JP2019503700A - 微細藻類バイオマスのタンパク質濃縮のための方法 - Google Patents

Abstract

本発明は、従属栄養条件下で培養されたクロレラ属の微細藻類、より詳細にはクロレラ・プロトテコイデスのタンパク質濃縮のための方法であって、- N.6.25で表される、50%未満の、好ましくは30%未満の、より好ましくは20〜25%のタンパク質含量を有する微細藻類バイオマスを得るように、アンモニウムの供給を制限することを意図された第1の工程;- 0%超の、好ましくは60%超の、より好ましくは65%超のタンパク質含量を得るように、アンモニウムの供給が発酵培地で増大する第2の工程を含むことを特徴とする、方法に関する。

Description

本発明は、微細藻類バイオマスの、より詳細にはクロレラ(Chlorella)属の、更により詳細にはクロレラ・プロトテコイデス(Chlorella protothecoides)種の、タンパク質濃縮のための方法に関する。

大型藻類及び微細藻類は、特有の豊富さを有し、大部分が未研究のままである。飲食、化学又はバイオエネルギー目的のそれらの利用は、依然として非常にわずかである。しかし、それらは、豊富さ及び存在量の両方に関して、大きな価値がある成分を含有する。

実際に、微細藻類は、ビタミン、脂質、タンパク質、糖、顔料及び抗酸化剤の供給源である。

そのため、藻類及び微細藻類は、工業部門において関心を集めており、それらは、補助食品、機能性食品、化粧品及び医薬を製造するために、又は水産養殖のために使用される。

微細藻類は、光に曝露される全てのバイオトープにコロニー形成する、最初且つ最大の光合成微生物である。

工業規模で、そのモノクローナル培養は、光バイオリアクター中で実施されるか(独立栄養条件:CO₂を用いて、光を受けて)、又は、一部では、それはまた、発酵槽中で実施される(従属栄養条件:炭素源の存在下で、暗所で)。

微細藻類のいくつかの種は、実際に光の非存在下で増殖できる:クロレラ属、ニッチア(Nitzschia)属、キクロテラ(Cyclotella)属、テトラセルミス(Tetraselmis)属、クリプテコディニウム(Crypthecodinium)属、スキゾキトリウム(Schizochytrium)属。

更に、従属栄養条件下における培養は、光栄養条件下より費用が10分の1であると推定されるが、その理由は、当業者にとって、これらの従属栄養条件が以下を可能にするためである:
- 全ての培養パラメータを制御することを可能にする、細菌及び酵母に使用されるものと同一の発酵槽の使用、
- 光ベースの培養によって得られるものよりはるかに多い量のバイオマスの生成。

微細藻類の有益な利用は、一般的には、発酵条件の制御を必要とし、以下のもの等のそれらの目的とする成分を蓄積することが可能になる:
- それらの注目すべき抗酸化剤特性、及び、食品用の天然色素の提供の両方のためにその需要が増加している、顔料(クロロフィルa、b及びc、β-カロテン、アスタキサンチン、ルテイン、フィコシアニン、キサントフィル、フィコエリトリン等)、
- それらの脂肪酸の含量(それらの乾燥固体の質量に対して、最大で60%、若しくは80%)を最適化するための脂質、特に:
・バイオ燃料の適用のための脂質、だけでなく、
・選択された微細藻類が、「必須の」(即ち、ヒト又は動物によって自然に生成されないため、食事によって供給される)多価不飽和脂肪酸若しくはPUFAを生成する場合、ヒトが消費する若しくは動物のえさとなるための食品での適用のための脂質、又は
- その栄養価を最適化するため、若しくは、例えば、目的のアミノ酸の供給を促進するためのタンパク質。

目的のアミノ酸を供給する状況において、アルギニン及びグルタメートに富む利用可能なタンパク質源を有することが実際に有利であり得る。

アルギニンは、動物界において多くの機能を有するアミノ酸である。

アルギニンは、分解され得、そのため、それを吸収する細胞のためのエネルギー、炭素及び窒素の供給源として役に立ち得る。

哺乳動物を含む様々な動物において、アルギニンは、オルニチン及び尿素に分解される。後者は、動物有機体の細胞中に存在する窒素化合物の量を調節するように(尿の排泄を介して)除去できる窒素分子である。

