CN105018360B - 一种酿酒酵母诱变菌株及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种酿酒酵母诱变菌株及其应用。本发明的酿酒酵母诱变菌株的保藏编号为CGMCC 10572。通过实验证明：酿酒酵母CGMCC No.10572可以显著增强双乙酰的还原能力、提高挥发性酯类物质含量、降低高级醇含量、提高啤酒的风味品质，不仅探索了将航天诱变应用于酿造酵母选育的新方法，而且开创了将航天诱变育种运用于啤酒生产过程的先例。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种酿酒酵母诱变菌株及其应用。
背景技术
航天育种也称空间诱变育种，是利用高空气球、返回式卫星、飞船等航天器将作物种子、组织、器官或生命个体搭载到宇宙空间，利用宇宙空间特殊的环境使生物基因产生变异，并经过地面选育获得稳定的生理和遗传性状，从中筛选出优良菌株的过程。
在啤酒生产领域，如何提高啤酒的品质、缩短发酵周期、降低生产成本以及减少对环境的污染都是啤酒生产企业重要的科研目标。通过对啤酒酿造酵母进行选育改良，也是实现上述目标的渠道之一。当前，常用的微生物改良手段主要有：紫外线诱变、离子注入诱变、原生质体融合、基因工程等，但上述方法应用于食品行业的菌种改良存在“食品安全”的风险，一般不被食品企业采用。
发明内容
本发明的第一个目的是提供一种酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)菌株。
本发明提供的酿酒酵母菌株的保藏编号为CGMCC No.10572。
本发明的第二个目的是提供上述酿酒酵母菌株的新用途。
本发明提供了上述酿酒酵母菌株在如下(1)-(5)中至少一种中的应用：
(1)生产啤酒；
(2)提高啤酒中挥发性酯类物质的含量；
(3)降低啤酒中高级醇的含量；
(4)降低啤酒中醇酯比；
(5)增强啤酒中羰基化合物的还原能力；
所述增强啤酒中羰基化合物的还原能力具体体现在降低啤酒中羰基化合物的产量。
上述应用中，所述羰基化合物为乙醛和/或双乙酰；所述挥发性酯类物质为乙酸乙酯；所述高级醇为异戊醇和/或正丙醇。
本发明的第三个目的是提供一种产品。
本发明提供的产品的活性成分为上述酿酒酵母菌株；所述产品的用途为如下(1)-(5)中至少一种：
(1)生产啤酒；
(2)提高啤酒中挥发性酯类物质的含量；
(3)降低啤酒中高级醇的含量；
(4)降低啤酒中醇酯比；
(5)增强啤酒中羰基化合物的还原能力；
所述增强啤酒中羰基化合物的还原能力具体体现在降低啤酒中羰基化合物的产量。
上述产品中，所述羰基化合物为乙醛和/或双乙酰；所述挥发性酯类物质为乙酸乙酯；所述高级醇为异戊醇和/或正丙醇。
本发明还有一个目的是提供一种发酵上述酿酒酵母菌株的方法。
本发明提供的发酵上述酿酒酵母菌株的方法包括如下步骤：将上述酿酒酵母菌株接种于麦汁培养基中，发酵培养。
上述方法中，所述发酵培养的温度为10℃；所述发酵培养时间为10天；所述酿酒酵母菌株接种于麦汁培养基中的初始浓度为(14-18)×106个/mL。
上述方法中，所述麦汁培养基是将麦汁(燕京啤酒股份有限公司)进行灭菌处理后得到的。
本发明的最后一个目的是提供上述方法制备得到的发酵物。
上述发酵物在如下(1)-(5)中至少一种中的应用也属于本发明的保护范围：
(1)生产啤酒；
(2)提高啤酒中挥发性酯类物质的含量；
(3)降低啤酒中高级醇的含量；
(4)降低啤酒中醇酯比；
(5)增强啤酒中羰基化合物的还原能力；
所述增强啤酒中羰基化合物的还原能力具体体现在降低啤酒中羰基化合物的产量。
上述应用中，所述羰基化合物为乙醛和/或双乙酰；所述挥发性酯类物质为乙酸乙酯；所述高级醇为异戊醇和/或正丙醇。
本发明依托于酿酒酵母CGMCC No.1784成功搭载神舟十号完成航天诱变，诱变后经过分离和筛选得到诱变菌株——酿酒酵母CGMCC No.10572。通过实验证明：酿酒酵母CGMCC No.10572可以显著增强双乙酰的还原能力、提高挥发性酯类物质含量、降低高级醇含量、提高啤酒的风味品质，不仅探索了将航天诱变应用于酿造酵母选育的新方法，而且开创了将航天诱变育种运用于啤酒生产过程的先例。
