JP6715252B2

JP6715252B2 - スラウストキトリウム（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属の微細藻類のバイオマスをＤＨＡで、かつアミノ酸ＡＲＧ及びＧＬＵで富化するプロセス

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Publication number: JP6715252B2
Application number: JP2017539445A
Authority: JP
Inventors: コーリエベルナール
Original assignee: Roquette Freres SA
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Priority date: 2015-01-27
Filing date: 2016-01-26
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Description

本発明は、スラウストキトリウム（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属、より詳細にはシゾキトリウム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属種又はシゾキトリウム・マングローベイ（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍｍａｎｇｒｏｖｅｉ）の微細藻類のバイオマスをドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）で、かつアミノ酸アルギニン及びグルタミン酸で富化する新規な発酵プロセスと、また、この微細藻類バイオマスから抽出される油を生産するプロセスとに関する。

脂質の技術分野
脂質は、タンパク質及び炭水化物と共に、多量必要栄養素の３つの主要ファミリーを構成する１つである。

脂質のうち、トリグリセリド及びリン脂質が特に際立っている。

トリグリセリド（トリアシルグリセロールもしくはトリアシルグリセリド、又はＴＡＧとも呼ばれる）は、グリセロールの３つのヒドロキシル基が脂肪酸でエステル化されているグリセリドである。これは、植物油及び動物性脂肪の主な構成成分である。

トリグリセリドは、ヒトによって摂取される食事の脂質のおよそ９５％に相当する。これは、生体において主に脂肪組織中に存在し、エネルギー貯蔵の主な形態を構成している。

リン脂質は、両親媒性脂質、すなわち、極性のある（親水性の）「頭部」及び２つの脂肪族の（疎水性の）「尾部」からなる脂質である。

リン脂質は、とりわけ流動性を付与する細胞膜の構成成分であることから、構造用脂質である。

トリグリセリド及びリン脂質は、主に脂肪酸で構成される。これらの脂肪酸は食事によって与えられ、一部については生体によって合成される。

生化学分類（脂肪酸分子中に含有される二重結合の数に基づく）により、飽和脂肪酸（ＳＦＡ）、一価不飽和脂肪酸（ＭＵＦＡ）、及び多価不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）に区別される。

生理学的見解から、以下が区別される：
− 不可欠脂肪酸。これは、ヒトの体の発達及び適切な機能に必要とされるが、ヒトの体が生産することはできない；
− 「条件付きで」不可欠な脂肪酸。これは、細胞の正常な増殖及び生理学的機能に必須であるが、前駆体が食事によって提供される場合に前駆体から生産され得る。したがって、必須の前駆体が不在である場合に完全に必要とされる；
− 非不可欠脂肪酸。

全ての不可欠脂肪酸及び「条件付きで」不可欠な脂肪酸が必須脂肪酸を構成する。

他の脂肪酸は、非必須脂肪酸と呼ばれる。

特に、非不可欠脂肪酸として、以下が挙げられる：
− オメガ３脂肪酸ファミリーのエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）、
− オレイン酸（ヒトの食事において主たる一価不飽和脂肪酸である）及びパルミトレイン酸、
− 飽和脂肪酸、例えばラウリン酸、ミリスチン酸又はパルミチン酸。

より詳細には、多価不飽和脂肪酸は、最後のメチル官能基から出発して、最初の二重結合の位置に従って分類される。

したがって、命名法において、オメガ「ｘ」又は「ｎｘ」について「ｘ」は最初の不飽和の位置に相当する。

必須脂肪酸の２つの主なファミリーが識別されている：その前駆体及び主な代表がリノール酸（ＬＡ）であるオメガ６脂肪酸（又はｎ−６ＰＵＦＡ）、及びその前駆体がアルファ−リノレン酸（ＡＬＡ）であるオメガ３脂肪酸（又はｎ−３ＰＵＦＡ）。

生物学的に注目される大部分の多価不飽和脂肪酸は、オメガ６ファミリー（アラキドン酸又はＡＲＡ）又はオメガ３ファミリー（エイコサペンタエン酸又はＥＰＡ、ドコサヘキサエン酸又はＤＨＡ）に属する。