アルギニンは、一酸化窒素(NO)合成酵素を介するNOの合成を可能にし、そのため動脈の血管拡張に関与し、それにより、血管の硬直は低減、血流は増加し、そのため血管の機能は向上する。

アルギニンを含有する補助食品は、心臓の健康、血管の機能を促進するため、「血小板凝集」(血塊の形成のリスク)を防ぐため、及び動脈圧を低下させるために推奨される。

創傷の治癒におけるアルギニンの関与は、コラーゲン合成で別の重要なアミノ酸であるプロリンの形成におけるその役割に関連している。

最後に、アルギニンは、特にスポーツをする人によって、エナジードリンク中で頻繁に使用される成分である。

グルタミン酸に関して、それは、タンパク質合成に使用される基礎材料(elementary brick)の1つであるだけでなく、中枢神経系(脳髄+脊髄)で最も広範囲にわたる興奮性神経伝達物質でもあり、GABA作動性ニューロン中のGABA前駆体である。

コードE620下で、グルタメートは、食品中の風味増強剤として使用される。それは、それらの味を増強するために食品調製物に添加される。

グルタメートの他に、国際食品規格委員会はまた、風味増強剤として、そのナトリウム塩(E621)、カリウム塩(E622)、カルシウム塩(E623)、アンモニウム塩(E624)及びマグネシウム塩(E625)を認めている。

グルタメート(又はその塩)は、多くの場合、出来合いの食事(スープ、ソース、クリスプ及び出来合いの料理)中に存在する。それはまた、アジア料理で一般的に使用される。

それは、現在、アペリティフでの香味料(ベーコン風味、チーズ風味)と組み合わせて頻繁に使用される。これにより、ベーコン、チーズ等の風味を増強することが可能になる。何も含有しないアペリティフを見つけるのは稀である。

それはまた、その味覚機能のためではなく、特定の医薬カプセル中で見られる。

最後に、それは、調理補助食品(固形スープの素、ソースベース、ソース等)の主成分である。

したがって、微細藻類の代謝的な豊富さを開発することを達成するために、高細胞密度(HCD)を得るための第1の発酵方法が、最大限のタンパク質又は脂質の収率及び生産性を得るために徹底的に研究された。

これらHCD培養の目的は、可能な限りの高濃度での所望の生成物を、可能な限り短期間で得ることであった。

この原理は、例えば、クロレラ・ゾフィンギエンシス(Chlorella zofingiensis)によるアスタキサンチンの生合成により裏付けられ、ここで、微細藻類の増殖は、この化合物の生成と直接的に相関することが証明された(Wang及びPeng、2008年、World J. Microbiol. Biotechnol.、24(9)、1915〜1922頁)。

しかし、その最高速度(μ、単位h^-1)での増殖を維持することが、所望の生成物の高い生産量と常に相関するとは限らない。

実際に、例えば、微細藻類で脂質の貯蔵が大きくなるように所望される場合、微細藻類をそれらの増殖を制限する栄養ストレスに供する必要性があることは、当分野の専門家にはすぐに明白となる。

そのため、発酵方法における増殖/生成のデカップリング及び細胞増殖の速度の制御が、ここで実施される。

一般的に、当業者は、発酵条件(温度、pH等)を制御することにより、又は、栄養成分の発酵培地への供給を調節すること(「フェドバッチ」と称される半連続条件)により、微細藻類の増殖を制御することを選択する。

従属栄養的に炭素源の供給を通して微細藻類の増殖を制御することを選択する場合、当業者は、一般的には、炭素源(純グルコース、アセテート、エタノール等)を、微細藻類(C.コフニイ(C. cohnii)、ユーグレナ・グラシイス(Euglena gracilis)等)に、生成された代謝物(例えばDHA型の多価不飽和脂肪酸)の機能として、適合させることを選択する。

温度はまた、キーパラメータであり得る:
- 例えば、クロレラ・ミヌチスシマ(Chlorella minutissima)によるEPA等の、いくつかの種の微細藻類での多価不飽和脂肪酸の合成が、前記微細藻類の最適な増殖に必要なものより低い温度で促進されることが報告されている;
- 一方、ルテイン収率は、生成温度を24℃から35℃に上げる場合、従属栄養的に培養されたクロレラ・プロトテコイデスでより高くなる。

