CN109136116A - 一种培养二型性微生物的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种培养二型性微生物的方法。具体而言,本发明提供一种减少菌丝型酵母、增加酵母型酵母的酵母生产方法,其特征在于,所述方法包括,在酵母发酵步骤中,(1)将发酵过程中的溶氧水平控制在20%以上;和/或(2)将发酵过程中发酵液中的碳的总含量与氮的总含量的比值,即C/N比,控制在2~25的范围内,其中,所述含量以质量百分比计;和/或(3)将发酵温度控制在26~30℃的范围内。本发明的方法还可任选地包括菌种多级活化的步骤。采用本发明方法可以有效减少菌丝型酵母的比例,同时增加酵母型酵母的比例,利于耶氏酵母高密度培养。
Description
技术领域
本发明涉及一种培养二型性微生物的方法。
背景技术
二型性(Dimorphism)是指同一种生物(有时是同一个个体)内出现二种相异性状的现象。菌体二型性是指一种真菌既能生长成酵母状细胞又能生长成菌丝体状细胞的一种现象。解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)是一种研究菌体二型性的模式生物。
解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)是一种非常规酵母,属于半子囊菌纲、耶氏酵母菌属,细胞形态可以在酵母型、假菌丝型以及菌丝型之间进行相互转换。解脂耶氏酵母因其独特的生理和代谢方式,且被公认为一种安全的菌种,引起了广大研究者的兴趣。随着该酵母的研究也日益增多,该酵母应用前景也越来越广泛。
解脂耶氏酵母的二型性转换受外界环境控制,生长温度、环境中氧的浓度以及pH值等都会影响细胞的菌丝形成能力,但对于解脂耶氏酵母二型性转化的外界环境的控制文献中记录的较少。
发明内容
本发明对解脂耶氏酵母发酵工艺进行了研究,发现利用控制菌种活性以及外界环境比如pH、溶氧、C/N比(发酵液中碳的总含量与氮的总含量的比值,所述含量以质量百分数计)、温度等,可以有效减少菌丝型酵母的比例,同时增加酵母型酵母的比例,利于耶氏酵母高密度培养。
因此,本发明提供了一种减少二型性微生物菌丝型细胞、增加酵母型细胞的生产方法,所述方法包括,在所述微生物的发酵步骤中,
(1)将发酵过程中的溶氧水平控制在20%以上;和/或
(2)将发酵过程中发酵液中的碳的总含量与氮的总含量的比值,即C/N比,控制在2~25、优选5~20、更优选5~15的范围内,其中,所述含量以质量百分比计;和/或
(3)将发酵温度控制在26~30℃,优选27.5℃~28.5℃的范围内。
在一个或多个实施方案中,通过增加搅拌速率和/或通气量来将发酵过程中的溶氧水平控制在20%以上。
在一个或多个实施方案中,通过以下方式中的一种或两种的组合来将发酵过程中的溶氧水平控制在20%以上:
(1)搅拌方式;和
(2)进气方式。
在一个或多个实施方案中,通过增大搅拌桨的规格和/或改变搅拌桨形状来改变搅拌方式,从而将发酵过程中的溶氧水平控制在20%以上。
在一个或多个实施方案中,所述改变搅拌桨形状包括将剪切力小的搅拌桨替换成剪切力相对而言提高的搅拌桨,或将六直叶圆盘涡轮式改为六弧叶圆盘涡轮式或六折叶圆盘涡轮式搅拌桨。
在一个或多个实施方案中,通过将单管进气改变为气体分布器进气,从而将发酵过程中的溶氧水平控制在20%以上。
在一个或多个实施方案中,通过调整发酵过程中流加的碳源和氮源的速度控制发酵液中的C/N比。
在一个或多个实施方案中,所述调整由手动补料、连续补料或反馈控制来实现。
在一个或多个实施方案中,所述手动补料包括:检测发酵液中的C/N比,和根据检测结果补料;其中,检测时间间隔为1~8小时。
在一个或多个实施方案中,所述连续补料包括:按照菌种的生长情况预先设定好补料速率,由电磁阀自动补料。
在一个或多个实施方案中,所述反馈控制包括:根据在线或离线检测pH、铵离子和/或硝酸根离子的结果来对发酵液中的C/N比进行调整。
在一个或多个实施方案中,补料的方式使发酵罐中的葡萄糖含量控制在0~5%的范围内,例如控制在0.1~0.5%,或者1.0~2.0%,或者2.0~3.0%,或者3.0~4.0%,或者4.0~5.0%的范围内。
在一个或多个实施方案中,所述碳源为糖和糖的衍生物、有机酸类、醇类。
在一个或多个实施方案中,所述糖类选自单糖、二糖和多糖或其任意组合。
在一个或多个实施方案中,所述单糖选自葡萄糖、果糖和半乳糖或其任意组合。
在一个或多个实施方案中,所述二糖选自蔗糖、乳糖和麦芽糖或其任意组合。
在一个或多个实施方案中,所述多糖为淀粉。
在一个或多个实施方案中,所述有机酸类选自甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、和琥珀酸的一种或任意多种的组合。
在一个或多个实施方案中,所述醇类选自甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、戊醇等的一种或任意多种的组合。
在一个或多个实施方案中,所述氮源选自酵母膏、蛋白胨、硫酸铵、氯化铵、乙酸铵、甲酸铵、丙酸铵、乳酸胺和丁酸铵中的一种或任意多种的组合。
在一个或多个实施方案中,所述发酵为分批发酵、补料分批发酵或者连续发酵。
在一个或多个实施方案中,所述微生物为酵母。
