ES2645631T3 - Microalgas verdes que carecen del gen funcional DYRKP-1, para uso en el aumento de la producción de materias primas - Google Patents

Abstract

Un método para producir materia prima de biomasa, que comprende las etapas de: (i) cultivar células de microalgas verdes en las que la expresión y/o la actividad de la proteína DYRKP-1 de secuencia SEQ ID Nº: 1 está disminuida, pudiéndose obtener dicha disminución mediante silenciamiento, desactivación, mutación y/o interrupción del gen DYRKP-1 o mediante la inhibición de la actividad de la proteína DYRKP-1 mediante compuestos químicos que actúan como inhibidores específicos; y (ii) inducir la acumulación de reservas y/o el aumento en la producción de biomasa por dichas microalgas, que comprende incubar las células de microalgas en un medio deficitario, siendo dicho medio deficitario en al menos un elemento elegido entre el grupo que consiste en nitrógeno, azufre y fósforo.

Description

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DESCRIPCION.

Microalgas verdes que carecen del gen funcional DYRKP-1, para uso en el aumento de la produccion de materias primas

La presente invencion se refiere al campo de las microalgas verdes y su uso en biotecnologfa. Mas en particular, la presente invencion describe el uso de Chlamydomonas que carecen de una protema DYRKP-1 funcional, para producir grandes cantidades de lfpidos neutros (triacilgliceridos: TAGs, o aceites) y/o grandes cantidades de almidon, bajo condiciones de estres.

Debido a la alta productividad de biomasa y a su capacidad de acumular elevadas cantidades intracelulares de almidon (convertible en bioetanol) o de aceite (convertible en biodiesel), las microalgas representan una prometedora materia prima para la produccion de biocombustibles de proxima generacion (Hu et al., 2008 Wijffels y Barbosa, 2010). Sin embargo, es preciso que su productividad aumente para alcanzar una produccion sostenible de biocombustibles (Delrue et al., 2013).

Las microalgas y, mas generalmente los organismos fotosinteticos, han desarrollado sofisticadas estrategias para optimizar el crecimiento y la supervivencia bajo condiciones constantemente fluctuantes de luz, temperatura y disponibilidad de nutrientes. En las microalgas, la privacion de macronutrientes esenciales afecta en gran medida al crecimiento e induce cambios drasticos en el metabolismo celular. Una respuesta general a la privacion de nitrogeno o azufre consiste en una disminucion de la smtesis de protemas, una detencion en la division celular, una acumulacion masiva de compuestos de almacenamiento ricos en energfa, tales como almidon y triacilgliceroles (Ball et al., 1990; Merchant et al., 2012 ) y una regulacion a la baja de la fotosmtesis (Grossman, 2000, Peltier y Schmidt, 1991). Este requisito de privacion de nutrientes para desencadenar la acumulacion de compuestos de reserva es una de las principales limitaciones biologicas de las microalgas para fines biotecnologicos, ya que afecta a la productividad de la biomasa (Hu et al., 2008). A pesar del considerable interes por las microalgas como nueva materia prima (Larkum et al., 2012), se sabe poco sobre los genes de senalizacion y reguladores que controlan los procesos de conversion y almacenamiento de energfa fotosintetica en relacion con el estatus nutricional y energetico.

La descodificacion de los mecanismos reguladores que controlan el crecimiento, la fotosmtesis y la acumulacion de reservas en respuesta al estatus de los nutrientes y la energfa es por lo tanto una cuestion clave para optimizar la productividad de microalgas para aplicaciones biotecnologicas.

Con el objetivo de descifrar los mecanismos reguladores implicados en la dinamica de reserva en respuesta a la disponibilidad de nutrientes, los autores de la presente invencion han caracterizado ahora un mutante de Chlamydomonas reinhardtii, cribado en un deficit en la degradacion del almidon y llamado stdl (de starch degradation). El mutante stdl alberga una insercion en un gen de la familia de DYRK, inicialmente anotado como DYRK2 (genoma de Chlamydomonas version 4.0), y renombrado en el presente texto DYRKP-1. El mutante de Chlamydomonas std1, el primer mutante dyrk del linaje verde publicado hasta ahora, acumula mucho mas almidon y aceite que su progenitor de tipo silvestre en respuesta a la privacion de nutrientes en condiciones fotoautotrofas y mas aceite que su progenitor de tipo silvestre en respuesta a la privacion de nutrientes tambien en condiciones mixotroficas. Por tanto, la presente invencion proporciona metodos para cultivar celulas de microalgas para optimizar su crecimiento para una produccion optima de almidon y/o lfpidos de las microalgas. Los metodos de la presente invencion inducen y potencian la acumulacion de almidon y/o aceite, dependiendo de las condiciones de cultivo, dentro de las celulas de microalgas. Los metodos descritos son adecuados para la produccion a gran escala de microalgas ricas en almidon y/o aceite.

Un primer aspecto de la presente invencion es por tanto un metodo para producir materia prima de biomasa, que comprende las etapas de:

(i) cultivar celulas de microalgas verdes en las que la expresion y/o la actividad de la protema DYRKP-1 de secuencia SEQ ID N° 1 esta disminuida, pudiendose obtener dicha disminucion silenciando, rebajando, mutando y/o interrumpiendo el gen DYRKP-1 o inhibiendo la actividad de la protema DYRK-P mediante compuestos qmmicos que actuan como inhibidores espedficos; y

(ii) inducir la acumulacion de reservas y/o el aumento en la produccion de biomasa por dichas microalgas, que comprende incubar las celulas de microalgas en un medio deficitario, siendo deficitario dicho medio deficitario en al menos un elemento seleccionado entre el grupo que consiste en nitrogeno, azufre y fosforo.

Como se define en el presente texto, la "protema DYRKP-1" es una protema DYRK expresada por microalgas, que posee una caja DH que tiene la siguiente secuencia: H(R/K) TGFEEXK (D/E/N) (F/L) (SEQ ID N°: 3). La secuencia de aminoacidos y la secuencia codificante (secuencia de cDNA que incluye los 5' y 3' - UTRs) de la protema DYRKP-1 de Chlamydomonas reinhardtii se describen en el presente texto (SEQ ID N°: 1 y 2, respectivamente). A partir de estas secuencias, un experto en la tecnica puede identificar perfectamente la secuencia de DYRKP-1 en cualquier microalga verde.

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En el presente texto, "alterado" significa que se cambia la expresion y/o la actividad de la protema DYRKP-1, de forma que la actividad de la protema desciende. Por ejemplo, el gen DYRKP-1 puede ser silenciado, desactivado, mutado y/o interrumpido, de modo que las microalgas carecen de una protema funcional DYRKP-1. La actividad de la protema DYRK-P podna ser tambien inhibida por compuestos qmmicos que actuan como inhibidores espedficos.

Como se describe en la parte experimental que sigue, el metodo segun la invencion puede llevarse a cabo con Chlamydomonas, especialmente con Chlamydomonas reinhardtii.

En la etapa (i), las celulas se cultivan de acuerdo con cualquier protocolo habitual conocido por los expertos en la tecnica. Por ejemplo, se pueden cultivar fotoautotrofamente en un medio mmimo tamponado con MOPS (MM) al que se suministra 2% de CO2 a una densidad de 2-5 x 106 celulas/ml.

En una realizacion particular de este aspecto, dicha acumulacion de reserva inductora comprende incubar las celulas de microalgas en un medio deficitario, es decir, un medio que no comprende, en cantidades suficientes, todos los nutrientes requeridos para un crecimiento optimo de microalgas verdes. Entre los ejemplos de tal medio deficitario se incluyen un medio deficitario en al menos un elemento seleccionado entre el grupo que consiste en nitrogeno, azufre y fosforo, en una forma que puede ser metabolizada por las microalgas. Por supuesto, la frase "deficitario en" no se ha de leer en un sentido absoluto (es decir, con una concentracion igual a cero), sino que significa que la concentracion de dicho nutriente en el medio esta muy por debajo (por lo menos 10 veces por debajo) de la concentracion de dicho nutriente en un medio clasico usado para el cultivo de microalgas.

Entre la etapa (i) y la etapa (ii), las celulas pueden ser recolectadas y transferidas al medio deficitario. Alternativamente, tipicamente en un dispositivo de cultivo continuo, el deficit en el medio es creado por el metabolismo de las celulas, en ausencia de adicion exogena de al menos un nutriente. Por ejemplo, como se ilustra en la parte experimental y en la Fig. 9A, la adicion de un medio mmimo libre de N en un fotobiorreactor que trabaja como turbidostato (para mantener la biomasa celular a un nivel constante) dio como resultado una disminucion del contenido de amomaco del medio de cultivo, que se agoto completamente en menos de 2 dfas.

En una realizacion particular, la etapa de inducir acumulacion de reserva comprende iluminar las celulas de microalgas con una luz que permite que tenga lugar la fotosmtesis.

Por ejemplo, esta iluminacion puede realizarse a una intensidad de al menos 25 pmoles de fotones m-2 s'1, o al menos 100 pmoles de fotones m'2s-1, por ejemplo comprendida entre 25 y 2000 pmoles de fotones m'2s-1, durante 8 a 24 horas al dfa. Un experto en la tecnica sabe perfectamente que los efectos de la intensidad de la luz dependen de hecho de la intensidad que realmente recibe la microalga, y por tanto dependen de diversos parametros tales como la densidad celular y la forma del fotobiorreactor, etc., y es capaz de adaptar la intensidad de la iluminacion a las condiciones espedficas encontradas.

Sorprendentemente, los autores de la presente invencion han demostrado que la privacion de nutrientes no conduce a una parada rapida de la fotosmtesis por microalgas que carecen de actividad de DYRKP-1, como es normalmente el caso de las microalgas de tipo silvestre. Esto es particularmente ventajoso, ya que las celulas no solo pueden ser enriquecidas con aceite y/o almidon, sino que ademas la biomasa global aumenta durante varios dfas de condiciones deficitarias, dando lugar a un notable aumento global de la productividad de lfpidos y almidon.

Por tanto, en una realizacion ventajosa de la presente invencion, la etapa de incubar las celulas de microalgas en un medio deficitario dura por lo menos 24 horas, por ejemplo de 2 a 8 dfas, preferiblemente de 3 a 6 dfas. Por supuesto, el crecimiento celular en un medio deficitario depende mucho de las condiciones experimentales, particularmente de la densidad celular, y por tanto un experto en la tecnica adaptara la duracion de la incubacion con un medio deficitario de forma que, en las condiciones espedficas utilizadas, la acumulacion de reserva y/o el aumento de la biomasa sean optimos.

De acuerdo con una realizacion particular de la invencion, la etapa (ii) comprende incubar las celulas de microalgas en un medio que comprende carbono organico tal como, por ejemplo, acetato. De acuerdo con un ejemplo no limitante de tales condiciones mixotroficas, ilustradas en los ejemplos que siguen, las celulas se incuban en la etapa (ii) durante 2 a 6 dfas en un medio deficitario en nitrogeno que comprende acetato, bajo iluminacion constante de al menos 50 pmoles de fotones m-2 s-1. Los autores de la presente invencion han demostrado que, en condiciones mixotroficas, las microalgas que carecen de actividad de DYRKP-1 responden al agotamiento de nutrientes aumentando la acumulacion de lfpidos en comparacion con las celulas de tipo silvestre. Por tanto, esta realizacion particular del metodo se utiliza ventajosamente para producir aceite, por ejemplo para la produccion de biodiesel.

