盐与镁。然而，从发酵的第144小时(即，在连续加料阶段期间)，发现两种组分都累积。这个结果发生的原因可能是加料培养基按照高加料速率添加。除此之外，可能存在导致磷酸盐和镁消耗速率较慢的代谢漂移(metabolic shift)。还通过HPLC分析所有样品中的丁二酸盐/丁二酸含量。这些结果显示从发酵开始时，存在约0.4g/L丁二酸盐，其可能来自酵母提取物。另外，通过CEDEX分析所有样品中的乙酸盐、乳酸盐、乙醇和丙酮酸盐含量。然而，结果显示这些物质在所有样品中低于检测极限。
4.结论：
此研究证实，裸藻的连续培育能够在一系列稀释/加料速率下使用实验室中所用的标准复合培养基进行。尽管目标是通过每12小时改变加料速率来建立稳态条件，但此数据表明如果使用12小时取样时间点，则需要对此进行优化。如果例如每几个小时进行额外测量，或使用线上监测系统，则稳态是可能的。
通过运行连续发酵，可以将总体生产率提高到5gWCW/L/小时(1.6gDCW/L/小时)，但在加料培养基添加到生物反应器中的同时存在失误。然而，经由研究所实现的生产率度量标准比预期高得多，原因在于其与早先经由裸藻分批发酵所计算的生长特征数据(即，最大比生长速率、产量等)不匹配。然而，较高水平的生产率(约2gWCW/L/小时)可以维持108小时(即，发酵的第96小时到第204小时)。这归因于适应性加料样式而非保持其恒定，这继而引起较高的细胞生产率。根据实施例4(其中加料速率恒定)与本实施例(其中加料速率与细胞生长匹配)的差异能够发现这个结论。然而，在此处，此生产率不能够维持较长的时间段。这归因于加料培养基添加时的稀释速率高于最大生长速率(μmax)，导致细胞快速清除并且减小了细胞密度和生产率。
总体生物质产量是基于各输入来计算(gDCW/g输入)，大约是34％。这非常类似于先前由分批发酵实现的产量。然而，此结果大大高于先前在实验室中进行的分批加料实验所实现的结果。分批加料发酵中基于各种输入而得到低生物质产量的原因是使用了5x加料培养基，其中5x盐浓度连同5x浓缩葡萄糖一起添加。
质量平衡：
测量的另一个方面是发酵试验的输入和输出。这包括氧气(O2)输入和输出、二氧化碳气体(CO2)输入和输出、加入物料(即，加料培养基)的重量、淡水输入的重量、所用再循环培养基的重量，和生物质输出的质量。这些值如下计算：
O2输出如下计算：
CO2依据下式测量：
其中空气输入升数是抽入是空气量，二氧化碳气体输入的百分比是大气空气的假定百分比，理想气体每摩尔的升数是22.4L/摩尔，并且CO2分子量是44.01g/摩尔。
CO2输出如下计算：
其中空气输入的升数是抽入的空气量，二氧化碳气体输出的百分比是通过BlueSense排气分析仪测量，理想气体的每摩尔升数是22.4L/摩尔，并且CO2的分子量是44.01g/摩尔。裸藻生物质干重是根据细胞干重(DCW)测定，细胞干重是细胞湿重(克)乘以换算系数(0.32)而得，换算系数基于细胞湿重与细胞干重之间的比率。
基于干重的加料如下计算：
其中总培养基干重是总培养基质量(克/升)，总新制培养基是所添加的培养基体积，总葡萄糖加料体积是添加了多少葡萄糖，并且葡萄糖加料浓度是所添加的葡萄糖浓度(克/升)。
单位量加料所产生的生物质的净产量如下计算：
水用量如下计算：
另外，所产生的单位量的生物质所使用的CO2量还如下计算：
其中CO2产生是CO2输出与CO2输入的差值除以生物质的产生量，得到每kg生物质所产生的CO2量。
在下述表30和表31中，将发酵试验的输入和输出的总量(混合和对照)列表。依据这些数值，净产量、淡水用量和每单位生物质所产生的CO2量如下：
混合：净产量＝37％，淡水用量＝52.2(L/kg生物质)，并且每kg生物质所产生的CO2是0.466kg。
为了使这些数字更有意义，进行其中不添加再循环培养基的对照试验并且其发酵试验的数值如下：
混合：净产量＝34％，淡水用量＝68.2(L/kg生物质)，并且每kg生物质所产生的CO2是0.410kg。
相较于混合培养基试验，对照组具有更低效率，产生每kg生物质使用的水更多，并且所产生的二氧化碳稍微低于混合培养基情况。这表明混合培养基途径在其输入物利用率方面更有效，使用的水更少，但产生的CO2量与对照连续实验非常相似。
表30：混合培养基发酵试验与对照发酵试验的输入物质量平衡计算
| 输入 | 混合培养基(g) | 对照(g) |
| 加料(干重) | 892 | 1038 |
| 淡水 | 17,380 | 24,320 |
| O<sub>2</sub>输入 | 11,241 | 7,165 |
| CO<sub>2</sub>输入 | 29.4 | 19 |
| 再循环培养基 | 13,520 | - |
表31：混合培养基发酵试验与对照发酵试验的输出物质量平衡计算。
| 发酵 | 混合培养基(g) | 对照(g) |
| O<sub>2</sub>排气 | 11,137 | 6,955 |
| CO<sub>2</sub>排气 | 184 | 165 |
| 裸藻干重 | 333 | 357 |
另外，得到的结论是再循环培养基可以用于裸藻的连续培育。这些结论的得到是基于此发酵经证实的能够运行3周而无需任何中断。然而，细胞生长依赖于碳源和氮源的可利用率。在此，培养基中使用复合氮源(即，酵母提取物)。基于葡萄糖概况，观察到在再循环培养基的分批加料与初始连续加料阶段期间，残余葡萄糖水平极低。因此，决定在培育第204小时加入葡萄糖，这在将浓缩葡萄糖添加到生物反应器中以维持约10g/L葡萄糖时，引起细胞生长模式的变化。尽管希望通过每12小时改变加料速率来建立稳态条件，但此数据显示其需要加以优化(如果基于12小时取样时间点)。如果例如每几个小时进行额外测量，或使用线上监测系统，则可以观察到稳态。就此而言，在得出任何结论之前，需要使用含有足量葡萄糖的再循环培养基进行额外的实验。
通过运行连续发酵，使总体生产率提高到2.31gWCW/L/小时(0.74gDCW/L/小时)。较高生产率(约2gWCW/L/小时)仅维持了60个小时(即，从第276小时到第336小时)，这被认为是添加混合培养基时的稀释速率高于最大生长速率(μmax)的结果，导致细胞清除缓慢并且减小了细胞密度和生产率。
我们基于各输入来计算总体生物质产量(gDCW/g输入)，其大约是37％。这非常类似于先前由分批发酵实现的产量。然而，此结果大大高于先前在先前分批加料实验中所实现的结果。分批加料发酵中基于各种输入而得到低生物质产量的原因是使用了5x加料培养基，其中5x盐浓度连同5x浓缩葡萄糖一起添加。当此时只需要葡萄糖和/或氮源时，过量的盐会抑制生长。
就质量平衡来说，与对照相比，混合培养基试验具有更好的效率，使用的水更少，但CO2产生稍微更高。所述混合实施例也产生氧气，表明其可以将CO2转化成能量。总体而言，连续混合培养基试验显示出生产率、效率提高，并且用水总体上更少。
实施例9：两种浓度的有机酸对裸藻生长的影响
在此实施例中，测试五种不同有机酸在不同浓度(低和高)下、在葡萄糖存在和不存在下的影响。选择低含量的有机酸来模拟当在混合培养基途径中使用再循环培养基时发现的条件，其中在所述培养基中发现低浓度的有机酸。为了了解较高浓度和裸藻偏好对利用其作为碳源的影响，选择较高浓度。根据代谢理论，碳源可以基于其进入代谢的进入点以及其是否被依次使用抑或共同使用而分成两类：A组(参照实施例10)来源，其经由共同入口点进入代谢并且主要按照细胞偏好的次序依次代谢，一种通常归因于代谢物抑制(通常是但不限于糖)的过程。B组(参照实施例10)来源，其在多个点进入代谢并且能够被共同使用，从而提高生长速率且增强产物(通常是但不限于有机酸)的产生。
方法：
细胞培养物制备如先前所述进行。简单来说，将3mL活跃生长的细小裸藻种子接种体添加到125mL烧瓶中，所述烧瓶含有如实施例6中所提及的50mL培养基：含有如表32所示的碳源的不同组合的培养基。培养基中的最终细胞计数是每毫升约200万个细胞。
在28℃下，在连续摇振(120rpm)下，进行发酵120小时。在第0、24、48和120小时进行测量。在第0、48和120小时，获取12mL样品。使用样品测量细胞干重(DCW)、光学密度(OD600)、细胞计数、％固含量、葡萄糖、显微镜下细胞形态和有机酸浓度。第24小时获取8mL样品测定固含量而不测定DCW。
