CN114015594B - 一种东京芽孢杆菌及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种东京芽孢杆菌及其应用。该菌种保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏单位地址：中国.武汉.武汉大学，保藏时间为2021年07月13日，保藏编号为CCTCC NO：M2021872。本发明筛选得到的东京芽孢杆菌(Bacillus toyonensis)AB2RH05‑2能发酵产生丁酸，尤其在本发明优化的发酵条件下高产丁酸。

Description

一种东京芽孢杆菌及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种东京芽孢杆菌及其应用。
背景技术
白酒为中国特有的一种蒸馏酒，是世界六大蒸馏酒之一，由淀粉或糖质原料制成酒醅或发酵后经蒸馏而得。白酒的香型主要分为：浓香型、酱香型、清香型、米香型和其他香型等，白酒香味成分种类繁多、复杂，各种香味成分之间通过相互复合、平衡和缓冲作用，构成了不同香型白酒的典型风格。其中，酸既有香气又是呈味物质，与其他香味成分共同组成白酒所特有的芳香，酒中的酸主要是乙酸、己酸、乳酸及丁酸，在不同酒中所占比例不同，其能使酒体变得协调醇厚、绵软、回味悠长。
作为影响白酒风味的四大酸之一的丁酸，主要由窖泥中的丁酸菌发酵产生，其含量在一定范围内决定了白酒的风味及品质。目前大部分丁酸菌被认为属于梭状芽孢杆菌，袁华伟等人筛得一株产丁酸的酪酸梭菌(Clostridium butyricum)产量为3.44g/L，薛正楷等人筛得一株产丁酸的速生梭菌(Clostridium celerecrescens)丁酸产量为3.8g/L。然而，在实际白酒酿造中依然需要丁酸产量更高的菌株，来解决白酒发酵中丁酸含量低的问题，因此选育优良的产丁酸菌株，获的更高的丁酸产量，依然是白酒产业研究的重点。
发明内容
针对现有技术中的上述不足，本发明提供一种东京芽孢杆菌及其应用，本发明获得了一株能够高产丁酸的菌株—东京芽孢杆菌(Bacillus toyonensis)AB2RH05-2，能够在优化的条件下发酵高产丁酸，以解决现有产丁酸菌产量低的问题。
为实现上述目的，本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
本发明将采集的窖泥样品通过富集培养、分离纯化、产丁酸含量测定，筛选出产丁酸含量较高的菌株，再将产丁酸含量较高的菌株进行分子学鉴定，筛选出芽孢杆菌属中产丁酸量最高的菌，将该菌在RCM平板培养基上，于37℃培养24h，形成乳白色、边缘整齐的圆形或近似圆形的菌落，菌落表面湿润、微凸起；经革兰氏染色为阳性菌株。依照第九版《伯杰氏系统细菌学手册》和《常见细菌系统鉴定手册》对菌株进行形态学测定、生理生化检测、16S rRNA序列测定及系统发育树的分析，确定该菌株为东京芽孢杆菌(Bacillustoyonensis)。
东京芽孢杆菌(Bacillus toyonensis)AB2RH05-2，现已于2021年07月13日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2021872，保藏地址为中国.武汉.武汉大学。
东京芽孢杆菌在产丁酸中的应用时，东京芽孢杆菌发酵产丁酸的碳源为葡萄糖或果糖，葡萄糖或果糖的含量为10-15g/L。
进一步，东京芽孢杆菌发酵产丁酸的培养基中氮源为胰蛋白胨，胰蛋白胨含量为8-12g/L，杂菌抑制剂为乙酸钠，乙酸钠含量为4-12g/L。
进一步，东京芽孢杆菌发酵产丁酸的培养基中胰蛋白胨含量为9.4g/L，乙酸钠含量为12g/L。