De acuerdo con otra forma de realizacion, la etapa inductora (ii) comprende incubar las celulas de microalgas en un medio deficitario como se ha definido anteriormente y en condiciones fotoautotrofas, es decir, en condiciones tales que convierten energfa radiante en energfa biologicamente util y sintetizan compuestos metabolicos usando solamente dioxido de carbono, bicarbonato o carbonatos como fuente de carbono. Tfpicamente, las celulas de microalgas se incuban bajo iluminacion en un medio esencialmente carente de carbono organico que pueden metabolizar. En lo que precede, "esencialmente carente de carbono organico" significa que ningun carbono organico

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que pueda ser metabolizado por las microalgas ha sido anadido al medio. De acuerdo con una version preferida de esta realizacion, las celulas se incuban en la etapa (ii) durante al menos 15 horas, preferiblemente al menos 1, 2 o 3 d^as y hasta 6 o mas d^as en un medio deficitario en nutrientes, por ejemplo en un medio deficitario en nitrogeno esencialmente carente de carbono organico que puede ser metabolizado por las microalgas. Los inventores han demostrado que en condiciones fotoautotrofas, las microalgas que carecen de actividad de DYRKP-1 acumulan mucho mas almidon y aceite que sus progenitoras de tipo silvestre en respuesta a la privacion de nutrientes. Por tanto, esta forma de realizacion particular del metodo se utiliza ventajosamente para producir almidon, por ejemplo para la produccion de bioetanol, asf como para producir aceite, por ejemplo para la produccion de biodiesel. Esta realizacion es particularmente interesante porque, en condiciones fotoautotrofas, las celulas pueden satisfacer completamente su necesidad de carbono a traves de la fotosmtesis, lo cual es una ventaja importante en comparacion con las celulas que requieren una fuente de carbono suministrada adicionalmente para el crecimiento (tal como levadura o E. coli).

Se ha de tener en cuenta que las microalgas producen de forma natural grasas poliinsaturadas (omega-3 y omega- 6), asf como moleculas complejas tales como carotenoides, y que estos productos de alto valor pueden producirse tambien de acuerdo con los metodos descritos en la presente memoria. Por tanto, la invencion se refiere tambien a metodos para producir acidos grasos, grasas poliinsaturadas, carotenoides y otros compuestos para las industrias cosmetica y/o farmaceutica, asf como complementos alimenticios, los cuales metodos comprenden una etapa de acumulacion de almidon y/o triacilgliceroles en microalgas, llevando a cabo un procedimiento como el descrito anteriormente.

Los metodos de la invencion pueden comprender una o mas etapas de extraccion despues de desencadenar la etapa de acumulacion de almidon y/o triacilgliceroles en microalgas. La etapa de extraccion puede implementarse usando disolventes u otro metodo de extraccion bien conocido por los expertos en la tecnica.

La presente invencion se entendera con mas claridad por medio de la descripcion adicional que sigue, que se refiere a ejemplos que ilustran la respuesta de microalgas que carecen de actividad de DYRKP-1, ante la privacion de nutrientes, asf como a las figuras adjuntas.

Leyendas de las figuras.

Figura 1: Aislamiento y caracterizacion molecular del mutante de Chlamydomonas stdl afectado en el gen DYRKP- 1.

(A) Fenotipo de degradacion del almidon del mutante stdl. Las colonias algales se motearon en filtros de papel sobre TAP-agar agotado en N o S durante 5 dfas, dando lugar a la acumulacion de almidon, y luego se colocaron en la oscuridad sobre medio mmimo (MM) durante dos dfas para inducir la degradacion del almidon. La acumulacion de almidon se visualizo mediante la exposicion a vapor de yodo.

(B) El modelo del gen DYRKP-1 de Chlamydomonas se compone de 14 exones (cajas negras) y 13 intrones (lmeas negras). La informacion de la secuencia sobre los lfmites exon-intron y el inicio 5 ' se obtuvo a partir de tres RT-PCRs solapantes. La insercion de la casete de resistencia a la paromomicina (gen AphVIII, caja blanca) en el tercer exon de DYRKP-1 se determino mediante PCR de walking de genoma.

(C) La expresion del gen DYRKP-1 analizada mediante RT-PCR en cepas de tipo silvestre, std1 y dos cepas complementadas (std1 :: STD1 1 y 2) cultivadas en TAP. Se uso actina como gen testigo o de control.

(D) Expresion de la protema DYRKP-1 analizada mediante inmuno-deteccion en lisados de protemas solubles de celulas cultivadas fotoautotrofamente separadas en un gel de SDS-poliacrilamida al 8%.

(E) Acumulacion de transcripto de DYRKP-1 en respuesta a la privacion de N. Las cepas de tipo silvestre, mutantes std1 y complementadas std1:: STD1 1 y 2 fueron privadas de nitrogeno durante tres dfas en condiciones fotoautotrofas. El ARN se hibrido con sondas que codifican un fragmento de DYRKP-1; el gen CBLP2 que sirvio como testigo de carga.

Figura 2: Analisis de transferencia Southern y complementacion de mutante.

(A) Analisis de transferencia Southern de la cepa de tipo silvestre 137AH y cepa mutante std1. Se cargo en un gel de agarosa ADN genomico restringido con NotI-, Xmal o StuI/SacI-, se sometio a transferencia Southern y se hibrido con una sonda contra el gen AphVIII (casete de resistencia a la paromomicina). La cantidad de ADN cargada por pista se indica en |jg.

(B) Construccion del plasmido para la complementacion de std1 con marcador de resistencia a la higromicina. Se amplifico por PCR ADN genomico de tipo silvestre que codifica STD1 y fue clonado en el vector pSL-Hyg que emergio de pSL18.

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(C) Niveles de almidon de cepa de tipo silvestre (137AH, en negro), cepa de mutante stdl (blanco) y dos cepas complementadas (stdl :: STD1 1 y 2, en gris) en diferentes condiciones de privacion. Los cultivos se desarrollaron en medio TAP (Con. = Control), sometidos durante dos dfas a la carencia de nitrogeno (TAP-N) o de azufre (TAP-S), lo que indujo la acumulacion de almidon (Acc.). A continuacion los cultivos agotados se centrifugaron, se resuspendieron en medio mmimo (MM) y se mantuvieron durante 8 o 24 horas en la oscuridad. En MM (que comprende N pero no C) en la oscuridad se catabolizara el almidon (Degr.). Los valores de almidon son las medias de al menos 3 replicados biologicos ± SD.

Figura 3: Arbol filogenetico de la familia de protemas DYRK incluyendo el linaje verde.

(A) Arbol filogenetico de la familia de protemas DYRK. Las secuencias de aminoacidos homologos de algas, hongos y plantas recuperadas de bases de datos JGI, Phytozome o NCBI se compararon llevando a cabo un analisis filogenetico. Las secuencias se alinearon con el programa MAFFT version 6. El arbol se obtuvo con el metodo neighbor-joining (metodo del vecino mas cercano). Se utilizaron las siguientes abreviaturas: Asp: Aspergillus fumigatus, At: Arabidopsis thaliana, d: Drosophila melanogaster, Dd: Dictyostelium discoideum, ChlNC: Chlorella sp. NC64A, Cre: Chlamydomonas reinhardtii, Micpu: Micromonas pusilla (CCMP1545/sp. RCC299), Os: Oryza sativa, Ost: Ostreococcus (lucimarinus/tauri), Phypa: Physcomitrella patens, Vca: Volvox carteri, Viv: Vitis vimfera (se combinaron secuencias de Zea mays con homologos de arroz y con vino). Los numeros de registro de las secuencias DYRK y la multi-alineacion usados para construir el arbol filogenetico se muestran en la Tabla 1.

(B) Secuencia de consenso de la homologfa de DYRK (DH) - caja de seis subgrupos de DYRK de acuerdo con la Figura 3A; en el subgrupo DYRKP se distinguieron tres subgrupos menores que daban las siete clases siguientes: DYRK1 (7 secuencias), DYRK2 (22 secuencias), YAK1 (21 secuencias), DYRKP-A (12 secuencias de plantas superiores incluyendo musgo), DYRKP-B (11 secuencias de plantas superiores), DYRKP-algas (7 secuencias) y la secuencia de consenso DH publicada (Becker y Joost, 1999), en la que se compararon nueve secuencias de diferentes grupos DYRK.

DYRK1A DYRK1B DYRK2 DYRK3 DYRK4

DYRK1 DYRK1 DYRK2 DYRK2 DYRK2

DYRK1A DYRK1B DYRK2 DYRK3 DYRK4

DYRK1 DYRK1 DYRK2 DYRK2 DYRK2

Minibrain (dDyrkl) dDyrk2 (Smi35A) dDyrk3

DYRK1 DYRK2 DYRK2

DYRK1B (Dyrklb) DYRK2 DYRK4

DYRK1 DYRK2 DYRK2

DYRK3

DYRK2

YakA DdDyrkl DdDyrk2

Yak DYRK1 DYRK2

Yaklp

Yak

Pom1

Pom/DYRK2

Pom1

Pom/DYRK2

Ppk15p Pom1 (Pomlp) Ppk5p

Yak Pom/DYRK2 Pom/DYRK2

AspYakl

Yak

Homo sapiens

NP_001387; Gl:18765758 763

Homo sapiens

NP_004705; GI.4758222 629

Homo sapiens

NP_006473; Gl:153281169 601

Homo sapiens

NP_003573; Gl:51702240 588

Homo sapiens

NP_003836; Gl:28827774 520

Mus musculus

NP_031916; Gi:24418935 763

Mus musculus

NP_001033046; Gl:83816922 629

Mus musculus

NP_001014412; Gl:67846105 599

Mus musculus

NP 663483; Gl:21704000 586

Mus musculus

NP_001028487; Gl:161333817 616

Drosophila melanogaster

NP_728104; Gl:24642876 908

Drosophila melanogaster

NP_523564; Gl: 17737415 722

Drosophila melanogaster

NP_001033810; Gl:85724756 828

Danio rerio

NP_001161737; Gi:319996595 681

Danio rerio

NP_001038298.1 GM13677529 587

Danio rerio

XP_693389; Gl:189537435 634

Xenopus laevis

NP_001088793; Gi:148224808 567

Dictyostelium discoideum

XP_638920; Gl:66810395 1458

Dictyostelium discoideum

XP_642598; Gl;66817490 836

Dictyostelium discoideum

XP_628965; Gl:66800079 915

Saccharomyces cerevisiae

NP_012394; GI:6322320 807

Neurospora crassa

XP_960871; Gl:85099941 1300

Pyrenophora tritici-repentis

XP_001940188; GI: 189207709 545

Schizosaccharomyces pombe

NP_593830; Gl:19114742 534

Schizosaccharomyces pombe

NP_592974; Gl:19113886 1087

Schizosaccharomyces pombe

NP_593081; G!:63054495 836

Aspergillus fumigatus

XP_746572; Gl:70982087 894

Nombre

Grupo.