分析方法：
细胞干重(DCW)是用重量分析法、如实施例3中所述测定。如实施例3中所测定来测量葡萄糖浓度。
有机酸：将收获的1mL生物质离心(14000rpm；1分钟)且获得上清液。使用CEDEX测定存在于上清液中的乙酸、丙酮酸和乳酸。通过与标准试验对比来测定所分析的酸在上清液中的浓度。
每次处理收集5mL上清液并且-80℃下储存直至可以进行分析为止。经由0.2um过滤器过滤样品并且用5cc注射器注入试验小瓶中。使用HPLC检测有机酸含量。使用配备有DAD的Agilent HPLC-1260infinity系统和HPX-87H的Aminex HPLC柱(300x7.8 mm)。移动相是5mM硫酸，流速是0.35mL/min，在40℃下加热。DAD检测器设定在210nm。10μL样品在其经由自动取样器、经由0.2um针筒过滤器过滤之后直接注入。利用校准曲线计算个别的有机酸浓度，所述校准曲线是依据利用反丁烯二酸、IC用的苹果酸盐标准、IC用的丁二酸盐标准、丙酮酸(西格玛奥德里奇公司(Sigma Aldrich))所产生的标准校准曲线达成。
％固含量：用重量分析法测定固含量。将5mL生物质离心(5000rpm；10分钟)且将上清液输送到预称重的15mL法尔康管中。将所述管连同上清液一起再称重，然后使用LABCONCO真空冷冻干燥器、在-87℃下冷冻干燥。在干燥过程结束时，将管和残余固体称重。利用下式测定固含量：
OD：将1mL生物质添加到光析管中并且使用分光光度计在600nm下测量OD。
表32.培养基组成
表33.添加到培养基中的葡萄糖和/或酸的浓度。各处理重复执行两次。
| 碳源 | 葡萄糖浓度(g/L) | 其它碳浓度(g/L) |
| 葡萄糖(对照) | 15 | - |
| 丙酮酸盐+葡萄糖 | 15 | ～0.05(0.03-0.07) |
| 丙酮酸盐+葡萄糖 | 15 | ～2(1.3-2) |
| 苹果酸+葡萄糖 | 15 | ～0.05(0.04-0.11) |
| 苹果酸+葡萄糖 | 15 | ～5(4.5-5) |
| 丁二酸+葡萄糖 | 15 | ～0.05(0.01-0.06)* |
| 丁二酸+葡萄糖 | 15 | ～5(4.5-5.2) |
| 乳酸+葡萄糖 | 15 | ～0.05(0.04-0.07) |
| 乳酸+葡萄糖 | 15 | ～5(3.6-5) |
| 反丁烯二酸+葡萄糖 | 15 | ～0.0005(0.0005-0.0008) |
| 反丁烯二酸+葡萄糖 | 15 | ～5(3.4-5) |
| 仅丙酮酸盐 | - | ～0.05(0.03-0.07) |
| 仅丙酮酸盐 | - | ～2(1.3-2) |
| 仅苹果酸 | - | ～0.05(0.04-0.11) |
| 仅苹果酸 | - | ～5(4.5-5) |
| 仅丁二酸 | - | ～0.05(0.01-0.06)* |
| 仅丁二酸 | - | ～5(4.5-5.2) |
| 仅乳酸 | - | ～0.05(0.04-0.07) |
| 仅乳酸 | - | ～5(3.6-5) |
| 仅反丁烯二酸 | - | ～0.0005(0.0005-0.0008) |
| 仅反丁烯二酸 | - | ～5(3.4-5) |
| 阴性对照 | - | - |
*培养基中固有地存在一些有机酸，包括丁二酸，且因此可能会影响浓度检测。
结论
从实验得到的第1个结论：(i)细小裸藻Z可以利用不同类型的酸作为碳源，以及(ii)将酸补充到含有葡萄糖的培养基中能够改进细小裸藻Z的生物质产生并且允许碳源的共同利用。
在较低浓度(0.0005g/L到0.05g/L)下，作为单独的碳或与葡萄糖(15g/L)组合测试的酸均未显示对细小裸藻Z的生长任何抑制作用(参见表34)。与阴性对照(无葡萄糖)相比，所有单独酸产生了20到100％范围内的净生物质增幅。与单独的葡萄糖(对照)相比，乳酸和反丁烯二酸与葡萄糖的组合在48小时结束时分别使生物质提高13.4％和7.5％。在此浓度(即，0.05g/L)下，含有乳酸和葡萄糖的培养基的转化效率和生物质产量(g)/g碳是54.8％(比葡萄糖对照高约8％)和1.35g/g碳(即，比对照高约13％；图18)。类似地，反丁烯二酸(0.0005g/L)与葡萄糖(15g/L)组合的转化效率比单独的葡萄糖(15g/L)高21.9％。尽管发现反丁烯二酸和葡萄糖具有此良好转化效率，但生物质产量(g)/g碳仅提高8.4％(参见图18)。这归因于以下事实：添加到系统中的反丁烯二酸的量(0.0005g/L)远低于葡萄糖(15g/L)。因此，即使反丁烯二酸和葡萄糖完全消耗有助于提高生物质浓度，但培养基中的葡萄糖部分的贡献掩盖了反丁烯二酸的作用。
从下图(参见图19；表35)中还可以发现所有酸被消耗。截至48小时结束时，对于乳酸盐和丙酮酸盐检测不到有机酸含量，并且这些酸含量对细胞的葡萄糖摄取速率没有显著影响。截至48小时结束时，在所有情况中，葡萄糖消耗约90％，并且在所有情况中，葡萄糖消耗的水平非常相似(参看图20)。在添加较高浓度酸的情况下获得类似结果，如表36、图21、图22中所见。
从图19、20中还可以发现，截至第48小时结束时，所有酸被消耗，但仍存在一些葡萄糖。由此能够得出结论：细小裸藻Z将少量酸与葡萄糖同时消耗，而非等候其作为主要碳源(葡萄糖)来耗竭。
在单独的有机酸存在下，有机酸作为单独的碳源被消耗(图19以及表34和表35)。这与按照独立碳源分类来表征葡萄糖和有机酸的文献报告一致。组合添加时，葡萄糖与有机酸可以被共同利用(表34和表35；图21)，并且这种发酵类型迄今为止尚未针对细小裸藻加以充分探究。细小裸藻存在的这种灵活代谢允许基于多种碳源/氮源来引导生长和产物输出。
表34.在较低浓度的酸存在下，在48小时结束时的净生物质变化(g/L)。
表35：有机酸浓度在48小时时间段的发酵期间的变化(0.0005g/L到0.05g/L)(0.00是低于检测极限的数值)
表36：有机酸浓度(2g/L到5g/L)在120小时时间段的发酵期间的变化
将较高浓度的酸添加到单独的培养基中时，截至48小时结束时，大部分酸被消耗(图21；表36)。48小时结束时，使用含有丙酮酸盐(约2g/L)、苹果酸盐(约5g/L)、丁二酸盐(约5g/L)、乳酸盐(约5g/L)或反丁烯二酸盐(约5g/L)作为单独碳源的培养基分别获得0.90g/L、1.40g/L、2.20g/L、2.10g/L和2.10g/L净生物质培养基。在丁二酸盐和乳酸盐的情况下，截至120小时结束时，净生物质浓度分别获得13.6％和9.5％的进一步提高(与48小时相比)(参见表37)。表37.当较高含量的酸(约2g/L到5g/L)单独添加或与葡萄糖(约15g/L)组合添加时，生物质在发酵期间的净变化
较高含量的酸(约2g/L到5g/L)连同葡萄糖(约15g/L)一起添加时，在48小时结束时的总体生物质浓度高于对照(单独的葡萄糖)。将苹果酸、丁二酸、乳酸和反丁烯二酸补充到含有15g/L葡萄糖的培养基中，分别获得提高4.6％、3.1％、1.5％和12.3％的生物质(表37)。结果稍微不同于较低含量酸补充而获得的结果。与葡萄糖对照相比，在补充较低含量酸(约0.0005g/L到0.05g/L)的情况下，苹果酸、乳酸和反丁烯二酸产生的生物质浓度分别高-3％(低)、13.4％(高)和7.5％(高)；但在较高浓度(约5g/L)下，苹果酸、乳酸和反丁烯二酸产生的生物质分别大4.6％、1.5％和12.3％。由此能够得出结论：确定与葡萄糖一起使用的酸的最优浓度是重要的。
在前48小时期间、在较高浓度的酸存在下的葡萄糖消耗非常类似于在较低浓度的酸存在下的葡萄糖消耗(参见图22)。
从实验得到的第2个结论：裸藻当与葡萄糖组合供应时能够将葡萄糖和酸一起作为碳源消耗：
在较低浓度的酸存在下：如上文已经论述，还可以从表36和36发现所有酸的消耗。截至48小时结束时，所有酸耗尽，并且这些酸含量对细胞的葡萄糖摄取速率无显著影响。截至48小时结束时，在所有情况中，约90％葡萄糖被消耗，并且在所有情况中，葡萄糖的消耗水平相当类似(参见图20、图23)。从图19和图20中还可以发现，截至第48小时结束时，所有酸被消耗，但仍存在一些葡萄糖。由此能够得出结论：细小裸藻Z将少量酸与葡萄糖同时消耗，而非等候其作为主要碳源(葡萄糖)来耗竭。