附图说明
图1为航天育种菌种携带方式。
保藏说明
菌种名称：酿酒酵母
拉丁名：Saccharomyces cerevisiae
菌株编号：YJ0001C030201-0
保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
保藏机构简称：CGMCC
地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所
保藏日期：2015年03月02日
保藏中心登记入册编号：CGMCC No.10572
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
麦汁培养基的制备方法：将麦汁(燕京啤酒股份有限公司)进行灭菌处理，得到麦汁培养基。
麦汁琼脂培养基的制备方法：在液体麦汁培养基中加2％的琼脂粉，得到麦汁琼脂培养基。
实施例1、酿酒酵母CGMCC No.10572的获得
一、酿酒酵母CGMCC No.1784的获得及鉴定
1、酵母菌株8902的分离
(1)在无菌的条件下取得生产发酵过程中发酵性能指标优良的酵母菌种发酵液。
(2)使用无菌生理盐水将上述发酵液进行适当梯度稀释，将各稀释液在麦汁琼脂培养基平板上进行涂布分离，25℃恒温培养3天。
(3)选取上述培养基平板上分离效果良好、菌落特征优良的单菌落，在麦汁琼脂培养基平板上划线分离，25℃恒温培养3天，重复操作2-3次，获得酵母菌株8902。
2、酵母菌株8902的形态鉴定
(1)菌落特征
酵母菌株8902的菌落特征：在麦汁琼脂培养基上培养3天后，呈乳白色圆形菌落，菌落表面光滑，隆起处呈1mm半球形，质地呈固态、较粘稠。
(2)细胞形态特征
菌种培养48h后镜检：细胞呈椭圆形，大小为长轴×短轴＝(10-11)×(8-9)μm。
3、酵母菌株8902的分子鉴定
酵母菌株8902经Biolog细菌鉴定仪溯源鉴定为：酵母属酿酒酵母，其拉丁文名为：Saccharomyces cerevisiae。综合以上鉴定和分析，酵母菌株8902的分类命名为酿 酒酵母，该菌株已于2006年08月22日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏号为CGMCC No.1784。
4、航天诱变育种携带方式的确定
(1)酿酒酵母CGMCC No.1784的培养温度的确定
A、在不同温度下对菌种进行培养
将上述步骤3分离纯化的酿酒酵母CGMCC No.1784的活化液稀释为3个浓度；分别使用麦汁琼脂培养基浇注于试管中，其中半数试管做成斜面，半数试管直接浇注；分别将每一浓度的试管均分为三组，分别于4℃、室温(25℃)和36℃下培养。每周进行称重观察。
B、在不同温度下酿酒酵母CGMCC No.1784的培养结果
1)4℃条件下的培养结果
在4℃培养存放的条件下2周时，酵母浓度最低的样品中开始有较小的菌落生长。其中相同浓度中有个别样品中开始有菌落生长，但无规律性。各支试管质量下降不明显。存放到4-6周，各支已有菌落生长的试管样品中菌落大小适中，呈乳白色，试管质量下降0.1g左右。其余样品仍无菌落生长，且无明显质量变化。未见直接浇注和摆放斜面的样品存在明显差异。
2)室温(25℃)条件下的培养结果
室温条件下存放的试管，酵母浓度最低的样品在1周时开始有酵母菌落生长，且培养基与试管内壁略有分离，每支试管质量下降0.12g左右。随培养存放时间的延长，菌落颜色逐渐加深，试管质量略有下降，培养基与试管壁的脱离面积逐渐加大。到6周时，菌落加深为褐色，质量下降0.13g左右，培养基仍未与试管壁完全脱离。未见直接浇注和摆放斜面的样品存在明显差异。
3)36℃条件下的培养结果
36℃培养存放的所有试管样品均无菌落生长，存放到5周后，所有斜面样品的培养基开始与试管脱离，质量出现较明显下降(0.1g左右)。仍无其他现象出现。
经过上述在不同温度下的培养结果可以看出：酿酒酵母CGMCC No.1784在低温条件下培养时，菌落生长缓慢，缺乏及时性；酿酒酵母CGMCC No.1784在较高温度条件下培养时，耐受力差。因此，酿酒酵母CGMCC No.1784的最佳培养温度为25℃。