AtYakl

Yak

AtDYRKP-1

DYRKP

AtDYRKP-2

DYRKP

AtDYRKP-3

DYRKP

AtDYRKP-4

DYRKP

OsYakl

Yak

OsYak2

Yak

OsDYRKP-1

DYRKP

OsDYRKP-2

DYRKP

OsDYRKP-3

DYRKP

VivYakl

Yak

VivDYRKP-1

DYRKP

VivDYRKP-2

DYRKP

ZmYakl

Yak

ZmYak2

Yak

ZmDYRKP-1

DYRKP

ZmDYRKP-2

DYRKP

ZmDYRKP-3

DYRKP

ZmDYRKP-4

DYRKP

ZmDYRKP-5

DYRKP

ZmDYRKP-6

DYRKP

PhypaYakl

Yak

PhypaYak2

Yak

PhypaYak3

Yak

PhypaYak4

Yak

PhypaYak5

Yak

PhypaDYRK2

DYRK2

PhypaDYRKP-1

DYRKP

PhypaDYRKP-2

DYRKP

PhypaDYRKP-3

DYRKP

PoptrYakl

Yak

PoptrYak2

Yak

PoptrDYRKP-1

DYRKP

PoptrDYRKP-2

DYRKP

PoptrDYRKP-3

DYRKP

PoptrDYRKP-4

DYRKP

Especie

Arabidopsis thaliana Arabidopsis thaliana Arabidopsis thaliana Arabidopsis thaliana Arabidopsis thaliana

Oryza sativa ssp japonica Oryza sativa ssp japonica Oryza sativa ssp japonica Oryza sativa ssp japonica Oryza sativa ssp japonica

Vitis vinifera Vitis vinifera Vitis vinifera

Zea mays Zea mays Zea mays Zea mays Zea mays Zea mays Zea mays Zea mays

Physcomitrella patens Physcomitrella patens Physcomitrella patens Physcomitrella patens Physcomitrella patens Physcomitrella patens Physcomitrella patens Physcomitrella patens Physcomitrella patens

Poputus trichocarpa Pop ulus trichocarpa Populus trichocarpa Pop ulus trichocarpa Populus trichocarpa Populus trichocarpa

Modelo de gen

Numero de registro NCBI aa predicho Sitio web del genoma

AT5G35980

NP_198447; Gl:42568145 956
http://www.arabidopsis.org

AT1G73450

NP_177487; GL42563202 1152

AT 1G73460

NP_177488; Gl:42563204 1169

AT2G40120

NP_181541; GI.15225633 570

AT3G17750

NP_188402; Gl:15229515 1138

0s02g0702500

NP_001047851; Gl:115448143 813
http://rice.plantbiology.msu.ed

0s04g0602800

NP_001053776; Gl: 115460352 924
http://www.phytozome.org

0s01g0832900

NP_001044708; Gl: 115440857 729

0s03g0719500

NP_001051095; Gl: 115454989 1115

0s05g0466900

NP_001055789; Gl:297604629 708

GSVIVG01024260001

XP_002267912.1; Gl:225454595 909
http://www.phytozome.org

GSVIVG01012107001

XP_002276420.1; Gl:225423662 1855

GSVIVG01032814001

XP_002272072.1; Gl:225448445 728

GRMZM2G156638

NP_001159228.1; Gl:259490627 706 (incomplete)

GRMZM2G311051

ACL53420.1; Gl:219886091 556 (incomplete)

GRMZM2G015073

no encontrado 1103
http://www.maizesequence.on

GRMZM2G181002

no encontrado 1098
http://www.phytozome.org

GRMZM2G068192

NP_001145942.1; Gl;226530085 391

GRMZM2G088409

NP_001182917.1; Gl:308081613 684

GRMZM2G357873

NP_001130373.1; Gl;212275250 724

GRMZM2G448633

NP_001148168.1; Gl:226506060 725

Pp1s3_592V6.1

no completados los modelos 959
http://www.cosmoss.org

Pp1s16_333V6.1

genicos en NCBI 1064
http://www.phytozome.org

Pp1s132_192V6.1

1108

Pp1s192_46V6.1

1089

Pp1s401_7V6.1

1136

Pp1s252_88V6.1

1129

Pp1s47_312V6.1

726

Pp1s312_23V6.1

525

Pp1s381_39V6.1

1446

POPTR_0013s07280

EEE95157.1; Gl:222857610 966
http://www.phytozome.org

POPTR_0019s06030

EEF00267.1; Gl:222862760 893

POPTR_0008s06890

EEE89528.1; Gl:222851981 725

POPTR_001 Os 19570

EEF01327.1; Gl:222864196 591

POPTR_0012s03670

EEE96543.1; Gl:222858996 1158

POPTR_0015s05140

EEF07789.1; Gl:222870658 1151

Nombre

Grupo Especie Modelo de gen , Numero de registro NCBI aa predicho Sitio web del genoma

CreYakl

Yak Chlamydomonas reinhardtii Cre08.g381950 XP_001694330; Gl:159472382 2202
http://www.phytozome.org

CreDYRK2

DYRK2 Chlamydomonas reinhardtii Cre02.g146500 XP_001695011; Gl:159473779 1239

CreDYRKP-1

DYRKP Chlamydomonas reinhardtii Cre07.g337300 XP_001700085; Gl:159484074 1278

VcaYakl

Yak Volvox carted Volcal |30949 XP_002953068; Gl:302843051 398 (incompleto)
http://www.phytozome.org

VcaDYRK2

DYRK2 Volvox carteri Volcal |61790 XP_002951959; Gl:302840826 512

VcaDYRKP-1

DYRKP Volvox carted Volcal |77582 XP_002957430; Gl:302851815 370

OstluYakl

Yak Ostreococcus lucimarinus CCE9901 Ost9901_3|37908 XP_001420045; Gl:145351353 425
http://genome.jgi.doe.gov

OstluDYRKP-1

DYRKP Ostreococcus lucimarinus CCE9901 Ost9901_3|36819 XP_001417467; Gl:145345962 395

Ostlu38674

DYRK2? Ostreococcus lucimarinus CCE9901 Ost9901_3|38674 XP_001418004 ; Gl: 145347077 397 (incompleto)

Ostlu42173

DYRK1? Ostreococcus lucimarinus CCE9901 Ost9901_3|42173 XP_001422264 ; Gl: 145356070 154 i (incompleto)

OsttaYakl

Yak Ostreococcus tauri Ostta4|19878 XP_003081795; Gl:308808970 772
http://genome.jgi.doe.gov

OsttaDYRKP-1

DYRKP Ostreococcus tauri Ostta4|16877 XP_003078697 ; Gl:308802768 652

Ostta 17596

DYRK2? Ostreococcus tauri Ostta4|17596 XP_003079347; Gl:308804069 837 (incompleto)

Ostta22490

DYRK1? Ostreococcus tauri Ostta4|22490 XP_003084217; Gl:308813822 472 (incompleto)

ChlNC-DYRK2

DYRK2 Chlorella sp. NC64A ChlNC64A_1116563 EFN52309; Gl:307104053 364 (incompleto)
http://genome.jgi.doe.gov

ChlNC-DYRKP-1

DYRKP Chlorella sp. NC64A ChlNC64A_1136965 EFN52148; Gl:307103891 285 ’(incompleto)

MicpuC-Yak1

Yak Micromonas pusilla CCMP1545 MicpuC3|39551 XP_003057930; Gl:303277273 605
http://genome.jgi.doe.gov

MicpuC-DYRK2

DYRK2 Micromonas pusilla CCMP1545 MicpuC3|152430 XP_003057384; Gl:303276180 513

MicpuC-DYRKP-1

DYRKP Micromonas pusilla COMF1545 MicpuC3| 16074 XP_003058010; Gl:303277433 341

MicpuC8718

DYRK1? Micromonas pusilla CCMP1545 MicpuC3|8718 XP_003057290; Gl:303275992 143 (incompleto)

MicpuN-Yak1

Yak Micromonas sp. RCC299 MicpuN3|83368 XP_002503782; Gl:255080404 421
http://genome.jgi.doe.gov

MicpuN-DYRK2

DYRK2 Micromonas sp. RCC299 MicpuN3|58615 XP_002502528; Gl:255077896 642

Micpu N-DYRKP-1

DYRKP Micromonas sp. RCC299 MicpuN3|58100 XP_002501491; Gl:25507563 1019

MicpuN85819

DYRK1? Micromonas sp. RCC299 MicpuN3|85819 XP 002508509; Gl:255083869 238 (incompleto)

Tabla 1: Numeros de registro para las secuencias usadas para el arbol filogenetico en la Figura 2.

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Las secuencias en gris no se utilizaron para la alineacion. Estan indicados los modelos de genes definitivamente incompletos. Cuando el numero predicho de aminoacidos difena en dos bases de datos comparadas del genoma, normalmente se eleg^a la version mas larga. Algunos genes tienen diferentes variantes de ayuste, p. ej. "ZmDYRKP3" que alberga tres transcripciones en este locus. En el caso de Danio rerio y Xenopus laevis, no se proporcionaron para la alineacion todos los genes DYRK existentes.

Figura 4: Almacenamiento de carbono y actividad fotosintetica en el mutante stdl en respuesta a la privacion de nitrogeno. Se cultivaron celulas en TAP o medio mmimo con 2% de CO2 en aire, bajo una iluminacion constante de 100 pmoles de fotones m-2 s-1. El dfa 0 las celulas se centrifugaron, se lavaron y se resuspendieron en TAP-N (paneles de la izquierda A-C) o MM-N (paneles de la derecha A-C). Las mediciones se realizaron en mutante stdl de tipo silvestre (WT), y en dos cepas complementadas stdl :: STD1 1 y stdl:: STD1 2 (A-C).

(A) Acumulacion intracelular de almidon. Se muestran las medias de 4 experimentos (3 para el dfa 6) ± SD para TaP-N y medias de 6 experimentos (3 para el dfa 10) ± SD para MM-N.

(B) Acumulacion intracelular de lfpidos neutros (TAGs). Tras la extraccion de lfpidos celulares totales, los TAGs se separaron por cromatograffa en capa fina y se cuantificaron. Se muestra un experimento representativo de tres replicados biologicos para cada condicion (TAP-N o MM-N). Los valores de TAG son la media de tres replicados tecnicos ± SD.

(C) La tasa de transporte de electrones fotosinteticos (ETR) se determino a partir de medidas de fluorescencia de clorofila durante los tres primeros dfas de privacion de N. Los valores representados son la media de 4 (TAP-N) o 6 (MM-N) medidas ± SD bajo iluminacion actmica de ~ 100 pmol de fotones m'2s'1.

(D) Inmunodeteccion de protemas de interes. Los extractos de protema de celulas enteras se analizaron por inmunodeteccion despues de 1, 2 o 6 dfas de agotamiento de nitrogeno en condiciones fotoautotrofas (MM-N). Las protemas se separaron en un gel de SDS-poliacrilamida al 10% y se tineron con azul de Coomassie para controlar la carga (Figura 7C) o se inmunotransfirieron para detectar las protemas indicadas.

Figura 5: Acumulacion de almidon intracelular y actividad fotosintetica en cultivos desarrollados fotoautotrofamente sometidos a privacion de N o privacion de S.

En el dfa 0, se centrifugaron, se lavaron y se resuspendieron cultivos desarrollados fotoautotrofamente (MM, 2% de CO2 en aire) de cepas de tipo silvestre (WT), mutante (stdl) y dos complementadas (stdl :: STD1 1 y 2) en MM- N o MM-S en presencia de 2% de CO2 en aire. En diferentes momentos, se analizaron los pelets de celulas, el volumen celular total y la biomasa en peso seco.