また、命名法において、鎖を構成する炭素の数も定義される。したがって、ＥＰＡはＣ２０：５として、ＤＨＡはＣ２２：６として記載される。

このように、「５」及び「６」は、ＥＰＡ及びＤＨＡによってそれぞれ示される炭素鎖の不飽和の数に相当する。

ＤＨＡは、オメガ３脂肪酸ファミリーであり、生体がアルファ−リノレン酸から合成する方法が知られており、又は油っこい魚（マグロ、サケ、ニシンなど）の消費によって提供される脂肪酸である。

ＤＨＡは、膜の構造ならびに脳及び網膜の発達及び機能において重要な役割を果たす。

魚の油が主にオメガ３脂肪酸、例えばＤＨＡ及びＥＰＡの源として用いられるが、これらは微細藻類の油にも見出されており、それから混合物として又は別々に抽出される。例えば、油は、選択された特定の株、例えばシゾキトリウム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属の株に由来する場合、微量のＥＰＡのみを含有するが、ＤＨＡ含有量が高い。

ペプチド及びアミノ酸の技術分野
ペプチド及びアミノ酸は、従来、多く分野において機能剤又は栄養補助食品として開発されている。

注目されるアミノ酸の供給に関連して、アルギニン及びグルタミン酸が豊富である入手可能なペプチド源を有することが実際に有利であり得る。

アルギニンは、動物界において多くの機能を有するアミノ酸である。

アルギニンは、分解し得るため、これを同化する細胞にとってエネルギー源、炭素源及び窒素源として機能し得る。

哺乳類が挙げられる種々の動物において、アルギニンは、オルニチン及び尿素に分解される。後者は、動物生体の細胞中に存在する窒素化合物の量を調節するように（尿の排泄を介して）除外され得る窒素分子である。

アルギニンは、ＮＯシンセターゼを介して一酸化窒素（ＮＯ）の合成を可能にするため、動脈の血管拡張に関与し、これが血管の剛性を引き下げて血流を増大させることで血管の機能を向上させる。

アルギニンを含有する栄養補助食品は、心臓の健康、血管機能を促進するため、「血小板凝集」（血塊形成のリスクとなる）を予防するため、及び動脈圧を低下させるために推奨されている。

創傷の回復へのアルギニンの関与は、コラーゲン合成における別の重要なアミノ酸であるプロリンの形成での役割と関連している。

最後に、アルギニンは、特にスポーツをする人々によって頻繁に用いられる栄養ドリンク中の成分である。

グルタミン酸に関しては、タンパク質合成に用いられる元素ブリックの１つであるだけでなく、中枢神経系（脳＋脊柱）において非常に広く存在しており、かつＧＡＢＡ作動性ニューロンにおけるＧＡＢＡ前駆体である興奮性神経伝達物質でもある。

コードＥ６２０の下で、グルタメートは、食品中の調味料として用いられている。これは、味を向上させるために食品調理物に加えられる。

また、グルタメートの他に、国際食品規格（ＣｏｄｅｘＡｌｉｍｅｎｔａｒｉｕｓ）は、調味料として、そのナトリウム塩（Ｅ６２１）、カリウム塩（Ｅ６２２）、カルシウム塩（Ｅ６２３）、アンモニウム塩（Ｅ６２４）、及びマグネシウム塩（Ｅ６２５）を認識している。

グルタメート（又はその塩）は、多くの場合、調理済み食品（スープ、ソース、チップス、及び調理済みの料理）中に存在する。これはまた、アジアの料理法において一般的に用いられている。

これは、現在、アペリチフにおける風味付け（ベーコンの調味料、チーズの調味料）と組み合わせて頻繁に用いられている。これにより、ベーコン、チーズなどの風味を向上させることが可能となる。何も含有しないアペリチフを見出すことはほぼない。

これはまた、特定の医薬カプセル中にも見出されるが、その味の作用を目的とするものではない。

最後に、これは、調理補助物（固形スープの素、ソースベース、ソースなど）の主成分である。

微細藻類による脂質、特に脂肪酸の産生
シゾキトリウム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属の微細藻類は、従来、発酵槽（従属栄養条件：暗黒下及び炭素源の存在下）内で培養される。

これらの微細藻類の有益な利用は、一般に、発酵条件を制御することを必要とする点に
留意すべきである。

したがって、この結果を達成するために、高細胞密度（ＨＣＤ）を得ることを可能にする発酵のための最初のプロセスが、最大の脂質収率及び生産性を得るために大いに開発されてきた。

