CN106574231B

CN106574231B - 缺少功能性dyrkp-1基因的绿色微藻在增加原料产量中的应用

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Publication number: CN106574231B
Application number: CN201580023211.XA
Authority: CN
Inventors: 米里亚姆·舒尔茨·拉夫利特; 文森特·可克里斯; 永华·李-贝森; 吉勒·佩尔蒂埃
Original assignee: Commissariat a lEnergie Atomique et aux Energies Alternatives CEA
Current assignee: Commissariat a lEnergie Atomique et aux Energies Alternatives CEA
Priority date: 2014-05-07
Filing date: 2015-05-07
Publication date: 2020-12-22
Anticipated expiration: 2035-05-07
Also published as: ES2645631T3; CA2947517A1; EP2942390A1; JP2017514493A; CN106574231A; US20170058254A1; JP6605500B2; EP2942390B1; US10513680B2; WO2015170280A1

Abstract

本发明涉及一种生产生物质原料的方法，所述方法包括培养DYRKP‑1蛋白表达和/或活性改变的绿色微藻细胞，通过所述微藻诱导储备累积和/或生物质产量的增加。

Description

缺少功能性DYRKP-1基因的绿色微藻在增加原料产量中的应用

技术领域

本发明涉及绿色微藻领域及其在生物技术中的应用。更具体的，本发明描述了缺少功能性DYRKP-1蛋白的衣藻(Chlamydomonas)在胁迫条件下生产大量的中性脂类(三酰甘油酯：TAG，或油类)和/或大量的淀粉中的应用。

背景技术

由于其高生物质产率和其累积大量胞内淀粉(可转化为生物乙醇)或油(可转化为生物柴油)的能力，微藻代表了用于生产下一代生物燃料的前景性原料(Hu et al.,2008；Wijffels and Barbosa,2010)。然而，为了实现生物燃料的可持续生产，需要提高微藻的产率(Delrue et al.,2013)。

已形成成熟的策略来对微藻和更普遍的光合生物进行优化以使其在可利用的光、温度和营养物不断变化的条件下生长和存活。在微藻中，大量必要养分的缺乏强烈影响其生长并引起细胞代谢的急剧变化。对氮或硫的一般响应在于蛋白质合成的减少、细胞分裂的阻滞、富含能量的存储化合物(例如淀粉和三酰基甘油)的大量累积(Ball et al.,1990；Merchant et al.,2012)及光合作用的下调(Grossman，2000；Peltier and Schmidt，1991)。触发储备化合物(reserve compound)的累积所需的营养缺乏，由于损害了生物质产率而成为微藻用于生物技术目的时主要的生物学限制之一(Hu et al.,2008)。尽管对于微藻作为新原料有相当大的兴趣(Larkum et al.,2012)，但是与营养物和能量状态有关的信号和调节基因以及控制光合能量转化和贮存过程的途径几乎是未知的。

因此，对响应于营养物和能量状态的控制生长、光合作用和储备累积(reserveaccumulation)的调节机制的解读是优化微藻在用于生物技术应用时的生产能力的关键问题。

发明内容

为了对响应于营养物可利用性的动态储备所涉及的调节机制进行阐述，本发明人现表征了莱茵衣藻Chlamydomonas reinhardtii的一种突变体，以淀粉降解中的缺陷进行筛选并命名为std1(为淀粉降解缩写starch degradation)。std1突变体在DYRK(双重特异性酪氨酸磷酸激酶)家族的基因中具有插入，最初注释为DYRK2(衣藻基因组第4.0版)，并在此重命名为DYRKP-1。衣藻(Chlamydomonas)std1突变体是迄今为止报道的绿色谱系的第一个dyrk突变体，在光合自养条件下，与野生型祖细胞相比其对营养缺乏做出累积更多淀粉和油类的响应；在兼养条件下，与野生型祖细胞相比其对营养缺乏做出累积更多油类的响应。因此，本发明提供了一种培养微藻细胞的方法，从而优化微藻细胞生长，以从微藻中获得最佳的淀粉和/或脂类产量。根据不同的培养条件，本发明的方法诱导并增强了微藻细胞内的淀粉和/或油类累积。所公开的方法适合于大规模生产富含淀粉和/或富含脂肪的微藻。

因此，本发明的第一方面是用于生产生物质原料的方法，所述方法包括以下步骤：

(i)培养绿色微藻细胞，在所述绿色微藻细胞中，DYRKP-1蛋白的表达和/或活性改变；以及

(2)通过所述微藻诱导储备累积和/或生物质产量的增加。

如本文所限定的，“DYRKP-1蛋白”是由微藻表达的DYRK蛋白，具有DH-框，DH-框具有以下序列：H(R/K)TGFEEXK(D/E/N)(F/L)(SEQ ID No:3)。本文中公开了莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)DYRKP-1蛋白的氨基酸序列和编码序列(含有5'-和3'-非翻译区的cDNA序列)，分别为SEQ ID No:1和SEQ ID No:2。由这些序列，本领域技术人员可以通过鉴定不同于莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)的任何绿色微藻相对SEQ ID NO:1的同源蛋白来精确地确认所述微藻的DYRKP-1序列。在本文中，蛋白与莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)的DYRKP-1显示出非常相似的一级序列(通过BLAST测量，至少50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％的一致性，)和二级和三级结构，则它们有共同祖先，将认定该蛋白与莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)的DYRKP-1是同源物。

在本文中，“改变的”或“受损的”是指DYRKP-1蛋白的表达和/或活性发生变化，使得蛋白的活性降低。例如，DYRKP-1基因可以被沉默、敲减、突变和/或干扰，使得微藻缺乏功能性DYRKP-1蛋白。DYRK-P蛋白的活性也可因用作特异性抑制剂的化合物而被抑制。

如下文中实验部分所公开的，根据本发明的方法可以使用衣藻(Chlamydomonas)，尤其用莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)进行。

在步骤(i)中，根据任何本领域技术人员已知的常规方法来培养细胞。例如，在提供有2％CO₂的MOPS缓冲基础培养基(MM)中，使细胞光合自养地生长至2-5×10⁶细胞/ml的密度。

在这方面的具体实施方式中，所述诱导储备累积包括在缺陷型培养基中孵育微藻细胞，该缺陷型培养基即未包括使绿色微藻最佳生长所需的足量的营养物的培养基。该缺陷型培养基的实例包括处于能够被微藻代谢的形式、缺乏选自由氮、硫和磷组成的组中至少一种元素的培养基。当然，词语“缺乏”不能按绝对意义来理解(即浓度等于0)，而是指培养基中所述营养物的浓度远远低于(至少低10倍)用于培养微藻的典型培养基中所述营养物的浓度。

在步骤(i)和步骤(ii)之间，可以收获细胞并将其转移到缺陷型培养基中。或者，通常在连续培养装置中，在未外源添加至少一种营养物的情况下，通过细胞代谢来使培养基中营养物缺乏。例如，如实验部分和图9A中所示，向作为恒浊器运转的光生物反应器(以使细胞生物质维持在恒定水平)中添加无N基础培养基导致培养基的氨含量降低，其在不到2天内完全耗尽。

在具体实施方式中，诱导储备累积的步骤包括：用能使光合作用发生的光照射微藻细胞。

例如，该照射可以以至少25μmol光子/m²s或至少100μmol光子/m²s，例如介于25μmol光子/m²s和2000μmol光子/m²s之间的强度，每天进行8小时至24小时。本领域技术人员完全知道光强度的影响事实上取决于微藻真正接收到的强度，并且因此将取决于例如细胞密度和光生物反应器的形状等若干参数，并且能使照射强度适应具体遇到的情况。

显然，发明人已经发现营养缺乏(deprivation)不会导致缺少DYRKP-1活性的微藻的光合作用像通常野生型微藻那样很快停止。这是非常有利的，因为细胞不仅能富含油类和/或富含淀粉，而且，在处于缺陷情况的几天里总体生物质增加，从而引起显著整体增加的脂类和淀粉产率。

因此，在本发明的有利实施方式中，在缺陷型培养基中孵育微藻细胞的步骤持续至少24小时，例如2天至8天，优选3天至6天。当然，缺陷型培养基中的细胞生长强烈依赖于实验条件，特别是细胞密度，因此本领域技术人员将改变用缺陷培养基进行孵育的持续时间，以在所用的特定条件下使储备累积和/或生物质增加最佳化。

根据本发明的具体实施方式，步骤(ii)包括：在包括有机碳(例如乙酸盐/酯)的培养基中孵育微藻细胞。根据以下实施例中所示的该兼养条件的非限制性实例，在步骤(ii)中，在至少50μmol光子/m²s的持续照射下，细胞在包括乙酸盐/酯的氮缺陷培养基中培养2天至6天。发明人发现在兼养条件下，与野生型细胞相比，缺少DYRKP-1活性的微藻对营养耗竭做出增加脂类累积的响应。因此，该方法的这一具体实施方式有利地用于生产油类，例如用于生物柴油的生产。

根据另一实施方式，上述诱导步骤(ii)包括：在光自养条件下，即在将辐射能转化为生物学有用能量并仅使用二氧化碳、碳酸氢盐或碳酸盐作为碳源合成代谢化合物的条件下，用如前文所限定的缺陷型培养基来孵育微藻细胞。通常来说，在光照下，在基本上不含有机碳的培养基中孵育该微藻细胞，其中有机碳是可代谢的。前述“基本上不含有机碳”是指培养基中没有添加微藻可代谢的有机碳。根据该实施方式的优选变型，在步骤(ii)中，用营养缺陷型培养基，例如基本上不含微藻可代谢的有机碳的氮缺陷培养基中培养细胞至少15小时，优选至少1天、2天或3天，及直到6天或更多天。发明人已发现在光合自养条件下，与野生型祖细胞相比，缺少DYRKP-1活性的微藻对营养缺乏做出累积更多的淀粉和油类的响应。因此，该方法的具体实施方式有利于用于生产淀粉，例如用于生物乙醇生产；以及用于生产油类，例如用于生物柴油生产。该实施方式是特别的有趣的，因为在光自养条件下，细胞完全可以通过光合作用来提供它们所需的碳，这是与需要额外提供的碳源来用于生长的细胞(例如酵母或大肠杆菌E coli)相比的主要优点。