(A) La dinamica del almidon en la privacion autotrofica de N y (B) la privacion autotrofica de S a intensidades bajas de luz de 30 - 40 pmol de fotones m-2 s-1. Los valores de almidon son las medias de 5 replicados biologicos ± SD y medias de 3 experimentos para las cepas de la progenie std1 1A y 2A que resultan de un retrocruzamiento de std1 (mt-nit1 nit2) con el tipo silvestre CC125 (mt + nitl nit2), ambos son del tipo cepa "137c". Se realizaron cuatro experimentos en MM-N / CO2 a bajas intensidades de luz de 30 - 40 pmol de fotones m'2s'1.

(C) Eficiencias fotosinteticas de celulas de tipo silvestre, mutantes stdl y complementadas durante los tres dfas de privacion de N en condiciones autotroficas de ~ 35 pE m-2 s-1 o (D) privacion de S a 100 pE m-2 s-1. Los valores trazados son la media de 5 mediciones ± SD a una iluminacion de ~ 100 pE m'2s_1.

Figura 6: Productividad de biomasa del mutante stdl durante la privacion de N en condiciones foto- autotroficas.

La disposicion experimental fue la misma que en la Figura 5 pero utilizando solo un medio MM-N.

(A) Se recolectaron las celulas de 1 mL de cultivo, se centrifugaron y se representaron pelets.

(B) Se determino el volumen celular total por mL. Se muestran las medias ± SD (n = 7).

(C) Se determino la biomasa como peso seco de cinco cultivos de 5 mL recolectados por filtracion, aclarados y secados durante la noche. El analisis del almidon intracelular permitio determinar la fraccion de almidon de la biomasa total (area sombreada). Se muestran las medias ± SD (n = 3).

Figura 7: Las celulas mutantes stdl forman agregados (palmeloides) encerrados por la pared de la celula madre.

(A) Imagenes de contraste de campo brillante e interferencia diferencial de cepas de tipo silvestre, mutantes stdl y complementadas (stdl :: STD1 1 y 2) cultivadas en medio mmimo y 2% de CO2 y luego sometidas a privacion de N durante 0, 2 o 6 dfas. Las flechas indican las paredes de las celulas madre. Barras de escala = 10 pm.

(B) Distribucion del diametro celular o de agregado, respectivamente, y comparacion del volumen celular por mL de WT, mutante stdl y cepas rescatadas stdl :: STD1 1 y 2 en 0, 2 o 6 dfas de condicion MM-N/CO2. El mismo experimento representativo que en (A).

5 (C) Control de carga de azul de Commassie del experimento de inmunodeteccion que se muestra en la Figura 4D.

Figura 8: Evolucion del contenido de clorofila, volumen celular total y numero de celulas durante la privacion de nitrogeno. Las celulas se cultivaron en TAP o medio mmimo en aire con 2% de CO2 bajo una iluminacion constante de 100 pmoles de fotones m"2s"1. El dfa 0, las celulas se centrifugaron, se lavaron y se resuspendieron en TAP-N (paneles de la izquierda) o MM-N (paneles de la derecha). Las mediciones se realizaron en el tipo silvestre (WT), 10 mutante stdl y en dos cepas complementadas stdl:: STD1 1 y stdl :: STD1 2.

(A) Concentracion de clorofila. Se muestran medias ± SD de 5 experimentos para TAP-N y 7 experimentos para MM- N (3 durante 10 d).

(B) Volumen celular total en pm3. mL-1, y (C) la concentracion de celulas o partmulas por mL fue registrada por Multisizer™ 3 Coulter Counter® (Beckman). Se muestran medias ± SD (n = 6 para experimentos TAP-N y n = 7 para

15 experimentos MM-N).

Figura 9: Comportamientos de crecimiento de las celulas de Chlamydomonas stdl y de tipo silvestre cultivadas fotoautotrofamente en fotobiorreactores de 1 L funcionando como turbidostatos durante la transicion del crecimiento exponencial a las condiciones de privacion de N. La densidad celular se midio usando una sonda de absorcion y se mantuvo a un nivel constante mediante la inyeccion de medio fresco. Debido al fenotipo de agregacion de stdl, la 20 OD880 nm se regulo a diferentes valores para WT (OD880 nm = 0,4) y stdl (OD880 nm = 0,3) para alcanzar concentraciones similares de biomasa (0,15 g de peso seco L-1) en los dos cultivos. Despues de 48 h de estabilizacion en presencia de MM bajo iluminacion constante (500 pmol de fotones m'2s'1) en presencia de aire enriquecido en CO2 al 2%, el medio de dilucion fue sustituido por MM-N (t0). Las mediciones de la concentracion de amonio en el medio de cultivo mostraron un agotamiento completo despues de 45 h. (A) Cantidades acumuladas de 25 medio fresco anadidas para mantener el cultivo a una concentracion constante de biomasa. Se muestran datos de tres replicados biologicos para los cultivos de WT y de stdl; (B) Las medidas de la productividad de biomasa (g peso seco d-1 L-1) se determinaron a partir de t0, t48 y t72 a partir de las tasas de dilatacion y las medidas de biomasa. Se muestran las medias ± SD (n = 3).

Figura 10: Formacion de MGDG oxidado en el mutante stdl.

30 (A) Sobreacumulacion de especies MGDG oxidadas en el mutante stdl detectado en la placa de TLC.

(B) Aclaracion estructural de una especie MGDG 34 oxidada (16: 2 O2; 18: 1) que se acumula en stdl.

Nota: C2 y C7 representan dos lmeas complementadas independientes, del mutante stdl.

Figura 11: Un analisis completo de lipidoma en WT, mutante stdl y las dos lmeas complementadas en respuesta a la falta de nitrogeno.

35 Figura 12: Sobreacumulacion de MGDG oxidado en el mutante y su distribucion de especies.

(A) Acumulacion total de MGDG oxidado en respuesta a dfas de carencia de nitrogeno en WT, mutante stdl y dos lmeas complementadas.

(B) Distribucion de especies moleculares de MGDG oxidado.

Figura 13: Sobreacumulacion de una lipoxigenasa 1 putativa (CreLOX1) en el mutante stdl de Chlamydomonas.

40 Una imagen del gel de SDS-PAGE tenido por azul de Coomassie que demuestra la apariencia de una banda mas intensa con una masa de ~110 kDa. El tipo silvestre, el mutante stdl y dos lmeas complementadas independientes (C2, C7) se cultivaron hasta la fase exponencial en condiciones autotrofas estandar en un medio mmimo al que se suministra 2% de CO2 a 100 pmol de fotones m-2 s-1. Despues de la lisis celular, las protemas solubles e insolubles se fraccionaron por ultracentrifugacion con un colchon de sacarosa. Las protemas de la fraccion del pelet que 45 contiene las membranas se resolubilizaron por adicion de Triton X-100, se ultracentrifugaron y se separaron en un gel Bis-Tris NuPAGE® al 10%. Despues de ser tenidos con Azul Brillante de Coomassie, se detecto una banda intensa en el mutante stdl a ~110 kDa y las regiones de gel crrespondientes de todas las muestras se escindieron y se sometieron a analisis de espectrometna de masas.

Figura 14: Inhibicion de TAG y acumulacion de almidon en el mutante por inhibidores LOX.

50 (A). Acumulacion de almidon.

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(B). Acumulacion de TAG.

Ejemplos.

Ejemplo 1: La doble especificidad de la quinasa regulada por fosforilacion de tirosina DYRKP-1 controla negativamente la acumulacion de almidon y aceite durante la privacion de nutrientes en Chlamydomonas reinhardth.

Metodos.

Cepas y condiciones de cultivo.

Como se describe en Chochois et al., 2010, se eligio la cepa CC125 (mt-nit1 nit2) como fundamento genetico para la generacion de mutantes y se uso como cepa de tipo silvestre en este estudio. La cepa mutante stdl se genero mediante transformacion con el plasmido pSL-X linealizado con Kpn\ que alberga el casete de resistencia a la paromomicina AphVIII. En el caso de stdl, solo se inserto en el genoma un fragmento de ~1900 pb de la pSL-X de ~4800 bp. Las celulas se cultivaron mixotroficamente en medio Tris-acetato-fosfato (TAP) (Harris, 2009) en un agitador incubador a 25°C, bajo luz continua a ~100 pE m"2 s-1. Para los experimentos de privacion, se desarrollaron mixotroficamente precultivos en medio TAP o fotoautotrofamente en un medio mmimo tamponado con MOPS (Harris, 2009) y 2% de CO2 en el aire a una densidad de 2-5 x 106 celulas mL"1. Despues de tomar las muestras a t = 0, el cultivo se centrifugo a 25 °C y 1789 g durante 4 minutos, el sedimento celular se lavo una vez y se resuspendio en medio privado de N o S. Debe observarse que una densidad de celulas inicial idealmente identica de los cultivos es cntica para obtener datos comparables para todas las cepas estudiadas. Debido a la formacion de palmeloides de stdl, se comparo el volumen celular total por mL o el contenido de clorofila para ajustar los cultivos antes de la carencia.

Caracterizacion genetica y complementacion de la cepa mutante std1.

Para comprobar la frecuencia de integracion del ADN insertado, se realizo el analisis de transferencia Southern con celulas de tipo silvestre y mutantes stdl. El ADN genomico se preparo como se describio anteriormente (Tolleter et al., 2011), y se separaron 4, 6 o 8 pg de ADN genomico restringido con Not\ en un gel de agarosa al 0,8%, se transfirieron a una membrana de nylon y se hibridaron con una sonda marcada con digoxigenina complementaria a parte del gen AphV\\\ del casete de resistencia insertado. Se utilizo un kit de smtesis de sonda PCR D\G (Roche) para el marcado de la sonda usando los cebadores 5'-CGAAGCATGGACGATGCGTT-3' (SEQ \D N°: 4) y 5'- CGAGACTGCGATCGAACGGACA-3' (SEQ \D N°: 5). La hibridacion con el fragmento de PCR resultante de 400 pb se realizo durante la noche a 50 °C usando tampon D\G Easy Hyb (Roche). Se aplicaron anti-Digoxigenin-AP y CSPD como sustrato (Roche) para detectar senales usando G:BOXChemin XL (Syngene). Para determinar el sitio de integracion del casete de resistencia a la paromomicina, el walking del genoma se realizo de acuerdo con el Kit GenomeWalker de Clontech. El ADN genomico de la cepa stdl se digirio con Fspl y se proceso de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las secuencias 5'-CTGGTGCTGCGCGAGCTGGCCCACGAGGAG-3' (SEQ \D N°: 6) (GPS1) y 5'-TGGTTCGGGCCGGAGTGTTCCGCGGCGTT-3' (SEQ \D N°: 7) (GPS2) sirvieron como cebadores espedficos de gen que permiten la determinacion de la secuencia genomica aguas abajo del casete insertado AphV\\\. La Advantage gC Genomic LA polimerasa (Clontech) se utilizo para las reacciones de amplificacion. Para la complementacion de la cepa stdl, se llevo a cabo una reaccion de PCR en ADN genomico de tipo silvestre usando los cebadores 5'-GTCTAGAATGTCGCTCCGCCTGAACCGATG-3' (SEQ \D N°: 8) (XbaG4 forHyg) y 5'- GTCTAGACTACATGCTGTCGAGCGAGG-3' (SEQ \D N°: 9) (XbaG4RevHyg) y la DyNAzyme™ EXT DNA Polimerasa (FinnzymesOy). Los genes amplificados de 6913 pb que codifican DYRKP-1 se restringieron mediante Xba\ y se clonaron en el vector pSL-Hyg digerido con Xba\, que procedfa de pSL18 (Dauvillee et al., 2003) bajo el control del promotor PSAD y que portaban un casete de resistencia a la higromicina (Berthold et al., 2002). Las celulas std1 se transformaron con pSL-Hyg-STD1 linealizado con Kpn\ por agitacion con perlas de vidrio (Kindle, 1990), se seleccionaron en higromicina 20 mM y luego se cribaron aplicando el mismo protocolo que para aislar la cepa mutante (Chochois et al., 2010). Los transformantes se expusieron durante varios dfas a la privacion S o N, se transfirieron a medio mmimo y se sometieron a la oscuridad, y a continuacion a tincion con yodo para analizar los niveles de almidon restantes.

