CN114456959B - 一种耐高渗的解脂亚罗酵母菌株、选育方法及应用 - Google Patents

一种耐高渗的解脂亚罗酵母菌株、选育方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及微生物发酵领域，具体涉及一种耐高渗的解脂亚罗酵母菌株、选育方法及应用，所述解脂亚罗酵母菌株于2021年11月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.23943。本发明还公开了该解脂亚罗酵母菌株的选育方法及在制备赤藓糖醇中的应用。本发明所提供的解脂亚罗酵母菌株用于制备赤藓糖醇时，赤藓糖醇转化率达到60%以上，发酵周期缩短为86h～90h，相比现有技术发酵周期缩短了11h～15h。

Description

一种耐高渗的解脂亚罗酵母菌株、选育方法及应用
技术领域
本发明涉及微生物发酵领域，具体涉及一种耐高渗的解脂亚罗酵母菌株、选育方法及应用。
背景技术
赤藓糖醇是一种天然的多醇类甜味剂，甜味纯正，热值接近零，入口具有清凉感，由于具有良好的加工特性，被广泛应用于糖果、饮料及烘焙等食品中， 2014版GB28050《预包装食品标签通则》问答中建议赤藓糖醇的能量系数为0kJ/g，这使赤藓糖醇作为甜味剂普遍添加到减糖食品中。赤藓糖醇除应用于食品工业外，还可用于医药、化妆品、化工等领域，可作为有机合成的中间体，用于制造电解液、油漆、炸药等产品的原料；代替部分甘油的作用生产化妆品，延缓化妆品变质；作为药品的矫味剂和片剂的赋形剂，改善药品的口感。
当前，赤藓糖醇的用量逐年递增，市场需求量不断提高，随着减糖风潮的愈演愈烈，致使赤藓糖醇市场出现供不应求的现状。赤藓糖醇的制备方法分为化学合成法和微生物发酵法，化学合成法副产物较多，收率低，产物较难分离，难以实现工业化，目前国内生产赤藓糖醇以微生物发酵法为主，微生物发酵法生产工艺易于控制，产品较化学法更安全，但是发酵法生产采用酵母在高糖环境下生产缓慢，生产发酵周期较长，产品转化率也较低。中国专利CN201911126727.3公开了一种通过混合镁盐提高赤藓糖醇转化率的方法，本方法通过对发酵培养基部分原料替代，由单一镁盐改为混合镁盐并调节混合镁盐的比例优化发酵培养基，使菌种代谢途径更有利于生成赤藓糖醇，赤藓糖醇转化率达到63%，但是发酵时间为98～102小时，发酵周期较长。中国专利CN201310282059.X公开了一种解脂亚罗酵母菌株及其用于合成赤藓糖醇的方法，该方法在发酵过程连续分批补料，提高葡萄糖的利用率，赤藓糖醇转化率最高达到63.2%，但连续分批补料使得工艺复杂，且多次补料增加了染菌的风险。因此，开发一种工艺简单且发酵周期短的赤藓糖醇生产工艺方法具有重要意义。
发明内容
本发明为了弥补现有技术的不足，提供了一种耐高渗的解脂亚罗酵母菌株、选育方法及应用。
本发明提供了一种耐高渗解的脂亚罗酵母菌株，所述耐高渗的解脂亚罗酵母菌株标记为解脂亚罗酵母（Yarrowialipoytica)XGSC-003保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为中国北京，保藏号为CGMCC No. 23943。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
一种耐高渗的解脂亚罗酵母菌株，该菌株已经于2021年11月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No. 23943。
所述的解脂亚罗酵母菌株的选育方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1，将出发菌株接种至高渗培养基中，在30℃，260rpm培养30h，每2h取一次样，在600nm下测定吸光度值，绘制菌种生长曲线，找出酵母在对数生长期；
步骤2，将出发菌株的试管斜面培养至对数生长期，在无菌条件下进行洗脱，稀释后进行ARTP诱变，诱变完成后，接种到TTC显色培养基上，30℃培养72h；