実際に、クロレラ・プロトテコイデスは、最良な油の取れる微細藻類の1つであることが認められている。

従属栄養条件下で、それは、炭水化物からトリグリセリドに迅速に転換する(乾燥物質の50%超)。

このトリグリセリドの生成を最適化するため、当業者により、発酵培地の栄養環境に働きかけることで、油の生成に向かう炭素流動が最適化するようになる。

このように、炭素の供給は十分だが、窒素は欠乏する条件下の場合、油が蓄積することが知られている。

したがって、C/N比は、本明細書で決定因子であり、グルコース含量が制限因子ではなく、最良な結果が窒素含量に直接作用して得られることが認められる。

当然のことながら、この窒素欠乏は、細胞の増殖に影響を及ぼし、これにより、微細藻類において、正常の増殖速度より30%低下した増殖速度という結果になる(Xiongら、Plant Physiology、2010年、154、1001〜1011頁)。

この結果を説明するために、上述の記事において、クロレラのバイオマスがその5つの主成分、即ち、炭水化物、脂質、タンパク質、DNA及びRNA(乾燥物質の85%を表す)に分けられる場合、C/N比がDNA、RNA又は炭水化物の含量に対して影響を及ぼさないまま、タンパク質及び脂質の含量に対して顕著となることを、Xiongらは実証する。

そのため、低C/N比で培養されたクロレラ細胞は、タンパク質25.8%及び脂質25.23%を含有する一方、高C/N比では、起こり得る脂質53.8%及びタンパク質10.5%の合成を可能にする。

したがって、その油の生成を最適化するため、当業者にとって、タンパク質生成を損ねる油の生成に向かうように導くことにより炭素流動を制御することは必須である。微細藻類が窒素不足培地に設置される場合、炭素流動は、再分配され、脂質貯蔵物質として蓄積される。

しかし、クロレラ・プロトテコイデスはまた、有利には、タンパク質を生成するために選択され得る。

したがって、油の生成に対してC/N比の管理(高C/N比が標的である)に関して当業者により行われた分析を考慮すると、当業者は、低いC/N比を奨励するようになり、それによって
- タンパク質へと転換されることになる炭素源の供給原料を一定に保持しながら、大量の窒素源を発酵培地に供給するようになり、
- 微細藻類の増殖を刺激するようになる。

したがって、貯蔵脂質生成を損ねるタンパク質(それゆえバイオマス)生成に向かう炭素流動を変更することが選択される。

Wang及びPeng、2008年、World J. Microbiol. Biotechnol.、24(9)、1915〜1922頁 Xiongら、Plant Physiology、2010年、154、1001〜1011頁

本発明は、より詳細にはクロレラ属の、更により詳細にはクロレラ・プロトテコイデス種の微細藻類バイオマスのタンパク質濃縮のための方法に関する。

本発明は、特定の微細藻類の、より詳細にはクロレラ・プロトテコイデスのバイオマスのタンパク質濃縮のための方法に関し、そのタンパク質のアルギニン及びグルタミンの含量が著しく高い。

本発明は、より詳細には、事前に窒素を不足させたバイオマス中へのアンモニウム供給を増加させることを特徴とする、タンパク質が濃縮された微細藻類のバイオマスを生成するための方法を網羅する。

具体的には、本発明の文脈において、本出願人の会社は、他方、当業者によって従来想定されるものに対する代替的な解決策、又は当業者が選択したものの正反対のものを提案することによって、新規な経路を探求することを選択している。

したがって、本発明は、従属栄養的に培養された、クロレラ属の、更により詳細にはクロレラ・プロトテコイデスである微細藻類のタンパク質濃縮のための方法に関し、その従属栄養的培養方法は、
- N.6.25として表される、50%未満の、好ましくは30%未満の、優先的には20〜25%の間のタンパク質含量で、微細藻類バイオマスを得るために、アンモニウム供給を制限することに向けられた第1の工程;
- 50%超の、好ましくは60%超の、更により優先的には65%超のタンパク質含量を得るために、アンモニウム供給が発酵培地で増大する第2の工程
を含む。

