CN115161203B - 一种小球藻异养培养高产蛋白质的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种小球藻异养培养高产蛋白质的方法，包括：在生物质培养阶段，通过异养发酵培养小球藻，基础培养基和补料培养基均以铵盐为氮源，葡萄糖为碳源；基础培养基中葡萄糖的初始浓度为25‑35g/L，C/N比为10:1‑40:1；当基础培养基中葡萄糖浓度首次降至3‑4g/L时，开始流加补料培养基；补料培养基的C/N比为320‑400:1；调节补料速度使葡萄糖浓度保持在5g/L±20％；细胞到达对数中后期转入异养诱导；通过切换为C/N比为3‑12的低碳氮比补料培养基以实现蛋白质诱导，继续培养至检测蛋白质含量不再增加时进行收获。该方法全程为异养培养，诱导时机为细胞对数中后期，不仅可获得高密度藻液和高蛋白质含量，还可减少反应器成本和收获成本，缩短培养周期、提高生产效率，减少藻液沾染杂菌的几率。
Description
技术领域
本发明涉及微藻培养技术领域，尤其涉及一种小球藻异养培养高产蛋白质的方法。
背景技术
小球藻藻粉是一种高蛋白、低糖、低脂、营养全面均衡的绿色营养源，被广泛的应用于食品、饲料、医疗保健等领域。随着微藻行业的兴起和微藻市场的逐步打开，人们对高品质的小球藻藻粉的需求日益增加。传统的小球藻藻粉制备工艺主要为异养发酵或者光自养培养。小球藻具有高光合效率，在自养过程中具有蛋白质含量高的优点，但其细胞生长速度缓慢且细胞密度较低，光自养过程中容易受到昆虫和原生动物等的污染，因此单独的自养培养很难应用到工业生产之中。异养发酵则成为制备小球藻藻粉的主要方式。通过异养培养能够获得较高密度的小球藻，但由于其营养物质代谢途径不同于自养，导致细胞组分与自养藻粉存在较大差异。随着发酵周期的延长，藻细胞密度会逐渐增加，但其蛋白质含量会随之下降，导致最终收获的藻细胞蛋白质总含量显著低于光自养藻细胞，对小球藻藻粉的品质造成较大的影响。因此，需要针对小球藻提出一种高密度异养培养工艺和利用小球藻高效生产蛋白质藻粉的生产模式，为高品质小球藻藻粉的制备提供技术支撑。
现有公开的小球藻异养培养产蛋白质的专利方案，如CN100410362C公开采用异养-光自养串联培养工艺，异养培养过程中利用尿素和硝酸盐作为氮源，培养过程中发酵液pH值呈现上升的趋势，需要利用盐酸、硫酸等强酸维持pH值变化。该方案中由于培养基和培养条件控制情况不佳，小球藻在培养第60h细胞生长就进入了生长平台期(小球藻细胞密度最高时)，生长速率明显下降，最终收获细胞干重仅为55g/L左右，蛋白质含量不到30％。CN104357330A公开一种自养与异养混合培养小球藻的方法，包括在机械搅拌发酵罐异养培养小球藻、藻液稀释和光自养培养小球藻三个阶段。其异养培养过程小球藻生长缓慢，在培养周期内获得高密度小球藻，最大生物量为45-55g/L；转入自养，控制温度和光照强度，诱导后蛋白质含量不超过2g/L(以藻液计)。CN110195019A公开一种高产蛋白质小球藻的培养方法，包括第一阶段异养培养和第二阶段自养诱导培养，异养至小球藻达到平台期(干重≥200g/L、蛋白质占干重超过30％)后，将小球藻稀释后转入光自养，细胞中蛋白质含量得到进一步提升(增幅达到20％左右)。