进一步，东京芽孢杆菌发酵产丁酸的发酵条件为：发酵温度为31-37℃，发酵时间为80-90h，pH为6-8，酒精浓度为1-7％vol。
进一步，东京芽孢杆菌发酵产丁酸的发酵条件为：发酵温度为37℃，发酵时间为84h，pH为8，酒精浓度为1％vol。
本发明还提供一种产丁酸制剂，包括东京芽孢杆菌。
本发明还提供一种酿酒用产丁酸制剂，包括东京芽孢杆菌。
本发明提供的东京芽孢杆菌及其应用，具有以下有益效果：
1、本发明筛选得到的东京芽孢杆菌菌种产丁酸水平为15.5g/L,是目前所报道的产丁酸能力较高的菌株，具有重要的应用前景。
2、本发明筛选的到的东京芽孢杆菌具有一定的耐酸性、酒精耐受性、温度耐受性，能够适应不同季节的白酒发酵，特别是用于酱香型白酒的发酵。
3、本发明提供的产丁酸制剂，可以用在需要产丁酸的发酵中，应用前景广泛。
4、本发明提供的酿酒用产丁酸制剂，在酿酒过程中加入该产丁酸制剂，可以提高白酒发酵液中丁酸含量，从而改善白酒风味。
附图说明
图1为实施例1中AB2RH05-2菌落形态及菌体显微形态图；
图2为实施例1中AB2RH05-2菌株的16S rRNA序列进化树；
图3为实施例2中东京芽孢杆菌以不同碳源发酵后发酵液的吸光度图；
图4为实施例2中东京芽孢杆菌以不同氮源发酵后发酵液的吸光度图；
图5a为实施例2中丁酸与胰蛋白胨和乙酸钠三维空间响应面图；
图5b为实施例2中丁酸与胰蛋白胨和乳酸的三维空间响应面图；
图5c为实施例2中丁酸与乙酸钠和乳酸的三维空间响应面图；
图6为实施例2中东京芽孢杆菌在不同发酵时间发酵液的吸光度及有机酸含量图；
图7为实施例2中东京芽孢杆菌在不同接种量时发酵液的吸光度及丁酸含量图；
图8为实施例2中东京芽孢杆菌在不同发酵温度时发酵液的吸光度及丁酸含量图；
图9为实施例2中东京芽孢杆菌在不同pH时发酵液的吸光度及丁酸含量图；
图10为实施例2中东京芽孢杆菌在不同酒精度时发酵液的吸光度及丁酸含量图。
具体实施方式
以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
实施例1：东京芽孢杆菌的获得
本发明的东京芽孢杆菌分离于安徽某浓香型白酒厂窖壁泥、窖底泥。
所用的富集培养基成分为：2-吗啉乙磺酸0.5g/L，KH2PO4 0.5g/L，Na2SO4 5g/L，NaCl 1g/L，MgCl2·6H2O 0.4g/L，NaHCO3 0.3g/L，NH4NO3 0.3g/L，CaCO3 0.15g/L，酵母粉1.0g/L，蛋白胨1.5g/L，葡萄糖0.5g/L，可溶性淀粉5.0g/L，乙酸钠3.0g/L，乳酸钠3mL/L，L-半胱氨酸盐酸盐1g/L，窖泥浸提液20mL，蒸馏水1L，自然pH，121℃灭菌20min。
发酵液体培养基(RCM液体培养基)成分为：葡萄糖5g/L，氯化钠5g/L，酵母膏5g/L，蛋白胨10g/L，乙酸钠3g/L，牛肉膏10g/L，可溶性淀粉1g/L，L-半胱氨酸盐酸盐0.5g/L，蒸馏水1L，pH 6.8，121℃灭菌20min。加入20g/L的琼脂为RCM固体培养基。
采用GC-MS法测定发酵液中丁酸含量。
气相色谱条件：DB-WAX UI谱柱(30m×0.25mm，0.25μm)，程序升温40℃保持1min，以20℃/min升高至150℃，再以10℃升高至250℃保持2min。分流比30:1，载气为氦气(He)，流速1mL/min，氢气(H2)40mL/min，氧气(O2)300mL/min，检测器为火焰离子检测器。
质谱条件：电子电离源，传输线温度250℃，电子能量为70eV，光电倍增管电压为350V，质量扫描范围为30～350amu。
