JPWO2017217116A1

JPWO2017217116A1 - 凝集能を有した新微細藻類

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Publication number: JPWO2017217116A1
Application number: JP2018523549A
Authority: JP
Inventors: のぞみ塩原; 翔平木下
Original assignee: Honda Motor Co Ltd
Current assignee: Honda Motor Co Ltd
Priority date: 2016-06-17
Filing date: 2017-04-21
Publication date: 2019-03-22
Anticipated expiration: 2037-04-21
Also published as: GB2565970C; WO2017217116A1; GB2565970B; GB201820961D0; GB2565970A; CN109844094B; MX2018015471A; CN109844094A; BR112018075700A2; US20190177747A1; CA3026514C; US10745718B2; CA3026514A1; JP6677810B2

Abstract

微細藻類の自己発酵を利用したエチルアルコール生産において、遠心処理やフィルター処理等によって藻体を濃縮したり回収したりする工程を不必要とするか、あるいは簡略化して、そのための手間や設備を省力化する。
この微細藻は、クラミドモナス属（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓｓｐ．）に属する微細藻であって、暗嫌気下においてエチルアルコール産生能を有し、且つ、凝集しつつ増殖する能力を獲得した変異株である。また、このエチルアルコールの製造方法においては、前記微細藻を増殖させ、暗嫌気下に保持してエチルアルコールを生成させる。

Description

本発明は、再生可能なエネルギー資源の創出に資する微細藻類に関する。

有限な化石燃料にかわる環境に配慮したエネルギー資源として、植物などの再生可能資源を利用するバイオマスエネルギーの開発が進められている。例えば、サトウキビやトウモロコシなどの可食部には澱粉が多く含まれており、そのバイオマスからは、糖化、発酵、蒸留・精製等の工程を経て、比較的効率的に自動車燃料などに利用可能な高純度エチルアルコールを生産することができる。しかしながら、食物原料から生産されるバイオマスエチルアルコールには、人類が必要とする食糧との競合の問題がある。また、温暖化防止のためのＣＯ_２排出の収支でも、糖化、発酵、蒸留・精製等の工程におけるＣＯ_２排出の収支を考慮すると、それほど寄与しないという問題がある。

これに対し、光合成が活発な微細藻類に自己発酵させてエチルアルコールを生産する技術の開発も進められている。この方式によれば、太陽光エネルギーを効率的に変換することができ、且つ、澱粉からの糖化、発酵の工程を省くことができてＣＯ_２の排出削減にも資するものと考えられている。また、食糧競合の問題もない。

例えば、特許文献１には、微細藻類の自己発酵の技術に関し、細胞内にデンプンを蓄積する微細藻を培養し、培養した藻体を含む培養液を濃縮して得られるスラリーを、ｐＨを６．０〜９．０の範囲に保ちながら暗黒かつ嫌気性雰囲気に保持してエチルアルコールを生成させることを特徴とする微細藻からのエチルアルコール製造方法が開示されている。

また、例えば、特許文献２には、大量の淡水を必要とせず培養できる微細藻類の技術に関し、海水の塩分濃度で生育して細胞内に澱粉を蓄積し、暗くかつ嫌気性雰囲気に保つことにより細胞内の澱粉よりエチルアルコールを生産するクラミドモナス属に属する新規微細藻が開示されている。

特許第３００４５０９号公報特許第３８３７５８９号公報

図７には、従来のエチルアルコール生産用微細藻類を液体培地中で所定量増殖させた状態を模式的に示す。また、図８には、従来のエチルアルコール生産用微細藻類の自己発酵によりエチルアルコールを生産するための概略工程を示す。図７に示すように、従来型の微細藻類では単細胞で自泳力を持つ種も多く、容器４に入れられた液体培地５中で増殖した藻体１１が、増殖後にその容器４ごと静置しても沈降性に乏しくほぼ分散状態のままである。よって、図８に示すように、微細藻を増殖させる増殖系から増殖した藻体を暗嫌気下に曝して自己発酵させる自己発酵系に移る過程、あるいは暗嫌気下に曝した藻体を除いてエチルアルコールの分取系に移る過程などにおいて、その藻体を遠心処理やフィルター処理等によって濃縮・回収する工程が必要となり、煩雑で、そのための手間や設備にコストが嵩むという問題があった。

そこで本発明の目的は、微細藻類の自己発酵を利用したエチルアルコール生産において、遠心処理やフィルター処理等によって藻体を濃縮したり回収したりする工程を不必要とするか、あるいは簡略化して、そのための手間や設備を省力化することにある。

上記課題を解決するため、本発明は、その第１の側面として、クラミドモナス属（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓｓｐ．）に属する微細藻であって、暗嫌気下においてエチルアルコール産生能を有し、且つ、凝集しつつ増殖する能力を獲得した変異株であることを特徴とする微細藻を提供するものである。