在一个或多个实施方案中,所述微生物选自:解脂耶氏酵母(Yarrowialipolytica)、产朊假丝酵母(Candida utilis)、热带假丝酵母(Candida tropicalis)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、球拟酵母(Torulopsisutilis)、拟热带假丝酵母(Candida pseudotropicalis)、季也蒙假丝酵母果生变种(Candidaguilliermondiivar.carpophila)、近平滑假丝酵母(Candida parapsilosis)、土生假丝酵母(Candidahumicola)、克鲁斯假丝酵母(Candida krusei)、葡萄牙假丝酵母(Candida lusitaniae)、近平滑假丝酵母(Candida parapsilosis)、麦芽糖假丝酵母(Candida maltosa)、解脂假丝酵母解脂变种(Candida lipolytica var.lipolytica)、马其顿假丝酵母(Candidamacedoniensis)、休哈塔假丝酵母(Candida shehatae)、中间假丝酵母(Candidaintermedia)、涎沫假丝酵母(Candida zeylanoides)、白假丝酵母(Candida albicans)、博伊丁假丝酵母(Candida boidinii)、口津假丝酵母(Candida melibiosica)、冻胶假丝酵母(Candida gelida)、发皮安假丝酵母(Candida fabianii)、树状假丝酵母(Candidacerevisiae)、皱褶假丝酵母(Candida rugosa)、朗比可假丝酵母(Candida lambica)、枣椰假丝酵母(Candida dattila)、奶酪假丝酵母(Candida butyri)、歧异假丝酵母(Candidadiversa)、橄榄假丝酵母(Candida oleophila)、丘陵假丝酵母(Candida colliculosa)、克瑞斯假丝酵母(Candida krissii)、弗里思假丝酵母(Candida freyschussii)、山梨木糖假丝酵母(Candida sorboxylosa)、化脂假丝酵母(Candida steatolytica)、白假丝酵母(Candida albicans)、挪威假丝酵母(Candida norvegensis)、乳酒假丝酵母(Candidakefyr)、皮状假丝酵母(Candida pelliculosa)、季也蒙假丝酵母(Candidaguilliermondii)、斯达氏油脂酵母(Lipomycesstarkeyi)、茁芽丝孢酵母(Trichospironpullulans)、产油油脂酵母(Lipomyceslipofer)、胶粘红酵母(Rhodotorulagiutinis)、类酵母红冬孢(Rhodosporidiumtoruloides)和园拟酵母(Torulautilis)。
在一个或多个实施方案中,发酵液的pH值控制在5.5~8范围内,例如控制在6.5~7、7~7.5、7.5~8的范围内。
在一个或多个实施方案中,每升发酵液中包括蛋白胨15~25g,酵母提取物5~20g,葡萄糖15~25g。
在一个或多个实施方案中,发酵接种量为0.5~20%,例如8~10%、10~15%或8~15%。
在一个或多个实施方案中,所述方法还包括对菌种进行多级活化的步骤;其中,所述多级活化包括进行至少一次平板培养和一次摇瓶培养。
在一个或多个实施方案中,循环重复平板培养和摇瓶培养2~4次。
在一个或多个实施方案中,所述多级活化包括依次包括平板培养、摇瓶培养、平板培养和摇瓶培养,或依次包括摇瓶培养、平板培养、摇瓶培养和平板培养。
在一个或多个实施方案中,所述平板培养包括将菌种接种平板,在27~32℃下倒置培养的步骤。
在一个或多个实施方案中,倒置培养的时间为18~40小时。
在一个或多个实施方案中,所述摇瓶培养包括,将平板培养活动的单菌落接种至摇瓶中,在27~32℃下培养的步骤。
在一个或多个实施方案中,摇瓶培养的时间为12~36小时。
在一个或多个实施方案中,所述多级活化包括:
(1)将解冻的菌种接种到平板,27℃~32℃下倒置培养18~40小时;
(2)将步骤(1)获得的单菌落接种至摇瓶,27℃~32℃下培养12~36小时;
(3)将步骤(2)获得的菌液接种到平板,27℃~32℃下倒置培养18~40小时;和
(4)将步骤(3)获得的单菌落接种至摇瓶,27℃~32℃下培养12~36小时。
在一个或多个实施方案中,所述多级活化包括:
(1)将解冻的菌种接种到摇瓶,27℃~32℃下培养12~36小时;
(2)将步骤(1)获得的菌液接种到平板,27℃~32℃下倒置培养18~40小时;
(3)将步骤(2)获得的单菌落接种至摇瓶,27℃~32℃下培养12~36小时;和
(4)将步骤(3)获得的菌液至平板,27℃~32℃下倒置培养12~36小时。
本发明还提供一种微生物发酵方法,所述方法包括采用本文所述的减少二型性微生物菌丝型细胞、增加酵母型细胞的生产方法进行发酵的步骤。
本发明还提供一种微生物活化的方法,所述方法包括对解冻的微生物菌种进行至少一次平板培养和一次摇瓶培养。
在一个或多个实施方案中,循环重复平板培养和摇瓶培养2~4次。
在一个或多个实施方案中,所述多级活化包括依次包括平板培养、摇瓶培养、平板培养和摇瓶培养,或依次包括摇瓶培养、平板培养、摇瓶培养和平板培养
在一个或多个实施方案中,所述平板培养包括将菌种接种平板,在27~32℃下倒置培养的步骤;优选地,倒置培养的时间为18~40小时。
在一个或多个实施方案中,所述摇瓶培养包括,将平板培养活动的单菌落接种至摇瓶中,在27~32℃下培养的步骤;优选地,摇瓶培养的时间为12~36小时。
附图说明
图1:实施例1获得的菌丝型酵母和酵母型酵母OD随时间变化图。
图2:实施例1获得的菌丝型酵母和酵母型酵母镜检照片比对。左图:菌丝型酵母镜检照片;右图:酵母型酵母镜检图照片。
图3:实施例2的未活化处理试验中甘油管菌种OD和溶氧随时间变化图。
图4:实施例2的未活化处理试验中甘油管菌种在发酵过程中镜检图。左图:2L摇瓶中镜检图;右图:100L发酵罐镜检图。
图5:实施例2的活化处理试验中活化菌种OD和溶氧随时间变化图。
图6:实施例2的活化处理试验中活化菌种在发酵过程中镜检图,第一排的图片依次是:第一次活化250mL摇瓶中镜检图和第二次活化250mL摇瓶中镜检图;第二排的图片依次是:2L摇瓶中镜检图和100L发酵罐镜检图。
图7:实施例3获得的溶氧(DO)随时间变化图。
