CN105400725A

CN105400725A - 一株植物乳杆菌及其应用

Info

Publication number: CN105400725A
Application number: CN201510958448.9A
Authority: CN
Inventors: 艾连中; 冯小婉; 夏永军; 王光强; 印伯星; 张汇; 熊志强
Original assignee: University of Shanghai for Science and Technology
Current assignee: University of Shanghai for Science and Technology
Priority date: 2015-12-18
Filing date: 2015-12-18
Publication date: 2016-03-16
Anticipated expiration: 2035-12-18
Also published as: CN105400725B

Abstract

本发明提供了一株植物乳杆菌(Lactobacillus？plantarum)AR-307菌株及其应用。该菌株从腌制泡菜中筛选得到，其保藏编号为CGMCC？10773，可作为紫薯发酵产品发酵剂用于制备紫薯酱或紫薯酸奶，同时还可作为提取胞外多糖的原料。本发明的植物乳杆菌AR-307使紫薯发酵产品营养全面、附加值高、口感好。本菌株产生的胞外多糖能够显著改善紫薯发酵产品的组织状态、持水力等特性，提高产品稳定性，使产品无需添加稳定剂，满足消费者对绿色发酵食品的需求。

Description

一株植物乳杆菌及其应用

技术领域

本发明属于微生物领域，具体涉及一株植物乳杆菌及其在紫薯发酵品制备以及胞外多糖提取中的应用。

背景技术

随着健康食品行业的迅速发展，消费者对食品的品质以及保健功效的逐渐重视，紫薯、黑米等原料在食品中的应用也越来越多。紫薯不仅富含具有较强生理活性的花青素类化合物及酚类化合物，还含有可溶性糖、蛋白质、维生素、氨基酸等物质，营养价值很高。

紫薯发酵酸奶是以紫薯为原料，经乳酸菌发酵而制得一种具有营养保健功能的食品。由于使用紫薯为主要原料，紫薯发酵酸奶中的脂肪、胆固醇相对于同类产品含量明显下降，而低级脂肪酸和必需脂肪酸含量增加，更易于人体消化吸收。同时，紫薯发酵酸奶中富含植物多酚，可有效促进人体肠道中有益菌的增殖，抑制有害菌的生长，通过调节肠道微生态平衡维护人体健康。此外，紫薯发酵酸奶中的生物活性成分经乳酸菌发酵之后，具有更强的生理功能，生物利用率得以提升，营养效果更趋完善。

在乳制品的制备过程中，乳脂肪对于形成乳制品特有的质构、风味和口感有重要作用。采用紫薯等天然物质发酵制备的低脂酸奶由于脂肪含量较低，常常出现粘稠度低、组织状态粗糙、乳清析出、口感差等不良现象。同时，在一般的乳制品的制备过程中，为了降低脂肪含量，往往采用单纯减少配料中的乳脂含量的方法，这样反而会降低产品的可接受性。

乳酸菌胞外多糖(EPS)是指乳酸菌在其生长、代谢过程中分泌到胞外的荚膜多糖或粘液，其成分和结构复杂，可以作为增稠剂、稳定剂、持水剂等应用于食品、制药等诸多领域。在乳制品中，胞外多糖生产菌及其所产生的胞外多糖具有粘性和稳定性，可以有效地改善发酵乳的流变学特性和质构特性，避免乳清析出，也可以改善润滑感和风味。同时，高产胞外多糖乳酸菌也能够有效地结合酸奶中多余的水分，提高酸奶的粘度，并且降低机械加工过程对酸奶产品的质构损伤，减少产品的脱水收缩缺陷。

此外，高产胞外多糖菌株所产的胞外多糖还具有良好的生理功能，乳增强肠黏膜吸附能力，调节免疫力、降低胆固醇和血压等。因此，开展高产胞外多糖乳酸菌的筛选工作，对于改善乳制品的生产加工、开发特色的酸奶制品，具有非常重要的经济效益和社会效益。