この微細藻は、暗嫌気下においてエチルアルコール産生能を有し、且つ、凝集しつつ増殖する能力を獲得した変異株であるので、例えば、液体培地を入れた容器中で増殖させる場合は、藻同士が凝集しつつ増殖し、あるいは、増殖後に自然沈降させることにより藻同士を凝集させることができ、その藻体凝集物を増殖系から容易に分離して、その後の自己発酵系（エチルアルコール産生系）に移行させることができる。また、自己発酵系（エチルアルコール産生系）から容易に分離して、その後のエチルアルコール分取系に移行させることができる。また、糸や布などの担持体に付着させて液体培地を噴霧したりすることで効率よく増殖させることができ、その担持体上に藻同士が凝集しつつ増殖した藻体凝集物を培養系から容易に分離して、その後の自己発酵系（エチルアルコール産生系）に移行させることができる。また、自己発酵系（エチルアルコール産生系）から容易に分離して、その後のエチルアルコール分取系に移行させることができる。これにより、微細藻類の自己発酵を利用したエチルアルコール生産において、遠心処理やフィルター処理等によって藻体を濃縮したり回収したりする工程を不必要とするか、あるいは簡略化して、そのための手間や設備を省力化することができる。更には、エチルアルコール生産のために再利用したり、エチルアルコール生産以外の他の用途に転用したりすることが、行ない易い。

本発明による微細藻においては、前記微細藻は、クラミドモナス・ラインハルディ（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ）に属する微細藻であることが好ましい。

また、前記微細藻は、ＨｏｎｄａＤＲＥＡＭＯ株（受託番号ＦＥＲＭＢＰ−２２３０６）であることが好ましい。

一方、本発明は、その第２の側面として、上記の微細藻を増殖させ、暗嫌気下に保持してエチルアルコールを生成させることを特徴とするエチルアルコールの製造方法を提供するものである。

本発明によるエチルアルコールの製造方法においては、前記微細藻の増殖を、液体培地を入れた容器中で行い、藻同士が凝集しつつ増殖した該藻体凝集物、又は、増殖後に自然沈降させることにより藻同士を凝集させた該藻体凝集物を得て、これを暗嫌気下に保持してエチルアルコールを生成させることが好ましい。

また、前記微細藻の増殖を、担持体に担持させた前記微細藻に液体培地を接触させつつ行い、前記担持体上に藻同士が凝集しつつ増殖した該藻体凝集物を得て、これを暗嫌気下に保持してエチルアルコールを生成させることが好ましい。

一方、本発明は、その第３の側面として、上記の微細藻を増殖させ、藻同士が凝集した藻体凝集物を得ることを特徴とするエチルアルコール生産用の藻体凝集物の製造方法を提供するものである。

本発明によるエチルアルコール生産用の藻体凝集物の製造方法においては、前記微細藻の増殖を、液体培地を入れた容器中で行い、藻同士が凝集しつつ増殖した該藻体凝集物、又は、増殖後に自然沈降させることにより藻同士を凝集させた該藻体凝集物を得ることが好ましい。

また、前記微細藻の増殖を、担持体に担持させた前記微細藻に液体培地を接触させつつ行い、前記担持体上に藻同士が凝集しつつ増殖した該藻体凝集物を得ることが好ましい。

一方、本発明は、その第４の側面として、上記の藻体凝集物を暗嫌気下に保持してエチルアルコールを生成させることを特徴とするエチルアルコールの製造方法を提供するものである。

本発明によるエチルアルコールの製造方法においては、前記エチルアルコールの生成後の前記藻体凝集物を、該藻細胞内の澱粉の蓄積を回復させたうえで、更に暗嫌気下に保持してエチルアルコールを生成させることが好ましい。

一方、本発明は、その第５の側面として、上記のエチルアルコールの製造方法における、前記エチルアルコールの生成後の前記藻体凝集物を回収し、これをエチルアルコール生産以外の用途に用いる、該藻体凝集物の使用を提供するものである。

本発明による藻体凝集物の使用においては、前記用途は、食品、医薬品、医薬部外品、健康食品、機能性食品、栄養補助食品、サプリメント、動物・魚類用医薬品、動物・魚類用医薬部外品、動物・魚類用サプリメント、動物・魚類用飼料、肥料、又は固形燃料への配合用の用途であることが好ましい。

本発明によれば、微細藻類の自己発酵を利用したエチルアルコール生産において、凝集しつつ増殖する能力を獲得した変異株を用いることにより、遠心処理やフィルター処理等によって藻体を濃縮したり回収したりする工程を不必要とするか、あるいは簡略化して、そのための手間や設備を省力化することができる。

