KR20170105022A - Dha 및, arg 및 glu 아미노산을 갖는, 트라우스토키트리움 속 미세조류 바이오매스의 농축 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 발효 배지 중에 질소원을 유지하거나 발효 배지 내로 질소원을 연속 도입하는 것과 동시에 미세조류의 성장률 제한을 목표로 하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, DHA 및, 아르기닌 및 글루탐산 아미노산을 갖는, 트라우스토키트리움(Thraustochytrium) 속 미세조류 바이오매스를 농축하는 방법에 관한 것이다.
Description
본 발명은 도코사헥사엔산(DHA) 및, 아르기닌 및 글루탐산 아미노산을 갖는, 트라우스토키트리움(Thraustochytrium) 속, 보다 구체적으로 스키조키트리움(Schizochytrium) sp . 또는 스키조키트리움 만그로베이(Schizochytrium mangrovei) 미세조류 바이오매스를 농축하기 위한 신규 발효 방법, 및 또한 상기 미세조류 바이오매스로부터 추출되는 오일의 생산 방법에 관한 것이다.
지질의 기술 분야
지질은 단백질 및 탄수화물과 함께 다량영양소의 3가지 주요 패밀리 중 하나를 구성한다.
지질 가운데, 트리글리세라이드 및 인지질이 특히 두드러진다:
- 트리글리세라이드(트리아실글리세롤 또는 트리아실글리세라이드 또는 TAG로도 불림)는 글리세롤의 3개 하이드록실기가 지방산으로 에스테르화된 글리세라이드이다. 이들은 식물성 오일 및 동물 지방의 주요 구성분이다.
트리글리세라이드는 인간이 섭취하는 식이 지질의 약 95%를 차지한다. 유기체에서, 이들은 주로 지방 조직에 존재하며, 주요한 에너지 저장 형태를 구성한다.
- 인지질은 양친매성 지질, 즉 극성(친수성) "헤드" 및 2개의 지방족(소수성) "꼬리"로 구성되는 지질이다.
인지질은 이들이 특히 유동성을 제공하는 세포막의 구성분이므로, 구조적 지질이다.
트리글리세라이드 및 인지질은 식사에 의해 제공되기도 하고 이들 중 일부는 유기체에 의해 합성되기도 하는 지방산으로 주로 이루어진다.
생화학적 분류(지방산 분자에 함유되는 이중 결합의 수에 기반함)는 포화 지방산(SFA), 단일불포화 지방산(MUFA) 및 다중불포화 지방산(PUFA)을 구별한다.
생리적 관점에서, 다음과 같이 구별된다:
- 인체의 발생 및 정확한 기능수행을 위해 요구되지만, 우리 몸에서 생산할 수 없는 불가결 지방산;
- 정상 성장 및 세포의 생리적 기능을 위해 필수적이지만, 식사에 의해 제공되는 경우 이의 전구체로부터 생산될 수 있는, "조건부" 불가결 지방산. 따라서 이의 필수 전구체가 부재하는 경우, 이들은 절대적으로 요구된다.
- 비-불가결 지방산.
모든 불가결 및 "조건부" 불가결 지방산이 필수 지방산을 구성한다.
다른 지방산은 비-필수로 불린다.
비-불가결 지방산에는 특히
- 오메가 3 지방산 패밀리의 에이코사펜타엔산(EPA),
- 우리 식사에서 주요 단일불포화 지방산인 올레산 및 팔미톨레산,
- 포화 지방산, 예컨대 라우르산, 미리스트산 또는 팔미트산이 포함된다.
보다 구체적으로, 다중불포화 지방산은 마지막 메틸 작용기부터 시작해서, 첫 번째 이중 결합의 위치에 따라 분류된다.
따라서 명명법에서, 오메가 "x" 또는 "nx"에 대해, "x"는 첫 번째 불포화부 위치에 해당한다.
필수 지방산의 두 주요 패밀리가 구별된다: 오메가 6 지방산(또는 n-6 PUFA)는 그 전구체 및 주요 대표물이 리놀레산(LA)이며, 오메가 3 지방산(또는 n-3 PUFA)는 그 전구체가 알파-리놀렌산(ALA)이다.