步骤3，挑取步骤2中8～20个染色为深红色、直径1.5～2mm，表面光滑，边缘整齐不扩散的单菌落作为初筛菌株，进行孔板培养，30℃，260rpm培养24h，发酵液离心取上清液，进行薄层层析，根据发酵产物中赤藓糖醇含量选取优化菌株待进一步筛选；
步骤4，选取步骤3中优化菌株分别在低糖培养基、高渗培养基中进行发酵，验证初筛菌种的产赤藓糖醇能力，根据产赤藓糖醇能力确定目标菌种。
所述步骤1中的高渗培养基包括葡萄糖25%，酵母膏0.3%、蛋白胨0.5%、麦芽浸膏0.3%，其余为水。
所述步骤2中菌种诱变条件，载气为氦气，载气流量10SLM，电源功率120W，操作温度为室温，辐射距离2mm，诱变时间2min。
所述步骤4中低糖培养基配方为葡萄糖含量5%，酵母浸粉1%，玉米浆0.2%，硫酸镁0.02%，硫酸铜0.005%，磷酸二氢钾0.08%，柠檬酸铵0.4%，其余为水；高渗培养基配方为葡萄糖含量30%，酵母浸粉1%，玉米浆0.2%，硫酸镁0.02%，硫酸铜0.005%，磷酸二氢钾0.08%，柠檬酸铵0.4%，其余为水。
所述的耐高渗的解脂亚罗酵母在制备赤藓糖醇中的应用。
所述应用的具体方法为：
步骤1，种子液培养：将耐高渗解脂亚罗酵母XGSC-003斜面菌种用生理盐水清洗至一级种子培养基，在29℃～32℃，转速260～280rmp摇瓶培养21～22小时，转接至二级种子培养基中，接种量5%～8%，在29℃～32℃，转速250rmp～280rmp连续培养20～21小时，当细胞OD600大于等于20时，停止培养，得到种子液；
步骤2，发酵培养：将步骤1中种子液按照9～11%的接种量接种到发酵罐的发酵培养基中，29℃～32℃条件下进行发酵培养，当发酵液中葡萄糖含量0.01g/L，发酵结束。
所述步骤2发酵培养的具体过程为发酵初期控制pH6.8～7.2，发酵过程控制前24小时搅拌速度150rmp～200rmp，24～48小时200rmp～250rmp，48小时以后控制搅拌速度300rmp～350rmp；通风量控制前24小时为0.4～0.5m3/h，24～48小时0.6～0.8m3/h，48小时以后控制通风量0.7～1.0m3/h；发酵过程测定OD600值，当OD600大于等于22时，控制发酵液pH3.0～3.5，当发酵液中葡萄糖含量0.01g/L，发酵结束。
所述一、二级种子培养基成分相同，按重量比包括葡萄糖含量20%，酵母浸粉1%，硫酸镁0.03%，磷酸二氢钾0.08%，柠檬酸铵0.4%。
所述发酵培养基按重量比包括葡萄糖含量30～40%，酵母浸粉1%，玉米浆0.2%，硫酸镁0.02%，硫酸铜0.005%，磷酸二氢钾0.08%，柠檬酸铵0.4%。
本发明具有以下技术优势:
（1）本发明通过ARTP诱变技术对解脂亚罗酵母进行诱变，通过TTC及TCL及发酵验证筛选，筛选出耐高渗的解脂亚罗酵母，发酵周期缩短为86～90小时，相比现有技术发酵周期缩短了11-15h。
（2）本发明生产得到赤藓糖醇纯度高，经过液相色谱分析，几乎无杂醇，粗制品纯度95%以上。
（3）本发明采用连续发酵方式，发酵过程没有中间补料工序，可降低发酵过程染菌的风险，同时利用耐高渗解脂亚罗酵母的对高糖环境的适应性，使赤藓糖醇转化率达到63.14%，保证赤藓糖醇的转化率，简化了工艺流程，减少了生产过程能耗，降低生产成本，提高产品竞争力。
附图说明
下面结合附图对本发明作进一步的说明。
图1为出发菌株在高渗条件下培养的生长曲线图。
图2为TTC培养基初筛平板菌落生长状态。
图3为诱变菌种孔板培养发酵液薄层层析图。
图4为XGSC-002和初选4株诱变菌株在低糖（5%）环境下发酵24小时发酵液色谱峰面积对比图。
图5为XGSC-002和初选4株诱变菌株在高渗（30%）环境下发酵24小时发酵液色谱峰面积对比图。
图6为出发菌株解脂亚罗酵母菌株XGSC-002在100倍显微镜的形态图。
图7为耐高渗解脂亚罗酵母菌株XGSC-003在100倍显微镜的形态图。
图8为XGSC-003酵母菌株由葡萄糖发酵合成产物赤藓糖醇的HPLC分析图。
图9为赤藓糖醇标准品的HPLC分析图。
具体实施方式
下面结合附图说明和具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干调整和改进。这些都属于本发明的保护范围。