Analisis filogenetico.

Se alinearon las secuencias de aminoacidos usando el software MAFFT version 6 (Katoh et al., 2002). A continuacion, la alineacion resultante se refino manualmente utilizando SeaView version 4 (Gouy et al., 2010) y las regiones donde la homologfa era dudosa se retiraron de un analisis posterior. Se mantuvieron un total de 313 posiciones de aminoacidos para el analisis filogenetico de las protemas DYRK. Los analisis filogeneticos se realizaron utilizando los planteamientos neighbor-joining (NJ) (vecino mas cercano), Maximum Likelihood (ML) (maxima verosimilitud) y Parsimony (Pars) (parsimonia) en el paquete Phylip de inferencia de Phylogenetic version 3. 69 (Folenstein et al., 2005). El programa PROTML se uso para el analisis de ML y el orden de entrada de secuencia fue aleatorizado (20 revoltijos (jumbles)). Se utilizaron los programas SEQBOOT y CONSENSE para el calculo del valor de bootstrap en 100 repeticiones y reconstrucciones de arboles de consenso, respectivamente. Para examinar la confianza de los nodos, se llevaron a cabo analisis de NJ y Pars usando los programas

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NEIGHBOR y PROTPARS. Las matrices de distancia utilizadas para el analisis NJ se crearon con el programa PROTDIST. Los arboles filogeneticos se dibujaron con MEGA5 (Tamura et al., 2011).

Analisis de ARN y RT-PCR.

El ARN total se aislo como se describe en Liu et al., 2005. Para las reacciones de RT-PCR se empleo 1 |jg de ARN total tratado con DNasal para la aplicacion del kit OneStep RT-PCR (Qiagen). Para obtener informacion de la secuencia del gen DYRKP-1/STD1 transcrito completo, se realizaron tres RT-PCRs solapantes usando pares de cebadores en 5'-CATAGTGCTCAGCAGGGGACAAGGC-3' (SEQ ID N°: 10) (Std1UTR1) y 5' -

AGCGTGCCAGAGGTTTCGCCGTC-3' (SEQ ID N°: 11) (Std1P3rev), 5'-CCGCGGACGGCGAAACCTCTGGCAC-3' (SEQ ID N°: 12) (Std1FW2) y 5'-GATCTCGTCCAGCGACTGGTCAAAGTAG-3' (SEQ ID N°: 13) (G4rev14) y 5 '- GCGGATCCGACGAGCAGGGCAACGTGCTG-3' (SEQ ID N°: 14) (ACG4_FW3) y 5'-

CGGCAAGCTTCTACATGCTGTCGAGCGAGG-3' (SEQ ID N°: 15) (ACG4_Rev1), el ultimo par de cebadores se creo inicialmente para expresar la region correspondiente como antfgeno. Para comparar los niveles de transcripcion en las cepas mutantes y complementadas de tipo silvestre, se usaron los pares de cebadores Std1FW2 y G4rev14 para amplificar parte del transcripto DYRKP-1. Se disenaron cebadores espedficos para una actina (nombre del Locus Cre13. G603700, ID de Proteina 515031), que sirve como gen de control expresado constitutivamente (5'- AATCGTGCGCGACATCAAGGAGAA-3' (SEQ ID N°: 16) y 5'-TTGGCGATCCACATTTGCTGGAAGGT-3' (SEQ ID N°: 17)).

Analisis de transferencia Northern.

Para la extraccion de ARN, se recogieron en hielo 15 mL de cultivos celulares a valores del tiempo relativos, se centrifugaron durante 1 min a 1789 g y la suspension de celulas de 500 jL se transfirio a un tubo de 1,5 mL en hielo y se mezclo con 500 jL de tampon de lisis de ARN. La extraccion de ARN, la separacion en los geles de agarosa formaldetndo y la transferencia Northern se realizaron como se describe en (Liu et al., 2005). Las membranas se hibridaron con sondas de ADN que conteman un fragmento del gen STD1 o el gen CBLP2 como control de carga. Se obtuvo un plasmido 1. pAC-STD1 mediante una ligacion del vector pQE-30 restringido con BamHI-HindIII (Qiagen) y un producto de RT-PCR restringido por BamHI-HindII que codifica la parte 3' de DYRKP-1. La RT-PCR se llevo a cabo utilizando los cebadores 5'-GCGGATCCGACGAGCAGGGCAACGTGCTG-3' (SEQ ID N°: 14) (ACG4_FW3) y 5'-CGGCAAGCTTCTACATGCTGTCGAGCGAGG-3' (SEQ ID N°: 15) (ACG4_Rev1), dando lugar a un producto de 1116 pb. Un fragmento BamHI-HindIII de 1 kb de este plasmido pAC-STD1 y el ADNc de 1 kb de CBLP2 se usaron para la hibridacion. Se detectaron senales radioactivas usando placas de fosforimager BAS-IP MS2040 (Raytest;
http://www.raytest.de), escaneadas con un fosforimager Molecular Imager FX (Bio-Rad;
http://www.biorad.com/), y se tomaron en imagenes usando el programa Quantity One-4. 5. 1 (Bio-Rad).

Analisis de ADN genomico.

Para determinar la concentracion de ADN genomico durante los experimentos de relacion con el tiempo de privacion de nitrogeno, las celulas equivalentes a 1, 2 mm3 de volumen celular total por termino medio se recolectaron mediante centrifugacion y se almacenaron a -80°C. El ADN genomico de dos muestras por replicado para cada valor del tiempo se preparo mediante extraccion con fenol-cloroformo como se describio anteriormente (Tolleter et al., 2011). Las concentraciones de ADN se midieron utilizando un espectrofotometro NanoDrop 2000 (Thermo Scientific).

Preparacion de protemas, cuantificacion y analisis de inmunotransferencia.

Para la deteccion de DYRKP-1, se prepararon lisados de celulas solubles de la forma que sigue: se recogieron 100 mL de cultivos celulares de C. reinhardtii en la fase exponencial (eq. a 5 * 106 celulas/mL o 0,8 mm3/mL) mediante centrifugacion durante 2 min a 1789 g y se resuspendieron en 1 mL de tampon para lisis (HEPES-KOH 20 mM, pH 7,2, KCl 10 mM, MgCh 1 mM, NaCl 154 mM, 0,1x coctel inhibidor de proteasa; Sigma P9599). Las celulas se sometieron a ondas sonoras en hielo durante 90 segundos con un ajuste de 1 s de pulso/1 s de pausa. Los lisados se cargaron sobre un colchon de sacarosa (HEPES-KOH 20 mM pH 7,2, sacarosa 0,6 M) y se centrifugaron en un rotor MLA-55 (Beckman Coulter) durante 30 min a 151 300 g y 4°C. Las protemas solubles se mezclaron con un volumen de 2x tampon de muestra (Schulz-Raffelt et al., 2007) o 2x tampon de muestra LDS (Invitrogen) y se calentaron durante 5 minutos a 95°C o 10 minutos a 70°C antes de cargar en un gel de 8% SDS-poliacrilamina. La transferencia Western se llevo a cabo durante 1:45 h para detectar la expresion de DYRKP-1 por ECL (SuperSignal West Pico Chemiluminiscent Substrate, Thermo Scientific), utilizando un anticuerpo de peptido purificado (
www.proteogenix-antibody.com). Las muestras de protemas tomadas durante la cinetica de carencia de nitrogeno se trataron de la forma siguiente: se guardaron a -80°C hasta su uso pelets de celulas equivalentes a 1,2 mm3 de volumen celular total. Las protemas totales de dos muestras replicadas en valor del tiempo se extrajeron en 70 |jL de tampon que contema Tris 50 mM pH 8, EDTA 10 mM y 2% de SDS durante 30 minutos a temperatura ambiente, seguido por una centrifugacion en frio de 2 minutos. Para cuantificar las concentraciones de protemas, se analizaron 2 jL de extractos de protema por medida colorimetrica con acido bicinchonico (Pierce BCA Protein Assay kit, Thermo Scientific). Para el analisis de inmunotransferencia, se separaron 10 - 12 jg de extractos proteicos totales en geles de SDS-poliacrilamida al 10%, se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa BioTrace™ NT (Pall Life

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Sciences,
http://www.pall.com) y se analizaron mediante inmunodecoracion con anticuerpos contra AtpB, RbcL, CytF, PsbD (D2) (Agrisera) y HSP70B (Schroda et al., 1999). El anticuerpo DYRKP se obtuvo por inmunizacion de dos conejos con dos peptidos sintetizados (DGMDDPGYSRKEVPNP-cys y PAVNHEDVELFRN-cys) conjugados con KLH (hemocianina de lapa de bocallave) como protema portadora (
www.proteogenix-antibody.com).

Medidas de almidon y clorofila.

Los contenidos de almidon y clorofila se midieron de acuerdo con Chochois et al., 2010. Se recogio 1 mL de cultivo, se centrifugo a ~20.000 g durante 10 minutos, se resuspendio en 1 mL de alcohol metflico para la extraccion de clorofila y se almaceno a -80°C. Los pelets se secaron y se anadieron 400 pL de agua. Para solubilizar el almidon, las muestras se autoclavaron ajustando en "ciclo seco". A continuacion el almidon se degrado a glucosa mediante la adicion de 200 pL de solucion de amiloglucosidasa (1 U/mL, Roche) y la incubacion a 55°C durante 1-2 h. Se determino la concentracion de glucosa utilizando un analizador automatico de azucar (Ysi modelo 2700 select, Yellow Springs, OH, EE.UU.). La clorofila se extrajo mediante metanol, y se determinaron la clorofila a y b midiendo la absorbancia a 653, 666 y 750 nm usando un espectrofotometro UV-VlS (SAFAS UVmc2 con el software SP2000).

Cuantificacion del contenido de aceite.

Se recolectaron celulas de C. reinhardtii (eq. a 2 mm3 de volumen celular total) por centrifugacion a 1000 g durante 2 min (a 4°C). Las celulas se congelaron inmediatamente a -80°C o bien se apagaron en isopropanol caliente para extracciones inmediatas de lfpidos. Los lfpidos celulares totales se extrajeron utilizando una mezcla de hexano e isopropanol (Li-Beisson et al., 2010). La fase de disolvente organico conteniendo lfpidos celulares totales se recogio y se seco bajo una corriente de gas nitrogeno, y despues se resuspendio en 200 pL de cloroformo: metanol (2:1, v/v). Los triacilgliceroles (TAG) se separaron primero de otras clases de lfpidos en cromatograffa en capa fina, se carbonizaron con CuSO4 al 2% disuelto en H3PO4 al 8% en agua, y despues se calculo el contenido de TAG basandose en un metodo densitometrico despues de compararse con una curva estandar generada con un patron C17:0 TAG (Siaut et al., 2011).