생물학적 관심의 대상인 대부분의 다중불포화 지방산은 오메가 6 패밀리(아라키돈산 또는 ARA) 또는 오메가 3 패밀리(에이코사펜타엔산 또는 EPA, 도코사헥사엔산 또는 DHA)에 속한다.
또한 명명법에서, 사슬을 구성하는 탄소의 수가 또한 정의된다: 따라서, EPA는 C20:5로 그리고 DHA는 C22:6으로 기재된다.
따라서 "5" 및 "6"은 각각 EPA 및 DHA로 나타내는 탄소쇄의 불포화부 수에 해당한다.
오메가 3 지방산 패밀리의 DHA는 유기체가 알파-리놀렌산으로부터 합성하는 방법을 아는, 또는 지방성 어류(참치, 연어, 청어 등)의 소비에 의해 제공되는 지방산이다.
DHA는 막 구조에서 그리고 뇌 및 망막의 발생 및 기능에서 중요한 역할을 담당한다.
어류 오일은 주로 오메가 3 지방산, 예컨대 DHA 및 EPA의 원천으로서 이용되지만, 이들은 또한 미세조류의 오일에서도 확인되며, 특정한 선택된 균주, 예컨대 소량의 EPA만을 그러나 다량의 DHA 함량을 함유하는 스키조키트리움 속의 균주로부터 유래되는 오일에서와 같이 혼합물로서 또는 개별적으로 추출된다.
펩타이드
및 아미노산의 기술분야
펩타이드 및 아미노산은 여러 분야에서 기능성 제제 또는 식품 첨가물로서 통상적으로 활용된다.
관심 아미노산의 공급 맥락에서, 실제로 아르기닌 및 글루탐산이 풍부한 이용 가능한 펩타이드 원천을 갖는 것이 유리할 수 있다.
아르기닌은 동물계에서 여러 기능을 갖는 아미노산이다.
아르기닌은 분해될 수 있고, 이에 따라 이를 동화하는 세포에 대한 에너지원, 탄소원 및 질소원으로서 작용할 수 있다.
포유동물을 포함하는 다양한 동물에서, 아르기닌은 오르니틴 및 요소로 분해된다. 후자는 동물 유기체의 세포에 존재하는 질소성 화합물의 양을 조절하기 위해 제거될 수 있는(소변 중 배출을 통해) 질소성 분자이다.
아르기닌은 NO 합성효소를 통해 일산화질소(NO)의 합성을 허용하며, 이에 따라 동맥의 혈관확장에 참여하고, 이는 혈관의 강성도를 감소시키고, 혈류를 증가시키고, 이에 따라 혈관의 기능수행을 개선한다.
아르기닌을 함유하는 식품 첨가물은 심장 건강, 혈관 기능의 촉진을 위해, "혈소판 응집"(혈괴 형성의 위험)의 방지를 위해 그리고 동맥압의 저하를 위해 권장된다.
상처 치유에서 아르기닌의 관여는 프롤린 형성에서의 그 역할과 연관되며, 이는 콜라겐 합성에서 또 다른 중요한 아미노산이다.
마지막으로, 아르기닌은 특히 스포츠인의 에너지 음료에서 빈번하게 이용되는 성분이다.
글루탐산에 있어서, 이는 단백질 합성을 위해 이용되는 원소 블록 중 하나에만 그치지 않고 또한 중추 신경계(뇌와 척추)에서 가장 널리 퍼져있는 흥분성 신경전달물질이며, GABA성 뉴론에서의 GABA 전구체이다.
코드 E620 하에, 글루타메이트는 식품에서 풍미 증강제로서 이용된다. 이는 식품 조제물에 이들의 맛을 증강시키기 위해 첨가된다.
글루타메이트에 더하여, 식품규격위원회(Codex Alimentarius)에는 이의 나트륨염(E621), 칼륨염(E622), 칼슘염(E623), 암모늄염(E624) 및 마그네슘염(E625)이 또한 풍미 증강제로서 확인된다.
글루타메이트(또는 이의 염)는 기성식(수프, 소스, 크리스프 및 기성식 요리)에 종종 존재한다. 이는 또한 아시아 요리에서 일반적으로 이용된다.