在较高浓度的酸存在下，在48小时结束时，在所有情况中，培养基中仍存在一些葡萄糖，而在此时间期间，酸消耗达到一定水平或所有酸耗尽。类似于使用较低浓度的酸，即使在浓度较高的情况下，少量的酸也与葡萄糖同时消耗(参见图23)。
从实验得到的第3个结论：(i)在葡萄糖培养基中存在较高浓度的酸的情况下，生长按照两个阶段发生：葡萄糖主导阶段(主要)和酸主导阶段(次要)。(ii)在主要生长期间，在葡萄糖中，细小裸藻Z可以产生一些促生长化合物或可以影响代谢路径，从而在次要生长期间增强酸的生物质产生。
当较高浓度的这些酸与葡萄糖一起提供时，其按照两个阶段消耗碳(葡萄糖和酸)。在第一阶段中，48小时结束时，其将葡萄糖与一些量的酸一起消耗。在第二阶段期间，在第48小时与第120小时之间，其利用酸作为碳源用于其存活和生长(参见图24)。葡萄糖和酸消耗概况显示截至48小时结束时，大部分葡萄糖被消耗(图23)。此外，在此阶段期间，消耗了一些量的酸。葡萄糖和酸消耗的量类似于在较低浓度的酸存在下获得的量(表33和表36，图20、图23)。一旦葡萄糖耗尽，则在48小时之后，裸藻细胞利用酸作为碳源(表36、图24)。当较高浓度的酸单独加入时，其开始作为碳源立即消耗。
为了进一步了解裸藻消耗不同浓度的酸的能力，我们让细胞在不同浓度的反丁烯二酸(2g/L和5g/L)存在下生长。我们发现截至第120小时结束时，在两种情况下，微生物消耗了几乎所有的反丁烯二酸。在第48小时和第120小时，针对各种处理来测定反丁烯二酸净消耗。反丁烯二酸当与葡萄糖组合加料时、在前48小时期间消耗的量是约48％到67％，而单独反丁烯二酸的消耗量是约57％到71％。截至第120小时结束时，反丁烯二酸在两种浓度下与葡萄糖一起加入时被完全利用。然而，当单独加入时，仅消耗至多77％的反丁烯二酸。由此可以看出，葡萄糖的添加有助于反丁烯二酸在延长时间内被完全利用。
在2g/L和5g/L反丁烯二酸存在下获得的生物质最大量非常相似(即，约1.5g/L)。我们由此能够得知，反丁烯二酸连同葡萄糖一起使用的水平应该在较低浓度(即，≤2g/L)下优化。此类优化能够使葡萄糖和反丁烯二酸产生更佳的协同作用。随后得到的生物质水平高于或类似于我们当使用含有15g/L葡萄糖+5g/L反丁烯二酸的培养基时所获得的生物质水平。通过使用较低水平的酸获得相似或更高的生物质水平从经济的视角看，始终是优选的。
相对于转化效率在第120小时为37.75％的葡萄糖对照处理，使用反丁烯二酸和葡萄糖的处理增大了细胞的转化效率。然而，不论所用的反丁烯二酸浓度(即，2g/L或5g/L)，转化效率保持相似。当使用15g/L葡萄糖和2g/L反丁烯二酸时，发现转化效率是57.4％。类似地，当使用15g/L葡萄糖和5g/L反丁烯二酸时，获得58.41％的转化效率。这表明，反丁烯二酸添加到含有葡萄糖的培养基中能够提升输入向生物质输出的高效转化。然而，必须进一步优化酸的添加水平。
在补充有较高浓度的酸的葡萄糖培养基中，在第120小时结束时，酸的总贡献高于单独酸的贡献(图25)。这意味着在第1阶段期间，当葡萄糖消耗时，也释放了一些其它促生长化合物，这些化合物更有效地利用酸支持生长。当与葡萄糖组合加入时，大部分酸(除丁二酸之外)被消耗并且更好地代谢(酸到生物质产生)，这表明基于有机酸浓度，两种碳源能够相继依序消耗(二阶段生长)或同时消耗(共同利用)。如果我们比较酸在第120小时结束时的贡献与单独酸在整个发酵过程(即，48或120小时)期间的最大贡献，可以看出丙酮酸盐、苹果酸、乳酸和反丁烯二酸当连同葡萄糖一起加入时，将酸贡献提高72.73％、63.64％、5.56％和46.67％。
实施例10：细小裸藻在发酵期间利用输入的代谢理论。
由于裸藻显著的代谢能力允许其在多种多样的条件下生长，因此其已经成为了解生物化学、生理学、进化、解剖学和工业潜能的科学探究主题。
裸藻能够在好氧和厌氧条件下以异养方式(摄入有机碳源用于生长)、以兼养方式(利用不同能源的混合物用于生长)和以光自养方式(经由CO2固定来排他性地获得碳)利用能量，使得其在现代生物技术所用的微生物当中获得独特的地位。
裸藻的代谢可塑性是进化十亿年的产物，其已通过进化而获得且/或进化出了容许在各种环境条件下存活的生物化学路径。这突显为所有高等生物体中发现的所有中央能量系统在一些情况下存在冗余，包括(但不限于)糖酵解、葡糖新生、三羧酸周期(TCA)、戊糖磷酸盐路径(PPP)和卡尔文周期(calvin cycle)。另外，裸藻对于脂肪酸和蜡酯、抗氧化虾青素、维生素和裸藻中主要储存的碳水化合物裸藻淀粉来说具有额外的路径。有趣的是，裸藻似乎在黑暗中、在异养条件下、在碳耗尽和/或缺氧条件下将CO2作为碳源固定。
此多种多样代谢能力的结果是似乎有无数的原料供裸藻培育用，并且就此而言，利用非传统原料存在巨大的潜能。
在异养发酵期间(包括(但不限于)好氧和/或厌氧分批发酵、好氧和/或厌氧分批加料和/或重复进行的分批加料、好氧和/或厌氧连续发酵，和/或好氧和/或厌氧的再循环/分批或连续发酵)，输入物被代谢而产生特定的天然产物。天然产物包括(但不限于)：裸藻淀粉、蛋白质、氨基酸、蜡酯、脂肪酸和维生素。
在异养生长条件下，碳源的代谢是经由糖酵解和/或葡糖新生和/或蜡酯代谢和/或脂肪酸代谢和/或氨基酸代谢和/或蛋白质代谢和/或裸藻淀粉代谢进行。作为实施例，丙酮酸盐在线粒体中被氧化和/或还原，从而合成氨基酸和/或蛋白质和/或脂肪酸和/或蜡酯和/或葡萄糖和/或裸藻淀粉和/或维生素。过量的碳被封存到细小裸藻的主要碳储存产物(即：裸藻淀粉和/或蜡酯)中(图26)。最终产物的数量和比率(裸藻淀粉∶脂肪酸∶蛋白质∶氨基酸∶蜡酯∶维生素)是由培养期间所利用的碳∶氮比率(C:N比率)和/或培养参数决定，所述培养参数包括(但不限于)：pH、温度、溶氧、溶解CO2、曝气、收获技术和发酵技术(包括(但不限于)好氧和/或厌氧分批发酵、好氧和/或厌氧分批加料和/或重复进行的分批加料、好氧和/或厌氧连续发酵，和/或好氧和/或厌氧再循环/分批或连续发酵)。举例来说，高C:N比率通常产生较多的储存产物(裸藻淀粉和/或蜡酯)，而低C:N比率通常产生较多的蛋白质、氨基酸和脂肪酸。值得注意的是，碳源能够基于其进入代谢的进入点和/或其是否被依次使用抑或共同利用而分成两类：A组来源(包括(但不限于)单糖、二糖和多糖)经由共同进入点进入代谢并且主要按照细胞偏好的次序依次代谢，一种通常归因于代谢物抑制(通常是但不限于糖和碳水化合物)的过程。B组来源(包括(但不限于)有机酸)在多个点进入代谢并且能够与A组来源共同利用，从而使生长速率增加且使产物(包括(但不限于)裸藻淀粉、脂肪酸、蛋白质、氨基酸、蜡酯和维生素)的产生增强。
实施例11：细小裸藻在6L生物反应器中的分批加料发酵
目标：此实验的主要目标是优化用于高细胞密度培育细小裸藻的指数级分批加料策略。另外，确定两种最重要的生长参数，即，裸藻在分批阶段与分批加料阶段的产量和生产率。此外，还计算裸藻分批培育和分批加料培育的质量(输入和输出)平衡。
材料和方法：
种子接种体的制备：使用生长培养基进行种子繁殖。将约100到200mL生长培养基加入已经培育约2到3个月的细小裸藻母种培养物中，每3到4天一次。使用50mL此母种培养物接种含有150mL生长培养基的500L摇瓶。另外，将0.08mL的2500x维生素储备液添加到培养物中。所得培养物(总200mL)将在28℃和150rpm下培育3天。第3天，通过显微镜检查接种体状态(活跃移动的细长细胞对于接种来说是最佳的)并且通过自动化细胞计数器测定细胞密度。细胞密度为约25到30x106个细胞/毫升的种子接种体适于接种。
在此研究中，含有15g/L葡萄糖和5g/L酵母提取物的生长基础培养基用作分批培养基。分批培育始于2.5L分批培养基。
称取2.5L体积的上述材料且相应地溶解于去离子水中。所得培养基输送到装配有适当管的3L生物反应器中。生物反应器然后在121℃下高压蒸汽灭菌30分钟。完成高压蒸汽灭菌之后，当将培养基冷却到室温时，在无菌条件下将1mL的2500x维生素储备液(新)输送到生物反应器中。
在此研究中，使用5x浓缩的分批培养基作为加料培养基并且制备3L加料培养基用于分批加料发酵。然而，将必需量的酵母提取物分别溶解于至多500mL去离子水中并且输送到玻璃瓶中。将其余物料溶解于至多2495mL去离子水中并且输送到3L加料瓶中。含有加料培养基的所有瓶子然后在121℃下高压蒸汽灭菌30分钟。完成高压蒸汽灭菌之后，当将培养基冷却到室温时，在无菌条件下将6mL的2500x维生素储备液(新)和500mL酵母提取物溶液输送到加料瓶中。