样品准备：从窖泥中筛选得到的产丁酸菌种接种至RCM液体培养中，35℃厌氧静置培养12h，连续培养2代，得到种子液。将种子液以5％的接种量接种至RCM液体培养基中，35℃厌氧静置培养培养5d，完成发酵。取发酵好的发酵液通过0.22μm有机相滤膜收集在EP管内，以10000r/min离心20min，吸取1mL离心后的发酵液于进样瓶内待测。
由GC-MS分析得到的质谱数据经计算机在美国国家标准技术研究所17标准谱库检索定性，采用外标法测定发酵液中丁酸含量。
一、菌株的分离
1、窖泥样品的采集
窖泥样品采用五点取样法，每点各取50g左右窖泥，混匀后装于塑封袋内，迅速置于冰盒内运回，4℃低温保存备用。
2、窖泥的富集
称取5g窖泥，放入装有45mL无菌水的150mL三角瓶内，加入5粒玻璃珠，放置于25℃、200r/min摇床内，培养20min，转置于80℃水浴锅内，静置10min，杀死其中非营养细胞。随后放入超净工作台内冷却至30～40℃，充分振荡后以10％的接种量接种至富集培养基内，放入厌氧培养箱内，35℃富集培养两个月，每半个月更换一次富集培养基。
3、菌株的分离纯化
吸取窖泥富集液进行梯度稀释，得到10-1～10-8稀释度的菌悬液。取200μL菌悬液涂布于RCM固体培养基的表面，涂布前平板需放置厌氧培养箱内过夜除氧，各稀释度下的菌悬液各涂布三个，将涂布好的平板置于35℃厌氧培养箱内培养3-5d。将具有不同形态特征的菌落进行至少三次划线纯化后，获得139种菌落形态有较大差异的单菌落，编号并保存。
4、产丁酸菌的筛选
从窖泥中筛选出的高产丁酸的菌株多为革兰氏阳性菌，因此，分别对139株细菌进行革兰氏染色实验，最终筛选得到86株革兰氏阳性细菌。
将分离得到的86株细菌分别接种至RCM液体培养基中，于35℃厌氧静置培养12h，连续培养2代，得到种子液，将种子液以5％的接种量接种至RCM发酵培养基内，35℃下厌氧发酵5d，完成发酵。将发酵好的发酵液用0.22μm有机相滤膜收集在EP管内，于10000r/min离心20min，吸取1mL离心后的发酵液放入进样瓶内，采用GC-MS法测定发酵液中丁酸的产量，选取发酵液中丁酸含量3g/L以上的32株菌株，送至南京派森诺进行菌种鉴定。南京派森诺生物公司将得到32株纯培养物，利用细菌基因组DNA快速提取试剂盒提取其基因组DNA，以提取的DNA作为模板，以提取的DNA作模板，利用通用引物27F(5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)和1492R(5’-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3’)进行PCR扩增，扩增产物通过一代测序或三代测序检测16S rRNA的全长，经双向测序后，将得到的两条序列拼接，测序结果利用NCBI核酸比对网站进行比对，得到与待测物种序列相似性最大的同源序列，最终筛得蜡状芽孢杆菌属中丁酸产量最高的菌株，其编号为AB2RH05-2。
二、菌种鉴定
1、形态特征观察
将筛选出的菌株制成菌悬液，梯度稀释后，选取10-7稀释度涂布于已除氧的RCM固体培养基上，置于35℃厌氧静置培养，挑取单菌落再次于RCM固体培养基上分离划线，至少划线三次，确保得到纯培养物。将纯培养物接种至斜面上，保存于4℃冰箱中备用。将纯培养物采用点接种的方式接种至固体RCM培养基上，同时挑取菌体制片进行革兰氏染色，进一步观察细菌显微镜下的形态结构。菌落形态及菌体显微形态如图1所示。AB2RH05-2菌落呈圆形、乳白色，边缘整齐、表面湿润、微凸起，革兰氏染色阳性。
2、生理生化鉴定
参照《常见细菌系统鉴定手册》及《伯杰氏系统细菌学手册》中所述实验方法对AB2RH05-2菌株进行生理生化鉴定，鉴定结果见表1。
表1：AB2RH05-2细菌生理生化特征实验结果
