KR20160091905A - 미세조류 바이오매스의 카로티노이드 및 단백질 강화 방법 - Google Patents

미세조류 바이오매스의 카로티노이드 및 단백질 강화 방법 Download PDF

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KR20160091905A
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Abstract

본 발명은 종속 영양 조건 하에 배양되는 미세조류의 바이오매스(biomass)의 카로티노이드 및 단백질 강화 방법에 관한 것으로서, 여기서 상기 미세조류는 클로렐라(Chlorella) 속의 것이고, 바람직하게는 효모 추출물, 옥수수 침지액 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 유기 형태의 질소 공급원으로 보강된 최소 배지에서 미세조류를 배양하는 것을 포함한다.

Description

미세조류 바이오매스의 카로티노이드 및 단백질 강화 방법{PROCESS FOR ENRICHMENT OF MICROALGAL BIOMASS WITH CAROTENOIDS AND WITH PROTEINS}
본 발명은 미세조류 바이오매스(microalgal biomass), 보다 구체적으로는 클로렐라(Chlorella) 속, 보다 더 구체적으로는 클로렐라 소로키니아나(Chlorella sorokiniana) 종의 카로티노이드 강화 및 단백질 강화 방법에 관한 것이다.
대형조류(macroalgae) 및 미세조류는, 대체로 미개척된 채로 남아 있는 특이적인 풍부함을 가지고 있다. 음식, 화학 또는 바이오에너지 목적을 위한 대형조류 및 미세조류의 활용은 여전히 매우 미미하다. 그럼에도 불구하고, 대형조류 및 미세조류는 대단한 가치의 성분을 함유하고 있다.
실제로, 미세조류는 비타민, 지질, 단백질, 당, 안료 및 산화방지제의 공급원이다.
따라서, 조류(algae) 및 미세조류는 산업 분야에서 관심이 있는 대상이며, 여기서 조류 및 미세조류는 식품 보조제, 기능성 식품, 화장품, 약물의 제조 또는 수경재배에 사용된다.
미세조류는 광에 노출된 모든 생물학적 환경에서 대량 서식하는, 다른 무엇보다도 더 광합성 미생물이다.
산업적 규모에서, 미세조류의 단일 클론 배양은 광생물반응기(독립 영양 조건: CO2와 광)에서 수행되거나, 일부는 또한 발효조(종속 영양 조건: 탄소 공급원의 존재 하에 암흑)에서 수행된다.
이것은 미세조류의 일부 종, 즉 클로렐라, 니츠시아(Nitzschia), 시클로텔라(Cyclotella), 테트라셀미스(Tetraselmis), 크립테코디늄(Crypthecodinium), 쉬조키트리움(Schizochytrium)이 광의 부재 하에 성장할 수 있기 때문이다.
또한, 종속 영양 조건에서의 배양은 광 영양 조건에서보다 비용이 10 배 덜 드는 것으로 추정되는데, 이는 이러한 종속 영양 조건이 당업자에게
- 모든 배양 파라미터를 제어가능하게 하는, 박테리아 및 효모에 사용되는 것과 동일한 발효조의 사용, 및
- 광-기재 배양에 의해 얻어진 것보다 훨씬 더 많은 양의 바이오매스의 생성
을 가능하게 하기 때문이다.
미세조류의 유익한 활용은 일반적으로 미세조류의 관심이 있는 성분, 예컨대
- 안료(엽록소 a, b 및 c, β-카로틴, 아스타크산틴, 루테인, 피코시아닌, 크산토필, 피코에리트린 등)(미세조류의 주목할 만한 산화방지 특성 및 이의 식품에 대한 천연 색소의 공급 둘 다로 인해 미세조류의 수요가 증가하고 있음),
- 단백질(미세조류의 영양 품질을 최적화하기 위함), 또는
- 지질(특히
· 바이오연료 용도, 뿐만 아니라
· 선택되는 미세조류가 "필수" (즉, 인간 또는 동물에 의해 자연적으로 생성되는 것이 아니기 때문에 음식에 의해 공급되는) 다불포화(polyunsaturated) 지방산, 즉 PUFA를 생성할 경우 인간 소비를 위한 식품 또는 동물 사료에서의 용도
를 위해 지방산의 함량을 최적화하기 위함(미세조류 고형분의 60 중량％ 이하, 또는 심지어 80 중량％ 이하))
의 축적을 가능하게 하는 발효 조건의 제어를 필요로 한다.