以上技术基本都是先异养转自养的模式，异养阶段快速增加藻细胞生物量至最大细胞密度，后转入自养诱导以增加细胞中蛋白质含量。然而，这些小球藻培养产蛋白质模式均存在如下问题：(1)异养环境和自养环境悬殊、包括培养基和光照因素等，小球藻异养阶段生长至平台期，经稀释转入自养条件培养；平台期细胞活力最低，骤然将其转入自养环境，对藻细胞而言，环境差异过大，会导致细胞数量减少、蛋白质总产量增幅受限；(2)由于细胞需要适应突然改变的生长环境，这将导致产生一个过渡停滞期，导致整个培养周期过长，降低生产效率；(3)异养转自养都需要进行稀释，稀释不仅带来大量水耗和无机盐等，需要提供能够承接异养产生的全部细胞的光生物反应器，且自养模式本身就是在较低细胞浓度下培养(异养培养基稀释20-40倍)，蛋白质相对藻液的含量通常不超过2g/L，因此即便自养诱导细胞中的蛋白质有所增加，但后期收获工作量和成本相对异养增加了数十倍，并随之产生大量污水。(4)将藻液由异养发酵罐转入大体量的光生物反应器，这个转移过程会带来很多工作量，转移培养装置的过程也会增加杂菌污染几率。需说明的是，前述内容虽记载在背景技术中，但并不属于本领域技术人员都知晓或发现的技术问题。
发明内容
(一)要解决的技术问题
鉴于现有技术的上述缺点、不足，本发明提供一种小球藻异养培养高产蛋白质的方法，该方法全程为异养培养，生物质积累阶段当细胞生长至对数中后期时通过切换异养培养基的组成实现诱导产蛋白质的过程，培养期间不需要完全改变藻细胞的培养环境也不需要转移培养装置，不仅可以获得高密度藻液和高蛋白质含量(蛋白质产量可达到99.64g/L)，还可减少反应器成本和收获成本，缩短培养周期、提高生产效率，减少藻液沾染杂菌的几率。
(二)技术方案
为了达到上述目的，本发明采用的主要技术方案包括：
第一方面，本发明提供一种小球藻异养培养高产蛋白质的方法，其包括生物质培养阶段和诱导产蛋白质阶段；其中，
生物质培养阶段：将经活化培养的小球藻接种至装有基础培养基的发酵罐中；基础培养基和补料培养基均以铵盐为氮源，葡萄糖为碳源；基础培养基中葡萄糖的初始浓度为25-35g/L，C/N比为10:1-40:1；
接种后开始培养，适时监测基础培养基中葡萄糖浓度，当其中葡萄糖浓度首次降至3-4g/L时，开始流加补料培养基；补料培养基的C/N比为320-400:1；培养过程中，适时监测发酵罐中葡萄糖浓度，根据葡萄糖浓度变化调节补料速度，使葡萄糖浓度保持在5g/L±20％；判断细胞到达对数中后期时即结束本阶段的培养；
诱导培养阶段：继续进行发酵培养，在维持发酵罐中葡萄糖浓度在5g/L±20％的条件下，切换补料培养基为低碳氮比补料培养基以实现蛋白质诱导，所述低碳氮比补料培养基中C/N比为3-12；或者，继续进行发酵培养，通过配制高浓度氮源溶液并一次性向该发酵罐中补加大量氮源，使发酵罐内培养基氮源浓度达到10-60g/L且停止碳源补加；在本阶段培养至检测蛋白质含量不再增加时进行收获。
根据本发明的较佳实施例，在所述诱导培养阶段，所述低碳氮比补料培养基中的氮源为尿素；所述氮源溶液中氮源为尿素。
根据本发明的较佳实施例，在所述诱导培养阶段，所述低碳氮比补料培养基中C/N比为5-8。
根据本发明的较佳实施例，在所述诱导培养阶段，通过配制高浓度氮源溶液一次性向该发酵罐中补加大量氮源使发酵罐内培养基氮源浓度达到10g/L。
根据本发明的较佳实施例，在生物质培养阶段和诱导培养阶段，保持发酵温度为29-31℃、溶解氧为18-25％、pH值在6.5±0.2。
根据本发明的较佳实施例，在生物质培养阶段和诱导培养阶段，实时监测发酵罐内培养基的pH值，以氨水为pH调节剂使发酵罐中pH在6.5±0.2，氨水同时作为一种补充性氮源。
根据本发明的较佳实施例，在所述生物质培养阶段，基础培养基和补料培养基均以铵盐为氮源、葡萄糖为碳源；基础培养基中葡萄糖的初始浓度为30g/L；补料培养基的C/N比为360:1，培养过程中根据葡萄糖浓度变化调节补料速度，使葡萄糖浓度保持在5g/L左右。
根据本发明的较佳实施例，所述小球藻为索罗金小球藻Chlorella sorokiniana；生物质培养阶段培养120h时结束该阶段培养。通常在结束生物质培养阶段时，此时发酵罐中生物量达到150-200g/L。此时，藻细胞生长到达对数生长期的中后期阶段，此时细胞还保持极强的活力和耐受力。