これらのＨＣＤ培養の目的は、考えられる最短期間で考えられる最高濃度の所望の脂質を得ることであった。

しかしながら、脂質を多量に蓄積させることを所望する場合、例えば、微細藻類を栄養ストレスに曝すことが必須であるが、これは、増殖を制限することが当分野の専門家に直ちに明らかとなった。

したがって、増殖及び生産は、慣例的に発酵プロセスにおいて結び付けられていない。

例えば、多価不飽和脂肪酸（この例では、ドコサヘキサエン酸又はＤＨＡ）の蓄積を促進するために、特許出願国際公開第０１／５４５１０号パンフレットは、多価不飽和脂肪酸の生産から細胞の増殖を切り離すことを推奨している。

より詳細には、微生物の脂質を生産するプロセスが特許請求されており、このプロセスは、
（ａ）微生物、炭素源、及び制限栄養源を含む培地の発酵を実行して、溶解酸素含有量を前記発酵培地中で少なくともおよそ４％の飽和に維持するのに十分な条件を確実にして、バイオマスを増大させる工程と；
（ｂ）続いて、溶解酸素含有量を前記発酵培地中でおよそ１％以下の飽和に維持するのに十分な条件を与えて、前記微生物が前記脂質を産生し得るのに十分な条件を与える工程と；
（ｃ）前記微生物脂質の少なくともおよそ１５％が多価不飽和脂質から構成されている、前記微生物脂質を収集する工程と
を含む工程を含み、少なくともおよそ１００ｇ／ｌのバイオマス密度が発酵の経過から得られる。

したがって、微細藻類のシゾキトリウム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属種の株ＡＴＣＣ２０８８８において、第１の増殖期は、より詳細には、炭素源及び窒素源の存在下で酸素を制限することなく実行されて、高細胞密度の生成が促進され、その後、第２期において窒素の供給が停止され、かつ酸素の供給が徐々に減速されて（溶解酸素圧又はｐＯ２が１０％から４％に、その後、０．５％に管理される）、微細藻類にストレスが加えられ、その増殖が減速され、かつ注目される脂肪酸の産生がトリガーされる。

微細藻類の渦鞭毛藻（Ｃｒｙｐｔｈｅｃｏｄｉｎｉｕｍｃｏｈｎｉｉ）において、より高いＤＨＡ含有量が低グルコース濃度（５ｇ／ｌのオーダー）で、したがって低い増殖速度で得られる（ＪｉａｎｇａｎｄＣｈｅｎ，２０００，ＰｒｏｃｅｓｓＢｉｏｃｈｅｍ．，３５（１０），１２０５−１２０９）。

結果的に、産物の形成が高い細胞増殖と相関しない場合、細胞増殖の速度を制御することが賢明であることが教示されている。

一般に、当業者は、発酵条件（温度、ｐＨなど）を制御することにより、又は発酵培地への栄養成分の供給を調節すること（「流加（ｆｅｄｂａｔｃｈ）」と呼ばれる半継続的条件）により微細藻類の増殖を制御することを選択する。

当業者は、炭素源の供給を介して従属栄養的に微細藻類の増殖を制御することを選択する場合、一般に、産生される代謝物質（例えば、ＤＨＡ型の多価不飽和脂肪酸）に応じて、炭素源（純粋なグルコース、アセテート、エタノールなど）を微細藻類（渦鞭毛藻（Ｃ．ｃｏｈｎｉｉ）、ミドリムシ（Ｅｕｇｌｅｎａｇｒａｃｉｌｉｓ）など）に適応させることを選択する。

温度も重要なパラメータであり得る。例えば、微細藻類の一部の種における多価不飽和脂肪酸、例えばクロレラ・ミヌティッシマ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａｍｉｎｕｔｉｓｓｉｍａ）によるＥＰＡの合成は、前記微細藻類の最適な増殖に必要とされるよりも低い温度で促進されることが報告されている。

また、トリグリセリドの生産を最適化するために、当業者は、発酵培地の栄養環境に影響を与えることにより、炭素フローを油生産に向けて最適化するようになる。

したがって、炭素の供給が十分であるが窒素欠乏条件下にある場合、油が蓄積することが知られている。

したがって、Ｃ／Ｎ比がここでの決定因子であり、窒素含有量に直接影響を与えることによって最も良い結果が得られることが認められており、グルコース含有量は制限因子ではない。