따라서, 이러한 결과를 얻기 위하여, 높은 세포 밀도(HCD)를 얻을 수 있게 하는 제1 발효 방법은 최대 단백질 또는 지질 수율 및 생산성을 얻기 위하여 철저하게 연구되어 왔다.
이러한 HCD 배양의 목적은 가능한 최단 시간 내에 원하는 생성물의 가능한 최고 농도를 얻는 것이었다.
이러한 원리는, 예를 들어 클로렐라 조핀지엔시스(Chlorella zofingiensis)에 의한 아스타크산틴의 생합성에 의해 증명되어 있으며, 여기서 미세조류의 성장이 이러한 화합물의 생성과 직접적으로 관련되어 있는 것으로 입증되었다(Wang and Peng, 2008, World J Microbiol. Biotechnol., 24(9), 1915-1922).
그러나, 미세조류의 최고 속도(μ(단위: h-1))로 성장을 유지하는 것이 원하는 생성물의 높은 생성과 항상 관련되어 있는 것은 아니다.
실제로, 예를 들어 미세조류가 큰 지질 저장고를 만들게 하는 것이 요구될 경우, 미세조류를 이의 성장을 제한하는 영양상의 스트레스에 노출시키는 것이 필요하다는 것이 당업자에게는 매우 명백해졌다.
따라서, 발효 방법에서, 성장 및 생성은 이제부터 분리된다.
예를 들어, 다불포화 지방산(이 경우, 도코사헥산산, 즉 DHA)의 축적을 촉진시키기 위하여, 특허 출원 WO 01/54510은 다불포화 지방산의 생성으로부터 세포 성장을 분리해서 생각할 것을 권고한다.
따라서, 미세조류 쉬조키트리움 종(Schizochytrium sp.; 균주 ATCC 20888)에서, 제1 성장 단계는 따라서 산소의 제한 없이 수행되어 높은 세포 밀도(100 g/l 초과)를 얻는 것을 촉진시키고, 이어서 제2 단계에서, 산소의 공급이 점진적으로 늦춰져서 미세조류에게 스트레스를 주고, 이의 성장을 늦추며, 관심이 있는 지방산의 생성을 촉발시킨다.
미세조류 크립테코디늄 코니(Crypthecodinium cohnii)에서, 도코사헥산산(DHA, 다불포화 지방산)의 최고 함량은 낮은 글루코스 농도(약 5 g/l)에서 및 이에 의한 낮은 성장 속도에서 얻어진다(Jiang and Chen, 2000, Process Biochem ., 35(10), 1205-1209).
이러한 결과는 생성물 형성 속도가 미세조류의 성장과 긍정적으로 및 부정적으로 모두, 또는 심지어 이 둘의 조합과 연관될 수 있다는 사실의 좋은 실례이다.
따라서, 생성물의 형성이 높은 세포 성장과 관련이 없는 경우, 세포 성장의 속도를 제어하는 것을 신중히 해야 한다.
일반적으로, 당업자는 발효 조건(온도, pH)을 제어하거나, 발효 배지에 영양 성분을 공급하는 것을 조절("유가 배양(fed batch)"으로 칭해지는 반연속 조건)함으로써 미세조류의 성장을 제어하는 것을 선택한다.
당업자가 탄소 공급원의 공급을 통해 종속 영양으로 미세조류의 성장을 제어하는 것을 선택할 경우, 당업자는 일반적으로 생성된 대사 물질(예를 들어, DHA 유형의 다불포화 지방산)에 따라서 탄소 공급원(순수 글루코스, 아세테이트, 에탄올 등)을 미세조류(시. 코니(C. cohnii), 유글레나 그라실리스(Euglena gracilis) 등)에 적합하도록 선택한다.
또한 온도가 중요한 파라미터일 수 있다:
- 예를 들어, 미세조류의 일부 종에서 다불포화 지방산, 예컨대 클로렐라 미누티시마(Chlorella minutissima)에 의한 EPA의 합성은 상기 미세조류의 최적의 성장에 요구되는 온도보다 더 낮은 온도에서 촉진되는 것으로 보고되었음;
- 반면, 루테인 수율은 생성 온도가 24℃에서 35℃로 증가될 때 종속 영양적으로 배양된 클로렐라 프로토테코이데스(Chlorella protothecoides)에서 더 높음.