根据本发明的较佳实施例，判断细胞是否处于对数中后期的方法为：在相同的异养培养条件下对该小球藻进行预培养，培养过程中，不断取样测藻液中的生物量，绘制生物量-培养时间曲线图；生物量随培养时间快速增长的阶段为对数期，生物量不再随培养时间增加而增加的阶段为平台期；平台期与对数期的接点为拐点；以该拐点或该拐点之前的时间点为节点，记录从接种开始到节点的耗时；在实际的生物质培养阶段培养时，通过记时判断细胞生长到达对数中后期。
根据本发明的较佳实施例，在生物质培养阶段和诱导培养阶段，保持发酵温度为30℃，搅拌速度和溶解氧偶联控制，溶解氧为20％，pH值在6.5。
根据本发明的较佳实施例，所述小球藻为索罗金小球藻Chlorella sorokiniana；在诱导培养阶段，以开始接种的时间起算，培养至第9-10天时进行收获。根据本发明的具体实施例验证，此时，蛋白质产量高达70.0g/L-99.6g/L。
根据本发明的较佳实施例，在生物质培养阶段，所述基础培养基和补料培养基中的氮源为氯化铵。此外，作为pH调节剂的氨水为补充性氮源。
根据本发明的较佳实施例，在生物质培养阶段，由计算机结合传感器根据培养体系的实时监测结果，控制速度可调的蠕动泵流加氨水和补料培养基，以维持发酵罐内培养基的pH和葡萄糖浓度。
本申请中，C/N是培养基中C原子和N原子的摩尔比。
(三)有益效果
本发明的方案相较于现有技术，其优点包括：
(1)全程异养培养，减少大型光生物反应器的投入成本和管理成本，培养过程中不需要稀释和转移藻液到新的培养装置中，减少耗水量和藻液染杂菌机会。
(2)在生物质培养阶段，将到达生长对数中后期的藻细胞转入诱导条件，相对平台期的藻细胞，可大大提高此时细胞的活力和耐受能力，减少环境变化对细胞的冲击，消除环境变化导致的停滞期，缩短培养周期，提高生产效率。
(3)本发明的诱导过程也是在异养条件下进行，包括两种方式，方式一是通过切换生物质培养解阶段的补料培养基，更改为低碳氮比(3-12)的补料培养基，使藻细胞在不知不觉中完成从生物质积累到蛋白质诱导的过渡，相对于异养转自养诱导，本发明的方案可减少诱导培养期对细胞的冲击性，防止细胞数量突然减少的问题，有利于获得更高的总的蛋白质含量；方式二：通过配制高浓度氮源，一次性向发酵罐中加入大量氮源，使发酵罐内氮源浓度瞬时达到10-60g/L，也能诱导藻细胞中蛋白质产生和积累。方式一与方式二相比，前者通过切换低碳氮比补料培养基的方式实现诱导培养过程，对藻细胞数量影响最小，且诱导蛋白质的效果明显，最终产蛋白质的技术效果更优。
相比异养转自养，本发明提供的两种方式都是异养环境，大体环境因素变化少，对藻细胞的负面影响更少。
(4)本发明在生物质培养阶段采用的基础培养基和补料培养基中的氮源均为铵盐，优选为氯化铵，即铵态氮；相比硝态氮，细胞利用铵态氮的能耗较低。因此，在生物质培养阶段采用铵态氮配制培养基，有利于藻细胞快速从接种浓度达到对数中后期。在本发明中，索罗金小球藻藻细胞可在4-6天，由1g/L干重增加到200g/L。在诱导培养阶段，经过实验验证，若继续使用铵态氮或导致NH4 +过量积累对小球藻生长产生不利影响。因此，在诱导培养阶段，本发明在较佳实施例中切换成尿素作为诱导氮源，可以解决铵积累的毒性，同时降低诱导阶段补料培养基的碳氮比，以获得高蛋白质。
(5)本发明的整个生长培养周期很短。现有技术CN110195019A公开异养转自养培养方法，培养周期是16-18天，本发明整个培养周期是10天左右。这一改变极大缩短了整体生产周期，生长周期缩短接近40％，非常有利于经济化作业。这主要得益于全程为异养培养、对数中后期转入诱导以及更优培养基营养组分的配制等改进。
(6)本发明的方法，诱导培养期结束后，藻液蛋白质含量为73.0g/L以上，最高为99.64g/L。因为自养诱导产蛋白质的藻液，无论其条件如何优化，由于自养特点本身决定了藻液中的蛋白质含量不超过2g/L，因此本发明培养结束后即可得到浓缩且高含蛋白质的藻液，可大幅减少收获的工作量和成本，并减少污水量。