以下で説明されるように、本発明による方法の優先的な実施形態は、NH₃/KOH混合物を用いて第1の工程でpHを調節し、それによってアンモニウム供給を制限し、したがってタンパク質含量の少ない生成を促進すること、次いで、アンモニウムを発酵培地に再供給するために、NH₃を単独で用いて第2の工程でpH調節を使用することにあり得る。

NH₃/KOH混合物は、アンモニウム供給を制限することが可能になるものである。例えば、第1及び第2の工程間で同じ濃度のNH₃に対して、混合物は、約1:1程度で、例えば、NH₃約70〜45%及びKOH 30〜55%、好ましくはNH₃約65〜55%v/v及びKOH 35〜45%であり、量はモルで表される、NH₃/KOH比で構成され得る。

用語「約」は、示される値の±10%、好ましくはその±5%を含む値の範囲を意味することが意図される。例えば、「約10」は、9〜11の間、好ましくは9.5〜10.5の間を意味する。

この優先的な実施形態において、次いで、NH₃供給には、約1.5〜2を乗算し、これによって得られた窒素消費の速度には、5を乗算する。

この第2の工程は、事前に窒素を不足させたバイオマスに対するアンモニウム供給が増加することで、このバイオマスによりこの塩を散発的に過剰消費する結果となり、タンパク質含量が最大で50%超、好ましくは60%超、優先的には65%超(N.6.25として表される百分率)の含量に著しく増大することになる工程である。

したがって、窒素欠乏フェーズの間、0.005g/g/時間未満の値に低下する窒素消費の比速度(specific speed)は、窒素欠乏が解消された後、0.01g/g/時間超の値に増加することが見出される。

好ましい実施形態において、増殖速度は、実質的に一定に保持される。例えば、これら2つのフェーズの間、増殖速度は、0.07h^-1〜0.09h^-1、好ましくは約0.08h^-1で保持される。

この概念を説明するために、より具体的には、本発明は、クロレラ・プロトテコイデスを従属栄養的に培養するための方法であって、
- 20g/lのグルコースを供給する、発酵槽に播種した後のバッチフェーズ、
- バッチ内で供給されるグルコースが完全に消費される場合に開始される、増殖速度を0.08h^-1に設定した指数関数的フェドバッチフェーズであって、
その間、アンモニウム供給が、(N.6.25として表される)25%未満のタンパク質を含有するバイオマスを得る目的で、上述のNH₃及びKOHの混合物の援助を受けるpH調節を使用することにより制限される、フェーズ、
次いで、
- その間100%アンモニア溶液の援助を受けてpHを調節することによりアンモニウム欠乏が解消される、増殖速度を同じ0.08h^-1に設定した指数関数的フェドバッチフェーズ
を含む方法を網羅する。

例えば、アンモニウム欠乏が解消される、第2のフェドバッチフェーズは、約2kgの乾燥グルコースが導入される場合に開始される。

本発明の目的として、不可欠な基準として、明らかに、発酵培地の窒素欠乏により起こる細胞ストレスと、それに続くこのストレスの解消が、非常に特異的な条件下で、生成されるバイオマスのタンパク質含量を増加するために導入される窒素の消費のきっかけとなることがある。

したがって、この戦略は、バイオマスのタンパク質含量を増すために、培養の開始時から窒素供給を増加することが絶対に必須であると考える技術的な先入観に完全に反する。

更に、これらの動作条件は、本明細書で、タンパク質の豊富さが増すだけでなく、そのアルギニン及びグルタミンの含量もかなり増すことになることを反映している。

更に詳細には、以下で説明されるように、窒素欠乏と続くアンモニウムパルスで培養する工程を含むクロレラ・プロトテコイデス種の微細藻類の従属栄養的な培養は、全アミノ酸に対して45%超のグルタミン酸及びアルギニンを生成することになる。

そのため、本発明はまた、従属栄養的に培養された微細藻類の、好ましくはクロレラ・プロトテコイデス種の微細藻類のグルタミン酸及び/又はアルギニンの含量を濃縮するための方法であって、タンパク質の乏しい微細藻類バイオマスを得るために、アンモニウム供給を制限することに向けられた工程、続く増殖速度を維持してアンモニウム供給を増す工程を含む、前記微細藻類を従属栄養的に培養する工程を含む方法にも関する。