실제로, 클로렐라 프로토테코이데스는 최고의 오일-생성 미세조류 중 하나인 것으로 알려져 있다.
종속 영양 조건에서, 클로렐라 프로토테코이데스는 탄수화물을 트리글리세리드로 신속하게 전환시킨다(클로렐라 프로토테코이데스 고형분의 50％ 초과).
이러한 트리글리세리드의 생성을 최적화하기 위하여, 당업자는 발효 배지의 영양 환경에 영향을 미침으로써 오일 생성으로의 탄소 흐름이 최적화되도록 한다.
따라서, 질소 결핍 조건 하이지만 탄소의 충분한 공급이 있을 경우 오일이 축적되는 것으로 알려져 있다.
따라서, C/N 비는 여기서 결정적인 인자이며, 최상의 결과는, 글루코스 함량이 제한 인자가 아니라, 질소 함량에 직접적으로 작용함으로써 얻어진다는 것이 인정된다.
당연하게도 이러한 질소 결핍은 세포 성장에 영향을 미쳐서, 미세조류에 대한 정상 성장 속도보다 30％ 더 낮은 성장 속도를 초래한다(Xiong et al., Plant Physiology, 2010, 154, pp. 1001-1011).
이러한 결과를 설명하기 위하여, 상기 언급한 문헌에서 Xiong 등은 실제로 클로렐라 바이오매스가 이의 5 가지 주요 성분, 즉 탄수화물, 지질, 단백질, DNA 및 RNA(클로렐라 바이오매스 고형분의 85％를 나타냄)로 나누어질 경우, C/N 비는 DNA, RNA 또는 탄수화물의 함량에는 영향을 미치지 않지만, 단백질 및 지질의 함량에는 매우 중요하게 된다는 것을 입증하였다.
따라서, 낮은 C/N 비로 배양된 클로렐라 세포는 25.8％의 단백질 및 25.23％의 지질을 함유하는 반면, 높은 C/N 비는 53.8％의 지질 및 10.5％의 단백질의 합성을 가능하게 한다.
따라서, 클로렐라 바이오매스의 오일 생성을 최적화하기 위하여, 당업자는 단백질 생성을 희생시키면서 탄소 흐름이 오일 생성으로 향하도록 함으로써 탄소 흐름을 제어하는 것이 필수적이며; 탄소 흐름은 미세조류가 질소-결핍 배지에 놓일 때 지질 저장 물질로서 재분배되고 축적된다.
따라서, 이러한 교시를 숙지하면서, 단백질-풍부 바이오매스를 생성하기 위하여, 당업자는 이러한 물질 대사 제어의 정반대의 것이 수행되도록, 즉 대신에 낮은 C/N 비를 촉진시킴으로써 발효 조건을 개질시키고, 따라서:
- 단백질로 전환될 탄소 공급원 공급 원료를 지속적으로 유지시키면서 발효 배지에 다량의 질소 공급원을 공급하고,
- 미세조류의 성장을 자극시킨다.
이것은 저장 지질 생성을 희생시키면서, 탄소 흐름을 단백질 (및 따라서 바이오매스) 생성으로 향하도록 개질시키는 것을 포함한다.
본 발명의 맥락에서, 본 출원인 회사는 당업자에 의해 통상적으로 구상되어 온 것에 대한 또 다른 해결책을 제안함으로써 원래의 경로를 탐구하는 것을 선택하였다.
따라서, 본 발명은 종속 영양적으로 배양된 미세조류 바이오매스의 카로티노이드 강화 및 단백질 강화 방법에 관한 것으로, 상기 미세조류는 클로렐라 속의 것, 보다 더 구체적으로는 클로렐라 소로키니아나이고, 종속 영양 배양 방법은 효모 추출물 및 옥수수 침지액, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 질소 공급원으로 보강된 최소 배지에서 상기 미세조류를 배양하는 것을 포함한다.