分批加料培育始于分批发酵。将培育3天的种子接种体(200mL)输送到接种烧瓶中并且在无菌条件下接种到含有2.5L分批培养基的生物反应器中。观察到分批培育开始时的细胞密度是约1x106到约3x106个细胞/毫升。
培养物用典型的叶轮在70到100rpm下连续搅拌且曝露于1L/min的空气(0.4vvm)。通过供应(自动)1M NaOH而使培养物的pH维持于3.2。通过向生物反应器中供应(自动)纯氧气而使溶氧维持于20％。每天在无菌条件下从生物反应器收集样品。通过显微镜检查细胞形态并且通过自动化细胞计数器、分光光度计(600nm光学密度)、细胞湿重(离心)和细胞干重(冷冻干燥)来监测细胞生长。通过YSI自动分析仪测量葡萄糖浓度。
然而，由于观察到生物反应器中的葡萄糖浓度在此时下降到低于5g/L，因此使分批培育运行48小时。然后通过向生物反应器中供应加料培养基(即，5x浓缩的分批培养基)来起始分批加料培育，以便维持指数生长。通过考虑比生长速率(μ＝0.03h-1)、生物质产量(Yxs＝0.7g DCW/g)、生物反应器在第48小时的DCW浓度(X＝9-10g DCW/L)和加料培养基中的葡萄糖浓度(75g/L)来计算加料流速。基于生物反应器中的细胞浓度来改变加料流速(mL/hr)。加料培养基最初以5.77mL/L/hr的速率添加。培育120小时之后，每天将加料流速增加到19.49mL/L/hr的最终速率，这与生物反应器中的生物质浓度增幅成比例。在3.5天(从第48小时到第130小时)供应总共3L加料培养基。
结果和结论：裸藻在分批阶段期间的产量和生产率是0.35g DCW/g输入和0.167g/L/hr。在分批加料发酵的情况下，总产量下降到0.26g DCW/g输入，但生产率增加，即，0.18g/L/hr。最有趣的是，仅分批加料阶段的生产率增加到0.575g/L/hr，这是分批加料发酵的共同趋势。
在加料过程优化的情况下，此数据显示，通过考虑利用0.03h-1的比生长速率和0.7gDCW/g葡萄糖的生物质产量能够使裸藻的生长速率按指数级维持。
实施例12：储罐
生物反应器储罐系统的示例性实施方式如图27中所示。储罐仅仅是与所公开的实施方式一致的实施例并且应理解，其它储罐在本公开的范围内。一个实施方式如图28中所示。图29描绘可与图28组合使用的喷淋器栅格俯视图。
实施例储罐包括用于大规模培育裸藻的鼓泡塔生物反应器，所述鼓泡塔生物反应器由不锈钢制成并且具有17,000L的最大允许总体积和0.33巴(5psig)的最大允许压力。储罐无绝热，但配备有三个加热和冷却夹套壳层。生物反应器的构造和配置允许使用103℃到107℃、约4.3psig压力的饱和蒸汽或使用过氧乙酸对生产容器进行安全灭菌循环。储罐具有3的纵横比。储罐具有总共18个盲塞接头。位于容器底部的两英寸盲塞构成容器排出口或主要收获孔口，培养物经其输送到收获物输送管线且最终输送到碟片堆叠式离心机。鼓泡塔生物反应器的顶部存在总共6个盲塞接头。储罐在容器高度的约三分之二处经由两英寸盲塞接头连接到独立的加料主管线。浓缩培养基、细胞接种体和新制工艺用水经由此加料主管线加入到生物反应器中。
储罐包括配置成双重鼓泡模式的内部曝气/混合系统，其由一至三个微喷淋器和两个借以注入清洁压缩空气的文丘里喷嘴组成。曝气主要通过微喷淋器进行，其向储罐内的培养物提供充氧。相较于微喷淋器提供的充氧，喷嘴提供的充氧被认为是最小的。微喷淋器设计成通过提供足够的空气鼓泡表面积(取决于烧结金属的平均孔隙率)来使细胞剪切(或损伤)在高空气流速下最小化。换句话说，微喷淋器设计成产生低于裸藻的临界值的气体进入速度(例如低于出现细胞损伤时的值，所述细胞损伤因微喷淋器表面处发生剪切所致)。由于气体进入速度较低，因此跨越粗糙喷淋器的较低压力差使得生长可再现且更富有成效。反过来，通过精细喷淋器的较小孔隙的气体进入速度较高在此前会阻碍较大生产发酵罐(例如20,000L生物反应器)中的细胞生长。
测试实施例生物反应器系统时，通过用单个粗糙喷淋器置换3个精细空气喷淋器而使20,000L生物反应器中的细小裸藻培养物体积生产率增加两倍。精细喷淋器和粗糙喷淋器的压力差较高表明，通过精细喷淋器时的气体进入速度可能过高，导致局部扰动剪切而杀死细胞。
文丘里喷嘴向容器提供总体上的主体混合并且有助于调节或维持储罐的内部压力。尽管其主要用于充氧，但微喷淋器也部分地促成主体混合和流体上升流动以使细胞高效再悬浮。调节内部文丘里喷嘴，以在裸藻培养物包含厌氧和好氧区段的鼓泡塔生物反应器中建立非均相好氧模式。厌氧和好氧区段的建立是通过基于实例生物反应器的计算流体动力学研究来证实。举例来说，流体动力学研究显示，高混合区段局限于喷嘴周围并且储罐中也形成低混合区段。高混合区段是高充氧区段，而低混合区段意味着低充氧区段。这些区段的存在使储罐内的培养物建立非均相好氧模式。
在加料系统的一个实施例中，九个生产发酵罐按照平行的3排或每组3个生物反应器排列并且存在三个热液加料(HLF)管线：每组三个生物反应器用一个加料管线，例如图27中所示。这种配置允许向多个生物反应器中同时并行加料。使储存容器与阀组连接的管线配备有泵或加压管线和流动发射器，所述流动发射器监测和控制浓缩培养基成分在管线中的流速。流动发射器监测加料培养基流速并且在必要时控制泵。流体输送的准确监测和控制允许将准确体积的各种浓缩培养基成分临界传输到生物反应器中生长的培养物。各种浓缩培养基成分经由双座阀连接到所有三个HLF输送管线，从而向生物反应器组中加料。浓缩的碳源和浓缩的氮源通过顶部空间加压和/或经由泵、从痕量成分储罐输送到阀组。
实施例13：大规模生产和喷淋器测试
使用由以下构成的经改性的生长培养基(g/L，溶解于微过滤的水中)培养细小裸藻：10g/L葡萄糖；5g/L酵母提取物；2g/L(NH4)2SO4；1g/L KH2PO4；1g/L MgSO4；0.1g/LCaCl2；每100L培养基5mL痕量盐，其包括(g/L)：19.6g/L FeCl3.6H2O；3.6g/L MnCl2.4H2O；2.2g/L ZnSO4.7H2O；0.4g/L CoCl2.6H2O；0.3g/L Na2MoO4.2H2O；10g/L NaEDTA.2H2O；和每100L培养基40mL维生素混合物，其包括(g/L)：25g/L维生素B1；0.125g/L维生素B12；0.005g/L维生素B6；0.00025g/L维生素B7。使用盐酸或磷酸将培养基pH调节到3.2。
为了在500L鼓泡塔生物反应器中培育，用约18到24L接种体培养物接种100L新制生长培养基。起始细胞干重浓度在2g/L与3g/L之间的范围内。培养物在28℃下培育并且空气流速在0.2scfm到1.5scfm(5.6升/分钟到42.5升/分钟)范围内。在20,000L鼓泡塔生物反应器中，用从500L鼓泡塔生物反应器输送的200L到300L的接种体培养物接种3700L新制培养基，总初始培养物体积为3900L到4000L。初始细胞干重浓度在3g/L到7g/L之间的范围内。在28℃培育培养物并且空气流速在6scfm到50scfm(170升/分钟到850升/分钟)范围内。
为了验证精细喷淋器和粗糙喷淋器对细小裸藻培养物生长的影响，制造10"10μm级喷淋器并且靠近储罐底部向下成45°角并且安装于其中3个精细喷淋器已去除的20,000L鼓泡塔生物反应器中。新的储罐/喷淋器配置模拟了500L生物反应器的配置。测试时，主要任务是实现较高的生物质生产率用于商业和下游工艺开发目的。因此将这些试验集成到生产进度中。
由于喷淋器处的气体进入速度显示为生物反应器中生长的Sf9和NS0细胞系培养物的细胞死亡的主要因素，并且速度与差压的平方根成比例，因此后者是气体进入速度的间接度量。在500L生物反应器中，使用粗糙喷淋器和精细喷淋器执行曝气测试。表38中的结果显示，在不同流速下精细喷淋器的压降或压差(ΔP)几乎是粗糙喷淋器的两倍。这表明，通过精细喷淋器孔隙的气体进入速度比通过粗糙喷淋器孔隙的速度高约两倍。