图8:实施例3获得的对照组和实验组48h镜检图。左图:对照组镜检照片;右图:实验组镜检照片。
图9:实施例4获得的对照组和实验组OD随时间变化图。
图10:实施例4获得的对照组和实验组C/N随时间变化图。
图11:实施例5获得的对照组和实验组48h镜检图。左图:对照组镜检照片;右图:实验组镜检照片(稀释10倍)。
图12:实施例5获得的对照组和实验组48h镜检图。左图:对照组镜检照片;右图:实验组镜检照片(稀释10倍)。
图13:实施例6的发酵过程中的OD结果。
图14:实施例6的镜检结果。
具体实施方式
应理解,在本发明范围内中,本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合,从而构成优选的技术方案。
本文涉及二型性微生物的培养,尤其涉及如何减少二型性微生物菌丝型细胞、增加其酵母型细胞。本文中,二型性(Dimorphism)是指同一种生物(有时是同一个个体)内出现二种相异性状的现象。菌体二型性是指一种真菌既能生长成酵母状细胞又能生长成菌丝体状细胞的一种现象。本文的二型性微生物即指既能生长成酵母状细胞(酵母型细胞,通常情况下长宽比例小于等于2)又能生长成菌丝体状细胞(菌丝型细胞,通常情况下长宽比例大于2)的微生物。本发明的二型性微生物尤其指酵母。在某些实施方案中,本发明的二型性微生物包括但不限于解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)、产朊假丝酵母(Candidautilis)、热带假丝酵母(Candida tropicalis)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、球拟酵母(Torulopsisutilis)、拟热带假丝酵母(Candida pseudotropicalis)、季也蒙假丝酵母果生变种(Candida guilliermondii var.carpophila)、近平滑假丝酵母(Candidaparapsilosis)、土生假丝酵母(Candida humicola)、克鲁斯假丝酵母(Candida krusei)、葡萄牙假丝酵母(Candida lusitaniae)、近平滑假丝酵母(Candida parapsilosis)、麦芽糖假丝酵母(Candida maltosa)、解脂假丝酵母解脂变种(Candida lipolyticavar.lipolytica)、马其顿假丝酵母(Candida macedoniensis)、休哈塔假丝酵母(Candidashehatae)、中间假丝酵母(Candida intermedia)、涎沫假丝酵母(Candida zeylanoides)、白假丝酵母(Candida albicans)、博伊丁假丝酵母(Candida boidinii)、口津假丝酵母(Candida melibiosica)、冻胶假丝酵母(Candida gelida)、发皮安假丝酵母(Candidafabianii)、树状假丝酵母(Candida cerevisiae)、皱褶假丝酵母(Candida rugosa)、朗比可假丝酵母(Candida lambica)、枣椰假丝酵母(Candida dattila)、奶酪假丝酵母(Candida butyri)、歧异假丝酵母(Candida diversa)、橄榄假丝酵母(Candidaoleophila)、丘陵假丝酵母(Candida colliculosa)、克瑞斯假丝酵母(Candida krissii)、弗里思假丝酵母(Candida freyschussii)、山梨木糖假丝酵母(Candida sorboxylosa)、化脂假丝酵母(Candida steatolytica)、白假丝酵母(Candida albicans)、挪威假丝酵母(Candida norvegensis)、乳酒假丝酵母(Candida kefyr)、皮状假丝酵母(Candidapelliculosa)、季也蒙假丝酵母(Candida guilliermondii)、斯达氏油脂酵母(Lipomycesstarkeyi)、茁芽丝孢酵母(Trichospironpullulans)、产油油脂酵母(Lipomyceslipofer)、胶粘红酵母(Rhodotorulagiutinis)、类酵母红冬孢(Rhodosporidiumtoruloides)和园拟酵母(Torulautilis)。
在某些实施方案中,本文的二型性微生物尤其可选自解脂耶氏酵母、产朊假丝酵母、热带假丝酵母、酿酒酵母、球拟酵母。
本文通过以下方式中的一种或任意多种的组合来减少发酵中的菌丝型细胞比例,增加酵母型细胞的比例:
(1)对菌种进行多级活化;
(2)提高发酵过程中的溶氧水平;
(3)降低发酵过程中发酵液中的C/N比;和
(4)控制发酵温度。
通常的发酵包括将菌种从甘油管中解冻,然后直接接种到2L摇瓶中进行种子液的制备。本文对菌种进行多级活化的方法包括将解冻后的菌种进行至少一次平板培养和至少一次摇瓶培养。例如,可将解冻后的菌种进行摇瓶培养,然后再进行平板培养;或者可先将解冻后的菌种进行平板培养,然后再进行摇瓶培养。通常,以一次平板培养加一次摇瓶培养或一次摇瓶培养加一次平板培养为一次活化,可进行1~4次、优选2~4次活化。
平板培养可在营养琼脂上进行。例如,将解冻的菌种通过划线的方式接种到营养琼脂上,然后在27~32℃下倒置培养。倒置培养的时间可以为18~40小时。
平板培养后,将平板培养活动的单菌落接种至摇瓶中,在27~32℃下培养的步骤。此时所用的摇瓶通常是250mL摇瓶。摇瓶培养的时间通常为12~36小时。摇瓶培养所用的培养基可以是常规的培养基,例如含有蛋白胨、酵母提取物和葡萄糖的培养基。
在某些实施方案中,本文所述的多级活化包括:
(1)将菌种接种到平板,27℃~32℃下倒置培养18~40小时;
(2)将步骤(1)获得的单菌落接种至摇瓶,27℃~32℃下培养12~30小时;