本发明提供了一种耐高渗的解脂亚罗酵母菌株，所述耐高渗的解脂亚罗酵母菌株标记为耐高渗解脂亚罗酵母（Yarrowia lipoytica)XGSC-003保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No. 23943。
本发明出发菌菌株：解脂亚罗酵母（Yarrowia lipoytica)XGSC-002于2021年3月28日购于中国工业微生物菌种保藏管理中心，保藏号为CICC 33063。
实施例1：出发菌株解脂亚罗酵母（Yarrowia lipolytica）XGSC-002菌株的高糖环境下生长曲线绘制
（i）配置高渗培养基：
重量比,葡萄糖25%，酵母膏0.3%、蛋白胨0.5%、麦芽浸膏0.3%，余量为水，115℃高压灭菌30min。
（ii）将酵母菌株XGSC-002接种至上述25%的高渗液体培养中，在30℃，260rpm调节下连续培养30h，每2h取一次样，在600nm下测定吸光度值，绘制菌种生长曲线。
图1是出发菌株XGSC-002在高渗环境下的生长曲线，由曲线可以看出XGSC-002的对数生长期在18～20h。
实施例2：菌株诱变
出发菌株经试管斜面培养20小时，于超净工作台中，用2ml无菌生理盐水洗脱，稀释至OD600值0.7，金属载片置于酒精灯外焰灼烧30s，待冷却后放到一次性平板中，取10μL菌悬液均匀涂抹于金属载片，将金属载片置于ARTP诱变系统进行诱变处理，载气(He)，载气流量10SLM，电源功率120W，操作温度为室温，辐射距离2mm，处理2min。处理完毕后，用无菌镊子将载片置于装有1ml无菌生理盐水的EP管中，将EP管在振荡器上振荡1min，形成新的菌悬液。菌悬液稀释104倍，取100μL稀释液在TTC平板培养基上进行涂布，30℃培养72小时。
所述TTC培养基包括葡萄糖25%，琼脂2%，酵母膏0.3%、蛋白胨0.5%、麦芽浸膏0.3%，TTC 0.002%，其余为水。
诱变在菌株生长的对数期生长期进行，此时菌种最易发生突变，诱变最易进行。
图2为诱变菌种在TTC筛选培养基上生长状态，染色越深表明菌种的生长活力越高，挑选生长活力高的单菌落进行进一步筛选。
实施例3：耐高渗酵母菌株的筛选
挑取诱变菌种单菌落8～20个染色为深红色、直径1.5～2mm，表面光滑，边缘整齐不扩散即无菌丝蔓延的单菌落，本实施例中挑取TTC染色较深的8个单菌落，编号为B1至B8，接种至24孔板液体培养基进行培养，30℃，250rpm培养24小时，发酵液10000rpm离心5min，取上清液进行薄层层析（TCL）分析，发酵产物中赤藓糖醇含量较多的作为目标菌种进行进一步筛选。同时以出发菌株作为对照，编号为A1、A2。
所述孔板培养培养基为葡萄糖含量25%，酵母膏0.8%，玉米浆0.3%，硫酸镁0.01%，硫酸铜0.01%，磷酸二氢钾0.08%，柠檬酸铵0.4%，其余为水。
图3为10个单菌落孔板培养发酵产物TCL分析图，代表赤藓糖醇的点越大表明赤藓糖醇含量越多，其中可以看出诱变菌株有几株发酵产物中赤藓糖醇含量较多。
实施例4：耐高渗酵母菌株发酵产赤藓糖醇能力验证
对TCL初筛菌种3～5株分别在低糖培养基、高渗培养基中进行发酵产赤藓糖醇能力验证，本实施例中挑取了4株，编号分别为B2、B5、B6、B8，进行斜面培养，将斜面菌种用生理盐水清洗至种子培养基30℃，250rmp培养24小时，按照4%接种量接种至摇瓶（50ml/500ml)培养基进行发酵培养,30℃，250rmp培养24小时，测定发酵液中赤藓糖醇含量，同时以原始菌株作为对照。选取在低糖培养基、高渗培养基中产赤藓糖醇能力均较高的菌株作为目标菌株。
所述种子培养基配方为葡萄糖含量2%，酵母浸粉1%，硫酸镁0.03%，磷酸二氢钾0.08%，柠檬酸铵0.4%，其余为水。
所述摇瓶培养低糖培养基配方为葡萄糖含量5%，酵母浸粉1%，玉米浆0.2%，硫酸镁0.02%，硫酸铜0.005%，磷酸二氢钾0.08%，柠檬酸铵0.4%，其余为水。
所述摇瓶培养高渗培养基配方为葡萄糖含量30%，酵母浸粉1%，玉米浆0.2%，硫酸镁0.02%，硫酸铜0.005%，磷酸二氢钾0.08%，柠檬酸铵0.4%，其余为水。