附图说明
图1为7.5L发酵罐异养培养结果；小球藻异养培养分为三个时期：0-48小时为延滞期，48-120小时为对数期，120-216为稳定期。
图2为诱导阶段低碳氮比补料培养基C/N＝10，分别使用氯化铵(a)和尿素(b)为诱导氮源进行诱导培养的生物量和蛋白质含量(％干重)的变化曲线图。
图3为利用Biolog PM表型分析系统对小球藻异养培养中适合生长的氮源进行高通量筛选结果；其中除A1孔为阴性对照外，每一个孔均对应一种氮源。图中，红色/蓝色为一组生物学平行结果。
图4为基于图3的筛选结果使用氯化铵、硝酸铵、尿素、硝酸钾、亚硝酸钠等五种常见氮源配制低碳氮比诱导补料培养基的诱导效果。
具体实施方式
为了更好的理解上述技术方案，下面将参照附图更详细地描述本发明的示例性实施例。虽然附图中显示了本发明的示例性实施例，然而应当理解，可以以各种形式实现本发明而不应被这里阐述的实施例所限制。相反，提供这些实施例是为了能够更清楚、透彻地理解本发明，并且能够将本发明的范围完整的传达给本领域的技术人员。
以下各实施例使用的藻种均为索罗金小球藻Chlorella sorokiniana，在接种到发酵罐进行异养培养之前，藻种均经过如下方法的活化处理：
(1)在无菌环境下，用接种环从已培养好的平板上挑取小球藻Chlorellasorokiniana单菌落，于灭菌平板上(培养基组成见表1)进行划线，将划线后的平板置于暗环境下进行培养，培养温度30℃，培养7-10天(形成明显的小球藻单菌落)。
(2)从活化好的平板上，挑取一环小球藻藻苔于50mL三角瓶中(培养基装液量为20mL)，放置摇床中进行培养，培养温度30℃，转速180rpm，培养120-144h。通过摇瓶依次逐级扩大培养制备发酵藻种，将培养好的一级种子液以10％(v/v)接种量接种于250mL二级摇瓶(装液量100mL)于摇床中进行培养，培养温度30℃，转速180rpm，培养72～84h。将培养好的二级种子液以10％(v/v)接种量接种于1000mL三级摇瓶(装液量300mL)于摇床中进行培养，培养温度30℃，转速180rpm，培养72h左右。
表1藻种制备培养基
以下是本发明的具体实施例。
实施例1
本实施例为小球藻异养培养高产蛋白质的方法，包括：
(1)生物质培养阶段：将培养好的三级摇瓶种子液以10％(v/v)接种量接种于7.5L发酵罐(基础培养体积为2.8L)中，培养温度30℃，搅拌速度和溶解氧偶联控制，溶解氧设定为20％，培养过程中用氨水控制pH＝6.3-6.7。发酵基础培养基的组成如表2-3。其中，氯化铵作为氮源，基础培养基中碳氮质量比为18:1，初始葡萄糖浓度为27.27g/L(一水葡萄糖浓度是30g/L)。补料培养基的组成参见表2-3：葡萄糖为750g/L，氮源为氯化铵；碳氮比为360:1。
表2发酵罐基础和补料培养基组成
表3异养培养基各母液组成
当葡萄糖浓度首次降至3-4g/L时，开始流加补料培养基，培养过程中适时监控测定葡萄糖浓度，根据葡萄糖浓度的变化适当调节补料速度，整个培养周期控制葡萄糖浓度在5g/L±20％。培养至120h，细胞处于对数中后期。
(2)诱导培养阶段
诱导阶段培养基参见表2的补料培养基配方，将其中13.37g氯化铵换成450g尿素，补料培养基其他组分不变，此时补料培养基中C/N比为6:1。这个阶段，同样适时监控测定葡萄糖浓度，根据葡萄糖浓度的变化适当调节补料速度，整个培养周期控制葡萄糖浓度在5g/L±20％。培养温度30℃，溶解氧设定为20％，用氨水控制pH＝6.3-6.7。培养至第9天时，测得此时藻液中蛋白质含量为99.64g/L，即可进行收获。