Fluorescencia de clorofila.

La fluorescencia de clorofila se midio usando un Dual Pam-100 (Heinz Walz). Las muestras se pusieron en una cubeta bajo agitacion constante a temperatura ambiente y se adaptaron a la oscuridad durante 5-10 minutos antes de la medicion. Las curvas de luz se registraron con diez etapas de iluminacion que oscilaban entre 15 y 715 pmol m-2 s'1 PAR, cada intensidad luminosa se mantuvo durante 30 s despues de un destello de saturacion para medir Fm'. La ETR se calculo como se describio anteriormente (Rumeau et al., 2005).

Determinacion de la biomasa.

Para determinar la acumulacion de biomasa de un cultivo, a cada valor del tiempo se vertieron tres muestras de 5 mL sobre un filtro de fibra de vidrio en placas de aluminio desechables (VWR, Ref. 611-0739 y -0741) y se secaron durante la noche en un horno a 80°C. Se trataron igualmente tres muestras de 10 mL del medio. Los filtros de papel se pesaron antes y despues de anadir celulas y se resto el valor de la media para el medio.

Microscopfa.

Para microscopfa optica se uso un microscopio Leica DMRXA (Leica Microsystems, Alemania). Las celulas se fijaron con glutaraldehfdo al 0,25% en el medio, en caso necesario. Para comparar facilmente las concentraciones celulares, se utilizo una camara de Neubauer. Las imagenes fueron capturadas con el software Spot Insight 4 (Diagnostic Instruments Inc., Sterling Heights, EE.UU.,
www.spotimaging.com).

Resultados.

Identificacion y caracterizacion genetica del mutante stdl de degradacion del almidon.

A partir del cribado de una biblioteca de insercion de ADN creada por transformacion de la cepa de tipo silvestre CC125 de C. reinhardtii con un casete de resistencia a la paromomicina (AphVIII), se aislaron previamente varios mutantes afectados en la degradacion del almidon (Chochois et al., 2010). Uno de estos mutantes, denominado stdl de “degradacion del almidon 1” (starch degradation 1), mostro una velocidad mas lenta de degradacion del almidon en la oscuridad en comparacion con su progenitor de tipo silvestre (Figura 1A). El analisis de transferencia Southern indico una unica integracion del casete de paromomicina en el genoma mutante (Figura 2A). La secuenciacion de las regiones flanqueantes de ADN mostro la insercion del casete AphVIII dentro del tercer exon de un gen, anotado como Dual-Specificity Tyrosine-Phosforilated Protein Kinase (protema quinasa fosforilada por tirosina de doble especificidad DYRK2 (genoma Chlamydomonas version 4.0), y renombrado aqrn DYRKP-1 (Figura 1B). El modelo del gen DYRKP-1 de Chlamydomonas se confirmo secuenciando tres fragmentos de ADNc solapantes producidos por RT-PCR (Figura 1B). El DYRKP-1 de Chlamydomonas consta de 14 exones y 13 intrones, conteniendo la region codificante 3834 nucleotidos. Con respecto al modelo genico Cre07. g337300 (Phytozomev 9. 0), el codon de inicio

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se encuentra 51 nucleotidos aguas arriba. El mutante stdl fue complementado utilizando una construccion que contema la secuencia genomica DYRKP-1 de tipo silvestre impulsada por el promotor psaD (Figura 2B). Se aislaron dos cepas complementadas independientes stdl :: STD1 1 y stdl :: STD1 2, mostrando los niveles de expresion del gen STD1 y las cantidades de protema Stdl ligeramente inferiores al progenitor de tipo silvestre (Figura 1C, D). Se observaron patrones similares de acumulacion de almidon y cinetica de degradacion en respuesta a la privacion de N o S tanto en las lmeas complementadas como en el progenitor de tipo silvestre (Figura 2C). El analisis de transferencia Northern revelo que el transcripto DYRKP-1 se induce fuertemente despues de 1 dfa de agotamiento de N, manteniendose los niveles de transcripcion en un nivel alto despues de 3 d^as de privacion (Figura 1E). Observese que aunque la expresion del gen DYRKP-1 fue impulsada por el promotor PSAD constitutivo en la lmea complementada, la acumulacion del transcripto DYRKP-1 aumento de la misma manera que en celulas de tipo silvestre en respuesta a la privacion de N, lo que sugiere que la regulacion de la expresion del gen DYRKP- 1 se regula a un nivel post-transcripcional.

Chlamydomonas DYRKP-1/STD1 es un miembro de un nuevo grupo espedfico de plantas de la familia de protemas DYRK.

Un analisis filogenetico de la familia de genes DYRK permitio distinguir cuatro ramas distintas: las subfamilias DYRK1, DYRK2 y Yak descritas anteriormente, y un nuevo grupo de DYRK, denominado aqu DYRKP (por Plant DYRK) que comprende solamente miembros del linaje verde (plantas, musgos y algas), incluyendo Chlamydomonas DYRKP-1/STD1 (Figura 3A). Mientras que los genomas de las algas albergan solo un miembro del grupo DYRKP, los musgos y las plantas superiores contienen de dos a seis homologos similares a plantas. Es interesante que los genomas de plantas y algas contienen homologos de Yak, pero no homologo de DYRK1 (Han et al., 2012), siendo identificados los homologos de DYRK2 solamente en algas y musgos, pero no en plantas superiores. Las quinasas DYRK muestran caractensticas de secuencia conservadas, en particular la caja-(DH) de homologfa de DYRK que precede al dominio catalftico conservado (Figura 3B). La secuencia de consenso para los subgrupos DYRK1 y DYRK2 es NxGYDD (D/E) (N/R)xDY, ligeramente diferente para el grupo Yak (Figura 3B). La caja-DH del nuevo grupo DYRKP identificado muestra un motivo alterado: (N/H) (R/K) TGFEExK (D/E/N) (F/L).

El std1 muestra un fuerte aumento en la acumulacion de reservas y una actividad fotosintetica mas robusta bajo la privacion de nutrientes en condiciones de fotoautotrofia.

El efecto del agotamiento del nitrogeno se estudio luego en diferentes condiciones de crecimiento (mixotroficas vs. fotoautotrofas) que se sabe que afectan de forma diferente al estado energetico intracelular y la acumulacion de compuestos de reserva como el almidon (Ral et al., 2006) o TAG (Goodson et al. 2011). En condiciones mixotroficas (en presencia tanto de acetato como de luz), no se observo diferencia en la acumulacion de almidon entre el WT y el mutante std1 en respuesta a la privacion de N (Figura 4A), pero se observo un aumento en el contenido de aceite en el mutante despues de 1 a 3 dfas de inanicion (Figura 4B). En condiciones totalmente fotoautotrofas, se observo una acumulacion de almidon mucho mas alta y persistente en std1 en comparacion con el WT y con ambas lmeas complementadas (Figura 4B), aumentando el contenido de aceite en el mutante despues de 3 dfas de carencia (Figura 4B). Cuando la privacion de N se realizo en condiciones fotoautotrofas a una velocidad de fluencia menor (35 |jmol de fotones m-2 s-1), WT y las lmeas mutantes complementadas acumularon solo niveles de almidon bajos, mientras que el mutante std1 acumulo altas cantidades de almidon (Figura 5A-D). Tambien se observo una mayor acumulacion de almidon en std1 en respuesta a la privacion de azufre (Figura 5E-H). Se obtuvieron los mismos resultados en respuesta a la privacion de azufre (datos no mostrados). La tasa de transporte de electrones fotosinteticos (ETR), determinada a partir de mediciones de fluorescencia de clorofila, mostro una disminucion paralela en las cepas std1 y testigo cuando se realizo la privacion de N en condiciones mixotroficas (Figura 4C, panel izquierdo). En cambio, cuando la privacion de N se llevo a cabo en condiciones fotoautotrofas, la cafda en ETR fue menos pronunciada en std1 en comparacion con las cepas testigo (Figura 4C, panel derecho). Tomados en conjunto, estos datos muestran que, dependiendo del estado de energfa intracelular, std1 acumula mas compuestos de reserva y mantiene una actividad fotosintetica mas alta que las cepas de control en respuesta a la privacion de nutrientes. La inmunodeteccion de los principales componentes fotosinteticos mostro una disminucion similar de PSII, PSI, citocromo b6f; subunidades ATPasa y Rubisco en std1 en comparacion con el progenitor de tipo salvaje (Figura 4D). Curiosamente, la oxidasa alternativa mitocondrial (AOX) fue mucho mas abundante en el mutante que en el WT (Figura 4D), lo que indica un desequilibrio redox en el mutante.

Aumento de la produccion de biomasa en mutante std1 durante la privacion autotrofica de nitrogeno.

Se observo un fuerte aumento en la produccion de biomasa en std1 a partir del tamano de los pelets celulares recolectados despues de 3 y 10 dfas de cultivo en un medio privado de N (Figura 6A). Notablemente, mientras que las lmeas de tipo silvestre y complementadas se contaban como partmulas de una sola celula de aproximadamente 6 - 7 jm de diametro, el mutante std1 consistfa en agregados de 2, 4 y 8 celulas encerradas por la pared de la celula madre y medidas como partmulas de 10 - 20 jm de diametro (Figura 7). Esta caractenstica fenotfpica, previamente descrita en varios mutantes de C. reinhardtii, se llama palmeloide (Harris, 2009). A pesar de la agregacion de las celulas, el volumen celular total fue similar en cultivos de tipo silvestre y mutantes en condiciones de N-repleto (Figura 6B). En respuesta a la privacion de nitrogeno, el volumen celular total mostro solo ligeras variaciones en los cultivos de tipo silvestre y en los complementados, pero aumento mucho en std1 (Figura 6B). Cuando la privacion de

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nitrogeno se realizo en condiciones mixotroficas (TAP-N), el mutante stdl mostro un comportamiento similar al de las celulas de tipo silvestre (Figura 8). La biomasa, medida como peso seco, mostro un aumento de 1,7 veces en cepas de tipo silvestre y complementadas despues de 6 dfas de agotamiento de N, y un aumento de mas de 3 veces en stdl (Figura 6C). Con el fin de confirmar el espectacular aumento de la produccion de biomasa y almidon observado en stdl, se llevaron a cabo experimentos adicionales en condiciones mas controladas usando fotobiorreactores de 1L que funcionan como turbidostatos (Figura 9). En estos experimentos, la biomasa celular se mantuvo a un nivel constante (monitorizado por ODasonm) mediante la adicion de medio de cultivo fresco, permitiendo asf la medicion de la tasa de dilucion y la productividad de biomasa. En to, se reemplazo la dilucion por un medio mmimo N-repleto por medio mmimo libre de N, dando como resultado una disminucion del contenido de amomaco del medio de cultivo, que se agoto completamente despues de 45 h (Figura 9A). En ese momento, la productividad de biomasa del WT comenzo a disminuir gradualmente y se detuvo completamente despues de 72 h. En marcado contraste, la productividad de biomasa de stdl aumento (de 45 h a 65 h) y luego comenzo a disminuir gradualmente, siendo aun la productividad de biomasa a 72 h mas alta que la productividad inicial del WT. Estos experimentos demuestran que stdl produce mas almidon y biomasa que la cepa testigo cuando se somete a privacion de N en condiciones fotoautotrofas.