したがって、油生産を最適化するために、タンパク質生産を損なうほど炭素フローを油生産に向けることによって炭素フローを制御することが当業者にとって必須である。微細藻類が窒素欠乏培地に入れられると、炭素フローは再分配されて、脂質貯蔵物質として蓄積する。

微細藻類によるタンパク質の産生
先に詳細に説明されるように、トリグリセリドの生産を最適化するために、当業者は、発酵培地の栄養環境に影響を与えることにより、炭素フローを油生産に向けて最適化するようになる。

クロレラ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ）属型の微細藻類において実行される研究では、窒素欠乏が細胞増殖に影響を及ぼすことにより、増殖速度が微細藻類の正常な増殖速度と比較して３０％低下することが注目されている（Ｘｉｏｎｇｅｔａｌ．，ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，２０１０，１５４，ｐｐ．１００１−１０１１）。

この結果を説明するために、先のＸｉｏｎｇらの論文において、実際に、クロレラ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ）属バイオマスが５つの主成分、特に炭水化物、脂質、タンパク質、ＤＮＡ、及びＲＮＡ（その固体の８５％に相当する）に分割される場合、Ｃ／Ｎ比は、ＤＮＡ、ＲＮＡ又は炭水化物の含有量に影響しないが、タンパク質及び脂質の含有量について重要性を増すことが実証されている。

したがって、低いＣ／Ｎ比で培養されたクロレラ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ）属細胞は、２５．８％のタンパク質及び２５．２３％の脂質を含有する一方、高いＣ／Ｎ比では５３．８％の脂質及び１０．５％のタンパク質の合成を可能にする。

したがって、タンパク質生産を最適化するために、脂質生産を損なうほど炭素フローをタンパク質生産に向けることによって炭素フローを制御することが当業者にとって必須である。微細藻類が窒素欠乏でない培地に入れられると、炭素フローは再分配されて、タン
パク質貯蔵物質として蓄積する。

したがって、この教示をもって、タンパク質及びそれを構成するアミノ酸が豊富であるバイオマスを生産するために、当業者は、低いＣ／Ｎ比を促進する代わりに発酵条件に影響を与えるようになり、したがって、
− 大量の窒素源を発酵培地へ供給する一方、タンパク質に変換されることになる炭素源フィードストックを一定に維持し、かつ
− 微細藻類の増殖を刺激する。

本発明は、脂質画分について、ＤＨＡが豊富であり、総アミノ酸に対するアミノ酸アルギニン及びグルタミン酸の含有量が高い、スラウストキトリウム（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属の微細藻類のバイオマスを生産するプロセスに関する。

このプロセスは、微細藻類の増殖速度の制御に基づいており、この制御は、増殖速度をその最小値に引き下げると同時に、発酵培地中で窒素源を維持するか、又は発酵培地中に窒素源を連続的に導入するように行われる。

この結果は、例えば、発酵培地中の微量元素を低減もしくは枯渇させることにより、又はＯ２移行を制限することにより得られ得る。

したがって、本発明に従うプロセスの優先される一実施形態において、酸素供給を制限することによって微細藻類の増殖速度を制限することが選択される。

本発明の目的のために、増殖速度の制限は、微細藻類の実際の増殖速度（μ）の、その最適な増殖速度（μｍａｘ）に対する比によって評価され、「μ」は、バイオマス１ｇあたり及び毎時、すなわち（ｈ−１）で形成されるバイオマスのｇで表される増殖速度である。

より詳細には、本発明のプロセスは、スラウストキトリウム（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属の微細藻類のバイオマスをＤＨＡで、かつアミノ酸アルギニン及びグルタミン酸で富化するプロセスにおいて、微細藻類の増殖速度の比率μ／μｍａｘの値が０．２未満になると直ちに、発酵培地中で窒素源を維持するか、又は発酵培地に窒素源を加えることを含む工程を含むことを特徴とするプロセスである。

好ましくは、微細藻類は、シゾキトリウム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属種又はシゾキトリウム・マングローベイ（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍｍａｎｇｒｏｖｅｉ）のものである。

