CN109337819B - 减少小球藻贴壁的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物技术领域，公开了减少小球藻贴壁的方法，其包括如下步骤：将处于对数生长期的小球藻液，按照3‑10％的接种量接种到含有培养液的反应池中，然后添加50‑200mg/L的氨基酸，培养96‑120h，离心，收集藻细胞。本发明方法可以降低小球藻的贴壁现象，提高小球藻生物量。

Description

减少小球藻贴壁的方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及减少小球藻贴壁的方法。
背景技术
小球藻(Chlorella)为绿藻门小球藻属普生性单细胞绿藻，是一种球形单细胞藻类，直径3～8微米，是地球上最早的生命之一，出现在20多亿年前，是一种高效的光合植物，以光合自养生长繁殖，分布极广。小球藻借助阳光、水和二氧化碳，以每隔20小时分裂出4个细胞的旺盛繁殖能力，不停地将太阳能量转化生成蕴涵多种营养成分的藻体，并在增殖中释放出大量的氧气；而它的光合能力高于其他植物10倍以上。小球藻不仅可以作为水生经济动物的优秀天然饵料，同时还可以吸收水中的氮、磷等元素，降低水体的富营养化水平，净化水质。
小球藻中富含多糖类成分，生物活性研究实验表明其具有多种生物学活性及药用价值，如降血脂、抗血栓、降血糖抗炎、抗疲劳、增强免疫、抑制肿瘤生长等作用，现有的研究大多集中在如何提高藻细胞的多糖产量的研究中。对小球藻的前期生长状况研究较少，申请人在之前的研究成果“一种提高小球藻多糖产量的方法”等相关项目已经申报国家发明专利，其中，在前期的培养过程中通过添加萘乙酸钠和赤霉素，可以提高小球藻的分裂速率，通过在培养中后期阶段添加葡萄糖和花生四烯酸两种物质，相互协同，对胞内藻多糖的生成起到正向调节。
目前，小球藻最主要的方式是规模化人工培养。然而，在培养过程中，因重力、曝气不均和藻类的本身生理特性等，培养装置内壁或与藻液接触的物件上常常会出现贴壁现象。轻微的贴壁现象不会对藻细胞生长产生影响，但是一旦发生大规模贴壁现象，将产生恶性循环并形成不利影响，使藻细胞摄取营养困难、生存环境恶劣以及光照不足，如何在规模化培养小球藻中避免大规模贴壁现象的发生，是我们需要解决的技术问题。现有技术中对上述问题的研究相对较少，目前仅有为数不多的几篇报道，其中，“CN105754861A”公开了一种减少小球藻贴壁的方法，包括在培养液中添加乳化剂，能够减少小球藻的贴壁，提高小球藻的生物量；尽管该专利技术中认为添加乳化剂不会对小球藻的生长有不利影响，但是乳化剂必然会少量残留于藻类提取物中，为了提升藻类提取物的品质，我们要尽量避免乳化剂等化学物质的残留。
发明内容
针对现有技术存在的缺陷，本发明提供了减少小球藻贴壁的方法，该方法可以显著降低小球藻的贴壁现象，提高生物量。
本发明是通过如下技术方案来实现的：
减少小球藻贴壁的方法，其包括如下步骤：
将处于对数生长期的小球藻液，按照3-10％的接种量接种到含有培养液的反应池中，然后添加50-200mg/L的氨基酸，培养96-120h，离心，收集藻细胞。
进一步地，所述培养的条件为：光照强度5000lux，22℃培养，光暗比为18:6，通气速率为0.2vvm。
进一步地，所述培养液的组分为：葡萄糖3g/L，硝酸钾 1.5g/L，氯化钠 1g/L，硼砂0.5g/L，磷酸二氢钾 0.5g/L，碳酸钙 0.1g/L，七水硫酸镁 50mg/L，柠檬酸铁铵20mg/L，萘乙酸钠10mg/L，赤霉素10mg/L。
进一步地，所述氨基酸的浓度为100g/L。
进一步地，所述氨基酸为组氨酸。
进一步地，所述组氨酸和精氨酸的混合物。
进一步地，所述组氨酸和精氨酸按照1:1的质量比进行混合。
进一步地，所述小球藻的接种密度为1-5×106个/ml。
进一步地，所述小球藻为普通小球藻。
本发明还要求保护按照上述方法获得的小球藻。
与现有技术相比，本发明取得的有益效果主要包括但是并不限于几个方面：
本发明对培养液进行了优化，在培养液中通过添加萘乙酸钠和赤霉素，在培养过程中添加组氨酸，能够抑制藻细胞贴壁，提高小球藻的分裂速率，提高藻细胞生物量；研究发现，藻类贴壁主要发生在培养初期，因此选择在规模化培养开始时添加带正电荷的氨基酸，组氨酸溶于水中，携带一定的正电荷，能够与表面带有负电荷的藻细胞通过化学键连接，从而诱导藻细胞悬浮培养，降低贴壁性能；而萘乙酸钠和赤霉素作为植物性调节剂，能够提高藻细胞的生长量。