(3)将步骤(2)获得的菌液接种到平板,27℃~32℃下倒置培养18~40小时;和
(4)将步骤(3)获得的单菌落接种至摇瓶,27℃~32℃下培养12~36小时。
多级活化结束后,可按常规的方式,将活化的菌种接种至2L摇瓶,进行种子液的培养。
本文中,提高发酵过程中的溶氧水平包括控制整个发酵过程中发酵液中的溶氧水平均大于等于20%。通常是通过改变搅拌方式和/或改变进气方式来将溶氧水平控制在20%以上。例如,可通过增大搅拌桨的规格和/或改变搅拌桨形状来改变搅拌方式,如可如将1吨发酵罐中原有的搅拌桨Ф20改为Ф30~Ф40。和/或,通过将剪切力相对较小的搅拌桨替换成剪切力相对而言提高的搅拌桨,来提高搅拌速率。例如,可将1吨发酵罐中原油的六直叶圆盘涡轮式改为六弧叶圆盘涡轮式或六折叶圆盘涡轮式搅拌桨。可通过改变搅拌方式来增加搅拌速率,从而将发酵液中的溶氧水平控制在20%以上。
对于进气/通气方式,只要能实现进气量/通气量增加,都可用于本文。例如,可将单管进气改变为分布环或者其它气体分布器进气。
对于降低发酵过程中发酵液的C/N比,本文通常是将其控制在2~25的范围内,例如,将其控制在2~20的范围内。优选将C/N比控制在5~20的范围内,例如控制在5~15或15~20的范围内。通常,当检测到发酵液中的C/N比接近25时,例如在20~25的范围内时,即可调整补料,以将发酵液的C/N比控制在上述范围之内。或者,当要将C/N比控制在例如5~15的范围内时,监控发酵液中的C/N比,当其接近15时,例如在10~15的范围内时,即可调整补料,以将发酵液的C/N比控制在15以下。同样地,当C/N比接近5时,例如在5~8的范围内,也需调整补料,以及将C/N比控制在5以上。
通常,在发酵初期,即第0~24h,发酵液的C/N比一般都会在2~25的范围内;在发酵的中后期(例如24h之后),需要监控发酵液中的C/N比,以将其控制在本文所述的范围之内。
可通过调整发酵过程中流加的碳源和氮源的速度而将C/N比控制在上述范围内。本文中,碳源可以是微生物尤其是酵母发酵所用的碳源,包括但不限于糖、糖的衍生物、有机酸类和醇类等。可使用其中任意两种或多种的混合物。糖可以是单糖、二糖和多糖或其任意组合。单糖可选自葡萄糖、果糖和半乳糖或其任意组合。二糖可选自蔗糖、乳糖和麦芽糖或其任意组合。多糖通常是淀粉。有机酸类可选自甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、和琥珀酸的一种或任意多种的组合。醇类可选自甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、戊醇等的一种或任意多种的组合。
本文中,氮源可以是微生物尤其是酵母发酵所用的氮源,包括但不限于酵母膏、蛋白胨、硫酸铵、氯化铵、乙酸铵、甲酸铵、丙酸铵、乳酸胺和丁酸铵中的一种或任意多种的组合。
碳源和氮源可以任何合适的形式提供。例如,对于氮源,可以铵盐如硫酸铵的形式提供。碳源和氮源可分别流加,也可作为混合物流加,只要流加后发酵液中的C/N比在本文所述范围内即可。例如,补料培养基由碳源和氮源配制。碳源和氮源可与原发酵液的碳源或氮源成分相同,也可不同。
可通过手动补料、连续补料或反馈控制来实现流加碳源和氮源,实现C/N比的控制。例如,手动补料包括:检测发酵液中的C/N比,然后根据检测结果进行补料。检测时间间隔可以为1~8小时。如前所述,当检测到发酵液中的C/N比为20~25时,可开始着手补料,以将发酵液中C/N控制在2~25、优选5~20之间。连续补料包括:按照菌种的生长情况预先设定好补料速率,由电磁阀自动补料,将发酵液中C/N控制在2~25、优选5~20之间。或者,可根据在线或离线检测,如pH检测、铵离子检测和/或硝酸根离子检测,来对发酵液中的C源和N源的比例进行控制,即反馈控制,由此可保证菌种处于最佳生长环境或使发酵处于利于产品产生的最佳条件。
本文另外一种减少发酵中的菌丝型酵母比例,增加酵母型酵母的比例的方法是控制发酵温度。更具体而言,在发酵过程中控制发酵温度为26~30℃,优选27.5℃~28.5℃。可采用常规的方法控制发酵温度。
应理解的是,可采用本文所述的四种方式中的任意一种、任意两种、任意三种或全部四种来实施本文所述的方法。例如,可先对菌种进行本文所述的多级活化,然后进行种子液配备及发酵;在发酵过程中,可单独控制发酵液的溶氧水平始终高于20%,或单独控制发酵液的C/N比始终在2~25的范围内,或单独控制发酵温度为26~30℃(优选27.5℃~28.5℃)。或者,虽然菌种未经本文所述的多级活化处理,但在发酵过程中,可单独控制发酵液的溶氧水平、C/N比或发酵温度,或控制这三者中的任意两种或全部三者。不论采用何种方式或方式的组合,均可减少发酵中的菌丝型酵母比例,提高酵母型酵母的比例。
因此,本文也提供一种发酵方法,所述方法包括上述四种方式中的任意一种、任意两种、任意三种或全部四种。本文中,整个发酵过程是分批发酵、补料分批发酵或者连续发酵。
通常,发酵时,接种量在0.5~20%的范围内,例如8~10%、10~15%或8~15%。发酵液的pH通常控制在5.5~8范围内,例如控制在6.5~7、7~7.5、7.5~8的范围内。可采用微生物常规的发酵培养基进行发酵。例如,作为示范性例子,每升发酵液通常含有蛋白胨15~25g,酵母提取物5~20g和葡萄糖15~25g,以水配制。
当补料时,补料的方式使发酵罐中的葡萄糖含量控制在0~5%的范围内,例如控制在0.1~0.5%,或者1.0~2.0%,或者2.0~3.0%,或者3.0~4.0%,或者4.0~5.0%的范围内。
应理解的是,若非采用本文所述四种方式,则可采用本领域常规的发酵条件进行。例如,若不采用本文所述的多级活化方法进行活化,而仅采用控制溶氧水平的方式进行发酵,则可采用本领域常规的活化方法、常规的发酵温度以及常规的C/N比进行发酵。以此类推,若采用本文的多级活化方法和控制发酵温度的方法,则可采用本领域常规的溶氧水平及C/N比进行发酵。