Discusion.

Los autores de la presente invencion informan en el presente texto sobre la caracterizacion del mutante stdl afectado en un homologo de la quinasa DYRK perteneciente a un nuevo subgrupo (denominado DYRKP), espedfico del linaje verde. El mutante stdl, el primer mutante DYRK del linaje verde publicado hasta ahora, acumula altas cantidades de almidon intracelular y de aceite y muestra una persistente actividad fotosintetica en respuesta a la carencia de nutrientes.

Control de la biomasa y acumulacion de reservas por DYRK quinasas.

Como se muestra en los experimentos realizados en diferentes condiciones troficas (mixotroficas frente a fotoautotrofas), el estatus de energfa celular, ademas del estatus de los nutrientes, desempena un papel central en el control de la acumulacion de almidon y aceite en el mutante. En condiciones mixotroficas (celulas iluminadas que crecen en un medio que contiene acetato), condiciones en las que el estatus energetico es alto, se acumulan altos niveles de almidon en el WT en respuesta a la privacion de N, pero no se observa aumento del almidon en stdl. Cabe tener en cuenta que en estas condiciones se observo en el mutante un aumento en el contenido de aceite. Sin embargo, en condiciones fotoautotrofas, la acumulacion de almidon en el WT depende de la intensidad de la iluminacion (baja a baja intensidad de luz y mas alta a luz mas alta). Sorprendentemente, la dependencia de la acumulacion de almidon sobre el estatus de la energfa se pierde en stdl, acumulando las celulas mutantes cantidades de almidon similares, si bien a velocidades diferentes, en las diferentes condiciones troficas (Figura 4A y Figuras 5A, E). En la levadura, se ha publicado que el homologo de DYRK Yak1 controla el almacenamiento de glucogeno, induciendo el borrado del gen YAK1 un aumento en el contenido de glucogeno intracelular (Wilson et al., 2010). Yak1 controlana la detencion del ciclo celular en respuesta a la privacion de glucosa fosforilando los factores de transcripcion Msn2 y Hsf1 (Moriya et al., 2001). Mas recientemente, se propuso que Yak1 se encuentra en el centro de una cascada reguladora que controla el crecimiento y la respuesta al estres dirigiendose a diferentes factores de transcripcion (Malcher et al., 2011). En cuanto al mutante Yak1 de la levadura, el aumento de la reserva y de la produccion de biomasa de stdl en respuesta a la privacion de nutrientes indica que una senal requerida para detener el crecimiento y la acumulacion de reservas no se percibe correctamente o no se transfiere. En la levadura, Yak1 esta entre otros factores de transcripcion como Sfp1 y Msn2/4, en la interseccion entre las rutas PKA y TOR (Rohde et al., 2008). El punto hasta el cual DYRKP de Chlamydomonas y plantas superiores estan involucradas en las cascadas de senalizacion TOR y cAMP-PKA, necesitara mas investigacion para ser aclarado.

Perdida de la regulacion por retroalimentacion de la fotosmtesis en stdl.

En las microalgas, la disminucion de la actividad fotosintetica es parte de la respuesta celular general a la privacion de nutrientes, que contribuye a mantener un equilibrio entre la generacion de potencia reductora por la fotosmtesis y la capacidad de usarla con fines metabolicos (Grossman, 2000). Se ha publicado que el mutante sacl (defecto en la respuesta a la Sacclimation) murio a los dos dfas de privacion de S a la luz, debido a una incapacidad para regular a la baja la fotosmtesis, dando como resultado una sobreproduccion de especies reactivas de oxfgeno (ROS) que danan los centros PSII (Davies et al., 1996, Wykoff et al., 1998). En cambio, el mutante stdl muestra una disminucion en los complejos fotoinsinteticos similares a la observada en las cepas de control (Figura 4D), pero su actividad fotosintetica, aun cuando disminuye, permanece mas alta que en la cepa testigo en condiciones fotoautotrofas (Figuras 4C y Figura 5B, F). En paralelo, el mutante stdl acumula mas compuestos de reserva que las cepas de control. Por tanto, los autores de la presente invencion proponen que la pronunciada acumulacion de almidon que se produce en stdl funciona como un sumidero para reducir la potencia generada por la fotosmtesis, disminuyendo asf la inhibicion de la fotosmtesis por retroalimentacion. Los estudios de perfilacion de metabolitos han demostrado la existencia en plantas superiores de una correlacion negativa entre la produccion de biomasa de almidon (Sulpice et al., 2009). Tal correlacion negativa se suprime en el mutante stdl en condiciones de limitacion de nutrientes donde se observan producciones paralelas de almidon y biomasa, al menos en condiciones de escasez de nutrientes.

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Implicaciones biotecnologicas.

El descubrimiento de un regulador negativo que controla el crecimiento y la acumulacion de reservas en condiciones de privacion de nutrientes tiene implicaciones biotecnologicas importantes para las microalgas. De hecho, estos microorganismos unicelulares se consideran cada vez mas como una fuente de biomasa prometedora para la produccion de biocombustibles de proxima generacion. Una de las principales ventajas de las microalgas, cuando se compara con plantas superiores, es su capacidad para acumular cantidades elevadas de almidon o lfpidos, siendo estos compuestos convertibles en bioetanol o biodiesel, respectivamente. Sin embargo, los analisis tecnoeconomicos han indicado que se necesita aumentar la productividad de los compuestos de reserva para alcanzar la viabilidad economica.

Ejemplo 2: Informacion adicional sobre la caracterizacion del mutante stdl.

El Ejemplo 1 describe una acumulacion masiva de aceite y almidon despues de una carencia de nitrogeno prolongada en el mutante stdl. Para analizar el mecanismo o mecanismos moleculares entre el gen mutado DYRK y el fenotipo observado en la formacion de reserva de carbono, se llevaron a cabo analisis comparativos transcriptomicos, cuantitativos tanto proteomicos como lipidomicos del mutante stdl y se compararon con su cepa 137AH de tipo silvestre.

Resultados.

El mutante stdl sobreacumulo MGDG oxidado.

En el ejemplo 1, los autores de la presente invencion observaron la sobreacumulacion de triacilgliceroles (TAGs, aceites) en el mutante stdl despues de una prolongada carencia de nitrogeno (Figura 4B). Para obtener una imagen completa de los cambios lipidomicos globales en el mutante, se cuantificaron las clases de lfpidos basandose en cromatograffa en capa fina (TLC), y se compararon los cambios en las especies moleculares de lfpidos utilizando el estado de la tecnica LC-MS/MS. En primer lugar, cada clase de lfpidos se cuantifico basandose en TLC. Como se muestra en la Figura 10A, ademas de los lfpidos polares clasicos (es decir, MGDG, DGDG, DGTS, PG, PE) presentes en todas las cepas, se detecto una nueva banda justo debajo del MGDG solamente en el mutante stdl en la placa de TLC (senalada mediante una flecha). Los lfpidos presentes en la banda se recuperaron por medio de elucion con una mezcla de cloroformo y metanol (2:1) y se sometieron a identificacion por LC-MS/MS. Los analisis de espectrometna de masas revelaron la presencia de una mezcla de MGDG 34 oxidado, con una combinacion de acidos grasos C16 y C18 con diferente nivel de insaturaciones. La identificacion por espectrometna de masas para una de las especies moleculares oxidadas MGDG34:x se muestra en la Figura 10B.

La cantidad relativa de estos MGDG oxidado en las celulas del mutante se examino con mas detenimiento en comparacion con el WT, tambien de una manera dependiente del tiempo en respuesta a la carencia de nitrogeno. Se recolectaron celulas cultivadas en fase intermedia-log una vez al dfa durante 5 dfas y se extrajeron los lfpidos celulares totales mediante el metodo de hexano e isopropanol caliente. El extracto lipfdico total se sometio despues a analisis lipidomico mediante el estado de la tecnica qTOF UPLC-MS/MS. Las muestras se sometieron a analisis tanto positivos como negativos, para para la deteccion de lfpidos de la membrana polar y lfpidos neutros, respectivamente. Como se muestra en la Figura 11, excepto DGTS, no se observaron diferencias significativas para todos los demas lfpidos celulares entre el WT, el mutante stdl y dos cepas complementadas (llamadas en el presente texto C2 y C7 respectivamente). Se observo una acumulacion de TAG significativa despues de una prolongada carencia de nitrogeno, lo que confirma los analisis anteriores basados en TLC. Por razones aun no aclaradas, el nivel de DGTS permanece constante en el mutante stdl, pero aumento de forma espectacular en el WT en respuesta a la carencia de nitrogeno.

Un nivel basal de MGDG oxidado esta presente en celulas de Chlamydonomas reinhardtii, que permanecieron inalteradas en respuesta a la carencia de nitrogeno en el WT (Figura 12A). Bajo condiciones de nutrientes suficientes, el mutante stdl ya acumulaba mas del doble de MGDG oxidado que las celulas de tipo silvestre, lo que aumento significativamente incluso mas (hasta 18 veces mas) de una manera dependiente del tiempo en respuesta a la carencia de nitrogeno. Las principales especies MGDG oxidadas incluyen las especies C16 y C18 y la estructura detallada de estas oxilinas es objeto de investigacion en el laboratorio en este momento (Figura 12B).

Colectivamente, la mayor acumulacion /smtesis de MGDG hidroperoxido apunta a la potencial desregulacion del gen o genes que codifican las protemas que catalizan o regulan las reacciones de oxidacion de los lfpidos. La oxidacion de los lfpidos es una reaccion metabolica comun en todos los sistemas biologicos. Esta reaccion esta principalmente catalizada por protemas llamadas lipoxigenasas (LOX: EC: 1.13.11.12). Las lipoxigenasas son una familia de dioxigenasas que contienen hierro no hemo. Los LOXs catalizan la insercion de oxfgeno molecular en la posicion estereoespedfica de una cadena de acidos grasos poliinsaturados. Los LOXs se encuentran ubicuamente en plantas, mairnferos, corales, musgos, hongos y tambien en diversas bacterias y microalgas.

CreLOX1 esta regulado al alza tanto a nivel transcriptomico como a nivel proteomico en el mutante stdl.

Para obtener una mejor comprension de las redes reguladoras potenciales que implican la protema STD1, se realizo un estudio transcriptomico comparativo basado en la tecnologfa de secuenciacion Illumina RNA-seq (Genoscope). Analisis preliminares del conjunto de datos transcriptomicos revelo un aumento de mas de 6 veces log (LogFC) del 5 transcripto de CreLOXI en comparacion con celulas WT en condiciones fotoautotrofas (Tabla 2). Los analisis proteomicos cuantitativos basados en el marcaje con 15N/14N indicaron un aumento sorprendente en la protema CreLOXI (hasta 30 logFC) en el mutante que en el WT (Tabla 2). Este gran aumento en la cantidad de protema CreLOXI en las celulas del mutante viene apoyado ademas por la observacion de un aumento de senal (~110 kDa) en la SDS-PAGE. Esta banda se recupero, y se identifico que realmente contema principalmente la protema 10 CreLOXI (Figura 13 y Tabla 3).