Figure BDA0003327527650000061
Figure BDA0003327527650000071
根据鉴定结果可知，AB2RH05-2菌无法利用过氧化氢生成新的水和氧，能够将葡萄糖分解成丙酮酸，但均不能将丙酮酸进一步脱羧形成乙酰甲基甲醇，且具备淀粉水解能力。AB2RH05-2菌的硝酸盐还原、明胶水解均呈阴性。该菌株与东京芽孢杆菌(Bacillustoyonensis)的特征相吻合。
3、16S rRNA序列测定和系统发育分析
根据AB2RH05-2的16S rRNA测序结果和序列比对结果构建系统进化树如图2所示，发现AB2RH05-2菌株与东京芽孢杆菌(Bacillus toyonensis)同属一个遗传分支，亲缘性达到98％。结合形态特征观察以及生理生态特征分析，确定分离菌株为东京芽孢杆菌。
实施例2：东京芽孢杆菌在产丁酸中的应用
发酵液体培养基(改良RCM液体培养基)成分为：葡萄糖10g/L，氯化钠3g/L，酵母膏4g/L，胰蛋白胨8g/L，乙酸钠4g/L，牛肉膏8g/L，可溶性淀粉0.8g/L，L-半胱氨酸盐酸盐0.4g/L，蒸馏水1L，pH 6.8，121℃灭菌20min。
采用GC-MS法测定发酵液中丁酸含量。
采用紫外分光光度法测发酵液中生物量。吸取细胞发酵液0.5mL，加入0.1mol/LNaOH溶液4.5mL混匀，以0.1mol/L NaOH溶液为参比，在仪器上于600nm处测定吸光度OD600nm。
一、培养基优化
1、碳源的选择
选取KEGG代谢途径中有基因映射代谢途径完整的C源，即葡萄糖、果糖、甘露糖、半乳糖、淀粉和蔗糖，分别添加至培养基当中，取代发酵液体培养基中的碳源，添加量为5g/L，将东京芽孢杆菌株以5％的接种量接种至以不同碳源为培养基的发酵液内，发酵完成后测定发酵液的吸光度值OD600nm，结果见图3，由图可知，东京芽孢杆菌能利用葡萄糖和果糖，对于甘露糖、半乳糖、淀粉和蔗糖无法利用，其中对葡萄糖利用率最高，因此，确定最佳碳源为葡萄糖。
2、氮源的选择
选取蛋白胨、酪蛋白胨、大豆蛋白胨和胰蛋白胨，分别添加至培养基中，取代发酵液体培养基中的氮源，添加量为10g/L，将东京芽孢杆菌株以5％的接种量接种至以不同氮源为培养基的发酵液内，发酵完成后测定发酵液的吸光度值OD600nm，结果见图4，由图可知，东京芽孢杆菌在不同的氮源培养基中的生长情况为：胰蛋白胨>酪蛋白胨>蛋白胨>大豆蛋白胨，因此，确定最佳氮源为胰蛋白胨。
3、Placket-Burman(PB)试验
PB法是一种两水平试验设计方法，广泛应用于微生物发酵培养基成分的优化。通过对试验进行统计学设计和数据分析，从众多考察因素中快速有效地筛选出对生物量影响最大的关键因素。根据上述单因素试验，选葡萄糖、胰蛋白胨分别作为碳源、氮源，同发酵液体培养基内的其他成分一起，作为影响丁酸产量的因子，设计PB试验，以选出对丁酸含量有主要影响的因素，试验设计表见表2、试验结果见表3、各因素的主要效应见表3。
表2 Plackett-Burman试验设计表
Figure BDA0003327527650000081
Figure BDA0003327527650000091
表3 Plackett-Burman试验结果表
Figure BDA0003327527650000092
表4 Plackett-Burman试验中各因素的主要效应
Figure BDA0003327527650000093
Figure BDA0003327527650000101
注：*表示在p＜0.05水平上差异显著,**表示p＜0.01水平上差异极显著
根据表4的结果，由Design-Expert.V8.0.6软件分析可知，该模型的回归方程如下：