本発明による微細藻の自己発酵によりエチルアルコールを生産するための概略工程を示す図である。本発明による微細藻を寒天培地上に所定量増殖させた状態を示す図である。本発明の一実施形態において微細藻を液体培地中に所定量増殖させた状態を示す図であり、図３（ａ）、図３（ｂ）、図３（ｃ）はそれぞれの順で植菌からより長く経過した状態を示す図である。本発明の他の実施形態において微細藻を担持体上で所定量増殖させた状態を示す図であり、図４（ａ）、図４（ｂ）、図４（ｃ）はそれぞれの順で植菌からより長く経過した状態を示す図である。本発明の一実施形態において微細藻を液体培地中に所定量増殖させた後に自己発酵系に移してエチルアルコールを生成させた状態を示す図である。本発明の他の実施形態において微細藻を担持体上で所定量増殖させた後に自己発酵系に移してエチルアルコールを生成させた状態を示す図である。従来のエチルアルコール生産用微細藻類を液体培地中で所定量増殖させた状態を示す図である。従来のエチルアルコール生産用微細藻類の自己発酵によりエチルアルコールを生産するための概略工程を示す図である。

本発明に用いる微細藻としては、クラミドモナス属（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓｓｐ．）に属する微細藻、より典型的にはクラミドモナス・ラインハルディ（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ）に属する微細藻が挙げられる。この藻類は光合成をともない光独立栄養的に生育・増殖することができ、その際のＣＯ_２固定により細胞内に豊富に澱粉を蓄積することができる。一方、光や栄養が乏しい条件では、蓄えた澱粉を酸化分解しながら生育し、さらに暗嫌気下に曝されるとエチルアルコールを生産するようになる。

本発明に用いる微細藻には、上記エチルアルコール生産能に加えて、更に、凝集しつつ増殖する能力が必要とされる。そのような性質を有するクラミドモナス属に属する微細藻としては、例えば、後述の実施例で示すＨｏｎｄａＤＲＥＡＭＯ株（受託番号ＦＥＲＭＢＰ−２２３０６）などが例示される。ただしこれに限られるものではなく、そのような性質を有する変異株を、例えば下記のようにして適宜所望に応じて実際的な頻度で取得することが可能である。

（変異株の取得方法）
親株が好まない環境下、例えば、光、温度、栄養、ＣＯ_２、ｐＨ、乾燥などの条件を悪条件にして、ほぼすべての藻体が死滅する条件で培養を行うと、その条件で培養を繰り返すうちにわずかに生き残る藻体が出現する。

生存藻体があれば回収し、確たる生存藻体が得られなければ、再び同様な過酷な条件下にて培養を行い、生き残る藻体が出現するまでその培養を繰り返し行う。

過酷生育環境への暴露は、通常これを数十から数百回程度繰り返すことにより、凝集しつつ増殖する能力を獲得した変異株を得ることができる。

親株が好まない環境としては、例えば、０〜５μｍｏｌ/ｍ^２・ｓｅｃ程度の暗条件下、カラカラに乾かない程度の乾燥条件下、バクテリア等の増殖が著しい条件下、冷熱温度サイクルが著しく激しい条件下、必須栄養源の枯渇条件下、これらいずれか２種以上の条件の組み合わせなどが挙げられる。このような過酷な条件でも生育する変異株を探索することで、凝集して生育しなければならない環境以外にも、最低限の水分量のみで生育される環境、光合成できない状況でも長期間生存する必要がある環境など、屋外での培養にも適するような性質をあわせて獲得した変異株を取得することができる。

本発明に用いる微細藻の培養、保存等の維持管理は、従来クラミドモナス属に属する微細藻において使用されている周知の方法に準じて行えばよく、特に制限はない。すなわち、窒素、リン、カリウム等の無機成分とその他の微量金属元素成分を含む液体培地やそれに寒天を添加して調製した寒天培地を得て、その液体培地中又は寒天培地上で培養したり、少量の培地で増殖させた前培養からより多量な培地に植え継いで増量したり、同じ容量で継代培養したり、寒天培地上に擦り付けて植菌して所定量増殖させたうえ、冷蔵庫に入れて保存したりする等の維持管理を行うことができる。

培養時の光条件としては、太陽光や人工光の照射によって５〜１０００μｍｏｌ/ｍ^２・ｓｅｃ程度とすることが好ましく、１００〜１５０μｍｏｌ/ｍ^２・ｓｅｃ程度とすることがより好ましい。また、温度としては、５〜４０℃程度とすることが好ましく、２０〜３０℃程度とすることがより好ましい。また、培地のｐＨとしてはｐＨ５〜９程度とすることが好ましく、ｐＨ７程度とすることがより好ましい。また、植え継ぎ間隔としては、２００ｍＬ程度の容量の液体培地での培養のときには、５〜１０日程度であることが好ましく、寒天培地上での培養のときには８〜１２週間程度であることが好ましい。長期間の植継ぎや寒天培地上での保存等のためには生長を律速するようにしてもよく、そのためには光条件を０〜１５０μｍｏｌ/ｍ^２・ｓｅｃ程度とすることが好ましく、５〜２０μｍｏｌ/ｍ^２・ｓｅｃ程度、温度は５〜２０℃とすることがより好ましい。なお、０℃以下あるいは凍結での保存は、死滅のおそれがあるので好ましくない。