下面通过具体实施例详细描述本发明方法的具体实施方式,所述实施例不应构成对本发明范围的限制。实施例中所采用的方法和材料,除非另有说明,否则均为本领域常规的方法和材料。
实施例1:培养菌丝型和酵母型解脂耶氏酵母
所选用的菌种1(菌丝型)和菌种2(酵母型)均来自解脂耶氏酵母(Yarrowialipolytica)〔菌种来源于CICC(中国工业微生物菌种保藏管理中心),编号:32291〕。所选用的反应器为2L摇瓶和100L发酵罐。
培养基配方(每升):蛋白胨20g,酵母提取物10g,葡萄糖20g。
发酵流程:分别将菌种1和菌种2甘油管接种至2L摇瓶中,摇瓶培养24小时后接种至100L发酵罐,于100L发酵罐内培养48小时。
控制发酵条件为:
溶氧:搅拌转速100~300rpm,通气量30~60Nm3/h,罐压0.03~0.05MPa;
pH:pH=7,用5moL/L的盐酸和5moL/L的氢氧化钠进行控制;
温度:28±0.5℃;
C/N:20;
补料:补料1(葡萄糖2.5kg,定容至4.5L,115℃灭菌20min);补料2(硫酸铵300g,定容至0.5L,121℃灭菌30min);
灭菌:121℃下灭菌30分钟。
根据时间来检测OD和在线DO,在显微镜下观察细胞形态。
OD的测定:使用可见分光光度计(上海菁华722S可见分光光度计)将可见分光光度计的波长调至600nm,预热30分钟后检测,取将发酵液样品放入1cm宽的玻璃比色皿中进行检测,检测时将样品稀释至在0.2~0.6的范围之间。
在线DO的检测:使用生物反应器上安装的溶氧电极(梅特勒)进行检测。
镜检:选用显微镜型号:奥林巴斯CX41生物显微镜,40×10下观察细胞形态并拍照。
本次实验总发酵时间为3天,检测结果如图1和2所示。同样培养条件下,菌丝型酵母OD在48小时时为9.2,酵母型酵母OD在48小时时为50.3,酵母型酵母是菌丝型酵母生长速率的5.5倍,菌丝型酵母镜检显示(假)菌丝比例为62%,酵母型酵母镜检显示(假)菌丝比例为8.6%。
实施例2:对菌种进行活化处理
1、未活化菌种进行培养
所选用的菌种是解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica),选用的补料罐为5L补料瓶。
培养基配方(每升):蛋白胨20g,酵母提取物10g,葡萄糖20g。
发酵流程:将甘油管菌种接种至2L摇瓶,摇瓶培养24小时后接种至100L发酵罐。
控制发酵条件为:
溶氧:搅拌转速100~300rpm,通气量30~60Nm3/h,罐压0.03~0.05MPa;
pH:pH=7,用5moL/L的盐酸和5moL/L的氢氧化钠控制;
温度:28±0.5℃;
C/N:20;
补料:葡萄糖2.5kg,硫酸铵0.25kg定容至5L灭菌;
灭菌:121℃灭菌30分钟。
根据时间来检测OD和在线DO,在显微镜下观察细胞形态。
OD的测定:使用可见分光光度计(上海菁华722S可见分光光度计)将可见分光光度计的波长调至600nm,预热30分钟后检测,取将发酵液样品放入1cm宽的玻璃比色皿中进行检测,检测时将样品稀释至在0.2~0.6的范围之间。
在线DO的检测:使用生物反应器上安装的溶氧电极(梅特勒)进行检测。
镜检:选用显微镜型号:奥林巴斯CX41生物显微镜,40×10下观察细胞形态并拍照。
本次实验总发酵时间为11天,检测结果显示,接种发酵液在40小时溶氧为0,OD和溶氧随时间变化见图3,最高OD为57;镜检结果见图4,100L发酵罐的(假)菌丝型含量为64%。
2、活化菌种后进行培养
所选用的菌种是解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)。
培养基配方(每升):蛋白胨20g,酵母提取物10g,葡萄糖20g。
发酵流程:将甘油管菌种接种至250mL摇瓶中,通过平板-摇瓶-平板-摇瓶的方式进行活化,具体包括:
(1)将制作的甘油管菌种进行解冻,并在超净工作台上通过划线的方式接种平板(营养琼脂),27℃~32℃下倒置培养18~40小时;
(2)在超净工作台内,挑取步骤(1)中培养的平板上的单菌落,接种至250mL摇瓶中27℃~32℃下培养12~30小时;
(3)在超净工作台内,挑取步骤(2)中培养摇瓶中的菌液在平板上划线,27℃~32℃下倒置培养18~40小时。
(4)在超净工作台内,挑取步骤(3)中培养的平板上的单菌落,接种至250mL摇瓶中27℃~32℃下培养12~36小时;
(5)在超净工作台内,挑取步骤(4)中培养摇瓶中的菌液,接种至2L摇瓶中培养27℃~32℃下培养12~30小时。
之后,将步骤(5)获得的活化菌液接种至100L发酵罐,100L发酵罐培养24小时后接种至1T发酵罐发酵48小时。
控制发酵条件为:
溶氧:搅拌转速100~300rpm,通气量30~60Nm3/h,罐压0.03~0.05MPa;
pH:pH=7,用5moL/L的盐酸和5moL/L的氢氧化钠控制;
温度:28±0.5℃;
C/N:20;
补料:葡萄糖2.5kg,硫酸铵0.25kg定容至5L灭菌;
灭菌:121℃灭菌30分钟。
根据时间来检测OD和在线DO,在显微镜下观察细胞形态。
OD的测定:使用可见分光光度计(上海菁华722S可见分光光度计)将可见分光光度计的波长调至600nm,预热30分钟后检测,取将发酵液样品放入1cm宽的玻璃比色皿中进行检测,检测时将样品稀释至在0.2~0.6的范围之间。
在线DO的检测:使用生物反应器上安装的溶氧电极(梅特勒)进行检测。
镜检:选用显微镜型号:奥林巴斯CX41生物显微镜,40×10下观察细胞形态并拍照。
本次发酵耗时6天,检测结果显示,接种发酵液在14小时溶氧为0,OD随时间变化见图5,最高OD为126;镜检结果见图6,活化过程中(假)菌丝型变化情况为60%—>24%—>3.6%。100L发酵罐中(假)菌丝型比例为1.6%。
未活化菌种培养和活化菌种培养结果的比较:
至发酵结束(即溶氧值开始增加),未活化菌种培养耗时11天,活化菌种培养耗时6天,活化后节省时间45.4%。