Y＝5.14667-0.143*A-0.23722*B-0.080417*C+0.19958*D+1.120383*E+0.06875*F+0.52292*G-0.63750*H-0.92722*J，整体模型的P值＝0.0383<0.05，表现为影响显著，则该模型是具有统计学意义的。由此可知，对丁酸产量影响的主要因素的影响力大小为：J乳酸>E乙酸钠>D胰蛋白胨。
4、最陡爬坡实验
根据PB试验结果设计主要因素的最陡爬坡路径，根据主要因素效应正负、大小的比例设定它们的变化方向与步长，能够快速、经济地逼近最佳值区域。实验结果见表5。
表5最陡爬坡试验设计及其试验结果
Figure BDA0003327527650000102
Figure BDA0003327527650000111
由表5可知，当乙酸钠、胰蛋白胨添加量逐渐增大，乳酸添加量逐渐减小的过程中，丁酸含量呈先增大后减小的趋势，即当实验组号4胰蛋白胨、乙酸钠、乳酸的含量分别为10g/L、7g/L和1.5mL/L时，丁酸含量最高。因此，选择试验4中的各因素的水平值为响应面试验设计的中心值。
5、响应面试验
依据PB试验及最陡爬坡试验的结果确定主要影响因素以及相应因素的响应面中心值，并以丁酸含量为响应值，进行Box-Benhnken试验设计，试设计见表6，试验结果见表7，方差分析结果见表8。
表6 Box-Behnken试验设计因素水平表
Figure BDA0003327527650000112
表7 Box-Benhken试验设计及结果
Figure BDA0003327527650000113
Figure BDA0003327527650000121
表8回归模型方差分析
Figure BDA0003327527650000122
注：*表示显著(p＜0.05)，**表示极显著(p＜0.01)
将表7的试验结果，采用Design-Expert软件进行分析可知，该模型的回归方程为：
Y＝4.59X1+0.76X2-7.30X3+0.09X1X2+0.06X1X3-0.066X2X3-0.19X1 2+0.037X2 2+1.61X3 2-13.93，其中Y表示丁酸含量，X1、X2、X3分别代表胰蛋白胨、乙酸钠和乳酸的含量。
运用F检验分析模型是否显著，对回归模型进行方差分析，方差分析结果见表8，R2＝0.9542，其拟合程度良好。由表8可知，模型p＜0.01，说明模型极显著，表明该响应面模型具有一定的实际意义。失拟项p值0.2809>0.05，说明失拟项不显著。模型的一次项X1、X3极显著，X2影响显著，交互项X1X2影响显著，其余均不显著；二次项X1 2、X3 2极显著，X2 2影响显著。图5a是丁酸与胰蛋白胨和乙酸钠的三维空间响应面图；图5b是丁酸与胰蛋白胨和乳酸的三维空间响应面图；图5c是丁酸与乙酸钠和乳酸的三维空间响应面图。根据RSM预测丁酸产量最高可达16.92g/L，此时胰蛋白胨含量9.35g/L，乙酸钠12g/L，乳酸0mL。
为便于操作，将胰蛋白胨修正为9.4g/L，乙酸钠修正为12g/L和乳酸0mL/L，以改良后的RCM培养基进行发酵验证，进行3次实验，测得丁酸含量为14.02g/L，达到模型预测值的83％。由于丁酸含量的检测采用外标法进行测定，每次进行测定时均需配置标准曲线，进行响应面模型模拟时的标准曲线与验证时的标准曲线不一致，由此带来了一定误差。加之每次测定时仪器状态对丁酸含量的测定也有影响，因此实际值与预测值相差不到3g/L，差值相对较小，模型仍具有一定的可信度。优化后的丁酸产量远高于同样采用响应面优化丁酸梭菌丁酸产量的报道4.5g/L，产量较其提高了近2倍。最后得到优化后的RCM培养基:葡萄糖10g，NaCl 3g，酵母膏4g，胰蛋白胨9.4g，乙酸钠12g，牛肉膏8g，可溶性淀粉0.8g，L-半胱氨酸盐酸盐0.4g。