이는 현재 아페리티프에서의 풍미제(베이컨 풍미, 치즈 풍미)와 조합되어 빈번하게 이용된다. 이는 베이컨, 치즈 등의 풍미를 증강시킬 수 있다. 이것을 전혀 함유하지 않는 아페리티프를 찾기는 쉽지 않다.
이는 또한 특정한 약제 캡슐에서 확인되지만, 그 맛 기능을 위한 것은 아니다.
마지막으로, 이는 요리 보조제(스톡 큐브, 소스 베이스, 소스 등)의 주요 성분이다.
미세조류에 의한 지질, 특히 지방산의 생산
스키조키트리움 속의 미세조류는 통상적으로 발효기에서(종속영양 조건: 암소에서 탄소원의 존재 하에) 배양된다.
이러한 미세조류의 수익성 있는 이용은 일반적으로 발효 조건의 제어를 요구함이 주지되어야 한다.
따라서, 상기 결과를 달성하기 위해, 최대 지질 수율 및 생산성을 수득하기 위해 높은 세포 밀도(HCD)를 수득할 수 있도록 하는 발효를 위한 최초 방법이 상당히 개발되었다.
이러한 HCD 배양의 목표는 가능한 최단 시기에 가능한 최고 농도의 원하는 지질을 수득하는 것이었다.
그러나, 당업자에게는, 예를 들어 이들이 대규모 지질 저장을 일으킬 수 있도록 하기를 원하는 경우, 미세조류가 이의 성장을 제한하는 영양적 스트레스를 거치는 것이 필요함이 곧 자명해졌다.
따라서, 성장 및 생산은 통상적으로 발효 방법에서 커플링되지 않는다.
예를 들어, 다중불포화 지방산(이 경우에는 도코사헥사엔산 또는 DHA)의 축적을 촉진하기 위해, 특허 출원 WO 01/54510은 다중불포화 지방산의 생산과 세포 성장을 분리할 것을 권장한다.
보다 구체적으로, 미생물 지질의 생산 방법이 청구되며, 이 방법은
(a) 미생물, 탄소원 및 제한 영양원을 포함하는 배지의 발효를 수행하고, 바이오매스를 증가시키기 위해 상기 발효 배지 중 적어도 약 4% 포화도의 용존 산소량을 유지하기에 충분한 조건을 확실히 하는 단계;
(b) 이어서 상기 발효 배지 중 약 1% 이하 포화도의 용존 산소량을 유지하기에 충분한 조건을 제공하고 상기 미생물이 상기 지질을 생산할 수 있도록 하기에 충분한 조건을 제공하는 단계;
(c) 및 상기 미생물 지질을 수집하며, 여기서 적어도 약 15%의 상기 미생물 지질이 다중불포화 지질로 구성되는, 단계로 구성되는 단계들을 포함하며;
적어도 약 100 g/l의 바이오매스 밀도가 발효 과정에 걸쳐 수득된다.
따라서, 미세조류 스키조키트리움 sp . 균주 ATCC 20888에서, 제1 성장기는 보다 구체적으로는 높은 세포 밀도의 생산을 촉진하기 위해, 탄소원 및 질소원의 존재 하에, 그러나 산소를 제한하지 않고 수행된 후, 제2 기에서, 미세조류에 스트레스를 주고, 그 성장을 완화시키고, 관심 지방산의 생산을 유발하기 위해, 질소 공급이 중단되고 산소 공급이 점차 완화된다(용존 산소압 또는 pO2를 10%에서 4%까지, 이어서 0.5%까지 관리).
미세조류 크립테코디니움 코니이(Crypthecodinium cohnii)에서, 더 높은 DHA 함량은 낮은 글루코스 농도(5 g/l 수준)에서, 이에 따라 낮은 성장률에서 수득된다(Jiang and Chen, 2000, Process Biochem., 35(10), 1205-1209).
결과적으로, 산물의 형성이 높은 세포 성장과 연관되지 않는 경우, 세포 성장률을 제어하는 것이 현명하다는 것이 교시된다.