由于不同的小球藻品种和不同培养条件，藻细胞到达对数中后期的时间不同。为了弄清正式培养时，何时结束生物质培养阶段转入诱导培养阶段。可以在正式培养之前，以与生物质培养阶段相同的培养基和条件进行预培养实验。如图1所示，7.5L发酵罐异养培养结果。根据该图可以将小球藻异养培养分为三个时期：0-48小时为延滞期，48-120小时为对数期，120-216h为稳定期。在整个培养周期，小球藻生物量不断积累，而蛋白质含量较为稳定，存在较小范围波动。其中，对数中后期较佳选在96-120h这一区间。如实施例1即以120h为转入异养诱导培养阶段、切换低碳氮比补料培养基的时间节点。
实施例2
本实施例与实施例1的区别仅在于，在生物质培养阶段，改变基础培养基中碳氮质量比为36:1。培养基中其余组成不变。补料培养基和诱导阶段低碳氮比补料培养基组成，及其他参数控制均参见实施例1。
生物质培养阶段培养至第102h，到达藻细胞生长对数后期，即转入异养诱导培养阶段继续培养5天，进行收获。
实施例3
本实施例与实施例1的区别仅在于，在生物质培养阶段，改变基础培养基中碳氮质量比为10:1。基础培养基中其余组成不变。补料培养基和诱导阶段低碳氮比补料培养基组成，及其他参数控制均参见实施例1。
生物质培养阶段培养至第128h时，到达藻细胞生长对数后期，即转入异养诱导培养阶段继续培养5天，进行收获。
实施例4
本实施例与实施例1的区别仅在于，在生物质培养阶段，改变补料培养基为：葡萄糖为750g/L，氮源为氯化铵；碳氮比为320:1。补料培养基中其余组成不变。基础培养基组成及其他参数控制均参见实施例1。
生物质培养阶段培养至第128h时，到达藻细胞生长对数后期，即转入异养诱导培养阶段继续培养5天，进行收获。
实施例5
本实施例与实施例1的区别仅在于，在生物质培养阶段，改变补料培养基为：葡萄糖为800g/L，氮源为氯化铵；碳氮比为400:1。补料培养基中其余组成不变。基础培养基组成及其他参数控制均参见实施例1。
生物质培养阶段培养至第116h时，到达藻细胞生长对数后期，即转入异养诱导培养阶段继续培养5天，进行收获。
将实施例1-5中培养结束后藻液中蛋白质浓度比较如表4：
表4
| 组别 | 藻液蛋白质含量 |
| 实施例1 | 99.64g/L |
| 实施例2 | 87.22g/L |
| 实施例3 | 81.35g/L |
| 实施例4 | 90.28g/L |
| 实施例5 | 92.46g/L |
从以上实施例可以看出，实施例1中，基础培养基中氮源为氯化铵，碳源为葡萄糖，且葡萄糖在基础培养基浓度为30g/L左右，碳氮比为18:1，补料培养基中碳氮比为360:1时，培养结束时藻液中蛋白质含量最高。而补料培养基中碳氮比为320-400:1这个范围时，培养结束时藻液中蛋白质含量均在90g/L以上。
在以下实施例6-11中，改变诱导培养阶段中低碳氮比补料培养基中C/N比值范围在3-12之间变化。
实施例6
本实施例与实施例1的区别仅在于，在诱导培养阶段，改变氮源尿素的添加量，将表2中13.37g氯化铵换成900g尿素，补料培养基其他组分不变，此时补料培养基中C/N比为3:1。其他条件与实施例1相同。培养至第9天时进行收获。
实施例7
本实施例与实施例1的区别仅在于，在诱导培养阶段，改变氮源尿素的添加量，将表2中13.37g氯化铵换成675g尿素，补料培养基其他组分不变，此时补料培养基中C/N比为4:1。其他条件与实施例1相同。培养至第9天时进行收获。
实施例8
本实施例与实施例1的区别仅在于，在诱导培养阶段，改变氮源尿素的添加量，将表2中13.37g氯化铵换成540g尿素，补料培养基其他组分不变，此时补料培养基中C/N比为5:1。其他条件与实施例1相同。培养至第9天时进行收获。
实施例9
本实施例与实施例1的区别仅在于，在诱导培养阶段，改变氮源尿素的添加量，将表2中13.37g氯化铵换成338g尿素，补料培养基其他组分不变，此时补料培养基中C/N比为8:1。其他条件与实施例1相同。培养至第10天时进行收获。