(2)酿酒酵母CGMCC No.1784的存放温度的确定
A、在不同温度下存放酿酒酵母CGMCC No.1784
使用麦汁琼脂培养基在冻存管中制备微小斜面培养基；在25℃条件下将实施例1分离得到的酿酒酵母CGMCC No.1784在微小斜面培养基上进行培养，使菌落生长到 正常，并分别于4℃和室温(25℃)条件下存放。每周进行称重观察。
B、在不同温度下存放的结果
1)在4℃条件下存放的结果
在4℃存放3周的条件下，已经生长的酿酒酵母CGMCC No.1784的菌落颜色缓慢加深为微黄色，各支试管失重0.14g左右，培养基与试管内壁部分脱离。
2)在25℃条件下存放的结果
室温条件下存放到3周时，酿酒酵母CGMCC No.1784的菌落形态和培养基状况与4℃形似，各支试管失重情况较高，为0.2g左右。
经过上述在不同温度下的存放结果可以看出：酿酒酵母CGMCC No.1784在小斜面上接种，待其成熟后4℃保存，菌种活力不受影响，培养基无明显改变，且采用在斜面表面接种的方式有利于菌种的挑取、分离。因此，酿酒酵母CGMCC No.1784的最佳存放温度为4℃。
5、航天诱变育种的携带方式的确定
从上述步骤一和步骤二的结果可以看出航天诱变育种的最佳携带方式：使用菌种冻存管制备微小斜面培养基，将待诱变的酵母菌株CGMCC No.1784接种于微小斜面培养基的表面，25℃培养至菌落成熟，4℃条件下保存备用(如图1所示)。
二、酿酒酵母CGMCC No.10572的获得及应用
1、诱变菌种的获得
用步骤一的5中确定的菌种携带方式携带酿酒酵母CGMCC No.1784进行航天诱变。具体步骤如下：于2013年5月28日，将酿酒酵母CGMCC No.1784送至中国空间技术研究所；于2013年6月11日搭载神舟十号飞船发射太空；经太空15天航程后，于6月26日成功返航；于2013年7月2日，中国空间技术研究所与本公司技术中心完成了诱变后的菌种交接，至此酿酒酵母CGMCC No.1784完成航天诱变过程，得到诱变菌种。
2、诱变菌种的分离
将步骤1获得的诱变菌种采用涂布分离法进行分离，具体步骤如下：
1)将生长在微小斜面上的诱变菌种的菌苔用无菌生理盐水进行洗脱，得到洗脱液。
2)将洗脱液进行适当稀释，并滴于麦汁平板固体培养基上，使用无菌三角耙进行均匀涂布，25℃条件下恒温培养72h。
3)挑取平板培养基上的单菌落(菌落数20-30个)，划线接种于麦汁斜面培养基上，25℃条件下恒温培养48h，暂时保藏，待筛选。
3、诱变菌株的获得
采用三角瓶发酵法对经过步骤二分离培养的诱变菌种进行筛选比对，具体步骤如下：
(1)发酵培养
将步骤2分离的各待筛选的诱变菌种接种于盛有350mL麦汁培养基(14°P)的三角瓶中，并安装使用硫酸液封的发酵栓，10℃恒温发酵培养(初始酵母接种量控制在15×106个/mL左右)，得到发酵液。发酵过程中，每天进行摇瓶排除CO2并称量CO2失重量，待CO2失重量小于0.2g时即表示发酵结束。发酵结束后，将发酵液经低温贮酒、过滤后，即可将其灌装为成品啤酒。
(2)菌种的筛选比对
发酵10d后比对各待选诱导后的发酵液的风味指标(乙醛、二甲基硫、乙酸乙酯、异戊醇等)和理化指标(原浓、发酵度、双乙酰等)。并以酿酒酵母CGMCC No.1784作为对照菌株，淘汰其中发酵异常、主要考察指标劣于对照菌株的样品。
结果如表1所示：最终保留一株双乙酰含量降低而其他主要指标未发生显著改变的酿酒酵母突变株，分类命名为酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae，该菌株已于2015年03月02日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏号为CGMCCNo.10572。
表1、航天诱变菌株性能指标比对
通过分子和形态鉴定结果表明：酿酒酵母CGMCC No.10572和酿酒酵母CGMCCNo.1784无显著性差异。其中，酿酒酵母CGMCC No.10572的26SrRNA序列如序列表中序列1所示。
4、诱变菌株的保藏