发明内容

本发明针对现有技术中缺乏高产胞外多糖的乳酸菌的不足，提供一株能够高产胞外多糖的植物乳杆菌及其应用。本发明的植物乳杆菌的第一应用是将其在适宜条件下制备紫薯发酵产品，发酵后得到的产品酸度柔和，风味饱满，质构良好；本发明的第二个应用是将其作为提取胞外多糖的原料，从植物乳杆菌的发酵液中提取胞外多糖。

为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：

本发明提供了一株植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)AR-307菌株，已保藏于中国普通微生物保藏中心，保藏编号为CGMCCNO.10773。

进一步的，本发明提供了植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)AR-307菌株的筛选方法，具有这样的特征，包括以下步骤：步骤1，将腌制泡菜碾碎，加入一定量的无菌水，剧烈震荡一段时间，采用浓度梯度稀释法稀释泡菜液，取稀释液100uL涂布于MRS培养基平板上，32～37℃厌氧培养48h，而后进行划线分离纯化，得到分离菌株；步骤2，将步骤1中的挑丝粘度大的分离菌株接种至MRS液体培养基中，32～37℃静置培养16～24h，制备成种子液；步骤3，将步骤2中的种子液按照一定的接种量接入灭好菌的MRS液体培养基中，32～37℃静置培养24～48h，测定发酵液中胞外多糖含量，筛选出含量最高的菌株，得到AR-307菌株。

进一步的，本发明还提供了一种植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)AR-307菌株作为紫薯牛乳发酵产品发酵剂的用途。

采用植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)AR-307菌株作为发酵剂进行紫薯发酵产品的制备的方法，包括以下步骤：步骤1，将植物乳杆菌AR-307菌株进行活化，得到活化菌种；步骤2，将活化菌种以质量体积比为3-5％的接种量接种于含紫薯粉和低脂牛乳或无菌水混合液的容器中，32～37℃静置发酵至凝乳，冷却后放入3～6℃冰箱进行后熟15-20h，得到紫薯发酵产品。

其中，紫薯发酵产品为紫薯酸奶或紫薯酱。步骤1中所述的活化的方法是：将保藏于MRS培养基中的植物乳杆菌AR-307按质量比为3～5％的接种量接入灭菌MRS培养基中，32℃静置培养16～24h进行培养。

进一步的，本发明还提供了一种植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)AR-307菌株作为提取胞外多糖的原料的用途。采用植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)AR-307菌株作为原料，从中提取胞外多糖的方法包括以下步骤：步骤1，制备植物乳杆菌AR-307菌株发酵液；步骤2，将发酵液煮沸后离心去除菌体以及凝结蛋白，得到上清液；步骤3，分别采用三氯乙酸法除去上清液中沉淀蛋白以及醇沉淀法沉淀上清液，得到上清液沉淀；步骤4，将上清液沉淀溶解于水后再用水透析，得到所述胞外多糖。

其中，在步骤1中，制备植物乳杆菌AR-307菌株发酵液的方法包括以下子步骤；子步骤1-1，菌种活化：将植物乳杆菌AR-307菌种接种于MRS固体培养基中，在32～37℃条件下培养16～24h进行活化，连续活化两代，得到活化菌种；子步骤1-2，将子步骤1-1中的活化菌种以质量体积比为3～5％的接种量接种于MRS液体培养基中，在32～37℃条件下培养14～18h，用作母发酵液；子步骤1-3，将子步骤1-2中的母发酵液以体积比为5％的接种量接种于MRS液体培养基中，在32～37℃条件下培养16～24h，得到植物乳杆菌AR-307菌株发酵液。在步骤3中，三氯乙酸法是在上清液中添加三氯乙酸至质量浓度为4％，静置12～24h，而后4℃、9000g、离心15～30min除去沉淀蛋白；所述醇沉淀法是向三氯乙酸法得到的上清液中加乙醇至乙醇体积百分比为75％，4℃静置20～28h，而后4℃、9000g、离心15～30min取沉淀。