일반적으로, 당업자는 발효 조건(온도, pH 등)의 제어에 의해 또는 발효 배지에 대한 영양 성분의 조절 공급("공급 배치"로 불리는 반연속식 조건)에 의해 미세조류의 성장을 제어하는 것을 선택한다.
이들이 미세조류의 성장을 탄소원 공급을 통해 종속영양적으로 제어하는 것을 선택하는 경우, 당업자는 일반적으로 탄소원(순수 글루코스, 아세테이트, 에탄올 등)을 생산되는 대사물질(예를 들어, DHA 유형의 다중불포화 지방산)에 따라서 미세조류(씨. 코니이(C. cohnii), 유글레나 그라실리스(Euglena gracilis) 등)에 대해 차용하는 것을 선택한다.
온도도 핵심 파라미터일 수 있다. 예를 들어, 일부 미세조류 종에서의 다중불포화 지방산, 예컨대 클로렐라 미누티씨마(Chlorella minutissima)에 의한 EPA의 합성은 상기 미세조류의 최적 성장을 위해 요구되는 것보다 낮은 온도에서 촉진된다고 보고되었다.
트리글리세라이드의 생산을 최적화하기 위해, 당업자는 또한 발효 배지의 영양 환경에 작용함으로써, 오일 생산을 향한 탄소 흐름을 최적화하도록 유도된다.
따라서, 충분한 탄소 공급이 존재하는 경우, 그러나 질소 결핍 조건 하에 있을 때, 오일이 축적되는 것으로 알려져 있다.
따라서, C/N 비가 여기서 결정 요인이며, 최고의 결과는 질소 함량에 직접 작용함으로써 수득되고 글루코스 함량은 제한 요인이 아닌 것으로 받아들여진다.
따라서 오일 생산을 최적화하기 위해, 당업자에게는 탄소 흐름을 오일 생산을 향해 단백질 생산의 손상까지 이동시킴으로써 이를 제어하는 것이 필수적이다; 미세조류가 질소-결핍 배지에 놓이는 경우, 탄소 흐름이 재분포되고 지질 저장 물질로서 축적된다.
미세조류에 의한 단백질 생산
상기에 상세히 설명된 바와 같이, 트리글리세라이드의 생산을 최적화하기 위해, 당업자는 발효 배지의 영양 환경에 작용함으로써, 탄소 흐름을 오일 생산을 향해 최적화하도록 유도된다.
클로렐라(Chlorella) 유형의 미세조류에서 수행된 연구에서, 질소 결핍은 세포 성장에 영향을 미침으로써, 미세조류의 정상 성장률에 비해 30% 감소된 성장률을 유도하는 것이 주지되었다(Xiong et al., Plant Physiology, 2010, 154, pp. 1001-1011).
상기 결과를 설명하기 위해, 상기 언급된 문헌에서 Xiong 등은 실제로 클로렐라 바이오매스가 그 5가지 주요 성분, 특히 탄수화물, 지질, 단백질, DNA 및 RNA(이의 고형분의 85%를 차지함)로 구분되는 경우, C/N 비는 DNA, RNA 또는 탄수화물 함량에 영향을 미치지 않지만, 단백질 및 지질 함량에 있어서는 주요해짐을 나타낸다.
따라서, 낮은 C/N 비로 배양된 클로렐라 세포는 25.8% 단백질 및 25.23% 지질을 함유하는 반면, 높은 C/N 비는 53.8% 지질 및 10.5% 단백질 합성을 가능하게 한다.
따라서 단백질 생산을 최적화하기 위해, 당업자에게는 탄소 흐름을 단백질 생산을 향해 지질 생산의 손상까지 이동시킴으로써 이를 제어하는 것이 필수적이다; 미세조류가 질소 결핍되지 않은 배지에 놓이는 경우 탄소 흐름이 재분포되고 단백질 저장 물질로서 축적된다.
따라서 상기 교시로부터, 단백질 및 이에 따라 이를 구성하는 아미노산이 풍부한 바이오매스를 생산하기 위해, 당업자는 낮은 C/N 비를 촉진하는 대신 발효 조건에 대해 작업하도록 유도되며, 이에 따라
- 단백질로 전환될 탄소원 공급원료를 일정하게 유지하면서 발효 배지에 다량의 질소원을 공급하고, 및
- 미세조류의 성장을 자극한다.