一方、十分な収量でエチルアルコールを生産するためには、微細藻を十分に増殖させ、その細胞中に澱粉を蓄えさせる必要がある。そのために望ましい条件としては、上記の維持管理の条件に加えて、あるいは代えて、光条件として、太陽光や人工光の照射によって５〜１０００μｍｏｌ/ｍ^２・ｓｅｃ程度とすることが好ましく、１５０〜３００μｍｏｌ/ｍ^２・ｓｅｃ程度とすることがより好ましい。また、温度として５〜４０℃程度とすることが好ましく、２５〜３０℃程度とすることがより好ましい。また、培地のｐＨとしてｐＨ５〜９程度とすることが好ましく、ｐＨ７程度とすることがより好ましい。

以下には、典型的な培養培地の組成を示す。ただしこれらの培地に限られるものではない。
■ＵＲＥＡ液体培地
溶液Ａ５．０ｍＬ
溶液Ｂ５．０ｍＬ
溶液Ｃ１．０ｍＬ
蒸留水で１．０Ｌにメスアップし、１２１℃１５分間のオートクレーブ滅菌
■ＴＡＰ液体培地
Ｔｒｉｓ２．４２ｇ
溶液Ｂ０．３７５ｍＬ
溶液Ｃ１．０ｍＬ
溶液Ｄ２５ｍＬ
酢１．０ｍＬ
蒸留水で１．０リットルにメスアップし、１２１℃１５分間のオートクレーブ滅菌
■ＴＡＰ寒天培地
ＴＡＰ液体培地に寒天を添加（寒天添加量５．０ｇ／Ｌ）
□溶液Ａ
ＣＨ_４Ｎ_２Ｏ５６．１ｇ
ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ４．０ｇ
ＣａＣｌ_２・２Ｈ_２Ｏ２．０ｇ
蒸留水で１．０リットルにメスアップ
□溶液Ｂ
Ｋ_２ＨＰＯ_４（無水）２８８．０ｇ
ＫＨ_２ＰＯ_４１４４．０ｇ
蒸留水で１．０リットルにメスアップ
□溶液Ｃ
ＺｎＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ２２．０ｇ
Ｈ_３ＢＯ_３１１．４ｇ
ＭｎＣｌ_２・４Ｈ_２Ｏ５．０６ｇ
ＣｏＣｌ_２・６Ｈ_２Ｏ１．６１ｇ
ＣｕＳＯ_４・５Ｈ_２Ｏ１．５７ｇ
（ＮＨ_４）_６Ｍｏ_７Ｏ_２４・４Ｈ_２Ｏ１．１ｇ
ＦｅＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ４．９９ｇ
Ｃ_１０Ｈ_１６Ｎ_２Ｏ_８（ＥＤＴＡ）５０．０ｇ
蒸留水で１．０リットルにメスアップ
□溶液Ｄ
ＮＨ_４Ｃｌ１５．０ｇ
ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ４．０ｇ
ＣａＣｌ・２Ｈ_２Ｏ２．０ｇ
蒸留水で１．０リットルにメスアップ

以下、図面を参照して、本発明について更に具体的に説明する。ただし本発明はこれらの例に限定されるものではない。

図１には、本発明による微細藻の自己発酵によりエチルアルコールを生産するための概略工程が示されている。この図に示すように、本発明においては、微細藻を増殖させる増殖系から増殖した藻体を暗嫌気下に曝して自己発酵させる自己発酵系に移る過程、あるいは暗嫌気下に曝した藻体を除いてエチルアルコールの分取系に移る過程において、その藻体を遠心処理やフィルター処理等によって濃縮・回収する工程が不必要とされ、あるいは少なくとも簡略化されている。以下更に詳細に説明する。

図２には、本発明による微細藻を寒天培地上に所定量増殖させた状態が示されている。すなわち、直径９０ｍｍ×高さ２０ｍｍの大きさのシャーレ１に調製した寒天培地２上に適量の前培養液を滅菌済みの白金耳で擦り付けて植菌し（このときには微細藻は肉眼で確認できないほど少量である）、光強度５〜２０μｍｏｌ/ｍ^２・ｓｅｃ、５〜２０℃の環境下で静置することで、植菌から１〜３週間後には、藻体が図２の藻体３の状態のようになる。

図３には、本発明の一実施形態において微細藻を液体培地中で所定量増殖させた状態が示されている。すなわち、この実施形態では、１６０ｍＬ容量の容器４に液体培地５を調製して入れ、上記寒天培地上に増殖させた藻体の一部を滅菌済みの白金耳で掻き取って植菌し、植菌直後に容器ごと撹拌して藻体を分散させた後、光強度１００〜１５０μｍｏｌ/ｍ^２・ｓｅｃ、２５〜３０℃の環境下で静置することで、植菌から３〜５日後には、藻体が図３（ａ）の藻体３ａの状態のようになる。また、植菌から５〜７日後には、藻体が図３（ｂ）の藻体３ｂの状態のようになる。さらに、７〜１０日後には、図３（ｂ）の藻体３ｂの底面の膜が厚みを増す。この状態において、容器を横に軽く振ると、藻体が図３（ｃ）の藻体３ｃの状態のようになる。なお、図３（ｃ）には液体培地を除いた状態が示されている。より詳細に図３（ａ）では、容器４の底面に長径０．５〜５ｍｍ程度、より典型的には長径１〜２ｍｍ程度の大きさの粒子状にまとまった藻体３ａのコロニーが複数分散し、また、それぞれのコロニーがさらに大きなまとまりを形成しつつ分散している状態となっている。図３（ｂ）では、分散していた藻体のコロニーがさらに密になって、藻体３ｂが、底面のほぼすべてを覆うように増殖して膜状となっている。図３（ｃ）では、厚みを増した藻体３ｃが、横方向の撹拌で絨毯状にまとまった状態となっている。