图4为XGSC-002和初选4株诱变菌株在低糖（5%）环境下发酵24小时发酵液色谱峰面积对比图，图5为XGSC-002和初选4株诱变菌株在高渗（30%）环境下发酵24小时发酵液色谱峰面积对比图。表1为XGSC-002与初选4株诱变菌株发酵24h产赤藓糖醇能力对比。由图4和图5可以看出B6菌种的峰面积明显高于其他菌株，表1结果B6菌株发酵产赤藓糖醇能力明显提高。
表1 XGSC-002与初选4株诱变菌株发酵24h产赤藓糖醇能力对比
Figure 153923DEST_PATH_IMAGE001
由上结果将B6菌株命名为耐高渗解脂亚罗酵母XGSC-003，对XGSC-002和XGSC-003两株菌株细胞形态进行观察，结果如图6和图7，XGSC-003细胞形态呈扁球形，XGSC-002细胞形态呈圆球形。
实施例5：利用耐高渗解脂亚罗酵母XGSC-003制备赤藓糖醇
（i）种子液培养：将斜面菌种用生理盐水清洗至一级种子培养基，29℃，260rmp培养22小时，转接至二级种子培养基中，接种量5%，29℃，250rmp连续培养20小时，当细胞OD600达到20以上即大于等于20时，停止培养，得到种子液。
（ii）发酵培养：将（i）中种子液按照9%的接种量接种到10L发酵罐中进行发酵培养，发酵罐装液量为6.8L，发酵过程温度为29℃，发酵初期控制pH6.8～7.2，发酵过程控制前24小时搅拌速度150rpm，24～48小时200rpm，48小时以后控制搅拌速度300rpm；通风量控制前24小时为0.4m3/h，24～48小时0.6m3/h，48小时以后控制通风量0.7m3/h；发酵过程测定OD600值，当OD600值达到22以上即大于等于22时，控制发酵液pH3.0～3.5，当发酵液中葡萄糖含量0.01g/L，发酵结束。
其中，所述一二级种子培养的组成为，各组分均为重量比，葡萄糖含量20%，酵母浸粉1%，硫酸镁0.03%，磷酸二氢钾0.08%，柠檬酸铵0.4%，其余为水。
所述发酵培养基的组成为，各组分均为重量百分比，葡萄糖含量30%，酵母浸粉1%，玉米浆0.2%，硫酸镁0.02%，硫酸铜0.005%，磷酸二氢钾0.08%，柠檬酸铵0.4%，其余为水。
本事实例发酵周期为86小时，制备发酵液中赤藓糖醇的含量检测结果为18.11%，赤藓糖醇的转化率为60.37%，产品纯度95.36%。
实施例6：利用耐高渗解脂亚罗酵母XGSC-003制备赤藓糖醇
（i）种子液培养：将斜面菌种用生理盐水清洗至一级种子培养基，32℃，280rmp培养22小时，转接至二级种子培养基中，接种量7%，32℃，270rmp连续培养21小时，当细胞OD600达到20以上即大于等于20时，停止培养，得到种子液。
（ii）发酵培养：将（i）中种子液按照9%的接种量接种到10L发酵罐中进行发酵培养，发酵罐装液量为6.8L，发酵过程温度为32℃，发酵初期控制pH6.8～7.2，发酵过程控制前24小时搅拌速度200rpm，24～48小时230rpm，48小时以后控制搅拌速度330rpm；通风量控制前24小时为0.5m3/h，24～48小时0.8m3/h，48小时以后控制通风量1.0m3/h；发酵过程测定OD600值，当OD600值达到22以上即大于等于22时，控制发酵液pH3.0～3.5，当发酵液中葡萄糖含量0.01g/L，发酵结束。
其中，所述一二级种子培养的组成为，各组分均为重量比，葡萄糖含量20%，酵母浸粉1%，硫酸镁0.03%，磷酸二氢钾0.08%，柠檬酸铵0.4%，其余为水。
所述发酵培养基的组成为，各组分均为重量百分比，葡萄糖含量35%，酵母浸粉1%，玉米浆0.2%，硫酸镁0.02%，硫酸铜0.005%，磷酸二氢钾0.08%，柠檬酸铵0.4%，其余为水。
本事实例发酵周期为88.5小时，制备发酵液中赤藓糖醇的含量检测结果为22.1%，赤藓糖醇的转化率为60.28%，产品纯度96.21%。
实施例7：利用耐高渗解脂亚罗酵母XGSC-003制备赤藓糖醇
（i）种子液培养：将斜面菌种用生理盐水清洗至一级种子培养基，30.6℃，270rmp培养22小时，转接至二级种子培养基中，接种量8%，31℃，280rmp连续培养20小时，当细胞OD600达到20以上即大于等于20时，停止培养，得到种子液。