본 발명은 지질 분획에 DHA가 풍부하고 총 아미노산 대비 아르기닌 및 글루탐산 아미노산의 함량이 높은 트라우스토키트리움 속 미세조류 바이오매스의 생산 방법에 관한 것이다.
상기 방법은 미세조류의 성장률 제어에 기반하며, 상기 제어는 발효 배지 중에 질소원을 유지하거나 발효 배지 내로 질소원을 연속 도입하는 것과 동시에 그 성장률을 그 최소까지 감소시키도록 실시된다.
상기 결과는, 예를 들어 발효 배지 중 미량 원소를 감소시키거나 고갈시킴으로써 또는 O2 전달을 제한함으로써 수득될 수 있다.
따라서 본 발명에 따른 방법의 하나의 바람직한 구현예에서, 산소 공급을 제한함으로써 미세조류의 성장률을 제한하는 것이 선택된다.
본 발명의 목적을 위해, 성장률의 제한은 미세조류의 실제 성장률(μ)과 그 최적 성장률(μmax) 간 비에 의해 평가되며, 여기서 "μ"는 시간 당, 즉 (h-1), 바이오매스 1 g 당 형성되는 바이오매스 g으로 표시되는 성장 속도이다.
보다 구체적으로, 본 발명의 방법은 DHA 및, 아르기닌 및 글루탐산 아미노산을 갖는 트라우스토키트리움 속 미세조류의 바이오매스를 농축하는 방법으로서, 미세조류의 성장률 비의 값 μ/μmax가 0.2 미만이 되자마자 발효 배지 중에 질소원을 유지하거나 발효 배지에 질소원을 첨가하는 것으로 구성되는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.
바람직하게는, 미세조류는 스키조키트리움 sp . 속 또는 스키조키트리움 만그로베이이다.
보다 구체적으로, 미세조류는 각각 2011년 4월 14일 및 2012년 11월 22일에 파스퇴르 연구소 프랑스 국립 미생물 배양 수집처(Collection Nationale de Cultures de Microorganismes)에 기탁된 균주 CNCM I-4469 및 CNCM I-4702로부터 선택된 균주일 수 있다.
선택적으로, 방법은 또한 바이오매스를 수확하는 단계, 선택적으로 상기 바이오매스로부터 세포 추출물 또는 용해물을 제조하는 단계, 이어서 선택적으로 DHA가 및 아르기닌 및 글루탐산 아미노산이 풍부한 미정제 오일을 추출하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 방법은 수득되는 바이오매스가
- 총 지방산의 적어도 45중량%의 DHA; 및
- 총 아미노산의 적어도 10중량%의 아르기닌 및 적어도 25중량%의 글루탐산, 바람직하게는 총 아미노산의 적어도 15중량%의 아르기닌 및 적어도 40중량% 글루탐산을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 맥락 내에서, 본 출원사는 발효를 수행하는 신규 방식을 제안함으로써 DHA 그리고 아르기닌 및 글루탐산 아미노산의 생산을 최적화하기 위한 원래 경로를 탐색하기로 선택하였다.
따라서 본 출원사는 대상체에 대한 기술적 편견에 반하여, 선행기술에 기재된 바와 같이, C/N 비(소비된 질소 대비 소비된 탄소, 몰/몰)를 최대화하는 것을 필수적으로 하지 않고, 발효에 의해,
- 지질이 풍부하고(바이오매스 건조 중량의 25중량% 초과, 바람직하게는 적어도 30중량%), 그 주요 지방산이 도코사헥사엔산(DHA)이며, 및
- 아르기닌 및 글루탐산 아미노산이 풍부한(총 아미노산의 35중량% 초과, 바람직하게는 적어도 55%)
미세조류 바이오매스를 생산할 수 있음을 확인하였다.
따라서 본 출원사는 성장률 μ/μmax가 0.2 미만인 경우에도 발효를 통해 지질 생산을 위해 통상적이 아닌, 질소 공급의 유지를 통해 발효에 의해 생산되는 바이오매스의 지질 및 아미노산 조성을 개질할 수 있음을 확인하였다.