尽管精细喷淋器(0.5μm)的表面交换面积(1.35倍)大于粗糙喷淋器，但精细喷淋器的空气喷射在所有流速下导致差压加倍。更高的差压表示通过精细喷淋器的气体进入速度大于通过粗糙喷淋器的气体进入速度并且可以解释配备有精细喷淋器的生物反应器中的培养低生产率增长的原因。
表38：在不同的空气流速下跨越精细喷淋器和粗糙喷淋器的压差。
注意：ΔP是通过喷淋器的压降或压差
在20,000L鼓泡塔生物反应器中进行测试培育，所述鼓泡塔生物反应器中安装有粗糙喷淋器且去除了3个精细喷淋器。两种培育分别用初始浓度为2.2g DCW/L和2.7g DCW/L的细胞接种(图30)。分别地，培育物中的总细胞干重在培育192小时后达到135DCW kg并且在培育183小时后达到80.8kg DCW，其遵循的指数趋势类似于在500L生物反应器中所观察的生长模式。另外，一些试验中的细胞浓度是15g DCW/L和12.6g DCW/L。另一方面，配备有3个精细喷淋器的生物反应器中的培育物的总细胞干重在培育192小时之后分别达到23kg和14.9kg的最大总生物质产量，并且最大细胞浓度分别达到5.8g DCW/L和3.46g DCW/L。
配备有1个单一粗糙喷淋器的生物反应器中的细胞生长超越了利用3个精细喷淋器的培育，其中所有3个精细喷淋器都在培育120小时之后投入使用。基于平均体积生物质生产率，这个结果是生产率比三个精细空气喷淋器配置大三倍到五倍。配备有精细喷淋器的生物反应器的平均体积生产率分别是0.0149g/L/h和0.0134g/L/h，相比之下，配备有1个粗糙喷淋器的生物反应器的培育是0.0724g/L/h。这表示平均体积生产率提高5.4倍。此外，配备有粗糙喷淋器的20,000L生物反应器培育的体积生产率类似于500L生物反应器的体积生产率，这表明发酵成功地按比例扩大。图30是表格，其显示根据本实施例的实施例培育结果，表明当使用粗糙喷淋器时产生改进的结果。
实施例14：其它按比例扩大
生产方法综述
在大规模生产发酵罐中通过分批培育来产生细小裸藻生物质。整个培育程序包括在3L摇瓶中且然后在种子(300L)发酵罐中进行2次初始细胞扩增步骤，随后在7000L发酵罐中进行分批培育。关于培育方法的总体描述，请参见下文的表39。
表39：培育方法综述
1.初始生长步骤-摇瓶种子培养
摇瓶(SF)步骤包括3L无挡板摇瓶中的2个生长周期并且需要使用定轨振荡器。第一个SF生长周期是在实施例3中所列的条件下培育48小时，并且使用10个SF的第二个SF生长周期也在类似条件下实施48个小时。这个步骤需要总共十二(12)个具有排气盖子的3L无挡板SF。
2.1通用程序
此培养步骤由按照表40中所列的操作参数实施的分批加料培育组成。加料速率进度是按照Noblegen线上加料计算器实施。Noblegen加料速率计算器利用操作员经由网页键入的样本条目获取数值。此操作每分批加料8个小时进行并且计算相关容器的下一个适当加料速率。这是基于针对室内所测定的细小裸藻生长优化的数学公式。用于此计算的数值是细胞干重、总体积和残余葡萄糖。然后网站向操作员指示下一次加料时，哪种加料速率应该是适当的加料速率。
表40：接种发酵罐(300L)的分批加料发酵操作规范
可使用1mol/L(40g/L)氢氧化钠控制pH。根据所达成的初始细胞湿重，接种培育时间可以在5天到6天范围内。
样品分析报告
将样品和图像的所有分析结果上传到数据库。
2.2生长培养基
生长培养基配方显示于表41中。
表41：接种培育用的(初始)生长培养基配方
中级发酵用的浓缩加料培养基配方如下表42中所述。
表42：种子(300L)发酵(仅)的浓缩加料培养基配方
3.最终生长步骤-分批发酵
3.1发酵工艺规范
为了实现必需的细胞密度，根据表43中的操作参数对细小裸藻实施大规模分批生产。此生长周期的持续时间是2到3天。此步骤不需要控制pH。
表43：分批培育的发酵操作规范(生产发酵罐)
样品分析报告
将样品和图像的所有分析结果上传到数据库用于分析。
3.2通用程序
3.2.1生长培养基配方
用于生产裸藻生物质的生长培养基如表44中所示。请注意，在此步骤中，初始培养基的配方含有3g/L酵母提取物和1.2g/L硫酸铵(而非先前生长步骤中的5g/L酵母提取物和2g/L硫酸铵)。必要时，这允许任选地通过在加料期间增加或减少氮源来进一步提高蛋白质或裸藻淀粉产量。
表44：大规模分批培育用的(初始)生长培养基配方
上述生长培养基已配制成满足表44中所示的目标产物规范。
3.2.3接种指南
将接种体培养物从种子发酵罐输送到生产发酵罐。种子培养物在其从种子发酵罐输送到生产发酵罐期间应该充分混合以避免过度的细胞沉降和不均匀的细胞流动。容纳接种体的培养液应该预温热到指定温度并且被溶氧完全饱和。接种体的体积应该按体积计是5％到10％。
3.2.4取样和分析测试
3.2.4.1频率和所需的样品
培养物取样每6到12小时(最短)进行，例如在培养期间的第0、6、12、18、24、30、36、42和48小时，每个时间点获取2x 50mL样品。分批结束时，即第48小时，还获取2x 2L样品。将各样品和图像的所有分析结果上传到数据库。在每个时间点收集两个50mL样品：一个样品应该处理后立即测试，而第二个(双重复)样品应该立即冷冻以送回用于外部分析。经由细胞干燥测定来测试样品的纯度、细胞密度，以及追踪发酵代谢物。待分析的代谢物包括(但不限于)：葡萄糖、钾、钙、硫酸盐、磷酸盐、丁二酸盐、乳酸盐。始终测量葡萄糖。
3.2.5收获指南
3.2.5.1工艺描述
发酵完成之后，使用冷冻水循环，经由发酵罐夹套将培养液冷却到15℃。如果在开始下游处理之前，需要将培养液搁置>12小时，则应该将培养液分批进行巴氏灭菌以将细胞灭活。这可以使用直接的蒸汽射流(最终温度60℃、45psig蒸汽、60分钟保持时间)在发酵罐中实现。然后使用冷冻水循环，经由发酵罐夹套将加热的培养液冷却到15℃。两种方法应该在传热操作期间提供充足的搅拌。理想情况下，发酵和收获应该按照计划进行，以便无需进行分批巴氏灭菌。
将冷却的培养液输送到冷却的(15℃)降液罐，随后作为批料输送到离心机加料罐。然后在离心机加料期间用市政供水稀释(管线内)培养液到10g湿重/L(约0.32％干燥固体)的最终细胞密度。从喷嘴收集的浓缩液被送回到离心机加料罐，形成再循环回路，直至在喷嘴物料流中实现固含量为5％的目标浓缩液。已初步选择5％固含量来提供足够用于巴氏灭菌的物料，以及限制离心机内的浓度积累直至喷嘴性能已经验证。上清液和碗槽排放物被排放到排出口。
然后将浓缩的淤泥转移到巴氏灭菌(85℃，保持时间15秒)。所有物料转移到巴氏灭菌器废弃物储罐，从巴氏灭菌器排放物取样孔收集最终产物样品(参见章节3.2.5.2中的进度)。所收集的最终产物能够送往干燥，即喷雾干燥、桶干燥或可接受的其它干燥方式。
3.2.5.2取样要求
为了(1)实时确认产物和工艺品质和(2)提供样品供内部最终产物品质测试分析，在下游过程期间需要不同的样品。操作期间所需的实时取样包括：
·水分分析(红外天平或类似分析)
·显微镜分析(20到40倍放大率)
在限定的工艺点需要取得额外样品并且在试验完成之后，立即冷冻装运。初始取样矩阵包括：
·2×20L桶；淤泥离心机喷嘴、预巴氏灭菌(冷冻、装运，然后当场干燥)
·2×20L桶；淤泥离心机喷嘴、后巴氏灭菌(冷冻、装运，然后当场干燥)
·4×50mL法尔康管；淤泥离心机喷嘴、预巴氏灭菌(冷冻和装运到现场)
·4×50mL法尔康管；淤泥离心机喷嘴、后巴氏灭菌(冷冻且装运到现场)
·4×50mL法尔康管；上清液离心机喷嘴(冷冻和装运到现场)
·4×50mL法尔康管；最终发酵液(冷冻且装运到现场)
结果和讨论：
2步骤摇瓶结果：
在第一步骤中，在28℃下过48小时之后，DCW是5.15g/L并且其已使用约7.27g或44％葡萄糖。第二步骤的葡萄糖消耗增加8.94g/L葡萄糖或54.2％。第二步骤之后，汇集烧瓶并且用于接种种子发酵罐，其具有10L的总体积和18.24g/L的DCW。最终葡萄糖水平也下降到2.89g/L或82.5％葡萄糖消耗。
300L储罐种子发酵：
在300L储罐中，在28℃、pH 3.25、15％溶氧(DO，ppm)下培养发酵，初始葡萄糖水平为15.2g/L且初始空气流速为10.5(slpm)。搅拌速率在60rpm到120rpm之间。第5天发酵度量标准的汇总可见于表45和图31到图33中。在下表45中，显示了试验的发酵度量标准。计算分批阶段的生产率，分批阶段是前60个小时的试验，分批加料阶段是试验的剩余部分，并且总体生产率是基于最终体积(L)、DXW(g)的变化除以时间变化(h)。基于葡萄糖、RM(原材料)和氧的产量在历史数据的范围内。