Los productos derivados de estas reacciones de oxidacion de acidos grasos se denominan colectivamente oxilipinas, que son moleculas lipofilas de senalizacion en muchos procesos biologicos. Basandose en busquedas de homologfa de protemas con las conocidas lipoxigenasas de Arabidopsis como cebos, solo un homologo putativo (CreLOXI) esta codificado en el genoma de Chlamydomonas reinhardtii (version 5). El locus que codifica el 15 CreLOXI putativo es Cre12.g512300 (phytozome version 5). La protema CreLOXI tiene un peso molecular teorico de 118 kDa y contiene dos dominios de lipoxigenasa similares a todos sus homologos de plantas superiores. Se predice que CreLOXI alberga un peptido de transito de cloroplasto largo (CPT) de 65 aminoacidos en su extremo N usando el software online ChloroP. Esto esta de acuerdo con la nocion de que el homologo de Arabidopsis closet es el plastido localizado AtLOX5.

Planteamiento de la bioloqia del sistema

metodo condicion de crecimiento Comparacion id del gen Anotacion LogFC valor de p ajust.

Transcriptomica

Plataforma de MM 2% CO2 stdl vs. WT Cre12.g512300.t1.1 lipoxigenasa 6,7 0,000

secuenciacion RNA- 1

seq Illumina Cre07.g337300.t1.2 DYRKP-1 -1,93 0,000

Proteomica

espectrometria de 24 h stdl vs. WT Cre12.g512300.t1.1 lipoxigenasa 29,6 0,063

cuantitativa

masas marcaje MM-N 2% 1

(14)N/(15)N CO2 Cre07.g337300.t1.2 DYRKP-1 n.d.

20 Tabla 2: CreLOXI esta regulado al alza en el mutante stdl de Chlamydomonas tanto a nivel de la transcripcion como en el de protema. Se realizaron dos estudios a gran escala, un planteamiento transcriptomico y uno proteomico, que revelan una regulacion positiva de la lipoxigenasa 1 en las celulas del mutante stdl. El conjunto de datos del transcriptoma fue obtenido por secuenciacion de ARN utilizando la tecnologfa Illumina (Genoscope). Se cultivaron celulas de tipo silvestre y mutantes stdl en condiciones autotroficas estandar en medio mmimo y 2% de 25 CO2 en el aire a 100 pE m"2 s"1 en cultivos triplicados que se combinaron antes de la recoleccion. Para el analisis

proteomico cuantitativo, las celulas de tipo silvestre y las mutantes se cultivaron en condiciones autotrofas en 4 replicados para cada cepa, 2 replicados en medio mmimo que contema 14N y 2 replicados que conteman sales de amonio 15N que conducen a un etiquetado metabolico global. Las celulas se centrifugaron, se lavaron, se resuspendieron en medio MM-N y se recogieron despues de 24 horas de privacion de nitrogeno. Antes de la 30 extraccion de protemas, las celulas de tipo silvestre marcadas con 14N se combinaron con celulas stdl marcadas con 15N y viceversa, dando 4 replicados biologicos. El Log2 fold change (logFC) para los resultados de protemas es la media de 4 replicados y se da en relacion con el tipo silvestre. "Adj. p-value" es el valor de p ajustado para comparaciones multiples.

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WT

registro

Anotacion masa (kba) rk puntuacion cobertura n° peptidos emPAI rec. espectrales

Cre06.g269050.tl.l

Familia similar a NmrA. deshidrogenasa predicha 91.26 1 4671.86 67.26 54 15.31 95

Crel2.g512300.ttl

LIPOXIGENASA 117.92 2 4i72 78 62.19 53 8,18 123

Crell.g477950.tl. 2

funcion desconocida 94.80 3 4440.31 77.86 39 6.21 66

Cre06.g288700.tl. 1

Glicolato deshidrogenasa 120.45 4 3137.98 50.18 ; 41 3.87 64

Cre01.g05450Q.tl. 1

NADP TRANSHIDROGENASA 112,85 5 2873.82 41.22 37 4.27 64

i stdl

_______________________________

registro'

Deftine (augl0.2; 169) masa (kDa) rk puntuacion j cobertura rec. espectrales

Crel2,g512300,tl.l

LIPOXIGENASA 117.92 1 3659.18 4904 48 7.72 ... ......248

Cre06.g269050.tl.l

Familia similar a NmrA. deshidrogenasa predicha 91.26 2 3740.72 56.12 43 7.61 . 67

Cre ll.g477950.tl. 2

funcion desconocida 94.80 3 3733.94 : 62.53 34 3.44 50

Cre01.g054500.tl. 1

NADP TRANSHIDROGENASA 112.85 4 2429.72 j 43.65 31 2.13 37

;Cre06.g288700.tl.l

Glicolato deshidrogenasa 120.45 5 2112.46 ; 34.45 25 1.55 37

1 C2

registro

Deftine {augl0.2; 169} masa (kDa) rk puntuacion cobertura n° peptidos j emPAI 1 1 rec. espectrales

Cre06.g269050.tl. 1

Familia similar a NmrA. desmarogenasa predicha 91.26 1 4919.95 64.92 56 17.04 108

Crell.g477950.tl2

funcion desconocida 94.80 2 4349.85 72.75 38 7.76 77

Cre 01, g054500.11.1

NADP TRANSHIDROGENASA 112.85 3 : 2898.18 42.87 36 4.88 86

Cre06.g288700.tl.l

Glicolato deshidrogenasa 120.45 4 : 2823.34 45.52 38...... 2.59 50

Crel2.g512300.tll

LIPOXIGENASA 117.92 5 2743.81 47,76 38 3,31 57

C7 |

registro i

1 Deftine (augl0 2, 169} | masa (kDa) rk puntuacion i cobertura n° peptidos emPAI rec. espectrales

Cre06.g269050.tl. 1

Familia similar a NmrA. deshidrogenasa predicha 91.26 1 4052.68 59.24 46 9 18 73

Crell.g477950.tl.2

: funcion desconocida 94.80 2 3862.11 69.64 36 4.39 58

Cre01.g005050.tl.l

RELACIONADO UGANDO SELECTINA protema 1 del aparato de Golgi 99.56 3 3007.98 45.86 43 3.98 53

Crel2.g512300,tll

LIPOXIGENASA 117.92 4 2399.25 40.09 33 2,07 44

Crel2.g517900.tl.l

i Protelna SecA asociada a cloroplasto 114.00 5 2029.16 32.72 29 1.25 30

Tabla 3: Identificacion de protemas en la banda senalada en la Fig. 13A mediante espectrometria de masas. Las 5 primeras protemas identificadas se enumeran segun su rango (rk) para cada cepa. Se muestran la puntuacion y cobertura de las protemas y el numero de peptidos identificados, que tambien corresponden a peptidos espedficos. Los valores "emPAI" que indican el 'Indice de abundancia de protema modificado exponencialmente" y el numero de espectros totales (espedficos) observados ("recuentos espectrales", relevantes y duplicados) pueden servir para dar una estimacion de la abundancia relativa de una protema en una muestra.

Los inhibidores de LOX impidieron la formacion de reservas de carbono (lfpidos y almidon).

Basandose en resultados actuales, los autores de la presente invencion plantearon la hipotesis de que la quinasa STD1 actua como regulador negativo de la protema LOX1. De hecho los productos de la lipoxigenasa, las oxilipinas, son precursores de una gran variedad de moleculas de senalizacion que desempenan papeles en muchas redes de senalizacion de respuesta al estres, al igual que al desarrollo. Para probar esta hipotesis se uso catecol (Sigma Cat # 452637). El catecol es un conocido inhibidor de la lipoxigenasa, que inhibe la actividad de la lipoxigenasa apagando la especie celular de oxfgeno reactivo. Se ensayaron inicialmente dos concentraciones diferentes de catecol (5 mM y 10 mM). Con la presencia de catecol 5 mM, la acumulacion tanto de TAG como de almidon se inhibio en el mutante stdl despues de 6 dfas bajo carencia de nitrogeno (Figura 14). El catecol inhibio tambien la acumulacion de TAG en respuesta a la carencia de nitrogeno en las cepas WT, si bien no se observo ningun efecto sobre la acumulacion de almidon. Se ensayan otras condiciones.

De lo anterior, parece que la inactivacion de STD1 en el mutante stdl provoca una regulacion al alza de LOX1, dando lugar asf a la formacion de una familia de oxilipinas que estan implicadas en las acumulaciones de almidon y TAG, evitando la inhibicion de la actividad de LOX por el catecol la acumulacion de almidon y de TAG.

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Claims (14)

1. 5

   10

   15

   20

   25

   30

   35

   REIVINDICACIONES

   1. Un metodo para producir materia prima de biomasa, que comprende las etapas de:

   (i) cultivar celulas de microalgas verdes en las que la expresion y/o la actividad de la protema DYRKP-1 de secuencia SEQ ID N°: 1 esta disminuida, pudiendose obtener dicha disminucion mediante silenciamiento, desactivacion, mutacion y/o interrupcion del gen DYRKP-1 o mediante la inhibicion de la actividad de la protema DYRKP-1 mediante compuestos qmmicos que actuan como inhibidores espedficos; y

   (ii) inducir la acumulacion de reservas y/o el aumento en la produccion de biomasa por dichas microalgas, que comprende incubar las celulas de microalgas en un medio deficitario, siendo dicho medio deficitario en al menos un elemento elegido entre el grupo que consiste en nitrogeno, azufre y fosforo.
2. 2. El metodo segun la reivindicacion 1a, en el que dichas microalgas carecen de un gen funcional DYRKP-1, cuya secuencia de codificacion es SEQ ID N° 2.
3. 3. El metodo segun la reivindicacion 1a o la reivindicacion 2a, en el que dichas microalgas son Chlamydomonas.
4. 4. El metodo segun cualquiera de las reivindicaciones 1a a 3a, en el que dichas microalgas son Chlamydomonas reinhardtii.
5. 5. El metodo segun cualquiera de las reivindicaciones 1a a 4a, en el que la etapa (ii) comprende iluminar las celulas de microalgas.
6. 6. El metodo segun la reivindicacion 5a, en el que dicha iluminacion se realiza a una intensidad comprendida entre 25 y 2000 pmol de fotones m'2s'1, durante 8 a 24 horas al dfa.
7. 7. Metodo segun cualquiera de las reivindicaciones 4a a 6a, en el que la etapa de incubar las celulas de microalgas en el medio deficitario dura al menos 24 horas.
8. 8. El metodo segun la reivindicacion 7a, en el que la etapa de incubacion de las celulas de microalgas en el medio deficitario dura de 2 a 8 dfas, preferiblemente de 3 a 6 dfas.
9. 9. El metodo segun cualquiera de las reivindicaciones 1a a 8a, en el que la etapa (ii) comprende incubar las celulas de microalgas en un medio que comprende carbono organico.
10. 10. El metodo segun la reivindicacion 9a, en el que en la etapa (ii) las celulas se incuban durante 2 a 6 dfas en un medio deficitario que comprende acetato.
11. 11. El metodo segun cualquiera de las reivindicaciones 1a a 8a, en el que la etapa (ii) comprende incubar las celulas de microalgas en condiciones fotoautotrofas.
12. 12. El metodo segun la reivindicacion 11a, en el que en la etapa (ii) las celulas se incuban durante al menos 15 horas en condiciones fotoautotrofas en un medio deficitario.
13. 13. Metodo segun cualquiera de las reivindicaciones 9a a 12a, en el que la materia prima de biomasa producida es aceite.
14. 14. Metodo segun la reivindicacion 11a o la reivindicacion 12a, en el que la materia prima de biomasa producida es almidon y/o biomasa.