带有正电荷的氨基酸能够降低贴壁现象，而其他氨基酸并不具备这种性能，研究发现，组氨酸不但具备降低贴壁现象，还能够刺激球小球藻细胞增殖效率，效果优于精氨酸；因此，本发明选择使用组氨酸或者组氨酸和精氨酸的复合氨基酸。
附图说明
图1：组氨酸的添加量对小球藻生物量的影响；
图2：培养时间对小球藻生物量的影响。
具体实施方式
本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的产品及方法已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的产品及方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明进行详细说明。
实施例1
减少小球藻贴壁的方法，其包括如下步骤：
将处于对数生长期的普通小球藻液，按照5％的接种量接种到含有培养液的反应池中，接种密度为1×106个/ml，然后添加100mg/L的氨基酸，培养96h，离心，收集藻细胞；培养的条件为：光照强度5000lux，22℃培养，光暗比为18:6，通气速率为0.2vvm；所述培养液的组分为：葡萄糖3g/L，硝酸钾 1.5g/L，氯化钠 1g/L，硼砂0.5g/L，磷酸二氢钾 0.5g/L，碳酸钙 0.1g/L，七水硫酸镁 50mg/L，柠檬酸铁铵20mg/L，萘乙酸钠10mg/L，赤霉素10mg/L；所述氨基酸为组氨酸。
实施例2
减少小球藻贴壁的方法，其包括如下步骤：
将处于对数生长期的普通小球藻液，按照5％的接种量接种到含有培养液的反应池中，接种密度为2×106个/ml，然后添加100mg/L的氨基酸，培养96h，离心，收集藻细胞；培养的条件为：光照强度5000lux，22℃培养，光暗比为14:10，通气速率为0.3vvm；所述培养液的组分为：葡萄糖3g/L，硝酸钾 1.5g/L，氯化钠 1g/L，硼砂0.5g/L，磷酸二氢钾 0.5g/L，碳酸钙 0.1g/L，七水硫酸镁 50mg/L，柠檬酸铁铵20mg/L，萘乙酸钠10mg/L，赤霉素10mg/L；所述氨基酸为组氨酸和精氨酸按照1:1质量比的混合物。
对比例1
减少小球藻贴壁的方法，其包括如下步骤：
将处于对数生长期的普通小球藻液，按照5％的接种量接种到含有培养液的反应池中，接种密度为1×106个/ml，培养96h，离心，收集藻细胞；培养的条件为：光照强度5000lux，22℃培养，光暗比为18:6，通气速率为0.2vvm；所述培养液的组分为：葡萄糖3g/L，硝酸钾 1.5g/L，氯化钠 1g/L，硼砂0.5g/L，磷酸二氢钾 0.5g/L，碳酸钙 0.1g/L，七水硫酸镁 50mg/L，柠檬酸铁铵20mg/L，萘乙酸钠10mg/L，赤霉素10mg/L。
对比例2
减少小球藻贴壁的方法，其包括如下步骤：
将处于对数生长期的普通小球藻液，按照5％的接种量接种到含有培养液的反应池中，接种密度为1×106个/ml，然后添加100mg/L的氨基酸，培养96h，离心，收集藻细胞；培养的条件为：光照强度5000lux，22℃培养，光暗比为18:6，通气速率为0.2vvm；所述培养液的组分为：葡萄糖3g/L，硝酸钾 1.5g/L，氯化钠 1g/L，硼砂0.5g/L，磷酸二氢钾 0.5g/L，碳酸钙 0.1g/L，七水硫酸镁 50mg/L，柠檬酸铁铵20mg/L，萘乙酸钠10mg/L，赤霉素10mg/L；所述氨基酸为丙氨酸。
对照组3
减少小球藻贴壁的方法，其包括如下步骤：
将处于对数生长期的普通小球藻液，按照5％的接种量接种到含有培养液的反应池中，接种密度为1×106个/ml，然后添加100mg/L的氨基酸，培养96h，离心，收集藻细胞；培养的条件为：光照强度5000lux，22℃培养，光暗比为18:6，通气速率为0.2vvm；所述培养液的组分为：葡萄糖3g/L，硝酸钾 1.5g/L，氯化钠 1g/L，硼砂0.5g/L，磷酸二氢钾 0.5g/L，碳酸钙 0.1g/L，七水硫酸镁 50mg/L，柠檬酸铁铵20mg/L；所述氨基酸为组氨酸。