未活化菌种发酵最高OD为57;活化菌种发酵最高OD为126,是未活化菌种发酵的2.2倍。
100L发酵罐中未活化菌种的(假)菌丝型为64%,活化后菌种的(假)菌丝型为1.6%。
实施例3:通过提高溶氧(DO)减少菌丝型酵母产生
所选用的对照组和实验组的菌种均为是解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)甘油管,对照组选用的发酵罐为常规的1T搅拌罐,实验组选用的发酵罐为改造搅拌桨和气体分布器后的1T搅拌罐。选用的补料罐为200L搅拌罐。
培养基配方(每升):蛋白胨20g,酵母提取物10g,葡萄糖20g。
发酵流程:将甘油管菌种接种至2L摇瓶,培养24小时后接种至100L发酵罐,培养24小时后接种至1T发酵罐发酵。
控制发酵条件为:
对照组溶氧控制:搅拌转速100~300rpm,通气量30~60Nm3/h,罐压0.03~0.05MPa;
实验组溶氧控制:搅拌转速100~300rpm,通气量30~96Nm3/h,罐压0.03~0.05MPa;
pH控制:pH=7,用5moL/L的盐酸和5moL/L的氢氧化钠控制;
温度:28±0.5℃;
C/N:20;
补料1:葡萄糖80kg,定容至160L灭菌;
补料2:硫酸铵80kg,定容至160L灭菌;
灭菌:121℃灭菌30分钟。
根据时间来检测OD和在线DO,在显微镜下观察细胞形态。
OD的测定:使用可见分光光度计(上海菁华722S可见分光光度计)将可见分光光度计的波长调至600nm,预热30分钟后检测,取将发酵液样品放入1cm宽的玻璃比色皿中进行检测,检测时将样品稀释至在0.2~0.6的范围之间。
在线DO的检测:使用生物反应器上安装的溶氧电极(梅特勒)进行检测。
镜检:选用显微镜型号:奥林巴斯CX41生物显微镜,40×10下观察细胞形态并拍照。
本次实验检测结果显示,溶氧随时间变化见图7,对照组溶氧为0,实验组最低溶氧在20%;镜检结果见图8,实验组(假)菌丝型酵母比例为7.0%,对照组(假)菌丝型酵母比例为40%。
实施例4:通过调整C/N减少菌丝型酵母产生
所选用的对照组和实验组的菌种均为是解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)甘油管,所选用的发酵罐为常规的1T搅拌罐。选用的补料罐为200L搅拌罐。
培养基配方(每升):蛋白胨20g,酵母提取物10g,葡萄糖20g。
发酵流程:将甘油管菌种接种至2L摇瓶,培养24小时后接种至100L发酵罐,培养24小时后接种至1T发酵罐发酵。
控制发酵条件为:
溶氧:搅拌转速100~300rpm,通气量30~60Nm3/h,罐压0.03~0.05MPa;
pH:pH=7,用5moL/L的盐酸和5moL/L的氢氧化钠控制;
温度:28±0.5℃;
对照组控制C/N:30(培养基中C/N比例,补料中葡萄糖和硫酸铵流加速率的控制);
实验组控制C/N:15(培养基中C/N比例,补料中葡萄糖和硫酸铵流加速率的控制);
补料1:葡萄糖80kg,定容至160L灭菌;
补料2:硫酸铵80kg,定容至160L灭菌;
灭菌:121℃灭菌30分钟。
根据时间来检测OD和在线DO,在显微镜下观察细胞形态。
OD的测定:使用可见分光光度计(上海菁华722S可见分光光度计)将可见分光光度计的波长调至600nm,预热30分钟后检测,取将发酵液样品放入1cm宽的玻璃比色皿中进行检测,检测时将样品稀释至在0.2~0.6的范围之间。
在线DO的检测:使用生物反应器上安装的溶氧电极(梅特勒)进行检测。
镜检:选用显微镜型号:奥林巴斯CX41生物显微镜,40×10下观察细胞形态并拍照。
葡萄糖检测:选用液相色谱仪型号:安捷伦LC1260,每隔八小时取样检测。
含氮量的检测:需用凯氏定氮仪型号:欧莱博OLB9830A,每隔八小时取样检测。
本次实验检测结果显示,OD随时间变化见图9,对照组最高OD为80,实验组最高OD为132;C/N随时间变化见图10,对照组控制在30~35,实验组控制在15~20;镜检结果见图11,对照组(假)菌丝型酵母比例为53%,实验组(假)菌丝型酵母比例为10%。
实施例5:通过控制发酵温度减少菌丝型酵母产生
所选用的对照组和实验组的菌种均为是解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)甘油管,所选用的发酵罐为常规的1T搅拌罐。选用的补料罐为200L搅拌罐。
培养基配方(每升):蛋白胨20g,酵母提取物10g,葡萄糖20g。
发酵流程:将甘油管菌种接种至2L摇瓶,培养24小时后接种至100L发酵罐,培养24小时后接种至1T发酵罐发酵。
控制发酵条件为:
溶氧:搅拌转速100~300rpm,通气量30~60Nm3/h,罐压0.03~0.05MPa;
pH:pH=7,用5moL/L的盐酸和5moL/L的氢氧化钠控制;
对照组温度:25±0.5℃;
实验组温度:28±0.5℃;
C/N:20;
补料1:葡萄糖80kg,定容至160L灭菌;
补料2:硫酸铵80kg,定容至160L灭菌;
灭菌:121℃灭菌30分钟。
根据时间来检测OD和在线DO,在显微镜下观察细胞形态。
OD的测定:使用可见分光光度计(上海菁华722S可见分光光度计)将可见分光光度计的波长调至600nm,预热30分钟后检测,取将发酵液样品放入1cm宽的玻璃比色皿中进行检测,检测时将样品稀释至在0.2~0.6的范围之间。
在线DO的检测:使用生物反应器上安装的溶氧电极(梅特勒)进行检测。
镜检:选用显微镜型号:奥林巴斯CX41生物显微镜,40×10下观察细胞形态并拍照。
本次实验检测结果显示,镜检结果见图12,对照组(假)菌丝型酵母比例为60%,实验组(假)菌丝型酵母比例为3.3%。
实施例6:整体优化发酵条件减少菌丝型酵母
1、对照组发酵
所选用的菌种是解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica),选用的补料罐为5L补料瓶。