より詳細には、微細藻類は、パスツール研究所（ＩｎｓｔｉｔｕｔＰａｓｔｅｕｒ）のＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎＮａｔｉｏｎａｌｅｄｅＣｕｌｔｕｒｅｓｄｅＭｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｓ［ＦｒｅｎｃｈＮａｔｉｏｎａｌＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎｏｆＭｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍＣｕｌｔｕｒｅｓ］にそれぞれ２０１１年４月１４日及び２０１２年１１月２２日に寄託された株ＣＮＣＭＩ−４４６９及びＣＮＣＭＩ−４７０２から選択される株であってよい。

任意選択的に、プロセスはまた、バイオマスを収穫することと、任意選択的にこのバイオマスから細胞抽出物又は溶解物を調製することと、その後、任意選択的にＤＨＡならびにアミノ酸アルギニン及びグルタミン酸が豊富な粗油を抽出することとを含んでもよい。

本発明に従うプロセスは、得られるバイオマスが、
− 総脂肪酸の少なくとも４５重量％のＤＨＡ；及び
− 総アミノ酸に対して少なくとも１０重量％のアルギニン及び少なくとも２５重量％のグルタミン酸、好ましくは総アミノ酸に対して少なくとも１５重量％のアルギニン及び少なくとも４０重量％のグルタミン酸。

Ｃ／Ｎの関数として、アミノ酸のうちのアルギニン及びグルタミン酸の割合の変化を示すグラフである。

本発明に関連して、本出願人企業は、発酵を実施する新規の方法を提唱することにより、ＤＨＡならびにアミノ酸アルギニン及びグルタミン酸の生産を最適化する独創的な経路を探究することを選択した。

このように、本出願人企業は、主題についての技術的な予想に反するが、発酵により、以下のような微細藻類バイオマスを生産することが可能であることを見出した：
− 脂質が豊富であり（バイオマスの乾物重で２５％超、好ましくは少なくとも３０％）（その主たる脂肪酸はドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）である）、かつ
− アミノ酸アルギニン及びグルタミン酸が豊富であり（総アミノ酸の３５重量％超、好ましくは少なくとも５５％）、
先行技術に記載されるように、Ｃ／Ｎ比（消費される窒素に対する消費される炭素、モル／モル）を最大にすることは必須ではない。

このように、本出願人企業は、脂質の生産について従来的でないが、増殖速度μ／μｍａｘが０．２未満である場合ですら、発酵の全体を通して窒素供給を維持することにより、発酵により生産されるバイオマスの脂質及びアミノ酸の組成を変更することが可能であることを見出した。

実際に、本出願人企業は、μ／μｍａｘ比が０．２未満である場合、窒素又は炭素ベースの培養基以外の栄養培養基の制限後、代謝生産をアミノ酸アルギニン及びグルタミン酸の生産に向けると同時に、相当なＤＨＡ生産を保持することが可能であることを理解した。

一実施形態において、増殖速度を引き下げることを可能にする制限は、酸素供給（ＯＴＲ、酸素移動速度）の制限であり得る。

特に、発酵段階中のＯＴＲは、好ましくは３０〜３５ｍｍｏｌ／ｌ／ｈである。

増殖制限はまた、好ましくはリン酸塩、マグネシウム、又はカリウムから選択される微量元素又は無機物を枯渇させることによっても誘導され得る。

より詳細には、本出願人企業は、μがμｍａｘの２０％未満であることを条件として、優先して水性アンモニアの形態（例えばｐＨ調節に用いられる）で窒素を供給することが必須であること、又は窒素供給を培養の最後まで維持することが必須であることを見出した。

好ましい一実施形態において、初期の窒素供給は、ｐＨの調節によって加えられる。したがって、消費される窒素は、ｐＨ調節の窒素によって補償される。これにより、培養の
終了時のＣ／Ｎ比（消費された窒素に対する消費された炭素、モル／モル）について、２０未満、例えば１０〜１５、好ましくはおよそ１５を得ることが可能となる。

本発明の方法に用いられる株は、スラウストキトリウム（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属、より詳細にはシゾキトリウム・マングローベイ（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍｍａｎｇｒｏｖｅｉ）又はシゾキトリウム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属種のものである。そのような株は当業者に知られている。