본 발명의 맥락에서,
- 카로티노이드 "강화"는 바이오매스 중 카로티노이드의 함량이 오로지 최소 배지에서만 배양된 바이오매스 중 카로티노이드의 함량과 비교하여, 바이오매스의 총 중량을 기준으로 0.05％ 이상, 바람직하게는 0.1％ 이상 증가된 것을 의미하는 것으로 의도된다. 바람직하게, 본 발명에 따른 방법에 의해 얻어진 바이오매스는 바이오매스의 총 중량을 기준으로 0.35％ 이상, 보다 구체적으로는 바람직하게 바이오매스의 총 중량을 기준으로 0.4％ 이상의 카로티노이드의 함량을 갖고;
- 단백질 "강화"는 바이오매스 중 단백질의 함량이 오로지 최소 배지에서만 배양된 바이오매스 중 단백질의 함량과 비교하여, 바이오매스의 총 중량을 기준으로 5％ 이상, 바람직하게는 10％ 이상 증가된 것을 의미하는 것으로 의도된다. 바람직하게, 본 발명에 따른 방법에 의해 얻어진 바이오매스는 바이오매스의 총 중량을 기준으로 45％ 이상, 보다 구체적으로는 바람직하게 바이오매스의 총 중량을 기준으로 50％ 이상의 단백질의 함량을 갖는다.
본 발명의 맥락에서, "최소 배지"는 통상적으로 임의의 특정 요건을 갖지 않는, 미세조류에 의해 사용될 수 있는 형태로 미세조류의 성장에 절대적으로 필요한 화학 요소만을 함유하는 배지로서 정의된다.
따라서, 최소 배지는
- 탄소 및 에너지의 공급원: 일반적으로 글루코스
- 칼륨 및 인의 공급원: 예를 들어, K2HPO4
- 질소 및 황의 공급원: 예를 들어, (NH4)2SO4
- 마그네슘의 공급원: 예를 들어, MgSO4.7H2O
- 칼슘의 공급원: 예를 들어, CaCl2.2H2O
- 철의 공급원: 예를 들어, FeSO4.7H2O
- 미량 원소의 공급원: Cu, Zn, Co, B, Mn, Mo의 염
- 비타민의 공급원(티아민, 비오틴, 비타민 B12 등)
을 함유한다.
그 후, 본 출원인 회사는 이러한 본질적으로 무기인 최소 배지에서 클로렐라 속, 보다 더 구체적으로는 클로렐라 소로키니아나의 미세조류의 배양이 여전히 다량의 바이오매스의 생성을 가능하게 하였으나, 이것이 카로티노이드 및 단백질과 같은 관심이 있는 성분을 희생시켰다는 것을 발견하였다.
본질적으로 무기인 배지에서 바이오매스의 높은 성장 속도(0.05 h-1 초과)는 질소에 대한 균주의 독립 영양을 뚜렷이 반영한다.
이어서, 임의의 이론에 의해 구속되고자 하는 것은 아니지만, 본 출원인 회사는 최소 배지에서 미세조류를 배양하는 것이 물질 대사 경로를 (다당류 유형의) 저장 물질의 생성으로 이끌었다는 가설을 제안한다.
이어서, 본 출원인 회사는 이러한 특정 조건(미세조류가 질소에 대하여 완전히 독립 영양임)에서 유기 형태, 즉 효모 추출물 또는 옥수수 침지액(CSL) 형태로 소량의 질소계 영양 보충물(질소 공급은 바람직하게 90％ 초과의 무기물로 남아 있음)을 공급하는 것이, 상기 다당류 저장 물질의 생성을 늦추고, 물질 대사 경로를 카로티노이드 및 단백질 생성으로 돌리게 할 수 있다는 것을 발견하였다.
따라서, 이러한 방식으로 발효를 수행하는 것은, 최소 배지에서 카로티노이드 및 단백질의 생성을 증가시키는 질소계 영양 보충물의 첨가를 용이하게 처리할 수 있게 한다.
따라서, 이러한 전략은, 예를 들어 바이오매스 중 단백질의 함량을 증가시키기 위하여, 절대적으로 반드시 이러한 바이오매스 및 따라서 세포 성장을 증가시키거나 질소의 공급원으로 발효 배지를 부스트(boost)시켜야 한다는 기술적 예상에 매우 어긋난다.
실제로, 여기서 바이오매스의 양은 일정하게 남아있으며, 영양 보충물의 첨가(바람직하게는 발효 배지에 첨가되는 전체 질소의 10 중량％ 미만)는 단백질의 과잉 생산을 초래하는 것이다.