したがって、これらの培養条件により、全アミノ酸に対して45%超のグルタミン酸及びアルギニンを含む、微細藻類バイオマスが調製される結果となる。

本発明は、例示的であり、非制限的であることを意図する以下の実施例により、より明らかに理解されるだろう。

消費されたグルコースの関数として、N.6.25の変化を示すグラフである。 消費されたグルコースの関数として、窒素消費の比速度(qN)の変化を示すグラフである。 時間の関数としてN.6.25、及び、時間の関数として乾燥バイオマスの質量百分率としての各アミノ酸の量の変化を示すグラフである。 時間の関数としてN.6.25、及び、時間の関数として乾燥バイオマスの質量百分率としての全脂肪酸又は個々の脂肪酸の量の変化を示すグラフである。 時間の関数としてN.6.25、及び、時間の関数として乾燥バイオマスの質量百分率としての全糖又は個々の糖の量の変化を示すグラフである。

(実施例1)
高含量のグルタミン酸及びアルギニンを有するタンパク質の豊富なC.プロトテコイデスのバイオマスの調製
使用される菌株は、クロレラ・プロトテコイデス(菌株CCAP211/8D、The Culture Collection of Algae and Protozoa、Scotland、UK)である。

前培養:
- 500mLの三角フラスコ中の150mLの培地;
- 培地の構成:40g/Lのグルコース+10g/Lの酵母抽出物。

インキュベーションを以下の条件下で実施する:
- 時間:72h;
- 温度:28℃;
- 振とう:110rpm(Infors Multitron Incubator)。

バッチと続くフェドバッチ方式での培養
調製及び初期バッチ培地
- 20%v/v(59%)で、400g/l(41%)/NH₃で、KOHの混合物を調製及びろ過する;
- 121℃/20分で、20Lの発酵槽を滅菌する;
- 2つの円錐フラスコに、500mLの前培養物(15のOD_600nm)を接種する;
- KOH/NH₃混合物を用いてpHを5.2に調節する;
- 開始振とう速度300rpm;
- エアレーション:15L/分の空気;
- 振とうを変更することによる30%でのpO₂調節;
- 温度:28℃;
供給
- グルコース:500g/L
- 硫酸アンモニウム:25g/L
- 一塩基性リン酸ナトリウム:17g/L
- 一塩基性リン酸カリウム:23g/L
- 硫酸マグネシウム七水和物:20g/L
- 硫酸鉄:120mg/L
- 硝酸カルシウム:610mg/L
- 微量元素の溶液:45mL/L
- ビタミンの溶液:3.6mL/L

発酵手順
- 接種前に、20g/Lの当量のグルコースを準備する
- グルコース濃度=0g/Lである場合、フェドバッチ方式でグルコースでの供給を開始する;増殖速度を0.08h^-1に設定することが可能になる流速を使用する
- 41%のKOH/59%のNH₃の混合物を用いてpHを5.2に調節する
- 2kgのグルコースが、微細藻類により消費された場合、系を、NH₃を単独で用いたpH調節に切り替える
- バイオマスが、乾燥物質の質量に対して100g/Lに達し、約3.5kgのグルコースが供給された場合、グルコースの供給を止める。

結果:
2つの試験を、これら同じ条件下で実施し、結果をTable I(表3)及び以下のグラフに示す。

図1は、消費されたグルコースの関数として、N.6.25の変化を示す。これら2つの試験は、いくつかの注目すべき結果を反映する:65%超のN.6.25含量を有する黄色のバイオマスの生成。

図2は、消費されたグルコースの関数として、窒素消費の比速度(qN)の変化を示す。

窒素の制限が(2kgの消費されたグルコースで)解消した後、窒素消費の比速度は、その最高値となり、次いで徐々に低下することが分かる。2つの試験間の同様の速度はまた、プロトコルの良好な再現性を反映する。