对比例4
减少小球藻贴壁的方法，其包括如下步骤：
将处于对数生长期的普通小球藻液，按照5％的接种量接种到含有培养液的反应池中，接种密度为1×106个/ml，然后添加100mg/L的氨基酸，培养96h，离心，收集藻细胞；培养的条件为：光照强度5000lux，22℃培养，光暗比为18:6，通气速率为0.2vvm；所述培养液的组分为：葡萄糖3g/L，硝酸钾 1.5g/L，氯化钠 1g/L，硼砂0.5g/L，磷酸二氢钾 0.5g/L，碳酸钙 0.1g/L，七水硫酸镁 50mg/L，柠檬酸铁铵20mg/L，萘乙酸钠10mg/L，赤霉素10mg/L；所述氨基酸为精氨酸。
实施例3
实施例1-2和对比例1-4中小球藻贴壁以及生物量的影响：
观察各组别的藻细胞生长情况，将藻细胞贴壁现象分为四个等级，其中，第一等级，贴壁非常严重，藻细胞聚集成块状，结合紧密，有大量死亡；第二等级，贴壁较严重，藻细胞聚集成小的团，有部分死亡；第三等级，贴壁轻微，藻细胞聚集松散，0或少量死亡。
藻细胞干重测定：离心藻液，收集沉淀，置于100℃烘箱中烘干2h，干燥冷却后称量并计算，获得单位体积培养液中细胞干重含量(g/L)。具体结果见表1：
表1
组别 细胞干重含量(g/L) 贴壁等级
实施例1 7.53 第三
实施例2 7.18 第三
对比例1 6.21 第一
对比例2 6.36 第一
对比例3 6.04 第三
对比例4 6.79 第三
分析：如表1所示，与对比例相比，本发明实施例1通过添加组氨酸、萘乙酸钠和赤霉素，能够减轻藻细胞贴壁，提高藻细胞生物量；其中，组氨酸溶于水中，携带一定的正电荷，能够与表面带有负电荷的藻细胞通过化学键连接，从而诱导藻细胞悬浮培养，降低贴壁性能；而萘乙酸钠和赤霉素作为植物性调节剂，能够提高藻细胞的生长量。本研究发现，带有正电荷的氨基酸能够降低藻细胞贴壁现象，而其他氨基酸不具备这种性能，而且，组氨酸不但能够减少藻细胞的贴壁现象，还能够刺激藻细胞增殖，效果优于精氨酸；因此，本发明选择使用组氨酸或者组氨酸和精氨酸的复合氨基酸。
本发明还检测了不同的组氨酸添加量对生物量以及贴壁现象的影响。
以实施例1的技术方案为例，分别设置组氨酸的添加量为：0,25,50,100,200，400；单位为mg/L。如图1所示，随着组氨酸添加量的增加，小球藻生物量增加，当增加到100g/L时，小球藻的生物量为7.53g/L（干重），继续增加组氨酸的添加量，小球藻的生物量没有明显改变，而且通过肉眼观察，组氨酸的添加量达到50g/L时，贴壁现象明显减轻，继续增加组氨酸的添加量，小贴壁现象没有明显改变，综合生长量、贴壁以及组氨酸成本三方面因素来考虑，选择100g/L的添加量为最佳。
本发明还检测了培养时间对藻细胞生物量的影响，分别设置24,48,72,96,120,144；单位为h；如图2所示，选择培养时间为96-120h藻类生物量最高，继续增加培养时间，生物量反而下降。
需要说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明实施例技术方案的精神和范围。

Claims (3)

1.减少小球藻贴壁的方法，其包括如下步骤：
将处于对数生长期的小球藻液，按照3-10％的接种量接种到含有培养液的反应池中，然后添加100mg/L的氨基酸，培养96-120h，收集藻细胞；
所述培养的条件为：光照强度5000lux，22℃培养，光暗比为18:6，通气速率为0.2vvm；
所述培养液的组分为：葡萄糖3g/L，硝酸钾 1.5g/L，氯化钠 1g/L，硼砂0.5g/L，磷酸二氢钾 0.5g/L，碳酸钙 0.1g/L，七水硫酸镁 50mg/L，柠檬酸铁铵20mg/L，萘乙酸钠10mg/L，赤霉素10mg/L；
所述氨基酸由组氨酸和精氨酸按照1:1的质量比进行混合。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述小球藻的接种密度为（1-5）×106个/ml。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述小球藻为普通小球藻。
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