采用真空冷冻干燥的方法将经过航天诱变后分离筛选得到的性能提高的酿酒酵母CGMCC No.10572进行长期保藏。具体步骤如下：使用20％无菌脱脂牛奶洗脱酵母菌苔，然后分装于无菌安瓿管中，在真空冷冻干燥机中进行冷冻干燥，经抽真空后熔封，进行长期保藏。
实施例2、酿酒酵母突变株CGMCC No.10572的功能研究
1、发酵
将实施例1的步骤二中的3获得的酿酒酵母突变株CGMCC No.10572以初始浓度18×106个/mL接种于盛有350mL麦汁培养基(14°P)的三角瓶中，并安装使用硫酸液封的发酵栓，10℃恒温发酵培养(初始酵母接种量控制在15×106个/mL左右)，10天收集酿酒酵母突变株CGMCC No.10572的发酵液。发酵过程中，每天进行摇瓶排除CO2并称量CO2失重量，待CO2失重量小于0.2g时即表示发酵结束。以酿酒酵母CGMCC No.1784为对照，得到酿酒酵母CGMCC No.1784的发酵液。
2、发酵产物的检测
分别检测酿酒酵母CGMCC No.10572的发酵液和酿酒酵母CGMCC No.1784的发酵液的理化和风味指标，检测方法参照文献“18°P高浓酿造抗葡萄糖阻遏效应啤酒酵母的选育，食品与发酵工业，2015，4”中的方法。
酿酒酵母CGMCC No.10572与酿酒酵母CGMCC No.1784的主要指标对比情况如表1所示。从表1中的理化指标数据可以看出：酿酒酵母CGMCC No.10572和酿酒酵母CGMCCNo.1784的原浓、酒精度和发酵度的检测数据接近，且发酵液的总酸和pH值无明显差异；但双乙酰含量差异比较明显，酿酒酵母CGMCC No.10572的双乙酰含量比酿酒酵母CGMCCNo.1784降低了54.5％，由此可以看出经过航天诱变得到的酿酒酵母CGMCC No.10572可以显著增强双乙酰的还原能力。
从表1中的风味指标数据可以看出：酿酒酵母CGMCC No.10572发酵液的各风味指标均发生了不同程度的变化，主要变化在于：酿酒酵母CGMCC No.10572的乙醛含量比酿酒酵母CGMCC No.1784下降10.7％、乙酸乙酯的含量比酿酒酵母CGMCC No.1784高12.1％、正丙醇的含量比酿酒酵母CGMCC No.1784低12.3％、异丁醇的含量 比酿酒酵母CGMCCNo.1784高7.8％、醇酯比比酿酒酵母CGMCC No.1784低10.3％。酿酒酵母CGMCC No.10572的发酵液整体表现为：挥发性酯类物质含量提高、高级醇含量降低，提高了啤酒的风味品质。
Claims (7)
1.一种酿酒酵母菌株，其保藏编号为CGMCC No.10572。
2.权利要求1所述的酿酒酵母菌株在如下（1）-（5）中至少一种中的应用：
（1）生产啤酒；
（2）提高啤酒中挥发性酯类物质的含量；
（3）降低啤酒中高级醇的含量；
（4）降低啤酒中醇酯比；
（5）增强啤酒中羰基化合物的还原能力；
所述增强啤酒中羰基化合物的还原能力具体体现在降低啤酒中羰基化合物的产量。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述羰基化合物为乙醛和/或双乙酰；所述挥发性酯类物质为乙酸乙酯；所述高级醇为异戊醇和/或正丙醇。
4.一种产品，其活性成分为权利要求1所述的酿酒酵母菌株；所述产品的用途为如下（1）-（5）中至少一种：
（1）生产啤酒；
（2）提高啤酒中挥发性酯类物质的含量；
（3）降低啤酒中高级醇的含量；
（4）降低啤酒中醇酯比；
（5）增强啤酒中羰基化合物的还原能力；
所述增强啤酒中羰基化合物的还原能力具体体现在降低啤酒中羰基化合物的产量。
5.根据权利要求4所述的产品，其特征在于：所述羰基化合物为乙醛和双乙酰；所述挥发性酯类物质为乙酸乙酯；所述高级醇为异戊醇和正丙醇。
6.一种发酵权利要求1所述的酿酒酵母菌株的方法，包括如下步骤：将权利要求1所述的酿酒酵母菌株接种于麦汁培养基中，发酵培养。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述发酵培养的温度为10℃；所述发酵培养时间为10天；
所述酿酒酵母菌株接种于麦汁培养基中的初始浓度为（14-18）×106 个/mL。
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