バイオマスに存在するアミノ酸の全分析を、制限が解消する直前に採取した試料、及びパルス後のいくつかの試料で実施した。

結果は図3に示す。

窒素制限が解消する直前、アミノ酸の合計は低く(16.3%)、様々なアミノ酸の中に優位性がないことに留意されたい。

窒素制限の解消の1時間後、最大の増加を経験するアミノ酸は、グルタミン酸であり、続いてアルギニンであることに留意されたい。他のアミノ酸の含量もまた増加するが、程度ははるかに低い。

したがって、N.6.25の増加は、とりわけグルタミン酸及びアルギニンの増加に相関している。

これらの分析に加えて、バイオマスに存在する脂肪酸の全分析を、窒素制限が解消する直前に採取した試料、及びパルス後のいくつかの試料で実施した。

結果は図4に示す。

バイオマス中の脂肪酸の全含量は、パルス前は19.2%であるが、10.2%に低下する。この曲線に顕著に沿う脂肪酸は、オレイン酸である。

したがって、脂肪酸は、窒素が不足している場合、バイオマスに蓄積する。

バイオマスに存在する糖の全分析もまた、窒素制限が解消する直前に採取した試料、及び窒素制限の解消後のいくつかの試料で実施した。結果は図5に示す。

バイオマス中の糖の全含量は、窒素制限が解消する前は37.5%であるが、20%に低下し、その後停滞する。この曲線に顕著に沿う糖は、グルコースである。

したがって、糖もまた、窒素が不足している場合、バイオマスに蓄えられる。

次いで、糖の含量は、低下し続ける脂肪酸の含量と異なり、安定しているように見える。

バイオマスの塩の含量は、焼成残渣を測定することによって測定した:9%である。

Claims (8)

1. 従属栄養的に培養された、クロレラ属の、更により詳細にはクロレラ・プロトテコイデスである微細藻類のタンパク質濃縮のための方法であって、
   - N.6.25として表される、50%未満の、好ましくは30%未満の、より優先的には20〜25%の間のタンパク質含量で、微細藻類バイオマスを得るために、アンモニウム供給を制限することに向けられた第1の工程;
   - 50%超の、好ましくは60%超の、より優先的には65%超のタンパク質含量を得るために、アンモニウム供給が発酵培地で増大する第2の工程
   を含むことを特徴とする、方法。
2. pH調節が、NH₃/KOH混合物を用いて第1の工程で実施され、NH₃を単独で用いて第2の工程で実施されることを特徴とする、請求項1に記載の方法。
3. NH₃/KOH混合物が、NH₃約70〜45%及びKOH 30〜55%、好ましくはNH₃約65〜55%v/v及びKOH 35〜45%であり、量はモルで表されることを特徴とする、請求項1又は2に記載の方法。
4. アンモニウム供給には、約1.5〜2を乗算することを特徴とする、請求項1から3のいずれか一項に記載の方法。
5. 微細藻類による窒素消費の比速度が、第1の工程では0.005g/g/h未満であり、第2の工程では0.01g/g/h超であることを特徴とする、請求項1から4のいずれか一項に記載の方法。
6. 増殖速度が、第1及び第2のフェーズの間、実質的に一定に保持され、好ましくは0.07h^-1〜0.09h^-1、好ましくは約0.08h^-1で維持されることを特徴とする、請求項1から5のいずれか一項に記載の方法。
7. - 20g/lのグルコースを供給する、発酵槽に播種した後のバッチフェーズ、
   - バッチ内で供給されるグルコースが完全に消費される場合に開始される、増殖速度を0.08h^-1に設定した指数関数的フェドバッチフェーズであって、
   その間、アンモニウム供給が、(N.6.25として表される)25%未満のタンパク質を含有するバイオマスを得る目的で、NH₃及びKOHの混合物の援助を受けるpH調節を使用することにより制限される、フェーズ、
   次いで、
   - その間100%アンモニア水溶液の援助を受けてpHを調節することによりアンモニウム制限が解消される、増殖速度を同じ0.08h^-1に設定した指数関数的フェドバッチフェーズ
   を含むことを特徴とする、請求項1から6のいずれか一項に記載の方法。
8. 前記バイオマスを構成する全アミノ酸に対して、45%超のグルタミン酸及びアルギニンを含有する、微細藻類バイオマスを生成することになることを特徴とする、請求項1から7のいずれか一項に記載の方法。