应当注意的是，微藻天然产生多不饱和脂肪(ω-3和ω-6)以及复合分子例如类胡萝卜素，并且根据本文所述的方法同样也可生产这些高价值产物。因此，本发明还涉及用于生产脂肪酸、多不饱和脂肪、类胡萝卜素和用于化妆品和/或制药工业的其它化合物，以及食品补充剂的方法，所述方法包括通过进行上文所述的方法使微藻内淀粉和/或三酰基甘油累积的步骤。

在触发微藻内淀粉和/或三酰基甘油累积的步骤之后，本发明的方法可包括一个或多个提取步骤。上述提取步骤可以使用溶剂法或本领域技术人员公知的其它提取方法来实现。

通过下文实例以及附图的进一步描述，将更清楚地理解本发明，下述实例示出了缺少DYRKP-1活性的微藻对营养缺乏的响应。

附图说明

图1：DYRKP-1基因受影响的衣藻(Chlamydomonas)std1突变体的分离及分子表征。

(A)std1突变体的淀粉降解表型。将藻类群落点在滤纸上，置于N或S耗竭的TAP-琼脂上5天，引起淀粉的累积，然后在黑暗中置于基础培养基(MM)上放置两天以诱导淀粉分解。通过暴露于碘蒸气可观察淀粉累积情况。

(B)衣藻(Chlamydomonas)DYRKP-1基因模型由14个外显子(黑框)和13个内含子(黑线)组成。由三次重叠RT-PCR获得关于外显子-内含子边界和5'起始的序列信息。通过基因组步移PCR确定巴龙霉素抗性盒(AphVIII基因，白框)插入至DYRKP-1第三外显子中。

(C)通过RT-PCR分析在TAP中生长的野生型、std 1和两个补充的株系(std1::STD11和std1::STD1 2)中DYRKP-1基因的表达。用肌动蛋白作为对照基因。

(D)通过对在8％SDS聚丙烯酰胺凝胶上分离的来自光合自养生长细胞的可溶性蛋白裂解物进行免疫检测来分析DYRKP-1蛋白的表达。

(E)响应于N缺乏的DYRKP-1转录物累积。野生型、std1突变体和补充的株系std1::STD1 1和2在光自养条件下氮饥饿3天。RNA与编码DYRKP-1片段的探针杂交；CBLP2基因用作内参对照。

图2：DNA印迹(Southern blot)分析和突变体补充。

(A)野生型株系137AH和std1突变株的Southern印迹分析。将经NotI-、XmaI或StuI/SacI-酶切的基因组DNA上样至琼脂糖凝胶，进行Southern印迹，并与针对AphVIII基因(巴龙霉素抗性盒)的探针进行杂交。每个泳道的DNA上样量以μg记。

(B)构建与潮霉素抗性标记物补充的std1的质粒。通过PCR扩增编码STD1的基因组野生型DNA，并将其克隆至来自pSL18的pSL-Hyg载体中。

(C)在不同缺乏条件下，野生型株系(137AH，黑色)，std1突变株(白色)和两个补充的株系(std1::STD1 1和2，灰色)的淀粉水平。培养物在TAP培养基(Con.＝对照)中生长，经受两天的氮饥饿(TAP-N)或硫饥饿(TAP-S)，从而诱导淀粉累积(Acc.)。随后，将饥饿的培养物离心，重悬于基础培养基(MM)中，并在黑暗中保持8小时或24小时。在黑暗条件下的MM(包含N但不含C)中，淀粉将被分解代谢(Degr.)。淀粉值为至少3个生物学重复样品的平均值±SD。

图3：包括绿色谱系的DYRK蛋白家族的系统进化树。

(A)DYRK蛋白家族的系统进化树。通过系统进化分析来比较来自通过JGI、Phytozome或NCBI数据库检索的藻类、真菌和植物的同源氨基酸序列。使用MAFFT第6版程序对序列进行比对。通过邻接法获得上述系统进化树。使用了以下缩写：Asp：烟曲霉(Aspergillus fumigatus)、At：拟南芥(Arabidopsis thaliana)、d：黑腹果蝇(Drosophilamelanogaster)，Dd：盘基网柄菌(Dictyostelium discoideum)，ChlNC：小球藻属(Chlorella sp.)NC64A，Cre：莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii,)，Micpu：微单胞藻(Micromonas pusilla)(CCMP1545/sp.RCC299)，Os：水稻(Oryza sativa)，Ost：青绿藻(Ostreococcus lucimarinus)/小球藻(Ostreococcus tauri)，Phypa：小立碗藓(Physcomitrella patens)，Vca：团藻(Volvox carteri)，Viv：葡萄(Vitis vinifera)(玉米(Zea mays)序列与水稻同源物组合，毛果杨(Populus trichocarpa)与果子酒(wine)组合)。表1中示出了用于构建系统进化树的DYRK序列登录号和多重比对。

(B)根据图3A的6个DYRK亚群的DYRK同源(DH)-框的共有序列；在DYRKP亚群中区分了三个次要亚群，提供以下七个类别：DYRK1(7个序列)、DYRK2(22个序列)、YAK1(21个序列)、DYRKP-A(包括苔藓的12个高级植物序列)、DYRKP-B(11个高等植物序列)、DYRKP-藻类(7个序列)和来自(Becker和Joost，1999)的公开DH共有序列，其中，比较了来自不同DYRK群的9个序列。

灰色序列未用来进行比对。指出了明确不完全的基因模型。当氨基酸的预测数目在两个比较基因组数据库时不同时，通常选择更长的版本。一些基因具有不同的剪接变体，例如“ZmDYRKP3”，其在该基因座处携带三个转录物。在斑马鱼(Danio rerio)和爪蟾(Xenopus laevis)的情况下，并未提供所有存在的DYRK基因的比对。

图4：响应氮缺乏时，std1突变体中的碳储存和光合活性。在100μmol光子/m²s的恒定照射下，于2％CO₂的空气中，使细胞在TAP或基础培养基中生长。在第0天，离心细胞，洗涤并重悬于TAP-N(左侧图，A-C)或MM-N(右侧图，A-C)中。在野生型(WT)，std1突变体和两个补充的株系std1::STD1 1和std1::STD1 2中进行测量(A-C)。

(A)细胞内淀粉的累积。所示为TAP-N中4次实验(第6天，3次)的平均值±SD和MM-N中6次实验(第10天，3次)的平均值±SD。

(B)细胞内中性脂类(TAG)的累积。在提取总细胞脂类后，用薄层色谱法分离TAG并随后进行定量。示出了每种条件(TAP-N或MM-N)三个生物学重复中的一个代表性实验。TAG值是三个技术重复的平均值±SD。

(C)在N缺乏的前三天，用叶绿素荧光测量确定光合电子传输速率(ETR)。绘图值是在约100μmol光子/m²s的光化照明下，4次(TAP-N)测量平均值±SD或6次(MM-N)测量平均值±SD。

(D)感兴趣的蛋白质的免疫检测。在光合自养条件(MM-N)下，氮饥饿的1天、2天或6天后通过免疫检测对全细胞蛋白提取物进行分析。蛋白用10％DS聚丙烯酰胺凝胶进行分离并用考马斯蓝染色用作内参对照(图7C)，或者进行免疫印迹以检测指定的蛋白。

图5：光合自养生长下的经受N-缺乏或S-缺乏的培养物中的细胞内淀粉的累积和光合活性。

在第0天，对野生型(WT)、突变体(std1)和两个补充的株系(std1::STD11和std1::STD12)的光合自养生物生长的培养物(MM，空气中CO₂为2％)进行离心、洗涤，并在2％CO₂的空气下，重悬于MM-N或MM-S中。在不同的时间点，对细胞沉淀物、总细胞体积和生物质干重进行分析。

在30μmol光子/m²s至40μmol光子/m²s的低光强度下，(A)N缺乏自养条件下的淀粉动力学以及(B)S缺乏的自养条件下的淀粉动力学。淀粉值是由std1(mt-nit1nit2)与野生型CC125(mt+nit1nit2)的回交产生的std1子代菌株1A和2A的5个生物学重复的平均值±SD和3次实验的平均值，两者均是“137c”型菌株。在30μmol光子/m²s至40μmol光子/m²s的低光强度下，于MM-N/CO₂中进行4次实验。

(C)在～35μE/m²s的自养条件下，在N缺乏三天期间，野生型、std1突变体和补充的株系的光合效率；或(D)在100μE/m²s的自养条件下，在S剥夺三天期间，野生型、std1突变体和补充的株系的光合效率。绘制值是～100μE/m²s的照射下，5次测量的平均值±SD。

图6：光自养条件下N缺乏期间std1突变体的生物质产率。

除了仅使用MM-N培养基之外，实验设置与图5中的实验设置相同。

(A)从1mL培养物中收获细胞、离心和对沉淀拍照。

(B)测定每mL总细胞体积。所示为平均值±SD(n＝7)。

(C)通过过滤、漂洗并干燥过夜来确定5个所收获的5mL培养物的生物质(干重)。对细胞内淀粉的分析能够确定总生物质的淀粉组分(阴影区域)。所示为平均值±SD(n＝3)。

图7：std1突变体细胞形成由母细胞壁包围的聚集体(四集藻型，palmelloid)。

(A)在2％CO₂下，于基础培养基中生长，且随后进行0天、2天或6天的N缺乏的野生型、std1突变体和补充的株系(std1::STD1 1和std1::STD1 2)的明场和微分干涉对比图像。箭头表示母细胞壁。比例尺＝10μm。

(B)在MM-N/CO₂条件下0天、2天或6天的，WT、std1突变体和拯救(rescued)株系std1::STD1 1和std1::STD1 2的相应的细胞或聚集体直径的分布，以及每ml的细胞体积的比较。代表性实验与(A)中相同。

(C)免疫检测实验的考马斯蓝内参对照示于图4D上。

图8：氮缺乏期间，叶绿素含量、总细胞体积和细胞数的变化。在100μmol光子/m²s的恒定照射下，于2％CO₂的空气中，使细胞在TAP或基础培养基中生长。在第0天，离心细胞、洗涤并重悬于TAP-N(左侧图)或MM-N(右侧图)中。在野生型(WT)、std1突变体和两个补充的株系std1::STD1 1和std1::STD1 2中进行测量。