따라서, 본 발명은 종속 영양적으로 배양된 미세조류 바이오매스의 카로티노이드 강화 및 단백질 강화 방법에 관한 것이며, 상기 종속 영양 배양 방법은 상기 미세조류를 유기 형태의 질소 공급원으로 보강된 최소 배지에서 배양하는 것을 포함한다.
미세조류는 바람직하게 클로렐라 속의 것, 특히 클로렐라 소로키니아나, 클로렐라 불가리스(Chlorella vulgaris) 및 클로렐라 케슬레리(Chlorella kessleri), 보다 구체적으로는 바람직하게는 클로렐라 소로키니아나로부터 선택되는 안료-풍부 미세조류이다.
바람직하게는, 유기 형태의 질소 공급원은 효모 추출물, 옥수수 침지액, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 보다 구체적으로는 바람직하게, 유기 형태의 질소 공급원은 효모 추출물이다. 바람직하게, 효모 추출물은 사카로마이세스 세레비시애(Saccharomyces cerevisiae)로부터 얻어진다.
유기 형태의 질소 공급원을 무기 질소 공급원을 포함하는 최소 배지에 첨가한다. 바람직하게, 유기 형태의 질소의 공급은 발효 배지(무기 및 유기 공급원을 갖춤)에 함유된 전체 질소의 10％를 초과하지 않는다.
최소 배지 중 무기 질소 공급원은 예를 들어 (NH4)2SO4 또는 NH4Cl일 수 있다.
최소 배지는 0.5 g/l 내지 3 g/l의 효모 추출물, 바람직하게는 1 g/l 내지 2 g/l의 효모 추출물로 보강될 수 있다. 보다 구체적으로는 바람직하게, 최소 배지는 약 1 g/l의 효모 추출물로 보강된다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "약"은 값 +/- 20％, 10％, 5％ 또는 2％를 나타낸다.
또한, 최소 배지는 1 g/l 내지 5 g/l의 옥수수 침지액, 바람직하게는 3 g/l 내지 5 g/l, 매우 특히 바람직하게는 4 g/l의 옥수수 침지액으로 보강될 수 있다.
일 구현예에 따라, 본 발명에 따른 방법은 오로지 최소 배지에서만 배양된 바이오매스 중 단백질의 함량과 비교하여, 바이오매스 중 단백질의 함량을 바이오매스의 총 중량을 기준으로 5％ 이상 증가시킬 수 있다. 본 발명에 따른 방법은 오로지 최소 배지에서만 배양된 바이오매스 중 단백질의 함량과 비교하여, 바이오매스 중 단백질의 함량을 바이오매스의 총 중량을 기준으로 6%, 7%, 8%, 9% 또는 10％ 이상 증가시킬 수 있다.
바람직하게, 본 발명에 따른 방법에 의해 얻어진 바이오매스 중 단백질의 함량은 바이오매스의 총 중량을 기준으로 45％, 50％ 또는 55％ 초과이다. 또 다른 구현예에 따라, 본 발명에 따른 방법은 오로지 최소 배지에서만 배양된 바이오매스 중 카로티노이드의 함량과 비교하여, 바이오매스 중 카로티노이드의 함량을 바이오매스의 총 중량을 기준으로 0.05％ 이상 증가시킬 수 있다. 본 발명에 따른 방법은 오로지 최소 배지에서만 배양된 바이오매스 중 카로티노이드의 함량과 비교하여, 바이오매스 중 카로티노이드의 함량을 바이오매스의 총 중량을 기준으로 0.1% 또는 0.2％ 이상 증가시킬 수 있다.
바람직하게, 본 발명에 따른 방법에 의해 얻어진 바이오매스 중 카로티노이드의 함량은 바이오매스의 총 중량을 기준으로 0.35%, 0.4% 또는 0.5％ 초과이다.
또 다른 측면에 따르면, 본 발명은 또한
- 최소 배지에서 미세조류를 배양하는 제1 단계, 및
- 효모 추출물, 옥수수 침지액, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 유기 형태의 질소 공급원을 최소 배지에 첨가하는 제2 배양 단계
를 포함하는 미세조류를 종속 영양적으로 배양하는 방법에 관한 것이다.
제1 단계는 미세조류의 성장을 가능하게 하고, 제2 단계는 다당류 저장 물질의 축적을 방지하고 바이오매스를 단백질 및 카로티노이드로 강화시킬 수 있게 한다.