发明作用与效果

本发明筛选出的植物乳杆菌AR-307在发酵低脂酸奶过程中产酸较为缓慢。一方面，使得酸奶产品酸度柔和，风味饱满；另一方面，使得发酵所得的低脂酸奶粘稠，避免了人工乳脂的添加。

另外，本发明所提供植物乳杆菌AR-307菌株产生胞外多糖的能力显著，不仅能够显著改善酸奶的组织状态等质构特性，减少乳清析出，而且使的产品无需添加稳定剂就能够满足消费者对无添加低脂酸奶的需求。

第三，本发明提供的高产胞外多糖乳酸菌株及其低脂酸奶发酵过程简单，有利于大规模工业化应用的实现。

附图说明

图1是本发明的植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)AR-307菌株的菌体拉丝图；

图2是本发明的植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)AR-307菌株的生长曲线图。

具体实施方式

以下结合附图来说明本发明的具体实施方式。对于实施例中所用到的具体方法或材料，本领域技术人员可以在本发明技术思路的基础上，根据已有的技术进行常规的替换选择，而不仅限于本发明实施例的具体记载。

实施实例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例中所用到的培养基的制备方法如下：

MRS固体培养基：蛋白胨10g/L，牛肉膏10g/L，酵母提取物5g/L，K₂HPO₄2g/L，柠檬酸二铵2g/L，乙酸钠5g/L，葡萄糖20g/L，吐温801mL，MgSO₄·7H₂O0.58g/L，MnSO₄·4H₂O0.25g/L，琼脂20g/L，调节pH至6.4。

脱脂牛乳培养基：脱脂乳粉100g/L，115℃灭菌15min。

实施例一、植物乳杆菌AR-307菌株的筛选与鉴定

1.样品稀释液制备及菌株分离

从腌制泡菜中分离提取植物乳杆菌AR-307菌株。首先将腌制泡菜碾碎，加入15mL无菌水，剧烈震荡20min；然后采用浓度梯度稀释法，取稀释液100uL涂布于MRS琼脂培养基平板上，32～37℃厌氧培养48h，挑选菌落大、生长快、挑丝粘度大的菌株，进一步划线分离纯化。

2菌株筛选

将1.1中挑丝粘度大的菌株接种至MRS液体培养基中，32～37℃静置培养16～24h，制备成种子液；然后按照体积分数为3～5％的接种量接入灭好菌的MRS液体培养基中，32～37℃静置培养24～48h，测定发酵液中胞外多糖含量，实验结果如表1所示。

如表1所示，AR-307菌株产胞外多糖的能力最强。

3菌株鉴定

AR-307菌株的菌落形状如图1所示：呈椭圆形或类圆形，边缘整齐，菌落大小一般为2～3mm，乳白色。

通过16SrDNA序列对比分析，结果显示该序列与NCBI数据库中植物乳杆菌的同源性达99％，可以鉴定该菌为植物乳杆菌。该植物乳杆菌AR-307菌株已于2015年4月29日保藏于中国普通微生物保藏中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，其编号为CGMCC10773。

4菌株生长特性

将活化好的植物乳杆菌AR-307按3～5％(v/v)接种量接入MRS液体培养基中，37℃静置培养24h，每隔2h在600nm测定培养液的菌浓。以菌体浓度对时间作图得到菌株AR-307在MRS中的生长曲线，其结果如图2所示：植物乳杆菌AR-307在MRS培养基中生长迅速，在4h左右进入对数期，18h左右进入稳定期。随着培养时间的延长，菌株生长产酸，pH不断降低，进入稳定期。

实施例一的作用与效果

本实施例提供了从腌制泡菜中筛选植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)AR-307菌株的筛选方法，采用梯度浓度稀释法，将稀释后的样品液涂布于MRS平板，37℃厌氧培养48h，而后进行划线分离纯化，得到分离菌株，而后结合胞外多糖的产生能力实验确定AR-307菌株，并通过序列比对进行菌株种属的确定。该AR-307菌株产生胞外多糖的能力很强，胞外多糖的浓度可达389.3mg/L。