(A)叶绿素浓度。所示为TAP-N中5次实验的平均值±SD和MM-N中7次实验的平均值±SD(第10天，3次)。

通过Multisizer^TM3

(Beckman)记录(B)总细胞体积(μm³/mL)和(C)每mL的细胞浓度或颗粒浓度。所示为平均值±SD(对于TAP-N实验，n＝6；对于MM-N实验，n＝7)。

图9：在指数生长过渡到N缺乏条件期间，在作为恒浊器操作的1L光生物反应器中光自养培养的std1和野生型衣藻(Chlamydomonas)细胞的生长性能。使用吸收探针测量细胞密度并通过注射新鲜培养基使其保持在恒定水平。由于std1的聚集表型，将OD880nm被调整为不同数值，对于WT为OD_880nm＝0.3，对于std1为OD_880nm＝0.3，以在这两种培养物中达到相似的生物质浓度(0.15g干重/L)。在富含2％CO₂的空气的存在下，恒定照射(500μmol光子/m²s)且存在MM的条件下稳定48小时后，用MM-N(t0)代替稀释培养基。对培养基中氨浓度的测量表明在45小时后完全耗尽。(A)所加入的用于将培养物维持在恒定生物质浓度的新鲜培养基的累积量。所示为是WT和std1培养物的三个生物学重复的数据；(B)在t0、t48和t72由扩张率和生物质测量确定的生物质产率的测量量(g干重d^-1.L^-1)。所示为平均值±SD(n＝3)。

图10：std1突变体中氧化的MGDG的形成。

(A)在TLC板上检测到的std1突变体中氧化的MGDG物质的过度累积。

(B)在std1中累积的一类氧化MGDG 34(16:2O2；18:1)物质的结构测定。

注意：C2和C7代表std1突变体的两个独立的补充株系。

图11：对WT、std1突变体和两个补充补充的株系中脂类响应于氮饥饿进行的完整分析。

图12：突变体中，氧化MGDG的过度累积及其物质分布。

(A)WT、std1突变体和两个补充株系响应于氮饥饿的天数的氧化MGDG的总累积量。

(B)氧化MGDG的分子类型分布。

图13：衣藻(Chlamydomonas)突变体std 1中，推定的脂氧合酶1(Cre LOX1)的过度累积。

通过考马斯蓝染色的SDS-PAGE凝胶的图像证实了质量为～110kDa处出现较强的条带。在100μmol的光子/m²s下，在供应2％CO₂的基础培养基中，使野生型、std1突变体和两个独立补充的株系(C2、C7)在标准自养条件下生长至指数期。细胞裂解后，利用蔗糖垫，通过超速离心来分离可溶蛋白和不可溶蛋白。来自含有膜的沉淀部分的蛋白通过加入TritonX-100来复溶，随后进行超速离心并在

Bis-Tris凝胶上进行分离。在用考马斯蓝染色后，std1突变体在～110kDa处检测到强条带，切除所有样品的相应凝胶区域并进行质谱分析。

图14：LOX抑制剂对突变体中TAG和淀粉累积的抑制。

(A)淀粉累积。

(B)TAG累积。

具体实施方式

实施例1：在营养缺乏期间，双特异性酪氨酸磷酸化调节激酶DYRKP-1负调控莱茵衣藻中的淀粉和油类的累积

方法

株系及培养条件

如(Chochois et al.,2010)所述，在本研究中选择CC125株系(mt-nit1nit2)作为生成突变体的遗传背景以及野生型株系。通过KpnI线性化质粒pSL-X转化产生std1突变株，pSL-X含有巴龙霉素抗性盒AphVIII。对std1而言，～4800bp的pSL-X中仅～1900bp片段插入至基因组中。在～100μE/m²sec的恒定光照下，细胞于25℃在Tris-乙酸盐-磷酸盐(TAP)培养基(Harris,2009)中兼养生长。对于缺乏实验，将预培养物在TAP培养基中兼养生长至2-5×10⁶个细胞/mL的密度或将预培养物于2％CO₂的空气中在MOPS缓冲的基础培养基(Harris，2009)中光合自养生长至2-5×10⁶个细胞/mL的密度。t＝0时取样后，将1789g的培养物于25℃下离心4分钟，将细胞沉淀物洗涤一次，并重悬于N-或S缺乏培养基中。应当注意的是，培养物的理论上相同的初始细胞密度对于获得所有研究的株系的可比较数据至关重要。由于std 1的四集藻型结构，比较了总细胞体积/mL或叶绿素含量以调节饥饿前的培养物。

std 1突变株的遗传表征和补充

为了检查插入的DNA的整合频率，用野生型细胞和std1突变体细胞进行Southernblot分析。根据先前描述的方法制备基因组DNA(Tolleter et al.,2011)，并且在0.8％琼脂糖凝胶中分离用NotI酶切的4μg、6μg或8μg基因组DNA，印迹在尼龙膜上，并与地高辛标记的探针杂交，该探针与插入的抗性盒的AphVIII基因的一部分补充。使用引物5’-CGAAGCATGGACGATGCGTT-3’(SEQ ID NO:4)和5’-CGAGACTGCGATCGAACGGACA-3’(SEQ ID NO:5)，通过PCR DIG探针合成试剂盒(Roche)进行探针标记。在50℃下，使用DIG Easy Hyb缓冲液(Roche)与得到的400bp-PCR片段杂交过夜。通过G:BOXChemin XL(Syngene)，以抗地高辛-AP和CSPD(Roche)作为底物来检测信号。为了确定巴龙霉素抗性盒的整合位点，根据来自Clontech的Genome Walker试剂盒进行基因组步移。使用FspI对std1的基因组DNA进行酶切，并且根据制造商的说明进行恰当处理。序列5’-CTGGTGCTGCGCGAGCTGGCCCACGAGGAG-3’(SEQ ID NO:6)(GPS1)和5’-TGGTTCGGGCCGGAGTGTTCCGCGGCGTT-3’(SEQ ID NO:7)(GPS2)用作基因特异性引物，从而可以对插入了Aph VIII盒的基因组序列下游进行测定。优越GC基因组LA聚合酶(Advantage GC genomic LA polymerase)(Clontech)用于扩增反应。为补充std1株系，使用引物5'GTCTAGAATGTCGCTCCGCCTGAACCGATG-3'(SEQ ID NO:8)(XbaG4forHyg)和5'-GTCTAGACTACATGCTGTCGAGCGAGG-3'(SEQ ID NO:9)(XbaG4RevHyg)以及DyNAzyme^TMEXT DNA聚合酶(FinnzymesOy)来对野生型基因组DNA进行PCR反应。使用XbaI对编码DYRKP-1基因的6913bp扩增产物进行限制性酶切，然后克隆至经XbaI酶切的载体pSL-Hyg，其中载体pSL-Hyg源自pSL 18(Dauvillee et al.,2003)，在PSAD启动子的控制之下并携带有潮霉素的抗性盒(Berthold et al.,2002)。std1细胞通过玻璃珠搅拌(Kindle,1990)来使用KpnI-线性化的pSL-Hyg-STD1来进行转化，用20mM潮霉素进行选择，然后使用同样的方案来进行筛选以分离突变株(Chochois et al.,2010)。将转化体暴露于S或N缺乏状态下几天，转移到基础培养基中置于黑暗下，接着用碘染色以测试剩余的淀粉水平。

系统发育分析

使用MAFFT第6版软件(Katoh et al.,2002)比对氨基酸序列。接下来，使用SeaView第4版(Gouy et al.,2010)手动完善所得到的比对结果，并通过进一步地分析去除可疑的同源区域。保留了总共313个氨基酸位置用于DYRK蛋白的系统发育分析。在Phylogenetic Inference Package Phylip第3.69版(Folenstein et al.,2005)中使用邻接法(NJ)、最大似然法(ML)和简约法(Pars)进行系统发育分析。用PROTML程序进行ML分析，并且随机化序列输入顺序(20个混乱次序)。SEQBOOT和CONSENSE程序分别用于对100个重复进行自展值(bootstrap value)计算，以及用于一致树重建。为了检查节点的置信度，使用NEIGHBOR和PROTPARS程序完成NJ和Pars分析。使用ROTDIST程序创建用于NJ分析的距离矩阵。使用MEGA5绘制系统发育树(Tamura et al.,2011)。

RNA分析和RT-PCR

如Liu等人(2005)所述的方法来分离总RNA。对于RT-PCR反应，将1μg的DNaseI处理的总RNA用于Onestep RT-PCR试剂盒(Qiagen)。为了获得完整转录的DYRKP-1/STD1基因的序列信息，使用如下引物5’CATAGTGCTCAGCAGGGGACAAGGC-3’(SEQ ID NO:10)(Std1UTR1)和5’AGCGTGCCAGAGGTTTCGCCGTC-3’(SEQ ID NO:11)(Std1P3rev),5’CCGCGGACGGCGAAACCTCTGGCAC-3’(SEQ ID NO:12)(Std1FW2)和5’GATCTCGTCCAGCGACTGGTCAAAGTAG-3’(SEQ ID NO:13)(G4rev14),和以及5’GCGGATCCGACGAGCAGGGCAACGTGCTG-3’(SEQ ID NO:14)(ACG4_FW3)和5’-CGGCAAGCTTCTACATGCTGTCGAGCGAGG-3’(SEQ ID NO:15)(ACG4_Rev1)进行三次重叠RT-PCR，最初创造的后一引物对用于表达抗原的相应区域。为了比较野生型菌株、突变型菌株和补充型菌株中的转录物水平，使用引物对Std1FW2和G4rev14来扩增DYRKP-1转录物的一部分。特异性引物被设计用于肌动蛋白(基因座名称Cre13.g603700,蛋白ID 515031)设计特异性引物，用作组成型表达的对照基因(5’AATCGTGCGCGACATCAAGGAGAA-3’(SEQ ID NO:16)和5’TTGGCGATCCACATTTGCTGGAAGGT-3’(SEQ ID NO:17))。