二、发酵周期的确立
将活化好的菌株以5％的接种量接种至发酵培养基内，每12h取样，以未接种的发酵培养基为空白对照，测定发酵液的吸光度OD600nm以及产酸含量，结果见图6。
实验探究了东京芽孢杆菌在5d内生物量和有机酸的变化情况。如图6所示：在0-48h内，菌株的生物量不断增加；当发酵时间超过48h后，生物量逐步趋于稳定，在1.3-1.4之间；培养96h后菌体浓度开始出现明显下降。在整个发酵过程中，菌株己酸含量偏低，乙酸和丁酸含量变化较为明显。0-84h内，菌株丁酸含量呈现不断上升的趋势；发酵超过96h后，除丁酸外，乙酸含量也出现明显降低，这可能是因为乙酸和丁酸在不断生成的过程中，同时也参与了其余物质的合成，在此时间段，乙酸和丁酸的反应速率超过乙酸和丁酸的合成速率，加之菌体活性和含量均不足，因而出现含量下降的现象。整个发酵过程中，由于培养基内含有乙酸，因此，菌株能在第一时间就能利用乙酸进行代谢转运产生丁酸，在12-24h内乙酸含量出现降低，丁酸含量明显升高。当培养至24h时，发酵液内菌体浓度超过0.8，发酵液内有足够的菌体利用培养基成分合成乙酸，此时的乙酸合成速率高于乙酸利用率，因而乙酸含量出现上升。发酵60h后，丁酸含量增长速率明显减缓，直至84h时趋于峰值，随后丁酸的代谢分解速率大于丁酸合成速率，丁酸含量降低。以丁酸含量作为确定发酵时间的主要因素，可确定东京芽孢杆菌发酵时间为84h。
三、培养条件的优化
采用RCM培养基，通过正交法对东京芽孢杆菌的培养条件进行优化，主要优化接种量、温度、pH以及酒精浓度，得到最佳培养条件。
1、接种量对有机酸含量的影响
在100mL厌氧瓶内(实际容量125mL左右)装100mL培养基和5mL的液体石蜡，温度35℃，pH为7，酒精浓度0vol％的条件下，分别接种3％、6％、9％、12％的种子液，测定不同接种量下生物量及乙酸含量。
结果见图7，由图可知，相同培养条件下，随着接种量的增加，菌株生物量相应增加，当接种量为12％时，菌体浓度最高。当接种量由3％增至6％后，丁酸含量提升了1g/L左右，继续增大接种量至9％和12％，丁酸含量后变化不大。说明接种量对丁酸含量影响不大。
2、温度对有机酸含量的影响
在接种量为5％，pH为7，酒精度0％vol的条件下，100mL厌氧瓶内装100mL培养基和5mL的液体石蜡，测定在31℃、34℃、37℃、40℃条件下的生物量和丁酸含量。
结果见图8，由图可知，在温度31-37℃范围内，菌株生物量随温度的提高而增大，继续升高温度至40℃时，菌体浓度出现下降。温度由31℃升高至34℃，丁酸含量增高近2g/L，继续升高温度至37℃，丁酸含量降低。因此最适发酵温度以丁酸产量最高，初步可确定为34℃，以31℃、34℃以及37℃作为优化条件下的温度梯度。
3、初始pH对有机酸含量的影响
在接种量5％，温度35℃，酒精度0％vol的条件下，100mL厌氧瓶内装100mL培养基和5mL的液体石蜡，发酵完成后，测定生物量和丁酸含量。
结果见图9，由图可知，菌株在中性条件下生长最好、菌体浓度最高。当4<pH<7时，菌体浓度随pH升高而升高，pH＝4时菌体生长受到极大限制，升高pH至5时，生长限制得到一定程度的解除，菌体浓度显著提高，吸光度在1.1左右。当7<pH<9时，pH上升菌体浓度下降。在4-9的pH实验范围内，乙酸含量随pH的升高而升高；4<pH<6时，丁酸含量与pH呈正相关。pH在6-8的范围内变化不明显，继续升高pH至9，丁酸含量出现下降。整个发酵过程，丁酸的变化趋势与菌体浓度大致相同。在整个实验因素设计下，在pH为7时丁酸含量取得最高值。选取pH分别为6、7、8作为正交优化条件下的pH梯度。
4、酒精度对有机酸含量的影响