このように本発明による微細藻は、凝集しつつ増殖する能力を有するので、図７に示す従来型の微細藻類とは、増殖させた藻体が自己集合的に藻体凝集物を形成する点において相違している。よって、また、本発明では、その藻体凝集物を容易に分離して、その後の工程に移行させることができる点において、従来型の微細藻類を用いる場合とは相違している。ここで「容易に分離して」とは、遠心分離の処理やフィルターでの処理を経ることなく液体媒体から分離することができることを意味し、より具体的には、藻体凝集物が、（１）例えば手やトングでつまんで図３の容器４や液体培地５から取り出せるほどに自己支持性を有することなどにより、あるいは（２）例えば図３の容器４から所定大きさの吸い口につながるポンプ等で液体培地５を排出ことにより固液分離が可能であるほどに自己支持性を有することなどにより、遠心分離の処理やフィルターでの処理を経ることなく液体媒体から分離することができることを意味している。

上記のような藻体凝集物は、増殖中に形成されてもよく、所定量増殖した後に静置して自然沈降により形成されてもよい。よって、例えば、増殖中には藻体の全部または一部が分散した状態であって、図７に示す従来型とみかけ上区別がない場合でも、所定量増殖した後にそのような藻体凝集物が形成されればよく、本発明の効果を十分に享受することができる。また、必ずしも増殖させた全部の藻体から藻体凝集物が形成される必要はなく、増殖させた藻体の少なくとも一部がそのような藻体凝集物を形成できれば、その藻体凝集物をその後の暗嫌気下における自己発酵系（エチルアルコール産生）に移行させることができるので、本発明の効果を十分に享受することができる。例えば、増殖させた藻体の３０湿質量％以上がそのような藻体凝集物を形成することができれば好ましく、５０湿質量％以上がそのような藻体凝集物を形成することができればより好ましく、７０湿質量％以上がそのような藻体凝集物を形成することができればさらにより好ましく、９９湿質量％以上がそのような藻体凝集物を形成することができれば最も好ましい。

図４には、本発明の他の実施形態において微細藻を担持体上で所定量増殖させた状態が示されている。すなわち、この実施形態では、糸からなる担持体６を担持体保持具７に所定本数吊るして、その担持体６に微細藻を担持させて増殖させている。より詳細に図４（ａ）には、液体供給具８から微細藻を分散させた液体培地を上方から垂らして、糸からなる担持体６に付着させる様子が示されている。担持体６に微細藻を付着させる方法に特に制限はなく、例えば、微細藻を分散させた液体培地を噴霧して担持体６に微細藻を付着させたり、担持体６を微細藻の培養液に漬け込んだり、担持体６に微細藻の培養液を吸わせたり、など方法であればよい。微細藻の分散媒は、微細藻の生育を阻害しない液体であればよいが、その液体として微細藻の生育に適した液体培地を用いれば、担持体６に吸水または付着し、これが微細藻に接触して初期の栄養として利用されるので、より好ましい。その後、光強度１００〜３００μｍｏｌ/ｍ^２・ｓｅｃ、１０〜３０℃の環境下で静置することで、植菌から１〜２日後には、藻体が図４（ｂ）の藻体３ｄの状態のようになる。また、植菌から５〜７日後には、藻体が図４（ｃ）の藻体３ｅの状態のようになる。微細藻の増殖中には、担持体６上に増殖した藻体があまり乾燥しないようにすることが好ましく、必要に応じて、微細藻の生育を阻害しない液体を上方から担持体６に沿って垂らす、または担持体６に対して噴霧する、環境雰囲気の湿度を保つなどすることが好ましい。そして、上記と同様に、その液体として微細藻の生育に適した液体培地を用いれば、担持体６に吸水または付着されて、これが微細藻に接触して追加の栄養として利用されるので、より好ましい。