RNA印迹(Northern blot)分析

为了提取RNA，在相对时间点，于冰上收集15mL细胞培养物，随后将1789g细胞培养物离心1分钟，并且将500μL细胞悬浮液转移至冰上的1.5mL管中，与500μLRNA裂解缓冲液混合。如Liu等人,2005)所述的方法进行RNA提取、在甲醛琼脂糖凝胶上的分离以及Northernblot。将膜与含有STD1基因片段或CBLP2基因片段的DNA探针杂交作为内参对照。通过将BamHI-HindIII酶切pQE-30(Qiagen)载体和编码DYRKP-1的3’-部分的BamHI-HindIII酶切RT-PCR产物连接来获得A1.pAC-STD1质粒。利用引物5’-GCGGATCCGACGAGCAGGGCAACGTGCTG-3’(SEQ ID NO:14)(ACG4_FW3)和5’CGGCAAGCTTCTACATGCTGTCGAGCGAGG-3’(SEQ ID NO:15)(ACG4_Rev1)进行RT-PCR，从而产生1116bp的产物。来自该pAC-STD1质粒的1-kb BamHI-HindIII片段以及CBLP2的1-kb cDNA用于杂交。使用BAS-IP MS2040磷相仪平板(Raytest；http://www.raytest.de)对放射性信号进行检测，使用Molecular Imager FX磷相仪(Bio-Rad；http://www.biorad.com/)进行扫描，并用Quantity One-4.5.1程序(Bio-Rad)进行成像。

基因组DNA分析

为了在氮缺乏时间过程实验期间确定基因组DNA浓度，通过离心收集平均相当于1.2mm³总细胞体积的细胞，并储存在-80℃。根据先前描述的苯酚-氯仿提取方法(Tolleteret al.,2011)，在每个时间点制备基因组DNA的两个重复样品。使用NanoDrop 2000分光光度计(Thermo Scientific)测量DNA浓度。

蛋白质制备、定量和免疫斑点分析

为检测DYRKP-1，采用如下方法制备可溶性细胞裂解物：通过将1789g培养物离心2分钟来收获处于指数期(相当于5×10⁶个细胞/mL或0.8mm³/mL)的100ml莱茵衣藻细胞培养物，随后使之重悬于1mL的裂解缓冲液中(20mM HEPES-KOH pH 7.2、10mMKCl、1mMMgCl₂、154mMNaCl、0.1×蛋白酶抑制剂混合物；Sigma P9599)。于冰上，将细胞在1秒脉冲/1秒暂停的设置下超声90秒。使裂解物上样到蔗糖垫(20mM HEPES-KOH pH7.2，0.6M蔗糖)上，使用MLA-55转子(Beckman Coulter)于4℃下对151300g离心30分钟。将可溶性蛋白与一倍体积的2×样品缓冲液(Schulz-Raffelt et al.,2007)或2×LDS样品缓冲液(Invitrogen)混合，并在95℃下加热5分钟或在70℃下加热10分钟，然后上样至8％SDS-聚丙烯酰胺凝胶。使用纯化的肽抗体(www.proteogenix-antibody.com)，通过ECL(SuperSignal West PicoChemiluminescent Substrate,Thermo Scientific)进行Western blot 1:45h以检测DYRKP-1的表达。对在氮饥饿动力学期间取得的蛋白质样品进行如下处理：在使用前，将平均相当于1.2mm³总细胞体积的细胞沉淀物储存在-80℃。在每个时间点的总蛋白的两个重复样品，在含有50mM Tris pH 8、10mM EDTA和2％SDS的70μL缓冲液中在室温下提取30分钟，随后进行2分钟低温离心。用二辛可宁酸(Pierce BCA Protein Assay kit,ThermoScientific)通过比色测量来分析2μL蛋白质提取物以定量蛋白质浓度。对于免疫斑点分析，将10-12μg总蛋白提取物在10％SDS-聚丙烯酰胺凝胶上进行分离，随后转移到BioTrace^TM NT硝酸纤维素膜(Pall Life Sciences,http://www.pall.com)，并使用抗AtpB、RbcL、CytF、PsbD(D2)(Agrisera)和HSP70B(Schroda et al.,1999)的抗体通过免疫装饰来进行分析。通过用与作为载体蛋白(www.proteogenix-antibody.com)的KLH(钥孔血蓝蛋白)缀合的两种合成肽(DGMDDPGYSRKEVPNP-cys和PAVNHEDVELFRN-cys)免疫的两种兔来获得DYRKP抗体。

淀粉和叶绿素的测量

根据Chochois等人(2010)方法测量淀粉含量和叶绿素含量。收集1mL培养物，将约20000g的培养物离心10分钟，随后使之重悬于1mL甲醇中以提取叶绿素，随后储存在－80℃下。对沉淀物进行干燥，然后加入400μL水。为了溶解淀粉，将样品在“干循环”设置下进行高压灭菌。随后，通过加入200μL淀粉葡糖苷酶溶液(1U/mL,Roche)并且在55℃下孵育1-2小时来使淀粉降解为葡萄糖。使用自动糖分析仪(Ysi model 2700select,Yellow springs,OH,USA)测定葡萄糖浓度。用甲醇提取叶绿素，并使用UV-VIS分光光度计(SAFAS UVmc2使用SP2000软件)测量653nm、666nm和750nm处的吸光度来确定叶绿素a和叶绿素b。

定量油类含量

通过将1000g培养无于4℃下离心2分钟来收获莱茵衣藻细胞(相当于2mm³总细胞体积)。将细胞在－80℃下立即冷冻，或在热异丙醇中猝灭以立即提取脂质。使用己烷和异丙醇的混合物提取总细胞脂质(Li-Beisson et al.,2010)。收集含有总细胞脂质的有机溶剂相并在氮气流下干燥，然后使之重悬于200μL氯仿:甲醇(2:1，v/v)中。三酰基甘油(TAG)首先在薄层色谱上从其它脂类种中分离出来，用溶于8％H₃PO₄的2％CuSO₄水溶液炭化，然后在与C17:0TAG标准品生成的标准曲线比较后，基于密度计法计算TAG含量(Siaut et al.,2011)。

叶绿素荧光

使用Dual Pam-100(Heinz Walz)测量叶绿素荧光。于室温下，将样品置于恒定搅拌的比色杯中，并且在测量前进行暗适应5-10分钟。通过15至715μmol/m²s PAR范围内的10个光照步骤来记录光曲线，在饱和光脉冲后保持每个光强度30秒以测量Fm'。根据先前所描述的方法计算ETR(Rumeau et al.,2005)。

生物质测定

为了测定培养物的生物质累积，在每个时间点，将三个5mL样品滴在一次性铝盘(VWR,Ref.611-0739和-0741)上的玻璃纤维过滤器上，并在80℃的烘箱中干燥过夜。采用同样方式处理培养基的三个10mL样品。在加入细胞之前和之后称重滤纸，并减去培养基的平均值。

显微镜检查

对于光学显微镜检查，使用Leica DMRXA显微镜(Leica Microsystems,Germany)。如果需要，在培养基中用0.25％戊二醛固定细胞。使用Neubauer室以便容易地比较细胞浓度。使用Spot Insight 4软件(Diagnostic Instruments Inc.,Sterling Heights,USA；www.spotimaging.com)来捕获图像。

结果

淀粉降解std1突变体的鉴定和遗传表征

对用巴龙霉素(AphVIII)抗性盒转化的野生型莱茵衣藻(C.reinhardtii)菌株CC125产生的DNA插入文库进行筛选，预先分离了几种影响淀粉降解的突变体(Chochois etal.,2010)。这些突变体之一，名为std1(淀粉降解1)，与其野生型祖细胞相比，在黑暗中表现出更慢的淀粉降解速率(图1A)。Southern印迹分析表明单一的巴龙霉素盒整合到突变体基因组中(图2A)。对DNA侧翼区的测序表明AphVIII盒插入基因的第三外显子内，该基因注释为双特异性酪氨酸磷酸化蛋白激酶DYRK2(衣藻Chlamydomonas基因组第4.0版)，并且在此重命名为DYRKP-1(图1B)。通过对RT-PCR产生的三个重叠cDNA片段进行测序来确认衣藻(Chlamydomonas)DYRKP-1基因模型(图1B)。衣藻(Chlamydomonas)DYRKP-1由14个外显子和13个内含子组成，编码区含有3834个核苷酸。对于基因模型Cre07.g337300(Phytozomev9.0)，起始密码子位于上游第51个核苷酸。使用含有由psaD启动子驱动的野生型DYRKP-1基因组序列的构建体对std1突变体进行补充(图2B)。对两个独立的补充的菌株std1::STD1 1和std1::STD1 2进行分离，表明发现STD1基因表达水平和Std1蛋白量略低于野生型祖细胞(图1C、图1D)。对N缺乏或S缺乏做出响应时，补充的株系和野生型祖细胞中均观察到相似的淀粉累积和降解动力学模式(图2C)。RNA印迹(Northern blot)分析显示在N缺乏1天后，强烈诱导了DYRKP-1转录物，该转录水平在缺乏3天后保持在高水平(图1E)。注意到，虽然在补充的株系中DYRKP-1基因表达由组成型PSAD启动子驱动，但是在对N缺乏做出响应时，DYRKP-1转录物的累积与野生型细胞以相同方式增加，这就表明DYRKP-1基因表达的调节是转录后水平的调节。

衣藻(Chlamydomonas)DYRKP-1/STD1是新的植物特异性DYRK蛋白家族群的成员

DYRK基因家族的系统进化分析能够区分四个不同的分支：先前描述的DYRK1、DYRK2和Yak亚家族，以及新的DYRK群，该新的DYRK群被命名为DYRKP(即Plant DYRK)，仅包括绿色谱系(植物、苔藓和藻类)的成员，其中，包括衣藻(Chlamydomonas)DYRKP-1/STD1(图3A)。虽然藻类基因组只有DYRKP组的一个成员，苔藓和高等植物具有两到六个植物样同源物。有趣的是，植物和藻类基因组含有Yak同源物，而没有DYRK1同源物(Han et al.,2012)，仅在藻类和苔藓中鉴定出DYRK2同源物，而在高等植物中未鉴定出。DYRK激酶表现出保守的序列特征，特别是在保守催化结构域前的DYRK同源(DH)-框(图3B)。DYRK1亚群和DYRK2亚群的共有序列是NxGYDD(D/E)(N/R)xDY，略微不同于Yak群(图3B)。新鉴定的DYRKP群的DH-框显示出改变的模体：(N/H)(R/K)TGFEExK(D/E/N)(F/L)。