表45：300L储罐中运行的发酵度量标准。所测量的度量标准包括：时间、最终DCW、最终体积、产生的总DCW、消耗的葡萄糖、消耗的氧、加入的总RM、产量和生产率。
根据图31，分批加料期间(即，在标记72小时之后)的比生长速率和比葡萄糖消耗稳定。葡萄糖维持在1.2g/L到3g/L之间，并且呼吸商(RQ，产生的mol CO2/消耗的mol O2)相当稳定(图32)。根据图32，体积生产率的趋势显示随着时间增加并且与总生物质成比例，即，在第128小时和第144小时，生产率峰存在0.757g DCW/L/hr的峰平均值。图33显示随着DO％降低，搅速增加直到180RPM的最大值。空气流速相当恒定直到结束，100小时之后稍微增加。pH在发酵试验的过程中保持相当恒定。
7000L储罐发酵：
在此试验中，由于培养几乎立即开始，因此仅存在很短的滞后时间，如图34中所示。7000L储罐中运行的发酵度量标准如表46中所示。初始pH设定为3.25，DO％为5到8％，温度为28℃，初始空气流速为1500slpm，并且初始葡萄糖水平是15g/L。产量稍微高于历史数据，但仍处于类似的水平。
表46：7000L储罐中运行发酵的度量标准。所度量的度量标准包括：时间、最终DCW、最终体积、产生的总DCW、消耗的葡萄糖、消耗的氧、加入的总RM、产量和生产率。
此试验的峰值体积生产率随着时间增加并且与总生物质成比例，峰值生产率在30小时到42小时之间(0.521g DCW/L/h的峰值平均值)(图35)。总体生产率是0.312g/L/h，然后在300L试验中，其具有较高的平均值。在此试验期间，RQ也相当稳定。
在此发酵试验中，搅速被调节到20RPM与90RPM之间，如图36中所示。空气流速相当恒定，而pH和DO随着时间稳定下降。未来试验旨在将DO保持在较高的恒定水平，以使细胞的氧利用率更佳。
培养度量标准在300L与7000L规模试验之间的比较：
表47总结了两种规模级的试验之间的比葡萄糖消耗、比氧消耗、比CO2释放速率和RQ。此数据用于帮助预测未来的生产产量。7000L具有较高的消耗和释放速率，由于生物质产生较高，因此这正是所预期的。
表47：300L和7000L发酵试验的消耗汇总数据
表48中报告了氧气摄取和二氧化碳释放速率。一般来说，摄氧速率有助于显示生物反应器系统中的氧气输送，其可以是用于评估发酵运行可行性的衡量标准。一般来说，较低的氧气摄取数值被视为正面的，原因是在培育期间不用于担心氧气限制。二氧化碳的释放速率也适用，然而如果水平过低或过高，则可以表明细胞的生长不是最优(如果过低)，并且如果过高，则可以表明运行异常。
表48：300L储罐与7000L储罐之间的比较，其突显最小O2摄取速率、最大O2摄取速率、中值O2摄取速率(mmol/L/h)、最小CO2释放速率、最大CO2释放速率和中值CO2释放速率(mmol/L/h)。
结论：
本实施例突显了在另一个机构使用所述工艺，其中使用机械搅拌。从斜面培养到7,000L储罐运行，其成功地实现了按比例扩大。培育结束时，当细胞密度较高时，体积生产率较高。在整个培育期间，比葡萄糖和O2消耗以及比CO2产生相当恒定。生长概况也类似于历史数据。
为了测试模拟较大规模发酵罐输送，将接种体从7000L发酵罐输送到128,000L规模发酵罐。视觉观察显示加压和输送到离心机之后的健康细胞，细胞溶解极少。测试喷嘴型碟片堆叠式离心机的收获率，其具有4400rpm的碗槽速度、65psig的背压、60分钟的排放间隔、420到640L/min的加料速率、9到11℃的加料温度、10个1.2mm喷嘴，和5个空白对照。并且按照3:1比率线上添加水洗液。所收集的收获物显示存在细胞溶解，这很可能导致培养物pH从2.06上升到5.57，并且固体浓度加倍。还经由连续HTST巴氏灭菌器测试巴氏灭菌，其中流速为68L/min、85℃保持温度维持2分钟，并且冷却温度为10℃。在操作期间未观察到问题，例如堵塞或蒸煮。
本文所引用的每一个专利、专利申请、出版物和登录号的公开内容特此以全文引用的方式并入本文中。
虽然本公开已参考各种实施方式公开，但是显而易见的是，在不偏离本公开的真实精神和范围的情况下，本领域的其它技术人员可以设计出其它实施方式和这些实施方式的变体。随附权利要求书旨在解释为包括所有此类实施方式和等效变型。
Claims (96)
1.一种以异养方式培养细小裸藻的方法，其包括：
在含有一种或多种碳源、一种或多种氮源、一种或多种糖、一种或多种醇、一种或多种油和一种或多种盐的培养基中培养所述细小裸藻；
使pH维持在约2.0至约4.0之间；
使温度维持约20℃至约30℃；以及
维持基本上无光的环境；
其中所述培养分三个培育阶段进行。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述三个培育阶段包括第一阶段培育、第二阶段培育和第三阶段培育。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述一种或多种碳源选自油、糖、醇、羧酸、阿魏酸和其组合。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述羧酸是柠檬酸、柠檬酸盐、反丁烯二酸、反丁烯二酸盐、苹果酸、苹果酸盐、丙酮酸、丙酮酸盐、丁二酸、丁二酸盐、乙酸、乙酸盐、乳酸、乳酸盐或其组合。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述一种或多种油选自由以下组成的组：植物油、大豆油、椰子油、橄榄油、花生油、鱼油、鳄梨油、棕榈油、亚麻油、玉米油、棉籽油、菜籽油、油菜籽油、葵花油、芝麻油、葡萄籽油、红花油、米糠油、丙酸酯、棕榈仁油、萼距花油、亚麻荠油、芥菜籽油、腰果油、燕麦油、羽扇豆油、洋麻油、金盏草油、大麻油、咖啡油、亚麻籽油、榛子油、大戟油、南瓜籽油、芫荽油、山茶油、稻米油、桐油树油、可可油、椰子壳油、鸦片罂粟油、蓖麻籽油、碧根果油、荷荷芭油、麻风果油、澳洲坚果油、巴西坚果油和其组合。
6.根据权利要求1所述的方法，其中所述一种或多种糖选自由以下组成的组：葡萄糖、果糖、半乳糖、乳糖、麦芽糖、蔗糖、糖蜜、甘油、木糖、右旋糖、蜂蜜、玉米糖浆和其组合。
7.根据权利要求1所述的方法，其中所述一种或多种醇选自由乙醇、甲醇、异丙醇和其组合组成的组。
8.根据权利要求1所述的方法，其中所述一种或多种氮源选自由以下组成的组：酵母提取物、硫酸铵、甘氨酸、尿素、丙氨酸、天冬酰胺、玉米浆、肝脏提取物、牛肉浸膏、蛋白胨、脱脂牛奶、豆浆、胰蛋白胨、牛肉提取物、麦黄酮、植物源蛋白胨、豌豆蛋白、糙米蛋白、大豆蛋白胨、马铃薯汁和其组合。
9.根据权利要求1所述的方法，其中所述一种或多种盐选自由以下组成的组：硝酸铵、硝酸钠、磷酸二氢钾、硫酸镁、硫酸镁七水合物、氯化钙、氯化钙二水合物、硫酸钙和其组合。
10.根据权利要求1所述的方法，其中所述培养基进一步包含金属、维生素和其组合。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述金属选自由以下组成的组：氯化铁(III)、氯化锰、硫酸锌、钼酸钠、氯化锌、硼酸、氯化铜、七钼酸铵和其组合。
12.根据权利要求10所述的方法，其中所述维生素选自由以下组成的组：生物素(维生素B7)、硫胺(维生素B1)、核黄素(维生素B2)、烟酸(维生素B3)、泛酸(维生素B5)、吡哆醇(维生素B6)、氰钴维生素(维生素B12)、维生素C、维生素D、叶酸、维生素A、维生素B12、维生素E、维生素K和其组合。
13.根据权利要求1所述的方法，其中所述细小裸藻按照分批模式培养，直至最终细胞湿重在5g/L至250g/L之间(1.6g/L至80g/L细胞干重)为止。
14.根据权利要求1所述的方法，其中所述以异养方式培养细小裸藻的方法是连续培养。
15.根据权利要求1所述的方法，其中所述以异养方式培养细小裸藻的方法的生产率在24天周期中是约270kg细胞干重。
16.根据权利要求2所述的方法，其中所述第一阶段培育包括：
获得细小裸藻；
将所述细小裸藻转移到具有最大培养容积的生物反应器中；以及