일 구현예에 따라, 미세조류는 클로렐라 속의 것이고, 바람직하게는 클로렐라 소로키니아나, 클로렐라 불가리스 및 클로렐라 케슬레리로부터 선택되며, 바람직하게는 클로렐라 소로키니아나이다.
제2 배양 단계에서 첨가된 유기 형태의 질소 공급원은 바람직하게 효모 추출물이다.
본 발명은 보다 구체적으로
- 최소 배지에서 미세조류를 성장시키는 제1 단계,
- 효모 추출물을 최소 배지에 첨가하는 제2 단계
를 포함하는 상기 미세조류, 특히 클로렐라 소로키니아나를 종속 영양적으로 배양하는 방법에 관한 것이다.
일 특정 구현예에 따라, 유기 형태의 질소 공급원의 첨가는 발효 배지에 함유된 전체 질소의 10％를 초과하지 않는다. 특히, 최소 배지는 0.5 g/l 내지 3 g/l의 효모 추출물, 바람직하게는 1 g/l 내지 2 g/l의 효모 추출물로 보강될 수 있다.
바람직하게, 제2 배양 단계는
- 바이오매스 중 카로티노이드의 함량을 오로지 최소 배지에서만 배양된 바이오매스 중 카로티노이드의 함량과 비교하여, 바이오매스의 총 중량을 기준으로 0.05％ 이상, 바람직하게는 0.1％ 이상, 및/또는
- 바이오매스 중 단백질의 함량을 오로지 최소 배지에서만 배양된 바이오매스 중 단백질의 함량과 비교하여, 바이오매스의 총 중량을 기준으로 5％ 이상, 바람직하게는 10％ 이상
증가시킬 수 있다.
한 바람직한 방식에 따라, 얻어진 바이오매스 중
- 카로티노이드의 함량은 바이오매스의 총 중량을 기준으로 0.35％ 이상, 바람직하게는 바이오매스의 총 중량을 기준으로 0.4％ 이상이고/이상이거나
- 단백질의 함량은 바이오매스의 총 중량을 기준으로 45％ 이상, 바람직하게는 바이오매스의 총 중량을 기준으로 50％ 이상이다.
선택적으로, 하기 실시예에서 입증되는 바와 같이, 제2 단계에서 글루코스는 상기 미세조류의 글루코스 소비 용량보다 상당히 낮은 값으로 연속적으로 공급된다.
미세조류 바이오매스의 카로티노이드 강화 및 단백질 강화 방법에 관한 상기 기재한 구현예는 또한 이러한 측면에서 구상된다.
본 발명은 예시적이고 비제한적인 것으로 의도된 하기 실시예로부터 보다 명확하게 이해될 것이다.
실시예
시. 소로키니아나의 생성 - 효모 추출물의 첨가
사용된 균주는 클로렐라 소로키니아나 UTEX 1663이었다.
전배양 ( preculture ):
- 2 l 삼각 플라스크 중 600 ml의 배지;
- 배지의 조성:
Figure pct00001
8 N NaOH를 첨가하여 멸균 전에 pH를 7로 조정하였다.
다음의 조건 하에 인큐베이션을 수행하였다: 기간: 72 시간; 온도: 28℃; 교반: 110 rpm(Infors Multitron 인큐베이터).
이어서, 전배양을 30 l Sartorius 유형 발효조로 옮겼다.
바이오매스 생성을 위한 배양:
기본 배지는 전배양의 것과 동일하였지만, 우레아는 NH4Cl로 대체하였다:
Figure pct00002
시험 1: 대조군; 영양 보충물을 첨가하지 않았다.
시험 2: 1 g/l의 효모 추출물을 첨가하였다.
발효조의 초기 부피(Vi)를 접종 후에 13.5 l로 조정하였다. 최종적으로 16 l 내지 20 l로 만들었다.
발효를 수행하기 위한 파라미터는 다음과 같았다:
Figure pct00003
초기에 공급된 글루코스가 소모되었을 때, 초기 배지와 유사한 배지를 특히 500 g/l의 글루코스를 함유하는 농축된 용액의 형태로 공급하였다.