在光合自养条件下，std1在营养缺乏下，显示出储备累积的强烈增加和更强的光合活性

在不同的生长条件下(兼养和光合自养)对氮缺乏的影响进行研究，已知的是，上述不同的生长条件对细胞内能量状态和储备化合物如淀粉(Ral et al.,2006)或TAG(Goodson et al.,2011)的累积具有不同的影响。在兼养条件下(乙酸盐/酯和光均存在)，观察到，WT和std1突变体中的淀粉累积对N缺乏的响应没有差异(图4A)，但是在饥饿1至3天后，在突变体中观察到油类含量的增加(图4B)。在完全光合自养条件下，与WT和两种补充的株系相比，在std1中观察到更高的且持续的淀粉累积(图4B)，在饥饿3天后突变体中油类含量增加(图4B)。当在光自养条件下以较低的通量率(35μmol光子/m²s)进行N缺乏时，WT和补充的突变株系仅累积低水平淀粉，而std1突变体累积高淀粉量(图5A至图5D)。在对硫(sulfur)缺乏做出响应时，std 1中也观察到较高的淀粉累积(图5E至图5H)。在对硫(sulphur)缺乏时，具有相同的响应结果相同(数据未显示)。由叶绿素荧光测量确定的光合电子传输速率(ETR)显示在兼养下进行N缺乏时，std1和对照菌株出现平行下降(图4C，左侧图)。相比之下，当在光自养条件下进行N缺乏时，与对照菌株相比，std1中ETR的下降较不明显(图4C，右侧图)。总之，这些数据显示，取决于细胞内能量状态，std1与对照菌株相比对营养缺乏产生累积更多的储备化合物并维持更高的光合活性的响应。主要光合成分的免疫检测表明：与野生型祖细胞相比，std1中PSII、PSI、细胞色素b6f、ATP酶和Rubisco亚基的减少相似(图4D)。有趣的是，线粒体替代氧化酶(AOX)在突变体中比WT中丰富得多(图4D)，表明突变体中氧化还原失衡。

自养氮缺乏期间std1突变体中增加的生物质产量

根据N缺乏的培养基中培养3天和10天后收获的细胞沉淀物量，观察到std1中生物质产量的强烈增长(图6A)。需注意的是，虽然野生型和补充的株系以直径为约6-7μm的单细胞颗粒来计数，std1突变体由母细胞壁包围的2、4和8个细胞的聚集体组成，并且以直径为10-20μm的颗粒来测量(图7)。在几种莱茵衣藻(C.reinhardtii)突变体中先前描述的这种表型特征被称为四集藻型(Harris,2009)。尽管细胞聚集，但是在N充足条件下野生型和突变体培养物中总细胞体积相似(图6B)。在对氮缺乏的响应中，在野生型和补充的培养物中，总细胞体积仅产生轻微变化，但在std1中强烈增加(图6B)。当在兼养条件下进行氮缺乏(TAP-N)时，std1突变体显示出与野生型细胞相似的行为(图8)。以干重计，在N缺乏6天后，野生型和补充的株系生物质增加至1.7倍，而std1中增加至3倍多(图6C)。为了确认在std1中观察到的生物质和淀粉产量的惊人增长，使用作为恒浊器操作的1L光生物反应器在更多的控制条件下进行额外的实验(图9)。在这些实验中，通过添加新鲜培养基使细胞生物质维持在恒定水平(通过OD_880nm监测)，从而得以测量稀释率和生物质产率。在t0时，用不含N的基础培养基替代N充足基础培养基来进行稀释，从而引起培养基的氨含量降低，该氨含量在45小时后完全耗尽(图9A)。此时，WT的生物质产率开始逐渐下降，并且在72h后完全停止。形成鲜明对比的是，std1的生物质产率增加(从45h到65h)，然后开始逐渐减少，在72h时生物质产率仍然高于WT的初始产率。这些实验证明，在光自养条件下经受N缺乏时，std1与对照菌株相比生产更多的淀粉和生物质。

讨论

在本文中，我们报道了对受DYRK激酶同源物影响的特定于绿色谱系std1突变体的表征，该DYRK激酶同源物属于新的亚群(称为DYRKP)。std1突变体，目前为止报道的第一个绿色谱系的DYRK突变体，对营养缺乏产生累积高细胞内淀粉和油类量、持续的光合活性的响应。

DYRK激酶对生物质和储备累积的控制

如在不同营养条件(兼养与光合自养)中进行的实验所示，除了营养状态之外，细胞能量状态对突变体中淀粉和油类累积的控制中起着核心作用。在兼养条件(经照射的细胞在含乙酸盐/酯的培养基中生长)下，能量状态高时，WT对N缺乏产生累积高淀粉水平的响应，但在std1中未观察到淀粉增加。需注意，在这些条件下，在突变体中观察到油类含量的增加。而在光自养条件下，WT中的淀粉的累积取决于照射强度(在低强度光下低，而在高强度光下高)。引人注目的是，在std1中淀粉累积对能量状态的依赖消失，突变细胞在不同的营养条件下以不同速率累积相似的淀粉量(图4A和图5A、图5E)。在酵母中，已报道DYRK同源物Yak1控制糖原储存，YAK1基因的缺失会诱导细胞内糖原含量的增加(Wilson et al.,2010)。Yak1将通过磷酸化转录因子Msn2和Hsf1来对葡萄糖缺乏产生控制细胞周期阻滞的响应(Moriya et al.,2001)。最近，已提出Yak1位于调节级联的中心，通过靶向不同的转录因子来控制生长和应激响应(Malcher et al.,2011)。关于酵母Yak1突变体，std1对营养缺乏产生增加的储备和生物质产量的响应表明停止生长和储备累积所需的信号没有被正确地觉察或转移。在酵母中，Yak1是在PKA和TOR途径的交集中的转录因子(如Sfp1和Msn2/4)之外中的一种(Rohde等人，2008)。需要进一步研究来阐明衣藻(Chlamydomonas)和高等植物的DYRKP在多大程度上参与TOR和cAMP-PKA信号级联。

std1中光合作用反馈调节的损失

在微藻中，光合活性的下降是一般细胞对营养缺乏响应的一部分，其有助于维持光合作用产生还原力与将其用于代谢目的的能力之间的平衡(Grossman,2000)。据报道，由于不能下调光合作用而导致活性氧(ROS)过量生产损伤PSII中心，sac1突变体(Sacclimation响应缺陷)在光照下，S缺乏两天时死亡。(Davies et al.,1996；Wykoff etal.,1998)。相比之下，std1突变体表现与对照菌株中所观察到的相似的光合复合物的减少(图4D)，但其光合活性虽然降低，但仍然高于在光合自养条件下的对照菌株(图4C和图5B、图5F)。同样地，std1突变体与对照株系相比累积更多的储备化合物。因此，本发明人提出，在std1中发生的显著的淀粉累积起到下沉的作用，降低光合作用所产生的能量，因而降低了光合作用的反馈抑制。代谢物分析研究表明，在高等植物中存在淀粉生物质产量的负相关性(Sulpice et al.,2009)。在营养限制的条件下，这种负相关性在std1突变体中消失，其中至少在营养短缺条件下，观察到平行淀粉和生物质产量。

生物技术影响

在营养缺乏条件下控制生长和储备累积的负调节物的发现对微藻具有生物技术上的重要意义。实际上，这些单细胞微生物越来越被认为是用于下一代生物燃料生产的有前景的生物质原料。与高等植物相比，微藻的主要优点之一是它们累积大量淀粉或脂类的能力，这些化合物可分别转化为生物乙醇或生物柴油。然而，技术经济分析表明，需要增加储备化合物的产率以实现经济可行性。

实施例2：关于STD 1突变体的表征的其它信息

实施例1描述了在std1突变体中长时间氮饥饿后油类和淀粉的大量累积。为了详细分析在形成碳储备中突变基因DYRK与观察到表型之间的分子机制，对std1突变体的可比较的转录组、可定量的蛋白质组以及脂质组学进行分析，并与野生型背景137AH菌株进行比较。

结果

突变体std1过度累积氧化的MGDG

在实施例1中，本发明人观察到在长时间氮饥饿后，std1突变体中过度累积三酰基甘油(TAG，油脂)(图4B)。为了获得突变体中整体脂质组变化的完整图片，基于薄层色谱(TLC)定量脂类，并使用现有技术中LC-MS/MS来比较脂质分子种类的变化。首先，基于TLC对每种脂类进行定量。如图10A所示，除了存在于所有菌株中的经典极性脂类(即MGDG、DGDG、DGTS、PG、PE)之外，仅在突变体std1的TLC板上检测到MGDG下方的新条带(由箭头指出)。通过用氯仿和甲醇(2:1)的混合物进行洗脱来回收存在于条带中的脂类，随后通过LC-MS/MS进行鉴定。质谱分析显示存在氧化的MGDG34与具有不同不饱和程度的C16和C18脂肪酸的组合的混合物。质谱分析显示存在氧化的MGDG34与具有不同水平不饱和度的C16和C18脂肪酸的组合的混合物。图10B中示出了氧化的MGDG34:x分子种类之一的质谱鉴定。

然后进一步检查与WT相比，这些氧化的MGDG在突变体细胞中的相对量，同样在氮饥饿时以时间依赖的方式。每天收获一次对数期生长中期的细胞，持续5天，并通过己烷和热异丙醇的方法提取总细胞脂类。然后通过现有技术中qTOF UPLC-MS/MS对总脂类提取物进行脂质组学分析。为了检测极性膜脂类和中性脂类，对样品分别进行阳性分析和阴性分析。如图11所示，除了DGTS外，所有其他细胞脂质在WT、std1突变体和两种补充的菌株(分别命名为C2和C7)之间没有观察到显著差异。在长时间氮饥饿后观察到显著的TAG累积，这证实了先前基于TLC所进行的分析。由于尚未知晓的原因，在响应氮饥饿时，DGTS水平在std1突变体中保持恒定，然而在WT显著增加。