实施例10
本实施例与实施例1的区别仅在于，在诱导培养阶段，改变氮源尿素的添加量，将表2中13.37g氯化铵换成300g尿素，补料培养基其他组分不变，此时补料培养基中C/N比为9:1。其他条件与实施例1相同。培养至第10天时进行收获。
实施例11
本实施例与实施例1的区别仅在于，在诱导培养阶段，改变氮源尿素的添加量，将表2中13.37g氯化铵换成225g尿素，补料培养基其他组分不变，此时补料培养基中C/N比为12:1。其他条件与实施例1相同。培养至第10天时进行收获。
将实施例1和实施例6-11中培养结束后藻液中蛋白质浓度比较，如表5：
表5
| 组别 | 藻液蛋白质含量 |
| 实施例1 | 99.64g/L |
| 实施例6 | 69.63g/L |
| 实施例7 | 72.28g/L |
| 实施例8 | 91.29g/L |
| 实施例9 | 87.15g/L |
| 实施例10 | 78.36g/L |
| 实施例11 | 80.02g/L |
从以上实施例可以看出，实施例1在诱导培养阶段，诱导氮源为尿尿，同时控制低碳氮比补料培养基中C/N比为6时可以获得最高的产蛋白质效果。而诱导阶段，同样使用尿素为诱导氮源，但是控制低碳氮比补料培养基C/N比在3-4或9-12时，到收获时藻液中蛋白质含量有所下降。这说明，低碳氮比补料培养基C/N比在5-8时小球藻产蛋白质效率最高。
对比例1
本对比例与实施例1的主要区别在于，在生物质培养阶段使藻细胞达到平台期(培养至144h)后转入到诱导培养阶段，即通入低碳氮比补料培养基继续培养5天后，进行收获。两个阶段培养基组成，补料方法和控制培养条件与实施例1相同。但本例进行收获时，藻液中蛋白质含量为50g/L。
对比例2
本对比例与实施例1的主要区别在于，在诱导培养阶段，使用氯化铵为诱导氮源。即将实施例1中诱导培养阶段使用的450g尿素换成57.3g的NH4Cl。在生物质培养至120h时转入诱导培养阶段继续培养5天后，进行收获。两个阶段除诱导氮源外，培养基其余组成，补料方法和控制培养条件与实施例1相同。但本例进行收获时，藻液中蛋白质含量为70.86g/L。由此说明，虽然在诱导阶段使用氯化铵为诱导氮源时，同样控制诱导补料培养基C/N较低的情况下，也可获得较高蛋白质产量，高于目前公开文献报道的产量。但与实施例1相比，若使用氯化铵为诱导阶段的氮源，其生产蛋白质的效率在同等条件下远低于尿素。
为了验证这一结果，在实施例1基础上，不改变诱导培养阶段补料培养基中的葡萄糖的浓度，只是将诱导阶段补料培养基C/N调整为10，分别以氯化铵和尿素为诱导氮源进行诱导培养，总共培养周期为10天。其结果如图2所示。图2的a为氯化铵为诱导氮源，b为使用尿素为诱导氮源。其结果显示：虽然经过氯化铵为诱导氮源的低C/N培养基诱导后，蛋白质％干重已超过50％，但是生物量也在培养的120h之后开始下降。而b图显示，使用尿素为诱导氮源诱导细胞积累蛋白质后，虽然蛋白质％干重未到50％，但是细胞生物量在120h还在上升且在168h进入平台期。
通过氯化铵和尿素两种氮源诱导结果可以看出，在相同碳氮比下，使用氯化铵补料培养基后，小球藻生物量浓度急剧下降，而尿素补料培养基下小球藻的生物量略微上升后维持稳定，因此在低C/N的前提下，使用尿素为诱导氮源的产蛋白质效果优于氯化铵。这说明，对于藻细胞而言，NH4 +虽然是低能耗氮源，但是其过量积累对小球藻生长产生不利影响。这一结论，在以前公开的研究中未见报道。因此，在生物质积累培养阶段使用铵盐为氮源，在诱导阶段改为尿素可以解决铵积累的毒性，降低碳氮比，有助于获得总量更高的蛋白质。
对比例3