실제로, 본 출원사는 μ/μmax 비가 0.2 미만이 되는 경우, 질소성 또는 탄소-계 기질 이외의 영양 기질의 제한에 따라, 상당한 DHA 생산을 보유하는 것과 동시에, 아르기닌 및 글루탐산 아미노산의 생산을 향해 대사 생산을 이동시킬 수 있음을 이해하였다.
하나의 구현예에서, 성장률을 감소시킬 수 있는 제한은 산소 공급(OTR, 산소 전달률)의 제한일 수 있다.
특히, 발효기 동안 OTR은 바람직하게는 30 mmol/l/h 내지 35 mmol/l/h이다.
성장 제한은 또한 미량 원소 또는 바람직하게는 포스페이스, 마그네슘 또는 칼륨으로부터 선택되는 무기질을 고갈시킴으로써 유도될 수 있다.
보다 구체적으로, 본 출원사는 바람직하게는 암모니아수 형태(예를 들어, pH 조절에서 이용됨)로 질소를 공급하는 것이 필요하거나, μ가 μmax의 20% 미만인 한, 배양 말기까지, 질소 공급을 유지하는 것이 필요함을 확인하였다.
하나의 바람직한 구현예에서, 초기 질소 공급은 pH의 조절에 의해 첨가되며, 이에 따라 소비되는 질소는 pH의 조절에 의해 보상된다. 이는 배양 말기에 20 미만, 예를 들어 10 내지 15, 바람직하게는 약 15의 C/N 비(소비된 질소 대비 소비된 탄소, 몰/몰)를 수득할 수 있도록 한다.
본 발명의 방법에서 이용될 균주는 트라우스토키트리움 속, 보다 구체적으로 스키조키트리움 만그로베이 또는 스키조키트리움 sp.의 균주이다. 이러한 균주는 당업자에게 공지되어 있다.
이들의 연구 과정에서, 본 출원사는 DHA를 생산하는 매우 큰 관심 대상인 몇몇 미세조류 균주를 확인하였다. 본 출원사는 특히 확인된 2가지 균주에 매우 관심이 있다.
첫 번째 균주는 파스퇴르 연구소 프랑스 국립 미생물 배양 수집처(25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15, France)에 번호 I-4469 하에 2011년 4월 14일에 프랑스에, 그리고 또한 중국 우한 대학의 CCTCC(중국 배양 수집 센터, China Center for Type Culture Collection)(Wuhan 430072, P.R. China)에 번호 M 209118 하에 중국에 기탁된 스키조키트리움 sp .의 균주이다. 상기 균주는 주로 DHA 및 더 적은 정도의 팔미트산 및 팔미톨레산을 생산한다. 이는 스키조키트리움 sp . 유형의 균주인 것으로 확인할 수 있도록 하는 18S RNA를 인코딩하는 유전자(SEQ ID No 1)의 부분적 서열분석에 의해 특성규명되었다:
상기 균주는 이후 본 출원에서 "CNCM I-4469"로 표시될 것이다.
또한, 두 번째 균주는 스키조키트리움 만그로베이 균주이다. 이는 비교적 동일한 비율로 DHA 및 팔미트산을 생산한다. 이는 본 출원사에 의해 2012년 11월 22일에 파스퇴르 연구소 CNCM(25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15)에 번호 CNCM I-4702 하에 프랑스에 기탁되었다. 이는 스키조키트리움 만그로베이 유형의 균주인 것으로 확인할 수 있도록 하는 18 S rRNA를 인코딩하는 유전자(SEQ ID No 2)의 서열분석에 의해 특성규명되었다:
상기 균주는 이후 본 출원에서 "CNCM I-4702"로 표시될 것이다.
또한, 본 발명에 따른 발효 방법은 종속영양 배양 조건 하에 수행된다. 고려되는 미세조류에 차용된 이러한 조건 및 또한 배양 배지는 당업자에게 널리 공지되어 있다.
미세조류의 성장을 위해 필요한 탄소원은 바람직하게는 글루코스이다.