在接种量5％，温度35℃，pH为7的条件下，100mL厌氧瓶内装100mL培养基和5mL的液体石蜡，测定在不同酒精浓度1％vol、4％vol、7％vol、10％vol、13％vol和16％vol下的生物量和丁酸含量。
结果见图10，由图可知，随着酒精度的升高，菌体浓度显著降低，当酒精浓度为7％vol-10％vol之间时，菌株不敏感，菌体浓度变化不大。继续增大酒精浓度至13％vol，吸光度出现显著下降，菌体几乎不能正常生长。以丁酸变化量作为考量标准，随着酒精浓度的上升，丁酸含量不断减低。丁酸含量在4％vol处取得最大值，酒糟中酒精浓度不超过10％vol，故选取酒精浓度1％vol、4％vol、7％vol作为正交优化条件下的浓度梯度。
5、正交实验设计
选取单因素实验中对丁酸含量造成显著影响的因素，选取适当的因素梯度进行正交设计并进行正交优化实验。发酵条件正交设计见表9、正交试验结果及分析见表10、方差分析见表11。
表9发酵条件正交设计表
Figure BDA0003327527650000161
表10正交试验结果及分析
Figure BDA0003327527650000162
/>
Figure BDA0003327527650000171
表11方差分析
Figure BDA0003327527650000172
注：a.R平方＝0.986
由表10可知，A：温度、B：pH和C：酒精浓度对丁酸含量的影响为C＞A>B。根据k值可确定最优培养条件组合为A3B3C1，即培养温度37℃，pH为8，酒精浓度1％vol。由方表11可知，温度和pH对丁酸浓度的影响不显著(p>0.05)，酒精浓度影响显著(p<0.05),整个模型p<0.05，说明模型显著。因此可确定正交试验培养条件优化结果为：培养温度37℃，pH为8，酒精浓度1％vol。在优化后的发酵条件丁酸产量达到15.5g/L，在14.02g/L的基础上提高了10.6％。
四、效果验证
以改良后的RCM培养基作为发酵培养基，在温度37℃，pH为8，酒精浓度1％vol条件下厌氧培养84h，最终测得丁酸含量为15.54g/L。和初始RCM培养基、优化培养条件前相比，产量提高了3.69倍，优化效果显著。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种东京芽孢杆菌(Bacillus toyonensis)，该菌属于蜡状芽孢杆菌属，命名为AB2RH05-2，该菌株于2021年07月13日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO：M2021872；
所述的东京芽孢杆菌在产丁酸中的应用；
东京芽孢杆菌发酵产丁酸的碳源为葡萄糖或果糖，葡萄糖或果糖的含量为10-15g/L；
东京芽孢杆菌发酵产丁酸的培养基中氮源为胰蛋白胨，胰蛋白胨含量为8-12g/L，杂菌抑制剂为乙酸钠，乙酸钠含量为4-12g/L；
东京芽孢杆菌发酵产丁酸的发酵条件为：发酵温度为31-37℃，发酵时间为80-90h，pH为6-8，酒精浓度为1-7％vol。
2.根据权利要求1所述的东京芽孢杆菌，其特征在于，东京芽孢杆菌发酵产丁酸的培养基中胰蛋白胨含量为9.4g/L，乙酸钠含量为12g/L。
3.根据权利要求1所述的东京芽孢杆菌，其特征在于，东京芽孢杆菌发酵产丁酸的发酵条件为：发酵温度为37℃，发酵时间为84h，pH为8，酒精浓度为1％vol。
4.一种产丁酸制剂，其特征在于，包括权利要求1-3任一项所述的东京芽孢杆菌。
5.一种酿酒用产丁酸制剂，其特征在于，包括权利要求1-3任一项所述的东京芽孢杆菌。
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