培养基配方(每升):蛋白胨20g,酵母提取物10g,葡萄糖20g。
发酵过程:摇瓶培养24小时,接种至100L发酵罐,100L发酵罐培养24小时后接种至1T发酵罐发酵48小时。
控制发酵条件为:
溶氧:搅拌转速50~150rpm,通气量30~60Nm3/h,罐压0.03~0.05MPa;
pH:pH=7,用5moL/L的盐酸和5moL/L的氢氧化钠控制;
温度:28±0.5℃;
C/N:20;
补料1:葡萄糖80kg,定容至160L灭菌;
补料2:硫酸铵80kg,定容至160L灭菌;
灭菌:121℃灭菌30分钟。
根据时间来检测OD和在线DO,在显微镜下观察细胞形态。
OD的测定:使用可见分光光度计(上海菁华722S可见分光光度计)将可见分光光度计的波长调至600nm,预热30分钟后检测,取将发酵液样品放入1cm宽的玻璃比色皿中进行检测,检测时将样品稀释至在0.2~0.6的范围之间。
在线DO的检测:使用生物反应器上安装的溶氧电极(梅特勒)进行检测。
镜检:选用显微镜型号:奥林巴斯CX41生物显微镜,40×10下观察细胞形态并拍照。
本次实验总发酵时间为4天,检测结果显示,接种发酵液在20小时溶氧为0,最高OD为57,发酵过程中OD结果见图13,镜检结果(稀释20倍)见图,镜检发现发酵罐中(假)菌丝型含量为42%。
2、实验组发酵
所选用的菌种是解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica),菌种提前进行活化。活化过程如下,但不计入发酵时间。
培养基配方(每升):蛋白胨20g,酵母提取物10g,葡萄糖20g。
活化过程:将甘油管菌种接种至250mL摇瓶中,通过平板-摇瓶-平板-摇瓶的方式进行活化:
(1)将制作的甘油管菌种进行解冻,并在超净工作台上通过划线的方式接种平板(营养琼脂),27℃~32℃下倒置培养18~40小时;
(2)在超净工作台内,挑取步骤(1)中培养的平板上的单菌落,接种至250mL摇瓶中27℃~32℃下培养12~30小时;
(3)在超净工作台内,挑取步骤(2)中培养摇瓶中的菌液在平板上划线,27℃~32℃下倒置培养18~40小时。
(4)在超净工作台内,挑取步骤(3)中培养的平板上的单菌落,接种至250mL摇瓶中27℃~32℃下培养12~36小时;
(5)在超净工作台内,挑取步骤(4)中培养摇瓶中的菌液,接种至2L摇瓶中培养27℃~32℃下培养。
发酵过程:步骤(5)摇瓶培养12小时后,接种至100L发酵罐,100L发酵罐培养20小时后接种至1T发酵罐发酵48小时。
控制发酵条件为:
溶氧:搅拌转速100~300rpm,通气量30~96Nm3/h,罐压0.03~0.05MPa;
pH:pH=7,用5moL/L的盐酸和5moL/L的氢氧化钠控制;
温度:28±0.5℃;
C/N:15;
补料1:葡萄糖80kg,定容至160L灭菌;
补料2:硫酸铵80kg,定容至160L灭菌;
灭菌:121℃灭菌30分钟。
根据时间来检测OD和在线DO,在显微镜下观察细胞形态。
OD的测定:使用可见分光光度计(上海菁华722S可见分光光度计)将可见分光光度计的波长调至600nm,预热30分钟后检测,取将发酵液样品放入1cm宽的玻璃比色皿中进行检测,检测时将样品稀释至在0.2~0.6的范围之间。
在线DO的检测:使用生物反应器上安装的溶氧电极(梅特勒)进行检测。
镜检:选用显微镜型号:奥林巴斯CX41生物显微镜,40×10下观察细胞形态并拍照。
本次发酵耗时3.3天,检测结果显示,接种发酵液在48小时后溶氧不为0,最高OD为184;发酵过程中OD结果见图13,镜检结果(稀释200倍)见图14,镜检发现发酵罐中(假)菌丝型含量为1.3%。
对照组发酵和实验组发酵结果的比较:
本实验设计的原理是综合菌种(是否活化)、溶氧、C/N等条件进行发酵比较。对照组设计的发酵条件参考酵母常规的发酵条件,实验组设计的发酵条件是经过优化后的发酵条件。
对照组发酵最高OD为57;实验组发酵最高OD为184,是对照组发酵的3.2倍。
对照组的(假)菌丝型为42%,实验组的(假)菌丝型为1.3%。
Claims (10)
1.一种减少二型性微生物菌丝型细胞、增加酵母型细胞的生产方法,其特征在于,所述方法包括,在所述微生物的发酵步骤中,
(1)将发酵过程中的溶氧水平控制在20%以上;和/或
(2)将发酵过程中发酵液中的碳的总含量与氮的总含量的比值,即C/N比,控制在2~25、优选5~20、更优选5~15的范围内,其中,所述含量以质量百分比计;和/或
(3)将发酵温度控制在26~30℃,优选27.5℃~28.5℃的范围内。
2.如权利要求1所述的方法,其特征在于,通过增加搅拌速率和/或通气量,或通过以下方式中的一种或两种的组合来将发酵过程中的溶氧水平控制在20%以上:
(1)搅拌方式;和
(2)进气方式;
优选地,通过增大搅拌桨的规格和/或改变搅拌桨形状来改变搅拌方式,从而将发酵过程中的溶氧水平控制在20%以上;优选地,所述改变搅拌桨形状包括将剪切力小的搅拌桨替换成剪切力相对而言提高的搅拌桨,或将六直叶圆盘涡轮式改为六弧叶圆盘涡轮式或六折叶圆盘涡轮式搅拌桨;或
通过将单管进气改变为气体分布器进气,从而将发酵过程中的溶氧水平控制在20%以上。
3.如权利要求1或2所述的方法,其特征在于,通过调整发酵过程中流加的碳源和氮源的速度控制发酵液中的C/N比;
优选地,所述调整由手动补料、连续补料或反馈控制来实现;
其中,所述手动补料包括:检测发酵液中的C/N比,和根据检测结果补料;其中,检测时间间隔为1~8小时;
所述连续补料包括:按照菌种的生长情况预先设定好补料速率,由电磁阀自动补料;和
所述反馈控制包括:根据在线或离线检测pH、铵离子和/或硝酸根离子的结果来对发酵液中的C/N比进行调整;
优选地,补料的方式使发酵罐中的葡萄糖含量控制在0~5%的范围内,例如控制在0.1~0.5%,或者1.0~2.0%,或者2.0~3.0%,或者3.0~4.0%,或者4.0~5.0%的范围内。