本例与实施例1的区别仅在于，在诱导培养阶段，改变氮源尿素的添加量，使用90g尿素配制低C/N比(C/N为30:1)补料培养基，其余组分保持不变，培养条件均参见实施例1。培养至第11天时进行收获，测得藻液中蛋白质含量为48g/L。因此，在诱导阶段，补料培养基C/N比过高非常不利于小球藻中蛋白质的积累。
进一步地，为了说明尿素用作小球藻蛋白质诱导氮源的显著效果，发明人还进行了96孔板培养实验，以验证各种不同类型氮源对小球藻蛋白质诱导能力的差异。实验中，使用Biolog PM板表型分析系统筛选小球藻可利用氮源。将摇瓶培养好的小球藻稀释到105个每毫升的浓度，加入显色液，分装至96孔微孔板(PM平板)中，每孔装液量为150微升。将孔板置于PM高通量微生物表型分析系统培养箱中进行培养，培养温度为30℃。该系统每15分钟采集一次孔板颜色程度，利用软件分析将显色程度绘制成曲线，显色深浅对应小球藻在该氮源存在下生长活性。通过这一方法从95种不同氮源中筛出能被小球藻利用的8种氮源。摇瓶培养氮源复筛。从上一阶段筛选到的氮源中挑选常见氮源配置成低碳氮比培养基，将培养好的小球藻接种到配置好的培养基中进行培养。培养温度30℃，转速180rpm，每天取样测定生物量，在第0天、第3天、第5天时收集藻液，离心、冷冻干燥并测定蛋白质含量。
实验结果参见图3所示，如图2每个格子对应96孔板中的一个孔，椭圆圈住的孔表示该孔中使用的氮源具有较好的诱导效果，经此筛选过程，筛选出A2氨、A3亚硝酸钠、A4硝酸钾、A5尿素、A8 L-精氨酸、B3 L-组氨酸、C12 L-鸟氨酸、H5 Ala-His小分子二肽为可用氮源。从这八种筛选的氮源中进一步选择，考虑到生产成本问题，后续选择五种常见氮源(氯化铵、硝酸铵、尿素、硝酸钾、亚硝酸钠)进行诱导培养。
如图4所示，通过不同氮源低碳氮比诱导培养，结果显示：使用尿素和硝酸铵进行诱导培养小球藻生长最快，而亚硝酸钠则不利于小球藻生长。从蛋白积累情况来看，除亚硝酸钠外，其余四种氮源低碳氮比均能促进小球藻蛋白质的积累，氯化铵、硝酸铵培养下表现为先上升后下降；尿素、硝酸钾则在两个时间点都呈现上升趋势。综合以上，由图4可知，使用尿素作为氮源更有利于小球藻蛋白质的积累。由此可见，使用尿素诱导小球藻积累蛋白质这一性能上具有不可替代性。
实施例12
改变诱导方式，采用先配制高浓度的尿素溶液，然后一次性向发酵罐中注入大量氮源，以刺激和诱导藻细胞积累蛋白质。具体的实施方法为：在生物质培养阶段按照实施例1的方式进行培养，在培养120h转入诱导培养阶段：继续在发酵罐中培养，然后一次性加入大量尿素溶液，使发酵罐内尿素浓度达到10g/L、30g/L和60g/L；之后，继续培养，培养期间不再加氮源和碳源，但仍然存在氨水自动补加以控制pH在6.2-6.7之间。培养5天后进行收获。不同诱导方式藻液中，蛋白质含量如表6。
表6
| 组别 | 藻液蛋白质含量 |
| 一次补加10g/L | 73.30g/L |
| 一次补加30g/L | 65.43g/L |
| 一次补加60g/L | 70.03g/L |
由上表可知，这种一次性添加大量尿素诱导的方式也能够诱导细胞中蛋白质的快速积累，并获得高蛋白质含量的藻液。这是由于本发明在生物质培养阶段使细胞生长到对数中后期就转入了诱导培养，因而绝大多数细胞具有很强的生长活力，能够较好适应一次性加入大量尿素所带来的负面影响，并最终能获得较高的蛋白质产量。一次性投加大量尿素溶液，可在一定程度上减少培养期间补料培养基的流加量。虽然此种诱导方法，蛋白质生产效率整体低于实施例1-11，但相较于现有技术中异养转自养诱导等，以及其他文献或方案报道的蛋白质含量，仍然具有显著进步性。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
Claims (10)
1.一种小球藻异养培养高产蛋白质的方法，其特征在于，包括生物质培养阶段和诱导产蛋白质阶段；其中，