その研究の間、本出願人企業は、ＤＨＡを産生する非常に注目されるいくつかの微細藻類株を同定した。本出願人企業は、とりわけ、同定した２つの株に非常に興味がある。

第１の株は、シゾキトリウム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属種の株であり、フランスにおいて２０１１年４月１４日にパスツール研究所（２５ｒｕｅｄｕＤｏｃｔｅｕｒＲｏｕｘ，７５７２４ＰａｒｉｓＣｅｄｅｘ１５，Ｆｒａｎｃｅ）のＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎＮａｔｉｏｎａｌｅｄｅＣｕｌｔｕｒｅｓｄｅＭｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｓ［ＦｒｅｎｃｈＮａｔｉｏｎａｌＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎｏｆＭｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍＣｕｌｔｕｒｅｓ］（ＣＮＣＭ）に番号Ｉ−４４６９として、また、中国において武漢大学（Ｗｕｈａｎ４３００７２，Ｐ．Ｒ．Ｃｈｉｎａ）のＣｈｉｎａＣｅｎｔｅｒｆｏｒＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＣＣＴＣＣ）に番号Ｍ２０９１１８として寄託されている。この株は、主に、ＤＨＡと、それほどではないがパルミチン酸及びパルミトレイン酸とを産生する。これは、１８ＳＲＮＡをコードする遺伝子の部分配列（配列番号１）によって特徴付けられた。

これにより、シゾキトリウム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属種型の株であると同定することが可能となった。この株は、その後、本出願において「ＣＮＣＭＩ−４４６９」と表されることになる。

さらに、第２の株は、シゾキトリウム・マングローベイ（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍｍａｎｇｒｏｖｅｉ）の株である。これは、ＤＨＡ及びパルミチン酸を比較的等しい割合で産生する。これは、本出願人企業により、フランスにおいて２０１２年１１月２２日にパスツール研究所（２５ｒｕｅｄｕＤｏｃｔｅｕｒＲｏｕｘ，７５７２４ＰａｒｉｓＣｅｄｅｘ１５）のＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎＮａｔｉｏｎａｌｅｄｅＣｕｌｔｕｒｅｓｄｅＭｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｓ（ＣＮＣＭ）に番号ＣＮＣＭ
Ｉ−４７０２として寄託された。これは、１８ＳｒＲＮＡをコードする遺伝子の配列（配列番号２）によって特徴付けられた。

これにより、シゾキトリウム・マングローベイ（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍｍａｎｇｒｏｖｅｉ）型の株であると同定することが可能となった。この株は、その後、本出願において「ＣＮＣＭＩ−４７０２」と表されることになる。

さらに、本発明に従う発酵プロセスは従属栄養培養条件下で実行される。これらの条件は、考慮して微細藻類に適応される。また、培地は当業者に周知である。

微細藻類の増殖に必須の炭素源は、好ましくはグルコースである。

好ましくは、グルコース供給は、発酵中のグルコース濃度が２０ｇ／ｌ以上の濃度に維持されるようなものである。発酵の終了時のグルコース濃度は、少なくとも５ｇ／ｌである。

窒素源は、酵母の抽出物、尿素、グルタミン酸ナトリウム、硫酸アンモニウム、ｐＨ調節の水性アンモニアが単独で用いられても併用されてもよい。

通常、培養工程は、株を復活させる前培養工程、その後の適切な培養工程又は発酵工程を含む。後者の工程は、注目される脂質、特にＤＨＡの生産工程に相当する。

好ましくは、ｐＨは、発酵中、５〜７、好ましくはおよそ６のｐＨに調節される。

好ましくは、発酵中の温度は、２６〜３０℃、好ましくはおよそ２８℃である。

発酵時間は、好ましくは、少なくとも５０時間、好ましくは６５〜９０時間、さらにより好ましくは７０〜８５時間である。

本発明に従う発酵プロセスは、総脂肪酸の少なくとも４５重量％のＤＨＡを含むバイオマスを得ることを可能にする（又は得るように実行される）。また、このプロセスは、バイオマスに対して少なくとも２５重量％の脂質含有量を保証する。したがって、バイオマスは、実際にＤＨＡが富化される。