（ii）发酵培养：将（i）中种子液按照9%的接种量接种到10L发酵罐中进行发酵培养，发酵罐装液量为6.8L，发酵过程温度为31℃，发酵初期控制pH6.8～7.2，发酵过程控制前24小时搅拌速度180rpm，24～48小时250rpm，48小时以后控制搅拌速度350rpm；通风量控制前24小时为0.4m3/h，24～48小时0.7m3/h，48小时以后控制通风量0.9m3/h；发酵过程测定OD600值，当OD600值达到22以上即大于等于22时，控制发酵液pH3.0～3.5，当发酵液中葡萄糖含量0.01g/L，发酵结束。
其中，所述一二级种子培养的组成为，各组分均为重量比，葡萄糖含量20%，酵母浸粉1%，硫酸镁0.03%，磷酸二氢钾0.08%，柠檬酸铵0.4%，其余为水。
所述发酵培养基的组成为，各组分均为重量百分比，葡萄糖含量40%，酵母浸粉1%，玉米浆0.2%，硫酸镁0.02%，硫酸铜0.005%，磷酸二氢钾0.08%，柠檬酸铵0.4%，其余为水。
本事实例发酵周期为90小时，制备发酵液中赤藓糖醇的含量检测结果为24.01%，赤藓糖醇的转化率为60.03%，产品纯度97.53%。
对比例1 利用解脂亚罗酵母XGSC-002制备赤藓糖醇
（i）种子液培养：将斜面菌种用生理盐水清洗至一级种子培养基，29℃，260rmp培养24小时，转接至二级种子培养基中，接种量5%，29℃，260rmp连续培养24小时，当细胞OD600达到20以上时，停止培养，得到种子液。
（ii）发酵培养：将（i）中种子液按照10%的接种量接种到10L发酵罐中进行发酵培养，发酵罐装液量为6.8L，发酵过程温度为29℃，发酵初期控制pH6.8～7.2，发酵过程控制前24小时搅拌速度150rpm，24～48小时200rpm，48小时以后控制搅拌速度300rpm；通风量控制前24小时为0.4m3/h，24～48小时0.6m3/h，48小时以后控制通风量0.7m3/h；发酵过程测定OD600值，当OD600值达到22以上时，控制发酵液pH3.1～3.5，当发酵液中葡萄糖含量0.01g/L，发酵结束。
其中，所述一二级种子培养的组成为，各组分均为重量比，葡萄糖含量20%，酵母浸粉1%，硫酸镁0.03%，磷酸二氢钾0.08%，柠檬酸铵0.4%，其余为水。
所述发酵培养基的组成为，各组分均为重量百分比，葡萄糖含量30%，酵母浸粉1%，玉米浆0.2%，硫酸镁0.02%，硫酸铜0.005%，磷酸二氢钾0.08%，柠檬酸铵0.4%，其余为水。
本事实例发酵周期为100小时，制备发酵液中赤藓糖醇的含量检测结果为16.86%，赤藓糖醇的转化率为56.2%，产品纯度96.12%。
对比例2 利用解脂亚罗酵母XGSC-002制备赤藓糖醇
本实施例中种子培养、发酵培养方法、一级种子培养基配方与对比例1相同。
本实施例中发酵培养基中葡萄糖含量为35%，其余成分与对比例1相同。
本事实例发酵周期为101小时，制备发酵液中赤藓糖醇的含量检测结果为20.12%，赤藓糖醇的转化率为57.49%，产品纯度95.36%。
实施例3～5及对比例1～2的发酵周期、赤藓糖醇产率、转化率及产品纯度见表2所示。
表2实施例与对比例的主要参数对比
Figure 340185DEST_PATH_IMAGE002
综上可知，实施例3～5耐渗解脂亚罗酵母XGSC-003发酵制备赤藓糖醇，其发酵周期缩短为86～90小时，转化率达到60%以上，而对比例1～2未诱变的解脂亚罗酵母发酵制备赤藓糖醇，发酵周期均在100小时以上，因此耐高渗解脂亚罗酵母可明显缩短发酵周期，相比出发菌株XGSC-002发酵周期缩短了11-15小时。
以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要了解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种形式的改变或修改，这并不影响本发明的保护范围。

Claims (1)

1.一种耐高渗的解脂亚罗酵母菌株，该菌株已经于2021年11月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No. 23943。
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