生物质培养阶段：将经活化培养的小球藻接种至装有基础培养基的发酵罐中；基础培养基和补料培养基均以铵盐为氮源，葡萄糖为碳源；基础培养基中葡萄糖的初始浓度为25-35g/L，C/N比为10:1-40:1；所述基础培养基和补料培养基中的氮源为氯化铵；
接种后开始培养，适时监测基础培养基中葡萄糖浓度，当其中葡萄糖浓度首次降至3-4g/L时，开始流加补料培养基；补料培养基的C/N比为320-400:1；培养过程中，适时监测发酵罐中葡萄糖浓度，根据葡萄糖浓度变化调节补料速度，使葡萄糖浓度保持在5 g/L±20%；判断细胞到达对数中后期时即结束本阶段的培养；
诱导培养阶段：继续进行发酵培养，在维持发酵罐中葡萄糖浓度在5 g/L±20%的条件下，切换补料培养基为低碳氮比补料培养基以实现蛋白质诱导，所述低碳氮比补料培养基中C/N比为3-12；或者，继续进行发酵培养，通过配制高浓度氮源溶液并一次性向该发酵罐中补加大量氮源，使发酵罐内培养基氮源浓度达到10-60g/L且停止碳源补加；在本阶段培养至检测蛋白质含量不再增加时进行收获；在所述诱导培养阶段，培养基中的氮源为尿素；
所述小球藻为索罗金小球藻Chlorella sorokiniana。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在所述诱导培养阶段，所述低碳氮比补料培养基中C/N比为5-8。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在所述诱导培养阶段，通过配制高氮源溶液一次性向该发酵罐中补加大量氮源使发酵罐内培养基氮源浓度达到10g/L。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在生物质培养阶段和诱导培养阶段，保持发酵温度为29-31℃、溶解氧为18-25%、pH值在6.5±0.2。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在生物质培养阶段和诱导培养阶段，实时监测发酵罐内培养基的pH值，以氨水为pH调节剂使发酵罐中pH在6.5±0.2，氨水同时作为一种补充性氮源。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在所述生物质培养阶段，基础培养基和补料培养基均以铵盐为氮源、葡萄糖为碳源；基础培养基中葡萄糖的初始浓度为30g/L；补料培养基的C/N比为360:1，培养过程中根据葡萄糖浓度变化调节补料速度，使葡萄糖浓度保持在5g/L。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，生物质培养阶段培养120h时结束该阶段培养。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，判断细胞是否处于对数中后期的方法为：在相同的异养培养条件下对该小球藻进行预培养，培养过程中，不断取样测藻液中的生物量，绘制生物量-培养时间曲线图；生物量随培养时间快速增长的阶段为对数期，生物量不再随培养时间增加而增加的阶段为平台期；平台期与对数期的接点为拐点；以该拐点或该拐点之前的时间点为节点，记录从接种开始到节点的耗时；在实际的生物质培养阶段培养时，通过记时判断细胞生长到达对数中后期。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在生物质培养阶段和诱导培养阶段，保持发酵温度为30℃，搅拌速度和溶解氧偶联控制，溶解氧为20%，pH值在6.5。
10.根据权利要求1或7所述的方法，其特征在于，在诱导培养阶段，以开始接种的时间起算，培养至第9-10天时进行收获。
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