在莱茵衣藻(Chlamydonomas reinhardtii)的细胞中存在基态水平的氧化的MDG，其在WT响应氮饥饿时保持不变(图12A)。在营养充足的条件下，与野生型细胞相比，std1突变体响应氮饥饿时已经累积超过两倍的氧化MGDG，甚至以时间依赖的方式进一步显著增加(高达高于18倍)。主要的氧化的MGDG物质包括C16和C18物质，并且这些氧化物(oxylin)的详细结构目前正在实验室研究中(图12B)。

总的来说，氢过氧化物MGDG的更高累积/合成表明编码催化或调节脂类氧化反应的蛋白的基因的潜在失调。脂质氧化是所有生物系统中的常见代谢反应。该反应主要由称为脂氧合酶的蛋白(LOX:EC:1.13.11.12)来催化。脂氧合酶属于含有非血红素铁的双加氧酶家族。LOX催化分子氧至多不饱和脂肪酸链的立体定向位置的插入。LOX广泛存在于植物、哺乳动物、珊瑚、苔藓、真菌以及许多细菌和微藻中。

std1突变体中CreLOX1在转录组水平以及蛋白质组水平上均上调

为了更好地了解涉及STD1蛋白的潜在调控网络，基于Illumina RNA-seq测序技术(Genoscope)进行比较转录组研究。转录组数据集的初步分析揭示了在光自养条件下，与WT细胞相比，CreLOX1转录物增加超过6的对数倍数(LogFC)(表2)。基于¹⁵N/¹⁴N标记的定量蛋白质组分析显示出，与WT相比，在突变体中的CreLOX1蛋白显著增加(高达30logFC)(表2)。通过在SDS-PAGE上观察到增加的信号(～110kDa)进一步证实了突变体细胞中CreLOX1蛋白量的大量增长。回收该条带并经鉴定，其确实主要包含CreLOX1蛋白(图13和表3)。

源自这些脂肪酸氧化反应的产物统称为脂氧化物(oxylipin)，其在许多生物过程中是亲脂性信号分子。基于用已知拟南芥脂氧合酶作为诱饵的蛋白质同源性搜索，仅一个推定的同源物(CreLOX1)在莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)(第5版)的基因组中编码。编码该推定的CreLOX1的基因座是Cre12.g512300(植物基因组数据库，phytozome，第5版)。CreLOX1蛋白具有118kDa的理论分子量，并且含有与其所有高等植物同源物相似的两个脂氧合酶结构域。使用在线ChloroP软件预测CreLOX1在其N-末端携带65个氨基酸长的叶绿体转运肽(cTP)。这与以下观点一致：隐藏的拟南芥属同源物是质体局部化的AtLOX5。

表2衣藻突变体std1中CreLOX 1在转录和蛋白水平上都上调。利用转录组和蛋白质组方法进行的两项大规模研究揭示了std 1突变体细胞中，脂氧合酶1的上调。使用Illumina技术(Genoscope)通过RNA测序获得转录组数据集。在100μE/m²s下，使野生型和std1突变体细胞在基础培养基和2％CO₂的空气中，于标准自养条件下以三份预培养物的形式生长，上述预培养物在收获前进行合并。对于定量蛋白质组分析，对于每种菌株，使野生型细胞和突变体细胞在自养条件下以4个重复(2个复制在含有¹⁴N的基础培养基中，2个重复在含有¹⁵N铵盐的基础培养基中以对代谢进行全面标记)生长。对细胞进行离心、洗涤，并使之重悬于MM-N培养基中，并在氮缺乏24小时后收获。在蛋白质提取之前，将¹⁴N-标记的野生型细胞与¹⁵N-标记的std1的细胞组合，反之亦然，从而供给4个生物学重复。蛋白质结果的Log2倍数变化(logFC)是4个重复的平均值并且相对野生型给出。“Adj.p-值”是针对多重比较调整的p-值。

表3：通过质谱法对图13A高亮条带中的蛋白质的鉴定。根据每种菌株的次序(rk)，列出了前5种鉴定的蛋白质。示出了蛋白质的评分和覆盖度以及所鉴定的肽的数量，其也对对应于特异性肽。值“emPAI”和观察到的总(特异性)光谱数(“光谱计数”；相关的和重复的)可用于评估一个样品中蛋白质的相对丰度，其中，值“emPAI”是指“指数修正的蛋白丰度指数”。

LOX抑制剂阻止碳储备(脂质和淀粉)形成

基于目前的结果，本发明人假设激酶STD1用作LOX1蛋白的负调节剂。实际上，脂氧合酶，脂氧化物的产物是在许多发育和应激响应信号网络中发挥作用的大量信号分子的前体。使用儿茶酚(Sigma Cat#452637)来验证该假设。儿茶酚是已知的脂氧合酶抑制剂，其通过猝灭细胞活性氧类物质来抑制脂氧合酶的活性。最初测试了两种不同的儿茶酚浓度(5mM和10mM)。在5mM儿茶酚的存在下，在氮饥饿6天后，std1突变体中TAG和淀粉累积均被抑制(图14)。儿茶酚同样也抑制了WT菌株对氮饥饿响应的TAG累积，但没有观察到对淀粉累积的影响。对其他条件也进行了测试。

从上文可以看出，std1突变体中STD1的失活引起LOX1的上调，从而引起淀粉和TAG累积涉及的脂氧化物家族的形成，通过阻止淀粉和TAG累积的儿茶酚抑制LOX活性。

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序列表

<110> 原子能和替代能源委员会

<120> 缺少功能性DYRKP-1基因的绿色微藻在增加原料产量中的应用

<130> VMA/sf-F263/604PCT

<150> EP14305673.7

<151> 2014-05-07

<160> 17

<170> PatentIn 3.5版

<210> 1

<211> 1278

<212> PRT

<213> 莱茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii）

<400> 1

Met Ser Ala Thr Gly Gly Gln Ser Glu Gly His Val Ala Pro Pro Glu

1 5 10 15

Pro Met Ser Leu Asp Thr Leu Asn Phe Val Val Asn Phe Leu His Ser

20 25 30

Ser Gly Phe His Lys Ala His Ser Ala Leu Leu Gln Glu Phe Ser Thr

35 40 45

Arg Leu Asn Pro Thr Ala Glu Gly Ala Leu Phe Ala Ala Ala Arg Thr

50 55 60

Ser Val Ser Ala Cys Ser Ala Pro Pro Ser Thr Ser Glu Tyr Val Glu

65 70 75 80

Arg Ala Leu Glu Ala Leu Ser Pro Pro Arg Ser Lys Ser Ala Gln Ala

85 90 95

Gly Pro Ser Trp Glu Gly Phe Pro Gly Pro Ala Ala Gln Pro Lys Ala

100 105 110

Gln Ser Thr Ala Gly Ala Val Glu Ser Ala Pro Ala Pro Ala Pro Pro

115 120 125

Pro Pro Ser Lys Pro Ala Thr Pro Val Ser Pro Pro Thr Thr Ala Pro

130 135 140

Val Thr Arg Ala Lys Arg Arg Gln Ser Arg Pro Ser Ala Thr Arg Gln

145 150 155 160

Arg Pro Ala Trp Asp Gly Glu Val Asp Asp Tyr Asp Gly Met Asp Asp

165 170 175

Pro Gly Tyr Ser Arg Lys Glu Val Pro Asn Pro Ser Arg Phe Ala Glu

180 185 190

Ile Glu Leu Asp Ala Ala Ser Gly Asp Glu Gly Ser Glu Arg Gln Tyr

195 200 205

Phe Met His Gln Pro Gly Asp Leu Asn Tyr Asp Asp Ile Glu Ser Glu

210 215 220

Val Ser Ala Ser Asp Leu Glu Gly Ile Thr Ala Ala Ser Ser Val Gln

225 230 235 240

Ser Gly Asn Tyr Thr Gly Gly Asp Thr His Asp Glu Thr Trp Asp Phe

245 250 255

Gly Pro Ile Asp Ile Lys Phe Ala Glu Pro Val Ser Thr Pro Ser Lys

260 265 270

Ser Pro Glu Lys Gln Glu Ala Glu Glu Arg Arg Pro Val Leu Ser Arg

275 280 285

Val Glu Ser Leu Ser Ser Ser Phe Lys Asp Phe Glu Met Glu Arg Gly

290 295 300

Phe Glu Ala Asp Gly Glu Gly Gly Gly Gln Ile Ser Ser Lys Val Ser

305 310 315 320

Glu Ala Glu Tyr Ala Ala Asp Pro Glu Val Ile Asp Phe Pro Val Pro

325 330 335

Val Pro Ala Val Asn His Glu Asp Val Glu Leu Phe Arg Asn Gln Arg

340 345 350

Arg Pro Ser Pro Thr Ser Ser Met Asp Val Ala Ala Gly Ser Leu Ala

355 360 365

Pro Ser Val Ala Pro Ser Glu Gln Gln Pro Ser Glu Ser Thr Gly Ser

370 375 380

Gln Glu Arg Gln Arg Lys Gly Thr Gly Lys Ser Thr Ser Leu Leu Lys

385 390 395 400

Ser Leu Ala Gly Arg Ser Ala Asp Ala Arg Asp Gly Ala Gly Leu Thr

405 410 415

Leu Gly Ser Ser Ala Leu Ser Ser Gly Gly Ala Ser Ser Ser Ala Ala

420 425 430

Arg Pro Ser Ala Pro Thr Val Gly Thr Gly Gly Ala Ala Ser Gly Gly

435 440 445

Gly Gly Phe Gly Gly Gly Gly Phe Gly Gly Gly Gly Phe Gly Gly Gly

450 455 460

Phe Ser Phe Pro Val Thr Pro Pro Thr Ala Asp Glu Pro Asp Gln Arg

465 470 475 480

Leu Phe Thr Ser Trp Pro Ser Val Arg Ser Ser Cys Thr Ser Glu Pro

485 490 495

Val Ala Met Ser Asp Asp Asp Asn Ala Leu Pro Ala Glu Tyr Ala Asp

500 505 510

Asp Glu Tyr Ser Lys Tyr Arg Leu Ser Ser Arg Ser Thr Ser Met Ala

515 520 525

Ala Gln Asp Leu Pro Glu Gln Arg Lys Thr Ala Asp Gly Glu Thr Ser

530 535 540

Gly Thr Leu Ala Ser Pro Asp Gly Asn Ser Ala Ala Gly Ser Gly Thr

545 550 555 560

Ala Arg Gln Ala Gly Ala Gly Ala Pro Ala Ala Asp Ala Ala Ala Asp

565 570 575

Leu Asp Phe Ser Leu Glu Trp Glu Phe Arg Pro Pro Leu Ser His Glu

580 585 590

Ser Arg Glu Pro Ser Leu Glu Phe Ser Thr Ala Asn Thr Asp Asp Glu

595 600 605

Gly Leu Gly Thr Pro Lys Ala Val Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala

610 615 620

Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Asn Glu Val Ser Ala Val Leu Thr

625 630 635 640

Leu Glu Pro Thr Pro Ser Ala Ser Ala Gly Val Ala Ala Ala Ala Ala

645 650 655

Pro Ala Pro Ala Ala Gly Ser Gly Pro Gly Gln Glu Pro Glu Val Glu

660 665 670

Gly Gly Asp Val Leu Asp Thr His Asn Gly Ser Val Thr Leu Ala Gly

675 680 685

Glu Val Glu Ala Ala Ala Ala Gln Leu Val Gln Leu Met Pro Gln Leu

690 695 700

Ala Leu Ile Asp Asp Ala Asp Ala Gly Ser Lys Pro Gly Thr Pro Val

705 710 715 720

Asp Ala Leu Glu Arg Lys Asp Ser Ser Gln Val Val Ala His Arg Ile

725 730 735

Asn Phe Glu Ser Glu Asp Leu His Asp Ala His Ser His Asp Gly Gly

740 745 750

Ala Ser Val His Ser Ala Pro His Ile Gly Ala Ala Ala Glu Ala Val

755 760 765

Pro Glu Pro Leu His Glu His Glu His Glu Arg Asp Asp Gln Ser Ser

770 775 780

Ile Ser Ala Ala Ile Ala Ala Val Glu Val Ala Ala Glu Ala Asp Asp

785 790 795 800

Glu Asp Thr Asp Leu Gly Glu Asp Gly Val Ala Ala Ala Ala Ser Phe

805 810 815

Ser Glu Pro Ala Ser Tyr Asp Ala Asp Asp Ala Asp Val Asp Glu Pro

820 825 830

Glu Pro Leu Ser Gly Leu Ala Asp Asp Glu Glu Arg Leu Gly Gly Asp

835 840 845

Glu Asp Asp Asp Glu Asp Asp Glu Asp Asp Glu Asp Glu Asp Glu Glu

850 855 860

Asp Glu Ala Gly Arg Arg Ser Ser Gly Gly Val Val Gly Val Gly Ala

865 870 875 880

Gly Gly Glu Trp Gly Asp Glu Gln His Leu Arg Ala Pro Asp Ala Lys

885 890 895

Asp Ile Ala Arg Ala Arg Pro Glu Ser Ser Leu Thr Pro Arg Tyr His

900 905 910

Met Asp Glu Gln Gly Asn Val Leu Tyr Glu Tyr Asp Pro Asp Tyr Ile

915 920 925

Asp Arg Lys Tyr Glu Val Phe Glu Leu Arg Val Ile His Arg Arg His

930 935 940

Arg Thr Gly Phe Glu Glu Thr Lys Asp Phe Pro Ile Arg Leu Asn Asp

945 950 955 960

Leu Ile Ala Gly Arg Tyr Gln Val Met Asp Phe Leu Gly Ser Ala Ala

965 970 975

Phe Ser Arg Ala Val Gln Ala Leu Asp Ile Lys Thr Gly Gln Leu Val

980 985 990

Cys Leu Lys Ile Ile Lys Asn His Lys Asp Tyr Phe Asp Gln Ser Leu

995 1000 1005

Asp Glu Ile Lys Leu Leu Lys Tyr Val Asn Thr Met Asp Pro Asn

1010 1015 1020

Asp Glu Tyr Ala Ile Val Arg Leu Tyr Asp Phe Phe Tyr Tyr Lys

1025 1030 1035

Glu His Leu Phe Leu Val Cys Glu Leu Leu Arg Ala Asn Leu Tyr

1040 1045 1050

Glu Phe Gln Lys Tyr Asn Lys Glu Ser Gly Asp Pro Ala Tyr Phe

1055 1060 1065

Thr Asn Ala Arg Ile Gln Arg Ile Ala Arg Gln Ala Leu Arg Ser

1070 1075 1080

Leu Ala Phe Leu His Ser Leu Gly Leu Ile His Ser Asp Leu Lys

1085 1090 1095

Pro Glu Asn Ile Leu Ile Lys Ser Tyr Ser Arg Cys Glu Val Lys

1100 1105 1110

Val Ile Asp Leu Gly Ser Ser Cys Phe Ile Thr Asp Gln Leu Ser

1115 1120 1125

Ser Tyr Val Gln Ser Arg Ser Tyr Arg Ala Pro Glu Val Ile Leu

1130 1135 1140

Gly Leu Pro Tyr Asp Tyr Lys Val Asp Val Trp Ser Leu Gly Cys

1145 1150 1155

Ile Leu Ala Glu Leu Ser Ser Ser Phe Val Leu Phe Gln Asn Asp

1160 1165 1170

Ser Leu Ser Thr Leu Leu Ala Arg Leu Glu Gly Ile Leu Gly Pro

1175 1180 1185

Val Pro Glu Trp Met Leu His Lys Gly Arg Tyr Ala His Arg Phe

1190 1195 1200

Tyr Thr Arg Ser Gly Met Leu Tyr Glu Arg Asn Ala Thr Thr Gln

1205 1210 1215

Lys Tyr Asp Met Leu Gln Pro Lys Arg Thr Ser Leu Arg His Arg

1220 1225 1230

Met Pro Asp Ala Asp Glu Gly Leu Leu Glu Phe Val Gly His Leu

1235 1240 1245

Leu Thr Val Asp Pro Arg Lys Arg Pro Thr Ala Ala Glu Ala Leu

1250 1255 1260

Lys His Pro Trp Leu Gln Gln Glu Tyr Pro Ser Leu Asp Ser Met

1265 1270 1275

<210> 2

<211> 5200

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 包括5' UTR和3' UTR的DYRKP-1 cDNA序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (165)..(167)

<223> 起始密码子 : nt n, n+3

<220>

<221> misc_feature

<222> (3999)..(4001)