このように本発明による微細藻は、凝集しつつ増殖する能力を有するので、図７に示す従来型の微細藻類とは、糸や布などの担持体に付着させて液体培地を噴霧したりすることで効率よく増殖させることができる点において相違している。すなわち、その担持体上に藻同士が凝集しつつ増殖した藻体凝集物を形成する点において相違している。よって、また、本発明では、その藻体凝集物を容易に分離して、その後の工程に移行させることができる点において、従来型の微細藻類を用いる場合とは相違している。ここで「容易に分離して」とは、遠心分離の処理やフィルターでの処理を経ることなく液体媒体から分離することができることを意味し、この実施形態においては、（１）例えば担持体上に形成させた藻体凝集物を、担持体ごと自己発酵系（エチルアルコール産生系）やその後のエチルアルコール分取系に移行させることなどにより、あるいは（２）例えば担持体から掻き取ったうえで自己発酵系（エチルアルコール産生系）やその後のエチルアルコール分取系に移行させることなどにより、達成され得る。

次に、図５、６を参照しつつ、エチルアルコールを生成させる工程について説明する。

上記のようにして得られた微細藻、藻体、あるいは藻体凝集物からは、従来周知の方法に準じて、これを暗嫌気下に保持することにより、その自己発酵によりエチルアルコールを産生させることができる。

例えば、図５には、上記図３で説明した藻体３ｃを用いた例が示されている。すなわち、藻体３ｃを容器４から取り出して、密閉容器９の収容部９ａに収容したうえ、液体培地５で満たし、蓋９ｂで密閉している。また、液体培地５の液体量に対して液体が入っていない空間（ＣＯ_２およびＯ_２が存在）の体積が、極めて小さくなるような状態となっている。これにより、嫌気環境を形成している。なお、密閉容器を使用しない場合は、Ｎ_２ガスやＨｅガスなど、不活性化ガスを流して空気を置換する方法をとってもよい。そして、その密閉容器９ごと暗箱１０の収容部１０ａに収容し、蓋１０ｂで密閉している。これにより、暗条件を形成している。なお、暗条件は、アルミホイルや暗幕で密閉容器９を覆うなどで形成してもよく、また、密閉容器自体が遮光性を有していてもよい。藻体３ｃの量に対する液体培地５の量は、藻体３ｃ（ｇ）：液体培地５（ｍＬ）の比にして、１：５であることが好ましく、２：５であることがより好ましい。温度条件としては、５〜４５℃であることが好ましく、２５〜３５℃であることがより好ましい。ｐＨとしは、ｐＨ５〜９であることが好ましく、ｐＨ７．０であることがより好ましい。この環境を６〜７２時間程度維持することにより、０．１〜１体積％程度の低濃度エチルアルコール溶液となる。

一方、例えば、図６には、上記図４で説明した藻体３ｅを用いた例が示されている。すなわち、藻体３ｅを糸からなる担持体６ごとを容器４から取り出して、密閉容器９の収容部９ａに収容したうえ、液体培地５で満たし、蓋９ｂで密閉している。その他は、上記図５において説明した態様と同様である。その環境を６〜７２時間程度維持することにより、０．１〜１体積％程度の低濃度エチルアルコール溶液となる。

上記のようにして得られた低濃度エチルアルコール溶液からは、従来周知の方法に準じて、エチルアルコールを分取することができる。例えば、自己発酵後の低濃度エチルアルコール溶液を活性炭に通し、エチルアルコールを選択的に活性炭内に吸着させることができる。これにより、活性炭内のエチルアルコール濃度は、自己発酵後の低濃度エチルアルコール濃度に比べ、最大で７倍程度まで純度を高めることが可能である。０．５体積％のエチルアルコール濃度の自己発酵溶液を用いた場合、３．５％程度の濃縮液が活性炭内に得られ、この活性炭を直接蒸留にかけることで、高純度のエチルアルコールを分取することができる。あるいは、自己発酵後の低濃度エチルアルコール溶液は、そのまま蒸留にかけてエチルアルコールを分取してもよく、又は、中空糸膜や浸透膜などを用いてパーベーパーレーションを行うなどの方法でエチルアルコールの純度を高めることもできる。

本発明の他の態様においては、エチルアルコール生産のために利用された藻体凝集物を再利用してもよい。すなわち、エチルアルコール生産のために利用された藻体凝集物では、通常、藻細胞内の澱粉の蓄積状態が枯渇し、あるいは不十分な状態となっているので、澱粉の蓄積を回復させたうえで、その後、更に上記に説明したように暗嫌気下に保持してエチルアルコールを生成させることができる。藻細胞内の澱粉の蓄積の回復させるためには、例えば、自己発酵系から回収した藻体凝集物を明条件下に所定時間保持することなどにより行なうことができる。その際、藻体凝集物は湿潤状態で保持することが好ましく、微細藻の培養、保存等の維持管理に用いる適当な培地に藻体凝集物を接触させつつ保持することがより好ましい。また、ＣＯ_２やＯ_２と接触し得る好気環境下に保持することが好ましい。