하기 표는 이러한 농축된 용액의 1 리터의 조성을 제공한다:
Figure pct00004
글루코스 이외의 요소의 농도는 상기 요소가 균주의 영양 요건에 대하여 과량으로 존재하도록 결정되었다.
이러한 용액을 균주의 글루코스 소비 용량보다 낮은 속도로 연속적으로 공급하였다. 이러한 방식으로, 배지 중 잔류 글루코스 함량을 0으로 유지시켰으며; 즉, 균주의 성장은 글루코스 가용량에 의해 제한되었다(글루코스-제한 조건).
이러한 속도는 하기 식에 따라 시간 경과에 따라 기하급수적으로 증가하였다:
S = 12.exp(0.07 × t)
상기 식에서, S = 글루코스 공급 속도(단위: g/h) 및 t = 유가 배양 방식 기간(단위: h)
Clerol FBA 3107 소포제가 필요에 따라 첨가되어 과도한 발포를 방지하였다.
결과: 효모 추출물 첨가의 효과
얻어진 바이오매스 중 단백질의 함량을 N 6.25으로 표현되는 전체 질소를 측정함으로써 평가하였다.
Figure pct00005
이러한 결과는 효모 추출물 형태의 영양 보충물을 공급하는 것이 50％ 초과의 단백질의 함량을 갖는 높은 바이오매스 농도를 얻을 수 있게 한다는 것을 나타낸다.
또한, 카로티노이드의 함량이 증가되었다.

Claims (16)

  1. 유기 형태의 질소 공급원으로 보강된 최소 배지에서 미세조류를 배양하는 것을 포함하는, 종속 영양적으로 배양된 미세조류 바이오매스(microalgal biomass)의 카로티노이드 강화 및 단백질 강화 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 미세조류는 클로렐라(Chlorella) 속의 것임을 특징으로 하는 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 미세조류는 클로렐라 소로키니아나(Chlorella sorokiniana), 클로렐라 불가리스(Chlorella vulgaris) 및 클로렐라 케슬레리(Chorella kessleri)로부터 선택되는 것임을 특징으로 하는 방법.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 미세조류는 클로렐라 소로키니아나인 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유기 형태의 질소 공급원은 효모 추출물, 옥수수 침지액, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것임을 특징으로 하는 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유기 형태의 질소 공급원은 효모 추출물인 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유기 형태의 질소 공급원은 옥수수 침지액인 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 유기 형태의 질소 공급원의 첨가는 발효 배지에 함유된 전체 질소의 10％를 초과하지 않는 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 최소 배지는 0.5 g/l 내지 3 g/l의 효모 추출물, 바람직하게는 1 g/l 내지 2 g/l의 효모 추출물로 보강되는 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 바이오매스 중 카로티노이드의 함량은, 오로지 최소 배지에서만 배양된 바이오매스 중 카로티노이드의 함량과 비교하여, 바이오매스의 총 질량을 기준으로 0.05％ 이상, 바람직하게는 0.1％ 이상 증가되는 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 바이오매스 중 단백질의 함량은, 오로지 최소 배지에서만 배양된 바이오매스 중 단백질의 함량과 비교하여, 바이오매스의 총 중량을 기준으로 5％ 이상, 바람직하게는 10％ 이상 증가되는 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 얻어진 상기 바이오매스 중 카로티노이드의 함량은 바이오매스의 총 중량을 기준으로 0.35％ 이상, 바람직하게는 바이오매스의 총 중량을 기준으로 0.4％ 이상인 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 얻어진 상기 바이오매스 중 단백질의 함량은 바이오매스의 총 중량을 기준으로 45％ 이상, 바람직하게는 바이오매스의 총 중량을 기준으로 50％ 이상인 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
    - 최소 배지에서 상기 미세조류를 배양하는 제1 단계, 및
    - 효모 추출물 또는 옥수수 침지액을 상기 최소 배지에 첨가하는 제2 배양 단계
    를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서,
    - 최소 배지에서 클로렐라 소로키니아나 유형의 미세조류를 성장시키는 제1 단계,
    - 효모 추출물을 상기 최소 배지에 첨가하는 제2 배양 단계
    를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 제14항 또는 제15항에 있어서, 상기 제2 단계에서 글루코스는 상기 미세조류의 글루코스 소비 용량보다 상당히 낮은 값으로 연속적으로 공급되는 것을 특징으로 하는 방법.
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