培养所述细小裸藻直至所述碳源、所述氮源或这两者均下降到限制细胞生长的水平为止。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述碳源是葡萄糖，并且培养物中的葡萄糖水平下降至低于5g/L。
18.根据权利要求16所述的方法，其中所述第二阶段培育包括在第一阶段培育之后从所述生物反应器中移出培养物以及对所述细小裸藻重复执行分批加料培养一次或多次。
19.根据权利要求18所述的方法，其中所述第一阶段培育进行1天至7天，并且所述第二阶段培育进行1天至7天。
20.根据权利要求18所述的方法，其中将所述细小裸藻培养到一定细胞密度。
21.根据权利要求20所述的方法，其中所述细胞密度被测定为在所述第二阶段培育完成时、作为培养过的所述细小裸藻的gDCW/L，并且比在所述第一阶段培育结束时测定为gDCW/L的细胞密度高至少1.5倍、1.6倍、1.7倍、1.8倍、1.9倍、2.0倍、2.1倍、2.2倍或2.5倍。
22.根据权利要求2所述的方法，其中所述第三阶段培育包括：
频繁地或连续地将培养基按照一定的加料流量添加到所述生物反应器中；以及
按照与所述加料流量相同的流量，频繁地或连续地从所述生物反应器中收获培养物。
23.根据权利要求22所述的方法，其中所述第三阶段培育包括实现稳态条件。
24.根据权利要求23所述的方法，其中所述第三阶段培育进行1天至30天。
25.根据权利要求16所述的方法，其中所述第一阶段培育生产率是约0.1gDCW/L/h至约0.3gDCW/L/h。
26.根据权利要求18所述的方法，其中所述第二阶段培育生产率是约0.5gDCW/L/h至约0.8gDCW/L/h。
27.根据权利要求22所述的方法，其中所述第三阶段培育生产率是约0.4gDCW/L/h至约3.0gDCW/L/h。
28.一种以异养方式培养微生物的生物反应器，其包括：
储罐，其经配置以容纳用于培养所述异养微生物的培养基和成分；
供气系统，其经配置以将气体引入所述储罐，从而使所述储罐内的所述培养基与微生物混合，其中所述供气系统包括低压供气装置和高压供气装置。
29.根据权利要求28所述的生物反应器，其中所述气体选自由压缩空气、氧气、氮气、氦气和其组合组成的组。
30.根据权利要求28所述的生物反应器，其中低压供气系统是孔隙尺寸小于30微米的鼓泡石。
31.根据权利要求28所述的生物反应器，其中所述高压供气系统包括至少一个喷嘴，所述喷嘴经配置以将气流导入所述储罐且经配置以枢转而改变所述气流方向。
32.根据权利要求31所述的生物反应器，其中所述气流的流量是约0.1升/分钟。
33.根据权利要求28所述的生物反应器，其中所述供气系统被配置为在所述储罐内同时建立多个区段，其中所述多个区段包括至少一个好氧区和至少一个厌氧区。
34.根据权利要求28所述的生物反应器，其中所述高压供气装置和所述低压供气装置可独立地以电子方式加以控制。
35.根据权利要求28所述的生物反应器，其中所述储罐具有至少3:1的高度与直径尺寸比。
36.根据权利要求28所述的生物反应器，其中所述储罐具有约10升至约1,000,000升的容量。
37.根据权利要求28所述的生物反应器，其中所述储罐被配置为使温度维持在约20℃至约35℃。
38.根据权利要求28所述的生物反应器，其中所述微生物选自由以下组成的群组：细小裸藻、血红裸藻、静裸藻、易变裸藻、梭形裸藻、绿裸藻、鱼腥裸藻、膝曲裸藻、尖尾裸藻、近轴裸藻、三棱裸藻、衣裸藻、光亮裸藻(Euglena splendens)、编织裸藻(Euglena texta)、中型裸藻、多形裸藻、带形裸藻(Euglena ehrenbergii)、粘着裸藻(Euglena adhaerens)、洁净裸藻(Euglena clara)、延长裸藻、弹性裸藻、矩圆裸藻、鱼形裸藻、坎塔布裸藻(Euglenacantabrica)、颗粒裸藻、钝顶裸藻、泽生裸藻、半色裸藻、变异裸藻、尾裸藻、极小裸藻、普通裸藻、放大裸藻、地生裸藻、短尖裸藻(Euglena velata)、拒斥裸藻(Euglena repulsans)、棒形裸藻、拉塔裸藻(Euglena lata)、结核裸藻(Euglena tuberculata)、坎塔布裸藻(Euglena cantabrica)、成梭裸藻(Euglena acusformis)、奥斯坦裸藻(Euglenaostendensis)、自养小球藻、拓殖小球藻、绿小球藻、极微小球藻、垂体小球藻(Chlorellapituita)、类丽小球藻(Chlorella pulchelloides)、蛋白核小球藻、圆形小球藻、单生小球藻(Chlorella singularis)、富油小球藻(Chlorella sorokiniana)、变异小球藻(Chlorella variabilis)、涡旋小球藻(Chlorella volutis)、普通小球藻、聚集裂殖壶菌(Schizochytrium aggregatum)、蛞蝓形裂殖壶菌(Schizochytrium limacinum)、米氏裂殖壶菌(Schizochytrium minutum)，和其组合。
39.根据权利要求28所述的生物反应器，其中所述生物反应器配有监测系统，所述监测系统测量选自由以下组成的组的参数：pH、溶氧、细胞密度、流明水平、葡萄糖水平、温度、所述生物反应器的培养容积、氮水平(例如铵、谷氨酸盐)、培养基组成、生物反应器排气中的残余分子氧、生物反应器排气中的二氧化碳水平，和其组合。
40.根据权利要求28所述的生物反应器，其中所述低压供气装置包含多个喷淋器，包括至少一个具有第一孔隙尺寸的喷淋器和至少一个具有第二孔隙尺寸的喷淋器，其中所述第二孔隙尺寸大于所述第一孔隙尺寸。
41.根据权利要求40所述的生物反应器，其中所述第一孔隙尺寸是大约5至10微米，而所述第二孔隙尺寸是大约20至70微米。
42.根据权利要求40所述的生物反应器，其中所述多个喷淋器定位于所述储罐内的向不同方向延伸的层中。
43.根据权利要求42所述的生物反应器，其中所述层在所述储罐的底部附近形成栅格。
44.一种用于生产生物质的系统，其包括：
并联连接的多个生物反应器，每个生物反应器包括单独的储罐；
多个输入系统，其经配置以将培养基、微生物和成分分别供应到每一个所述生物反应器储罐中；
供气系统，其经配置以将气体引入每一个所述生物反应器储罐中，其中所述供气系统包括低压供气装置和高压供气装置。
45.根据权利要求44所述的系统，其中所述气体选自由压缩空气、氧气、氮气、氦气和其组合组成的组。
46.根据权利要求44所述的系统，其中所述低压供气系统是孔隙尺寸小于30微米的鼓泡石。
47.根据权利要求44所述的生物反应器，其中所述高压供气系统是经配置以产生气流且经配置以枢转而改变所述气流方向的文丘里喷嘴。
48.根据权利要求47所述的系统，其中所述气流的流量是约0.1升/分钟。
49.根据权利要求44所述的系统，其中所述低压供气装置和所述高压供气装置定位于所述储罐的底部。
50.根据权利要求44所述的系统，其中所述高压供气装置和所述低压供气装置可独立地以电子方式加以控制。
51.根据权利要求44所述的系统，其中分别与所述多个生物反应器的每一个储罐相连的所述多个输入系统和供气系统可独立地以电子方式控制，以改变所述多个生物反应器的每一个储罐内的培养条件。
52.根据权利要求44所述的系统，其中各生物反应器配有监测系统，所述监测系统测量选自由以下组成的组的参数：pH、溶氧、细胞密度、流明水平、葡萄糖水平、温度、所述生物反应器的培养容积、氮水平(例如铵、谷氨酸盐)、培养基组成、生物反应器排气中的残余分子氧、生物反应器排气中的二氧化碳水平，和其组合。
53.根据权利要求44所述的系统，其中所述供气系统可加以控制以改变所述气体的流量和方向。
54.根据权利要求44所述的系统，其中对于所述多个生物反应器的每一个所述储罐来说，所述供气系统包括至少一个鼓泡石和至少一个喷嘴。
55.根据权利要求44所述的系统，其中所述多个输入系统和所述供气系统可独立地以电子方式加以控制，以在每一个储罐内同时建立多个区段，其中所述多个区段包括至少一个好氧区和至少一个厌氧区。
56.根据权利要求44所述的系统，其中所述多个生物反应器包括一个或多个中试罐和一个或多个生产罐。