<223> 终止密码子 : nt m, m+3

<400> 2

gtattcaata accacaggta ccttacttac cagacttgct atcacggtcc tcgttgacct 60

ctgaagtcgt cgagatggtt gtgcctgaac ctagttggcc aaggctcgtt tgagaggggc 120

ttgccatagt gctcagcagg ggacaaggcc cgcaagtggt caaaatgtca gcaacggggg 180

gccaaagtga gggccatgtc gctccgcctg aaccgatgtc gctggatacg cttaattttg 240

tcgtgaactt tctccattcg tccgggtttc acaaggcgca cagcgcactg ctccaggagt 300

tcagcacgcg gctgaacccc accgcggaag gagcgctctt cgcagctgcg cgaacttcgg 360

tcagcgcttg ttccgctcca ccttccacgt cggagtatgt ggagcgtgcg ctggaggctc 420

tatctcctcc tcgcagcaag tctgcgcagg cgggaccgag ctgggaagga tttccgggac 480

cggcagcgca gccaaaggcg cagtccacag ctggtgcagt tgaaagtgcg ccagctcccg 540

ccccgccacc gcccagcaag ccagctacgc ctgtcagccc tccgactacg gctcctgtaa 600

cacgtgctaa acgtcgacaa tccaggccct cggctacccg gcaacgacct gcctgggacg 660

gagaggtgga tgactacgat ggcatggacg acccgggcta tagccggaag gaggtgccga 720

acccgtcgcg cttcgcggag attgagctcg acgctgcaag cggcgacgag ggcagcgagc 780

ggcaatactt catgcaccag cccggcgacc tcaactatga tgatatcgag tcagaggtgt 840

ccgcctcgga cctggagggc atcaccgcag ccagcagcgt gcagtcgggg aactacacag 900

ggggtgacac gcacgacgaa acctgggact tcggccccat agatatcaag ttcgcggagc 960

cggtcagcac gcccagcaag agcccggaga agcaagaagc ggaggagcgg cggccggtgc 1020

tttcgcgcgt ggagtcgctc agcagctctt ttaaggactt cgagatggag cggggctttg 1080

aggcagacgg cgagggcggg ggccagatct catcaaaggt gtcggaggcg gagtacgcag 1140

cggacccgga ggtgattgac ttccctgtgc cggtgccggc ggtgaaccat gaggacgtgg 1200

agctgttccg caaccagcgg cggcccagcc ccacgtcctc catggacgtg gccgccggct 1260

cgctggcgcc gtccgtagca ccctcggagc agcagccttc cgaaagcacg ggcagtcagg 1320

agcggcagcg caagggcacg ggcaagagca cttcgctgct caagtcgctg gccgggcggt 1380

cagcggacgc tcgcgacggt gccggcctga cgctgggtag cagcgcgctc agcagcggtg 1440

gcgccagtag ctctgcggcg cgacccagcg cacccacggt aggcaccggc ggcgccgctt 1500

ccggtggtgg cgggttcggc ggtggcggct ttggcggcgg cggctttggc ggcggcttca 1560

gcttcccggt gacgccgccc acggcggatg agccagacca gcggctgttc acgtcgtggc 1620

cttccgtccg cagcagctgt acgtcagagc cggtggccat gtcggacgac gacaacgcgc 1680

tgccggccga gtacgcggac gacgagtact cgaagtaccg gctcagcagc cgcagcacgt 1740

ccatggcggc gcaggaccta ccggagcagc gcaaaaccgc ggacggcgaa acctctggca 1800

cgcttgccag ccccgatggc aactccgcgg ccgggtcagg cacggcgcgg caggccggcg 1860

ccggcgcgcc tgccgcagac gccgccgcag acctggattt ctcgctggag tgggagttcc 1920

ggccgccgct cagccacgag tcgcgggagc cgtcgctgga gttctccaca gccaacacgg 1980

acgacgaggg gctggggaca cccaaggcgg tcgcggcggc ggcagctgcc gccgccgccg 2040

ccgccgctgc ggcggccgcg aacgaggtca gcgcggtgct cacactggag ccgacaccgt 2100

cggcgtcagc gggtgtggcc gcggcggcgg cgccagcgcc ggccgctggg tccgggccgg 2160

ggcaggagcc ggaggtcgag ggcggcgacg tgctggacac gcacaacggc tcggtgacgc 2220

tggcgggcga ggtggaggcg gcggcggcgc agctggtgca gctgatgccg cagctggcgc 2280

tcatcgacga cgctgacgcc ggcagcaagc cgggcacgcc ggtggacgcg ctggagcgga 2340

aagactcctc ccaagtggtg gcgcaccgca tcaacttcga gtcggaggac ctgcacgacg 2400

cccactccca cgacggcggc gcctccgtgc actccgcgcc gcacatcggc gcggccgcgg 2460

aggccgtgcc cgaacccttg cacgagcacg aacacgagcg cgacgaccag tccagcatca 2520

gcgccgccat cgcggcggtg gaggtcgccg cggaggcgga tgacgaggat acggacctgg 2580

gtgaggatgg cgttgcggca gcggcgtctt tttccgagcc ggcgtcgtac gatgccgatg 2640

acgccgacgt ggatgagccg gagccgctgt cggggctggc ggatgatgag gagcggctgg 2700

gcggcgacga ggatgatgat gaggacgatg aagatgacga ggacgaggac gaggaggacg 2760

aggccgggag acgcagcagc ggcggcgtgg tgggcgttgg cgccggcggc gagtggggcg 2820

acgagcagca cttgcgcgcg ccggacgcca aggacattgc ccgcgcgcgg cccgagtcca 2880

gcctgacgcc ccgctaccac atggacgagc agggcaacgt gctgtacgag tacgaccctg 2940

actacatcga ccgcaagtac gaggtgtttg agctgcgcgt catccaccgc cgccaccgca 3000

ccggcttcga ggagaccaag gacttcccca tccgcctcaa cgacctcata gcgggcaggt 3060

accaggtgat ggacttcctg ggctccgccg ccttcagccg cgcggtacag gcgctggaca 3120

tcaagacggg gcagctggtg tgcctcaaga tcatcaagaa ccacaaagac tactttgacc 3180

agtcgctgga cgagatcaag ctgctcaagt acgtcaacac catggacccc aacgacgagt 3240

acgccatcgt gcgcctgtac gacttcttct actacaagga gcacctgttc ctggtgtgcg 3300

agctgctgcg cgccaacctg tacgagttcc agaagtacaa caaggagtcg ggcgacccgg 3360

cctacttcac caacgcgcgc atccagcgca tcgcgcggca ggcgctgcgc tcgctggcgt 3420

tcctacactc gctggggctg atccactccg acctcaagcc cgagaacata ctcatcaaga 3480

gctacagcag gtgtgaggtc aaggtgattg acctgggctc ctcctgcttc atcacggacc 3540

agctcagcag ctacgtgcag agccgctcct accgcgcgcc ggaggtcatc ctgggtctgc 3600

cctacgacta taaggtggac gtgtggtctc tgggctgcat cctggcggag ctgtccagca 3660

gctttgttct tttccagaac gactcgctgt ccacgctgct ggcgcggctg gagggcattc 3720

tgggccccgt gcccgagtgg atgctgcaca agggccgcta cgcgcaccgc ttctacacgc 3780

gcagcggcat gctgtacgag cgcaacgcca ccacccagaa gtacgacatg ctgcagccca 3840

agcgcacctc gctgcggcac aggatgccgg acgcggacga ggggctgctg gagttcgtgg 3900

gccacctgct gacggtggac ccgcgcaagc gccccaccgc cgccgaggcg ctcaagcacc 3960

cctggctgca gcaggagtac ccctcgctcg acagcatgta ggcgggcggc ggacagtggc 4020

ggccagtggc gcaagcgctg gcgctggggc cgcgctaagg ggtgctgcag cagcaggacc 4080

agcagagcgg aggccggcgg cagaggccgg gatggggccc gcggcagttt caggcagcaa 4140

gcggaaaccg gcaaggcttg acaacaactg ttttgtgggt gggtgggtaa tgcgggcttc 4200

cagagtggac ttcagcattt ggggttctgg ggtcgagggg ctacaggctg gctgctttgg 4260

agaggattgg gcggtcatag gggcacatac gtattgtttg tgcagtcaca ggcggctttc 4320

aggctcgggc gggagaagtt actgcatggc atagtacgca gaggaaggaa taggggcgtg 4380

cattcggagg cgtgcggcag acagcgcggg ctgacgtcaa ccggcggctg tgtgctcgtg 4440

cgcggaaggc ggttctgctg ttgcgcacat gggtcattat cattcgacac gtatcaggcg 4500

acgtcggcac acaatcgagg ccgaggtatt ggcctcccca ccaagcaagg agtcaggaag 4560

ggcccaaaga gatctcacgc gagtgacgtg cgagtcctgt tgcctacctg gtgtgcaagt 4620

tatctacgcc gcatggggac tcccgcggct gtgccgcgtc tgcgcgcgca acattgcaac 4680

ataccggtgc gcacgtttgc acccggtttt tcagatgaag tttgggttca agtgcggggt 4740

agcggctcag cgggtcttcg catctacatg tcctggcgga agagtgcgtg tctggtgtcg 4800

agtcatcgcg ggggcatgcg cagaccgttt gccagggggc tggggccctg cgatgcgaag 4860

gcaacgaaca agtgtgcgtg ggctgggtgt gtgtgtgcat gtgtcagggt gtgcttgcgg 4920

gcgcgctcgt gaatctgtgt tgtgttggtg tatgcatgaa cgcggtggcg tggcagctca 4980

catggtaagt gctgtgtgga ggccctgggc agaatcagcg aagcggtgtg gtgtcattga 5040

aggtcaagct gtgcaaccca gtaacaggga cgaccccgca gggagagggg cgccatggta 5100

gctgggcagg actggggaag gtggcggcat atcactgaga gtatgtagcg cgtcgacagg 5160

gggcaacggc caacacgccg tcgtgtaaca cattacacgc 5200

<210> 3

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> DYRK蛋白

<220>

<221> 变体

<222> (2)..(2)

<223> X = R或K

<220>

<221> 变体

<222> (8)..(8)

<223> X = 任意

<220>

<221> 变体

<222> (10)..(10)

<223> X = D, E或N

<220>

<221> 变体

<222> (11)..(11)

<223> X = F或L

<400> 3

His Xaa Thr Gly Phe Glu Glu Xaa Lys Xaa Xaa

1 5 10

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 4

cgaagcatgg acgatgcgtt 20

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 5

cgagactgcg atcgaacgga ca 22

<210> 6

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 6

ctggtgctgc gcgagctggc ccacgaggag 30

<210> 7

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 7

tggttcgggc cggagtgttc cgcggcgtt 29

<210> 8

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 8

gtctagaatg tcgctccgcc tgaaccgatg 30

<210> 9

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 9

gtctagacta catgctgtcg agcgagg 27

<210> 10

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 10

catagtgctc agcaggggac aaggc 25

<210> 11

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 11

agcgtgccag aggtttcgcc gtc 23

<210> 12

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 12

ccgcggacgg cgaaacctct ggcac 25

<210> 13

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 13

gatctcgtcc agcgactggt caaagtag 28

<210> 14

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 14

gcggatccga cgagcagggc aacgtgctg 29

<210> 15

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 15

cggcaagctt ctacatgctg tcgagcgagg 30

<210> 16

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 16

aatcgtgcgc gacatcaagg agaa 24

<210> 17

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 17

ttggcgatcc acatttgctg gaaggt 26

Claims

1.一种生产生物质原料的方法，所述方法包括以下步骤：

(i)培养绿色微藻细胞，在所述绿色微藻细胞中，序列为SEQ ID No:1的DYRKP-1蛋白的表达和/或活性降低，所述降低通过沉默、敲减、突变和/或干扰DYRKP-1基因来得到或者通过用作特异性抑制剂的化合物抑制DYRKP-1蛋白的活性来得到；以及

(ii)通过在缺陷型培养基中培养所述微藻细胞来通过所述微藻诱导储备的累积和/或生物质产量的增加，其中，所述缺陷型培养基为缺乏选自由氮和硫组成的组中的至少一种元素的培养基。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述微藻缺少功能性DYRKP-1基因。

3.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中，所述微藻是衣藻( Chlamydomonas) 。

4.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述微藻是莱茵衣藻( Chlamydomonas reinhardtii) 。

5.根据权利要求1或2所述的方法，其中，步骤(ii)包括：照射所述微藻细胞。

6.根据权利要求5所述的方法，其中，所述照射在25μmol光子/m²s至2000μmol光子/m²s的强度下进行，每天进行8小时至24小时。

7.根据权利要求5所述的方法，其中，在缺陷型培养基中孵育所述微藻细胞的步骤持续至少24小时。

8.根据权利要求7所述的方法，其中，在缺陷型培养基中孵育所述微藻细胞的步骤持续2天至8天。

9.根据权利要求8所述的方法，其中，在缺陷型培养基中孵育所述微藻细胞的步骤持续3天至6天。

10.根据权利要求1或2所述的方法，其中，步骤(ii)包括：在包括有机碳的培养基中孵育所述微藻细胞。

11.根据权利要求10所述的方法，其中，在步骤(ii)中，在包括乙酸盐/酯的缺陷型培养基中孵育所述微藻细胞2天至6天。

12.根据权利要求1或2所述的方法，其中，步骤(ii)包括：在光合自养条件下孵育所述微藻细胞。

13.根据权利要求12所述的方法，其中，在步骤(ii)中，在光合自养条件下，在缺陷型培养基中孵育所述微藻细胞至少15小时。

14.根据权利要求10或11所述的方法在生产油类物质中的应用。

15.根据权利要求12或13所述的方法在生产生物质中的应用。

16.根据权利要求12或13所述的方法在生产淀粉中的应用。