澱粉蓄積回復のための光条件としては、太陽光や人工光の照射によって５〜１０００μｍｏｌ/ｍ^２・ｓｅｃ程度とすることが好ましく、１００〜１５０μｍｏｌ/ｍ^２・ｓｅｃ程度とすることがより好ましい。また、温度としては、５〜４０℃程度とすることが好ましく、２０〜３０℃程度とすることがより好ましい。また、培地のｐＨとしてはｐＨ５〜９程度とすることが好ましく、ｐＨ７程度とすることがより好ましい。なお、この澱粉蓄積回復のためには藻の増殖は必要的ではなく、過度な藻の生長がかえってエネルギー浪費につながるので、生長をある程度律速するような条件で行ってもよく、そのためには光条件を０〜１５０μｍｏｌ/ｍ^２・ｓｅｃ程度とすることが好ましく、５〜２０μｍｏｌ/ｍ^２・ｓｅｃ程度、温度は５〜２０℃とすることがより好ましい。

本発明の別の態様において、エチルアルコール生産のために利用された藻体凝集物は、これを回収して、エチルアルコール生産以外の他の用途に転用してもよい。すなわち、エチルアルコール生産のために利用された藻体凝集物には、通常、脂質・タンパク質等の栄養成分あるいはエネルギー供給成分が豊富に含まれているので、食品、医薬品、医薬部外品、健康食品、機能性食品、栄養補助食品、サプリメント、動物・魚類用医薬品、動物・魚類用医薬部外品、動物・魚類用サプリメント、動物・魚類用飼料、肥料、固形燃料など各種の製品等に配合するための素材として好適である。使用の態様としては、それら製品等の原料の一部として含有せしめればよく、配合量としても、製品等の種類によって適宜設定すればよく、特に制限はない。例えば、食品、動物・魚類用飼料であれば、藻体凝集物を全体の０．０１〜１００質量％配合することが好ましく、１０〜５０質量％配合することがより好ましい。例えば、医薬品、医薬部外品、動物・魚類用医薬品、動物・魚類用医薬部外品であれば、藻体凝集物を全体の０．０１〜５０質量％配合することが好ましく、１〜３０質量％配合することがより好ましい。例えば、健康食品、機能性食品、栄養補助食品、サプリメントであれば、藻体凝集物を全体の０．０１〜５０質量％配合することが好ましく、１〜３０質量％配合することがより好ましい。例えば、肥料であれば、藻体凝集物を全体の０．０１〜１００質量％配合することが好ましく、１０〜５０質量％配合することがより好ましい。例えば、固形燃料であれば、藻体凝集物を全体の０．０１〜１００質量％配合することが好ましく、１０〜５０質量％配合することがより好ましい。

本発明による微細藻及びその微細藻を用いたエチルアルコールの製造方法は、上記に説明した態様に限らず、その他の実際的な大量生産方式の設備や施設にも好適に利用され得ることは勿論である。

以下、実施例により本発明のさらに詳細を説明するが、本発明は以下の実施例の範囲に限定されるものではない。

（試験例１）
親株として以下の典型株を用いて、凝集しつつ増殖する能力のある変異株を探索した。

＜親株＞
・原産地：米国
・分離源：Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ
・株保管機関：国立研究開発法人国立環境研究所
・株番号：ＮＩＥＳ−２２３６

＜過酷生育環境暴露＞
上記親株を、ＵＲＥＡ液体培地中で培養し、遠心分離により濃縮して、スラリー状の藻体からさらに自然乾燥により、カラカラに乾燥しない程度に乾燥させた。この半乾燥状の藻体を、遮光性の蓋を有する１Ｌ容量の容器の蓋の内側中央部に微量こすり付け、容器内にはＵＲＥＡ液体培地８００ｍＬを入れ、藻体をこすり付けた蓋を締め付けこの容器を完全に密閉し、暗所にて２０〜２５℃で５日間保持した。このとき、容器内に液体を入れたのは、蒸発によって水蒸気が発生することにより、蓋の内側にこすり付けた藻が完全に乾燥するのを防ぐためでもあった。５日間の保持後、密閉状態のまま容器を上下に撹拌し、蓋の内側にこすり付けた藻体を液体培地内に落とした。その後密閉状態を維持したまま、さらに５日間、２０〜２５℃、２００μｍｏｌ/ｍ^２・ｓｅｃ程度・明暗周期（8L16D：明８時間；暗１６時間）で保持した。５日間の保持後、容器を開けて培養液を取り出し、通常の液体培養を行なった。生存株がある場合、培養日数がたつにつれ、緑色が濃くなっていくのが目視で確認できた。生存株が確認できなかった場合、上記のサイクルを再び実施し、生存株が出現するまで繰り返した。

＜凝集試験＞
取得した生存株について凝集試験を行った。凝集試験では、培養ボトル中で通常の液体培養を行ない、藻体の沈殿物に厚みが生じるまで増殖させた状態で、ボトルを左右に振ったとき、藻体が絨毯状に凝集するか否かを観察した。

生存株のうち上記試験において凝集性を示した株の中から、ＦＡＣＳ法・走光性法・マニピュレーション法・抗生物質法等により５１株をピックアップし、通常の寒天培養を行った。培養した５１株の中から、生育状況が芳しい２４株を選択し、細菌検査および顕微鏡観察を実施した。細菌検査では、細菌増殖用培地（ＧＰＹ液体培地：２％グルコース、１％ポリペプトン、０．５％酵母エキス）を用いて、ＧＰＹ液体培地１００μLに藻培養液３０μＬを混合し、２８℃、暗所で最長で１４日間静置培養した。培養７日目以降に培地懸濁の有無と顕微鏡観察による細菌の生育の有無を確認した。