57.根据权利要求56所述的系统，其中所述一个或多个中试罐是大约250至500L，而所述一个或多个生产罐是至少15,000L。
58.一种以异养方式培养微生物的方法，其包括：
在含有一种或多种碳源、一种或多种氮源、一种或多种糖、一种或多种醇、一种或多种油和一种或多种盐的培养基中培养所述微生物；
使pH维持在约2.0至约4.0之间；
使温度维持在约20℃至约30℃；以及
维持基本上无光的环境；
其中所述培养是在储罐内进行，所述储罐经配置以容纳所述培养基、供气系统，所述供气系统被配置为将气体引入所述储罐中，从而能够使所述储罐内的所述培养基与微生物混合，其中所述供气系统包括低压供气装置和高压供气装置。
59.根据权利要求58所述的方法，其中所述一种或多种碳源选自油、糖、醇、羧酸、阿魏酸和其组合。
60.根据权利要求59所述的方法，其中所述羧酸是柠檬酸、柠檬酸盐、反丁烯二酸、反丁烯二酸盐、苹果酸、苹果酸盐、丙酮酸、丙酮酸盐、丁二酸、丁二酸盐、乙酸、乙酸盐、乳酸、乳酸盐或其组合。
61.根据权利要求58所述的方法，其中所述一种或多种油选自由以下组成的组：植物油、大豆油、椰子油、橄榄油、花生油、鱼油、鳄梨油、棕榈油、亚麻油、玉米油、棉籽油、菜籽油、油菜籽油、葵花油、芝麻油、葡萄籽油、红花油、米糠油、丙酸酯、棕榈仁油、萼距花油、亚麻荠油、芥菜籽油、腰果油、燕麦油、羽扇豆油、洋麻油、金盏草油、大麻油、咖啡油、亚麻籽油、榛子油、大戟油、南瓜籽油、芫荽油、山茶油、稻米油、桐油树油、可可油、椰子壳油、鸦片罂粟油、蓖麻籽油、碧根果油、荷荷芭油、麻风果油、澳洲坚果油、巴西坚果油和其组合。
62.根据权利要求58所述的方法，其中所述一种或多种糖选自由以下组成的组：葡萄糖、果糖、半乳糖、乳糖、麦芽糖、蔗糖、糖蜜、甘油、木糖、右旋糖、蜂蜜、玉米糖浆和其组合。
63.根据权利要求58所述的方法，其中所述一种或多种醇选自由乙醇、甲醇、异丙醇和其组合组成的组。
64.根据权利要求58所述的方法，其中所述一种或多种氮源选自由以下组成的组：酵母提取物、硫酸铵、甘氨酸、尿素、丙氨酸、天冬酰胺、玉米浆、肝脏提取物、牛肉浸膏、蛋白胨、脱脂牛奶、豆浆、胰蛋白胨、牛肉提取物、麦黄酮、植物源蛋白胨、豌豆蛋白、糙米蛋白、大豆蛋白胨、马铃薯汁和其组合。
65.根据权利要求58所述的方法，其中所述一种或多种盐选自由以下组成的组：硝酸铵、硝酸钠、磷酸二氢钾、硫酸镁、硫酸镁七水合物、氯化钙、氯化钙二水合物、硫酸钙和其组合。
66.根据权利要求58所述的方法，其中所述培养基进一步包含金属、维生素和其组合。
67.根据权利要求66所述的方法，其中所述金属选自由以下组成的组：氯化铁(III)、氯化锰、硫酸锌、钼酸钠、氯化锌、硼酸、氯化铜、七钼酸铵和其组合。
68.根据权利要求66所述的方法，其中所述维生素选自由以下组成的组：生物素(维生素B7)、硫胺(维生素B1)、核黄素(维生素B2)、烟酸(维生素B3)、泛酸(维生素B5)、吡哆醇(维生素B6)、氰钴维生素(维生素B12)、维生素C、维生素D、叶酸、维生素A、维生素B12、维生素E、维生素K和其组合。
69.根据权利要求58所述的方法，其中所述气体选自由压缩空气、氧气、氮气、氦气和其组合组成的组。
70.根据权利要求58所述的方法，其中所述低压供气系统是孔隙尺寸小于30微米的鼓泡石。
71.根据权利要求70所述的方法，其中所述高压供气系统包括至少一个喷嘴，所述喷嘴经配置以将气流导入所述储罐且经配置以枢转而改变所述气流的方向。
72.根据权利要求71所述的方法，其中所述气流的流量是约0.1升/分钟。
73.根据权利要求58所述的方法，其中所述供气系统经配置以在所述储罐内同时建立多个区段，其中所述多个区段包括至少一个好氧区和至少一个厌氧区。
74.根据权利要求58所述的方法，其中所述高压供气装置和所述低压供气装置可独立地以电子方式加以控制。
75.根据权利要求58所述的方法，其中所述储罐具有至少3:1的高度与直径尺寸比。
76.根据权利要求58所述的方法，其中所述储罐具有约10升至约1,000,000升的容量。
77.根据权利要求58所述的方法，其中所述储罐经配置以使温度维持在约20℃至约35℃。
78.根据权利要求58所述的方法，其中所述微生物选自由以下组成的群组：细小裸藻、血红裸藻、静裸藻、易变裸藻、梭形裸藻、绿裸藻、鱼腥裸藻、膝曲裸藻、尖尾裸藻、近轴裸藻、三棱裸藻、衣裸藻、光亮裸藻、编织裸藻、中型裸藻、多形裸藻、带形裸藻、粘着裸藻、洁净裸藻、延长裸藻、弹性裸藻、矩圆裸藻、鱼形裸藻、坎塔布裸藻、颗粒裸藻、钝顶裸藻、泽生裸藻、半色裸藻、变异裸藻、尾裸藻、极小裸藻、普通裸藻、放大裸藻、地生裸藻、短尖裸藻、拒斥裸藻、棒形裸藻、拉塔裸藻、结核裸藻、坎塔布裸藻、成梭裸藻、奥斯坦裸藻、自养小球藻、拓殖小球藻、绿小球藻、极微小球藻、垂体小球藻、类丽小球藻、蛋白核小球藻、圆形小球藻、单生小球藻、富油小球藻、变异小球藻、涡旋小球藻、普通小球藻、聚集裂殖壶菌、蛞蝓形裂殖壶菌、米氏裂殖壶菌，和其组合。
79.根据权利要求58所述的方法，其中所述生物反应器配有监测系统，所述监测系统测量选自由以下组成的组的参数：pH、溶氧、细胞密度、流明水平、葡萄糖水平、温度、所述生物反应器的培养容积、氮水平(例如铵、谷氨酸盐)、培养基组成、生物反应器排气中的残余分子氧、生物反应器排气中的二氧化碳水平，和其组合。
80.根据权利要求58所述的方法，其中所述低压供气装置包含多个喷淋器，包括至少一个具有第一孔隙尺寸的喷淋器和至少一个具有第二孔隙尺寸的喷淋器，其中所述第二孔隙尺寸大于所述第一孔隙尺寸。
81.根据权利要求80所述的方法，其中所述第一孔隙尺寸是大约5至10微米，而所述第二孔隙尺寸是大约20至70微米。
82.根据权利要求80所述的方法，其中所述多个喷淋器定位于所述储罐内的向不同方向延伸的层中。
83.根据权利要求82所述的方法，其中所述层在所述储罐的底部附近形成栅格。
84.根据权利要求1所述的方法或根据权利要求58所述的方法，其中所述微生物具有0.001h-1至0.1h-1的最大生长速率(μmax)。
85.根据权利要求1所述的方法或根据权利要求58所述的方法，其中所述培养基在75天的所述培养中周转至多300次。
86.根据权利要求1所述的方法或根据权利要求58所述的方法，其中所述方法进一步包括按照约20rpm至约180rpm之间的搅拌速率搅拌所述培养基。
87.根据权利要求1所述的方法或根据权利要求58所述的方法，其中所述方法进一步包括按照约0.2vvm至约1.0vvm、任选地约0.2vvm的空气流量向所述培养基中通气。
88.根据权利要求1所述的方法或根据权利要求58所述的方法，其中所述培养基包括混合型培养基。
89.根据权利要求88所述的方法，其中所述混合型培养基包括约10％至约75％回收培养基，任选地补充碳源。
90.根据权利要求1所述的方法或根据权利要求58所述的方法，其中所述培养基保持15％至约75％的转化效率。
91.根据权利要求1所述的方法或根据权利要求58所述的方法，其中所述培养基的特定葡萄糖消耗速率是约30mg/glc/gDCW/h至75mg/glc/gDCW/h，任选地为约40mg/glc/gDCW/h至55mg/glc/gDCW/h。
92.根据权利要求1所述的方法或根据权利要求58所述的方法，其中所述培养基具有约15％至约100％的溶氧(DO)值。
93.根据权利要求1所述的方法或根据权利要求58所述的方法，其中所述培养基具有约0.1mmol/L/h至40mmol/L/h的摄氧速率。
94.根据权利要求1所述的方法或根据权利要求58所述的方法，其中所述培养基的特定耗氧速率是约10mg O2/g DCW/h至30mg O2/g DCW/h，任选地为约14mg O2/g DCW/h至20mgO2/g DCW/h。
95.根据权利要求1所述的方法或根据权利要求58所述的方法，其中所述培养基的特定CO2释放速率是约10mg CO2/gDCW/h至40mg CO2/gDCW/h，最优地为约20mg CO2/gDCW/h至25mg CO2/gDCW/h。
96.根据权利要求1所述的方法或根据权利要求58所述的方法，其中所述培养基具有约0.1mmol/L/h至40mmol/L/h的CO2释放速率。
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