实施例二、利用植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)AR-307菌株作为发酵剂进行紫薯酱以及紫薯酸奶的制备

制备例1：制备紫薯酱

步骤1，将保藏于MRS培养基中的植物乳杆菌AR-307按质量比为5％的接种量接入灭菌MRS培养基中，32℃静置培养16～24h进行培养，得到活化菌种；

步骤2，将活化后的菌种按5％(m/v)的接种量接种于含紫薯粉和无菌水混合的容器中，紫薯粉含量为0.5％(m/v)，32～37℃(优选37℃)静置发酵，冷却后放入4℃冰箱进行后熟15h，得到紫薯酱。

根据本制备例的方法制备得到的紫薯酱酸度柔和，紫薯酱粘度为3670mPa·s，持水力为58.88％，酸度为78°T。

制备例2，制备紫薯酸奶

步骤1，将保藏于MRS培养基中的植物乳杆菌AR-307按质量比为3％的接种量接入灭菌MRS培养基中，32℃静置培养24h进行培养，得到活化菌种；

步骤2，将活化后的菌种按4％(m/v)的接种量接种于含紫薯粉和低脂牛乳混合液的容器中，紫薯粉含量为4％(m/v)，37℃静置发酵，冷却后放入4℃冰箱进行后熟18h，得到紫薯酸奶。

根据本制备例的方法制备得到的紫薯酸奶酸度柔和，极少乳清析出，低脂酸奶粘度为7597mPa·s，酸奶持水力为62.17％，酸度为80°T。

制备例3，制备紫薯酸奶

步骤2，将活化后的菌种按3％(m/v)的接种量接种于含紫薯粉和低脂牛乳混合液的容器中，紫薯粉含量为8％(m/v)，37℃静置发酵，冷却后放入4℃冰箱进行后熟20h，得到紫薯酸奶。

根据本制备例的方法制备得到的紫薯酸奶酸度柔和，极少乳清析出，低脂酸奶粘度为9251mPa·s，酸奶持水力为69.53％，酸度为85°T。

实施例二的作用与效果

利用本实施例的方法制备的紫薯发酵产品，不仅酸度柔和，粘度适中，而且能够有效促进紫薯中的花青素、硒等营养元素的释放。通过发酵有效结合了动物蛋白营养与植物膳食纤维的作用，产品营养全面、附加值高、口感好，更有利于人体接收和消化。

实施例三，植物乳杆菌AR-307的胞外多糖的提取

步骤1，菌种活化：将植物乳杆菌AR-307菌种接种于MRS固体培养基中，在32～37℃条件下培养16～24h进行活化，连续活化两代；

步骤2，种子培养：植物乳杆菌AR-307经活化后，5％(m/v)的接种量接种于MRS中，在32～37℃条件下培养14～18h，用作母发酵液。

步骤3，发酵培养：将植物乳杆菌AR-307母发酵液以5％(v/v)的接种量接种于MRS中，在32～37℃条件下培养16～24h。

步骤4，EPS的提取纯化：将上述制备的发酵液首先经过沸水浴10min，以失活可降解多糖的酶，然后离心(15～30min，9000g，4℃)除去菌体和凝结蛋白，上清液浓缩至原体积的1/3，添加80％(w/v)三氯乙酸至终浓度4％(w/v)，静置过夜，离心(15～30min，9000g，4℃)除去沉淀蛋白，浓缩液加95％(v/v)乙醇至终浓度75％(v/v)，4℃静置24h，离心(15～30min，9000g，4℃)，取沉淀去离子水溶解，离心(15～30min，9000g，4℃)去沉淀，上清液去离子水透析72h，每8h换水一次，冷冻干燥得粗多糖样品。