細菌検査により、２４株中、２２株が純化株であることが確認された。さらに、顕微鏡観察において、遊泳能を有していること、色、形等から２２株中１９株がクラミドモナス藻であると判断できた。

この選別された１９株について再度寒天培養を行い、生育が最も良い株をピックアップし、ＨｏｎｄａＤＲＥＡＭＯ株（受託日２０１６年４月２２日，受託番号ＦＥＲＭＢＰ−２２３０６）として、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許生物寄託センター（千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８１２０号室）に寄託した。

なお、ＨｏｎｄａＤＲＥＡＭＯ株について、別途ＤＮＡ塩基配列（配列決定率：全ゲノムの８５％以上）を調べたところ、ＮＣＢＩデータベースに登録されているＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉのリファレンス配列と比較し、９９．９％を超える高い相同性を示した。よって、ＨｏｎｄａＤＲＥＡＭＯ株は、クラミドモナス属（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓｓｐ．）に属する微細藻であり、さらにはクラミドモナス・ラインハルディ（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ）に属する微細藻であるであると判断された。

１シャーレ
２寒天培地
３、３ａ、３ｂ、３ｃ、３ｄ、３ｅ藻体
４容器
５液体培地
６担持体
７担持体保持具
８液体供給具
９密閉容器
９ａ密閉容器の収容部
９ｂ密閉容器の蓋
１０暗箱
１０ａ暗箱の収容部
１０ｂ暗箱の蓋
１１藻体

Claims

クラミドモナス属（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓｓｐ．）に属する微細藻であって、暗嫌気下においてエチルアルコール産生能を有し、且つ、凝集しつつ増殖する能力を獲得した変異株であることを特徴とする微細藻。
前記微細藻は、クラミドモナス・ラインハルディ（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ）に属する微細藻である請求項１記載の微細藻。
前記微細藻は、ＨｏｎｄａＤＲＥＡＭＯ株（受託番号ＦＥＲＭＢＰ−２２３０６）である請求項１記載の微細藻。
請求項１〜３のいずれか１項に記載の微細藻を増殖させ、暗嫌気下に保持してエチルアルコールを生成させることを特徴とするエチルアルコールの製造方法。
前記微細藻の増殖を、液体培地を入れた容器中で行い、藻同士が凝集しつつ増殖した該藻体凝集物、又は、増殖後に自然沈降させることにより藻同士を凝集させた該藻体凝集物を得て、これを暗嫌気下に保持してエチルアルコールを生成させる、請求項４記載のエチルアルコールの製造方法。
前記微細藻の増殖を、担持体に担持させた前記微細藻に液体培地を接触させつつ行い、前記担持体上に藻同士が凝集しつつ増殖した該藻体凝集物を得て、これを暗嫌気下に保持してエチルアルコールを生成させる、請求項４記載のエチルアルコールの製造方法。
請求項１〜３のいずれか１項に記載の微細藻を増殖させ、藻同士が凝集した藻体凝集物を得ることを特徴とするエチルアルコール生産用の藻体凝集物の製造方法。
前記微細藻の増殖を、液体培地を入れた容器中で行い、藻同士が凝集しつつ増殖した該藻体凝集物、又は、増殖後に自然沈降させることにより藻同士を凝集させた該藻体凝集物を得る、請求項７記載のエチルアルコール生産用の藻体凝集物の製造方法。
前記微細藻の増殖を、担持体に担持させた前記微細藻に液体培地を接触させつつ行い、前記担持体上に藻同士が凝集しつつ増殖した該藻体凝集物を得る、請求項７記載のエチルアルコール生産用の藻体凝集物の製造方法。
請求項７〜９のいずれか１項に記載の製造方法により得られたエチルアルコール生産用の藻体凝集物を、暗嫌気下に保持してエチルアルコールを生成させることを特徴とするエチルアルコールの製造方法。
前記エチルアルコールの生成後の前記藻体凝集物を、該藻細胞内の澱粉の蓄積を回復させたうえで、更に暗嫌気下に保持してエチルアルコールを生成させる、請求項１０記載のエチルアルコールの製造方法。
請求項４〜６、１０、１１のいずれか１項に記載の製造方法における、前記エチルアルコールの生成後の前記藻体凝集物を回収し、これをエチルアルコール生産以外の用途に用いる、該藻体凝集物の使用。
前記用途は、食品、医薬品、医薬部外品、健康食品、機能性食品、栄養補助食品、サプリメント、動物・魚類用医薬品、動物・魚類用医薬部外品、動物・魚類用サプリメント、動物・魚類用飼料、肥料、又は固形燃料への配合用の用途である、請求項１２記載の使用。