さらに、本発明に従う発酵プロセスは、タンパク質をバイオマスに対して少なくとも４０重量％含むバイオマスを得ることを可能にする（又は得るように実行される）。また、総アミノ酸に対するグルタミン酸の割合は、少なくとも２５％である。アルギニンの割合は、少なくとも１０％である。

ＣＮＣＭＩ−４７０２株について、本発明に従う発酵プロセスで得られる結果は、総脂肪酸のおよそ４７重量％のＤＨＡを含み、脂質含有量はバイオマスに対しておよそ３５重量％であり、及びおよそ５３％のタンパク質を含み、グルタミン酸の割合はおよそ４０
％であり、かつアルギニンはおよそ１６％である、バイオマスである。

ＣＮＣＭＩ−４４６９株について、本発明に従う発酵プロセスで得られる結果は、総脂肪酸のおよそ５２重量％のＤＨＡを含み、脂質含有量はバイオマスに対しておよそ２６重量％であり、及びおよそ４３％のタンパク質を含み、グルタミン酸の割合はおよそ２６％であり、かつアルギニンはおよそ１０％である、バイオマスである。

重量パーセントに言及する場合、乾物重によることが理解される。

バイオマスとは別に、本発明はまた、このバイオマスから調製される細胞抽出物又は溶解物に関する。特に、この抽出物又は溶解物は、発酵後に回収されるバイオマスから調製される。この抽出物又は溶解物は、ＤＨＡならびにアミノ酸アルギニン及びグルタミン酸が豊富である。

細胞は、脂質内容物を抽出するために、機械的方法、化学的方法、及び酵素による方法が挙げられる種々の方法で破壊されてよい。

その後、油が細胞溶解物から抽出され得る。

したがって、注目される脂質、好ましくはＤＨＡならびにアミノ酸アルギニン及びグルタミン酸を生産する方法は、バイオマスを収穫し、細胞抽出物又は溶解物を調製し、かつ注目される脂質、好ましくはＤＨＡならびに任意選択的にアミノ酸アルギニン及びグルタミン酸を含む粗油を抽出する、本発明に従う発酵プロセスを含む。

用語「およそ」は、値＋又は−前記値の１０％、好ましくは＋又は−前記値の５％を意味することが意図される。

本発明は、実例となり、かつ非限定的であることが意図される以下の実施例からより明らかに理解されるであろう。

実施例１：ＣＮＣＭＩ−４７０２株を培養する条件
プロトコルは、シゾキトリウム・マングローベイ（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍｍａｎｇｒｏｖｅｉ）ＣＮＣＭＩ−４７０２株について、発酵槽の接種用にバイオマスを０．１ｇ／ｌに前培養することを含む。

前培養
５００ｍｌのバッフル付きエルレンマイヤーフラスコ内での前培養（１００ｍｌの培地）を２８℃で２４時間にわたり続ける。

培地の成分は全て濾過滅菌する。

培養
培地を３部において滅菌する。

Ｔ０の直前に、添加用のグルコースをＫＨ２ＰＯ４で滅菌する。

残りの塩を０．７５ｍｌ／ｌのＣｌｅａｒｏｌＦＢＡ３１０７で発酵槽内において滅菌する。微量元素及びビタミンを濾過滅菌する。

Ｔ０時の容量は、最終容量の７５％に相当する。ｐＨを、水性アンモニアを用いてＴ０時に調整してから、なお水性アンモニアで６に調節する。

流加グルコース（濃度：５００ｇ／ｌ）をＴ０から一定の速度（計算に従って調整するべきである）で始めて連続的に供給して、２０ｇ／ｌ未満の濃度にならないようにする。終了時にグルコースは枯渇することになるが、発酵を停止する時点で５ｇ／ｌ未満まで下降することはない。

培養を２８℃で実行し、７０〜８５時間続ける。固定した一定のＯＴＲ（酸素吸収速度
）は、２０〜３０ｍｍｏｌのＯ２／ｌ／ｈである。

２つの発酵条件を実施する：
− コントロールとして：「標準的な」条件。炭素ベースの培養基の供給ではなく窒素供給を中断することにより、本質的に脂質を生産するようにＣ／Ｎ比（消費された窒素に対する消費された炭素）を最大にする。これにＯ２の制限はない。したがって、これらの条件は窒素欠乏である。