实施例三的作用与效果

根据实施例三的方法，胞外多糖的浓度可高达389mg/L。

Claims

1.一株植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)AR-307菌株，已保藏于中国普通微生物保藏中心，保藏编号为CGMCCNO.10773。

2.植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)AR-307菌株的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1，将腌制泡菜碾碎，加入一定量的无菌水，剧烈震荡一段时间，采用浓度梯度稀释法稀释泡菜液，取一定量的稀释液涂布于MRS培养基平板上，32～37℃厌氧培养48h，而后进行划线分离纯化，得到分离菌株；

步骤2，将所述步骤1中的挑丝粘度大的分离菌株接种至MRS液体培养基中，32～37℃静置培养16-24h，制备成种子液；

步骤3，将所述步骤2中的种子液按照一定的接种量接入灭好菌的MRS液体培养基中，32～37℃静置培养24-48h，测定发酵液中胞外多糖含量，筛选出含量最高的菌株，得到所述AR-307菌株。

3.植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)AR-307菌株作为紫薯发酵产品发酵剂的用途。

4.一种紫薯发酵产品的制备方法，其特征在于，采用植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)AR-307菌株作为发酵剂，包括以下步骤：

步骤1，将所述植物乳杆菌AR-307菌株进行活化，得到活化菌种；

步骤2，将所述活化菌种以质量体积比为3-5％的接种量接种于含紫薯粉和低脂牛乳或无菌水混合液的容器中，32～37℃静置发酵至凝乳，冷却后放入3～6℃冰箱进行后熟15-20h，得到所述紫薯发酵产品。

5.根据权利要求4所述的紫薯发酵产品的制备方法，其特征在于：

其中，所述紫薯发酵产品为紫薯酸奶或紫薯酱。

6.根据权利要求4所述的紫薯发酵产品的制备方法，其特征在于：

其中，步骤1中所述的活化的方法是：将保藏于MRS培养基中的植物乳杆菌AR-307按质量比为3～5％的接种量接入灭菌MRS培养基中，32℃静置培养16-24h进行培养。

7.植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)AR-307菌株作为提取胞外多糖的原料的用途。

8.一种胞外多糖的提取方法，其特征在于，采用植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)AR-307菌株作为原料，包括以下步骤：

步骤1，制备植物乳杆菌AR-307菌株发酵液；

步骤2，将所述发酵液煮沸后离心去除菌体以及凝结蛋白，得到上清液；

步骤3，分别采用三氯乙酸法除去所述上清液中沉淀蛋白以及醇沉淀法沉淀所述上清液，得到上清液沉淀；

步骤4，将所述上清液沉淀溶解于水后再用水透析，得到所述胞外多糖。

9.根据权利要求8所述的胞外多糖的提取方法，其特征在于：

其中，在所述步骤1中，制备所述植物乳杆菌AR-307菌株发酵液的方法包括以下子步骤；

子步骤1-1，菌种活化：将植物乳杆菌AR-307菌种接种于MRS固体培养基中，在32～37℃条件下培养16～24h进行活化，连续活化两代，得到活化菌种；

子步骤1-2，将所述子步骤1-1中的所述活化菌种以体积比为3～5％的接种量接种于MRS液体培养基中，在32～37℃条件下培养14～18h，用作母发酵液；

子步骤1-3，将所述子步骤1-2中的所述母发酵液以体积比为3～5％的接种量接种于MRS液体培养基中，在32～37℃条件下培养16～24h，得到所述植物乳杆菌AR-307菌株发酵液。

10.根据权利要求8所述的胞外多糖的提取方法，其特征在于：

其中，在所述步骤3中，所述三氯乙酸法是在上清液中添加三氯乙酸至其最终的质量体积比为4～6％，静置12～24h，而后4℃、9000g、离心15～30min除去沉淀蛋白，

所述醇沉淀法是向所述三氯乙酸法得到的上清液中加乙醇至乙醇体积百分比为75％，4℃静置20～28h，而后4℃、9000g、离心15～30min取沉淀。