4.如权利要求3所述的方法,其特征在于,
所述碳源为糖和糖的衍生物、有机酸类、醇类;优选地,所述糖类选自单糖、二糖和多糖或其任意组合,所述单糖选自葡萄糖、果糖和半乳糖或其任意组合,所述二糖选自蔗糖、乳糖和麦芽糖或其任意组合,所述多糖为淀粉;所述有机酸类选自甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、和琥珀酸的一种或任意多种的组合;所述醇类选自甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、戊醇等的一种或任意多种的组合;
所述氮源选自酵母膏、蛋白胨、硫酸铵、氯化铵、乙酸铵、甲酸铵、丙酸铵、乳酸胺和丁酸铵中的一种或任意多种的组合。
5.如权利要求1-4中任一项所述的方法,其特征在于,所述方法包括以下一个或多个特征:
所述发酵为分批发酵、补料分批发酵或者连续发酵;
所述微生物为酵母,选自:解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)、产朊假丝酵母(Candida utilis)、热带假丝酵母(Candida tropicalis)、酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、球拟酵母(Torulopsisutilis)、拟热带假丝酵母(Candidapseudotropicalis)、季也蒙假丝酵母果生变种(Candida guilliermondiivar.carpophila)、近平滑假丝酵母(Candida parapsilosis)、土生假丝酵母(Candidahumicola)、克鲁斯假丝酵母(Candida krusei)、葡萄牙假丝酵母(Candida lusitaniae)、近平滑假丝酵母(Candida parapsilosis)、麦芽糖假丝酵母(Candida maltosa)、解脂假丝酵母解脂变种(Candida lipolytica var.lipolytica)、马其顿假丝酵母(Candidamacedoniensis)、休哈塔假丝酵母(Candida shehatae)、中间假丝酵母(Candidaintermedia)、涎沫假丝酵母(Candida zeylanoides)、白假丝酵母(Candida albicans)、博伊丁假丝酵母(Candida boidinii)、口津假丝酵母(Candida melibiosica)、冻胶假丝酵母(Candida gelida)、发皮安假丝酵母(Candida fabianii)、树状假丝酵母(Candidacerevisiae)、皱褶假丝酵母(Candida rugosa)、朗比可假丝酵母(Candida lambica)、枣椰假丝酵母(Candida dattila)、奶酪假丝酵母(Candida butyri)、歧异假丝酵母(Candidadiversa)、橄榄假丝酵母(Candida oleophila)、丘陵假丝酵母(Candida colliculosa)、克瑞斯假丝酵母(Candida krissii)、弗里思假丝酵母(Candida freyschussii)、山梨木糖假丝酵母(Candida sorboxylosa)、化脂假丝酵母(Candida steatolytica)、白假丝酵母(Candida albicans)、挪威假丝酵母(Candida norvegensis)、乳酒假丝酵母(Candidakefyr)、皮状假丝酵母(Candida pelliculosa)、季也蒙假丝酵母(Candidaguilliermondii)、斯达氏油脂酵母(Lipomycesstarkeyi)、茁芽丝孢酵母(Trichospironpullulans)、产油油脂酵母(Lipomyceslipofer)、胶粘红酵母(Rhodotorulagiutinis)、类酵母红冬孢(Rhodosporidiumtoruloides)和园拟酵母(Torulautilis);
发酵液的pH值控制在5.5~8范围内,例如控制在6.5~7、7~7.5、7.5~8的范围内;
每升发酵液中包括蛋白胨15~25g,酵母提取物5~20g,葡萄糖15~25g;和
发酵接种量为0.5~20%,例如8~10%、10~15%或8~15%。
6.如权利要求1-5中任一项所述的方法,其特征在于,所述方法还包括对菌种进行多级活化的步骤;其中,所述多级活化包括进行至少一次平板培养和一次摇瓶培养,优选地,循环重复平板培养和摇瓶培养2~4次;更优选地,所述多级活化包括依次包括平板培养、摇瓶培养、平板培养和摇瓶培养,或依次包括摇瓶培养、平板培养、摇瓶培养和平板培养。
7.如权利要求6所述的方法,其特征在于,
所述平板培养包括将菌种接种平板,在27~32℃下倒置培养的步骤;优选地,倒置培养的时间为18~40小时;
所述摇瓶培养包括,将平板培养活动的单菌落接种至摇瓶中,在27~32℃下培养的步骤;优选地,摇瓶培养的时间为12~36小时。
8.一种微生物发酵方法,所述方法包括采用权利要求1-7中任一项所述的方法进行发酵的步骤。
9.一种微生物活化的方法,其特征在于,所述方法包括对解冻的微生物菌种进行至少一次平板培养和一次摇瓶培养;优选地,循环重复平板培养和摇瓶培养2~4次;更优选地,所述多级活化包括依次包括平板培养、摇瓶培养、平板培养和摇瓶培养,或依次包括摇瓶培养、平板培养、摇瓶培养和平板培养。
10.如权利要求9所述的方法,其特征在于,
所述平板培养包括将菌种接种平板,在27~32℃下倒置培养的步骤;优选地,倒置培养的时间为18~40小时;
所述摇瓶培养包括,将平板培养活动的单菌落接种至摇瓶中,在27~32℃下培养的步骤;优选地,摇瓶培养的时间为12~36小时。
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