１つ又は複数の塩が枯渇する場合、窒素供給の抑制を行う。その後、実際の増殖は不可能であるか、又は非常に制限される。細胞増殖速度は下がり、存在する細胞の脂質富化の利益が得られる。細胞の全体質量は増大するが、細胞数はほとんど変化せず、なぜなら、増殖速度が落ちるからである。
− 本発明に従う：ＤＨＡが豊富で、アミノ酸アルギニン及びグルタミン酸が豊富な脂質を生産することを可能にする条件は、μが迅速にμ／μｍａｘ＜０．２まで下がるようにＯ２移行を制限することによって増殖速度を制限すると同時に、水性アンモニアによるｐＨの調節を介してグルコース及び窒素の供給を優先して維持することによるものである。

図１は、培養の終了時に算出したＣ／Ｎの関数として、アミノ酸のうちのアルギニン及びグルタミン酸の割合の変化を示している。

Ｃ／Ｎ比が１５未満である（＃μ／μｍａｘ＜０．２）場合、プロセスは、アミノ酸アルギニン及びグルタミン酸の生産を促進しているように見える。

以下の表ＩＩＩは、ＣＮＣＭＩ−４７０２株について、「従来の」操作条件及び本発明に従う操作条件に従って産生されるバイオマスの脂肪酸及びアミノ酸の組成を反映している。

アミノ酸の合計に対するグルタミン酸の割合は３．７５倍増大しており、アミノ酸の合計に対するアルギニンの割合は２．７５倍増大している。

脂質組成物は引き下げられるが、脂肪酸のＤＨＡ含有量はほぼ２倍増大している。

実施例２：ＣＮＣＭＩ−４４６９株を培養する条件
この微細藻類を培養する条件は、実施例１の条件と同じである（但し、シゾキトリウム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属種について、前培養において選択した接種原のレベルは約５ｇ／ｌであることを除く）。

「従来的に」実施される２つの培養条件に従い、及び本発明に従う。

以下の表ＩＶは、「従来の」操作条件及び本発明に従う操作条件に従って生産されるバイオマスの脂肪酸及びアミノ酸の組成を反映している。

シゾキトリウム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属種株について、効果は同じであるがより小さい。さらにまた、アミノ酸のうちのプロリンの割合が７５％増大していることも注目される。

アミノ酸アルギニン及びグルタミン酸の含有量は、それぞれ６０％及び７５％増大する一方、タンパク質含有量は２倍である。

脂肪酸におけるＤＨＡ含有量は２３％増大する。

Claims

パスツール研究所のＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎＮａｔｉｏｎａｌｅｄｅＣｕｌｔｕｒｅｓｄｅＭｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｓ［ＦｒｅｎｃｈＮａｔｉｏｎａｌＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎｏｆＭｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍＣｕｌｔｕｒｅｓ］にそれぞれ２０１１年４月１４日及び２０１２年１１月２２日に寄託された株ＣＮＣＭＩ−４４６９及びＣＮＣＭＩ−４７０２から選択される株である微細藻類のバイオマスをドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）で、かつアミノ酸アルギニン及びグルタミン酸で富化するプロセスにおいて、前記微細藻類の増殖速度を制限し、前記微細藻類の前記増殖速度の比率μ／μｍａｘの値が０．２未満になるようにするとともに、発酵培地中で窒素源を維持するか、又は発酵培地中に窒素源を連続的に導入する工程を含み、
前記微細藻類の前記増殖速度の前記制限は、Ｏ _２移行を制限することにより得られることを特徴とするプロセス。
前記バイオマスを収穫することと、任意選択的に前記バイオマスから細胞抽出物又は溶解物を調製することと、その後、任意選択的にＤＨＡが豊富な粗油を抽出することとをさらに含むことを特徴とする、請求項１に記載のプロセス。
得られる前記バイオマスは、総脂肪酸の少なくとも４５重量％のＤＨＡを含むことを特徴とする、請求項１又は２に記載のプロセス。
得られる前記バイオマスは、総アミノ酸に対して少なくとも１０重量％のアルギニン及び少なくとも２５重量％のグルタミン酸を含み、バイオマスの少なくとも４０重量％（ｇ／ｇ）の、Ｎ．６．２５で表されるタンパク質を含むことを特徴とする、請求項１〜３のいずれか一項に記載のプロセス。