바람직하게는, 글루코스 공급은 발효 동안 글루코스 농도가 20 g/l 이상의 농도로 유지되도록 하는 것이다. 발효 말기에, 글루코스 농도는 적어도 5 g/l이다.
질소원은 단독으로 또는 조합되어 이용되는, 효모 추출물, 요소, 나트륨 글루타메이트, 암모늄 설페이트, pH 조절작용을 갖는 암모니아수일 수 있다.
일반적으로, 배양 단계는 균주를 재생시키기 위한 예비 배양 단계, 이어서 배양 또는 적절한 발효 단계를 포함한다. 후자의 단계는 관심 지질, 특히 DHA의 생산 단계에 해당한다.
바람직하게는, pH는 5 내지 7의 pH, 바람직하게는 약 6의 pH에서 발효 동안 조절된다.
바람직하게는, 발효 동안의 온도는 26℃~30℃, 바람직하게는 약 28℃이다.
발효 시간은 바람직하게는 적어도 50시간, 바람직하게는 65시간 내지 90시간, 보다 바람직하게는 70시간 내지 85시간이다.
본 발명에 따른 발효 방법은 총 지방산의 적어도 45중량%의 DHA를 포함하는 바이오매스를 수득할 수 있도록 한다(또는 이를 수득하도록 하는 방식으로 수행된다). 또한, 방법은 바이오매스에 비해 적어도 25중량%의 지질 함량을 보장한다. 따라서, 바이오매스에는 실제로 DHA가 풍부하다.
또한, 본 발명에 따른 발효 방법은 바이오매스에 비해 적어도 40중량%의 단백질을 포함하는 바이오매스를 수득할 수 있도록 한다(또는 이를 수득하도록 하는 방식으로 수행된다). 또한, 총 아미노산 대비 글루탐산의 비율은 적어도 25%이다. 아르기닌 비율은 적어도 10%이다.
CNCM I-4702 균주에 있어서, 본 발명에 따른 발효 방법으로 수득되는 결과는 총 지방산의 약 47중량%의 DHA를 포함하는 바이오매스이며, 지질 함량은 바이오매스 대비 약 35중량%이고, 글루탐산 약 40% 및 아르기닌 약 16%의 비율로, 단백질 함량은 약 53중량%이다.
CNCM I-4469 균주에 있어서, 본 발명에 따른 발효 방법으로 수득되는 결과는 총 지방산의 약 52중량%의 DHA를 포함하는 바이오매스이며, 지질 함량은 바이오매스 대비 약 26중량%이고, 글루탐산 약 26% 및 아르기닌 약 10%의 비율로, 단백질 함량은 약 43중량%이다.
중량%에 대해 언급되는 경우, 이는 건조 중량인 것으로 이해된다.
바이오매스 이외에, 본 발명은 또한 상기 바이오매스로부터 제조되는 세포 추출물 또는 용해물에 관한 것이다. 특히, 상기 추출물 또는 용해물은 발효 후 회수되는 바이오매스로부터 제조된다. 상기 추출물 또는 용해물에는 DHA 그리고 아르기닌 및 글루탐산 아미노산이 풍부하다.
세포는 기계적, 화학적 및 효소적 방식을 포함하는 다양한 방식으로 지질 함량을 추출하기 위해 파열될 수 있다.
이후 오일이 세포 용해물로부터 추출될 수 있다.
따라서, 관심 지질, 바람직하게는 DHA, 그리고 아르기닌 및 글루탐산 아미노산의 생산 방법은 본 발명에 따른 방법으로 발효시키는 단계, 바이오매스를 수확하는 단계, 세포 추출물 또는 용해물을 제조하는 단계 및 관심 지질, 바람직하게는 DHA 그리고 선택적으로 아르기닌 및 글루탐산 아미노산을 포함하는 미정제 오일을 추출하는 단계를 포함한다.
용어 "약"은 상기 값의 +10% 또는 -10%의 값, 바람직하게는 상기 값의 +5% 또는 -5%의 값을 의미하려는 것이다.
본 발명은 예시적이고 비제한적인 것으로 의도되는 다음 실시예로부터 보다 명확히 이해될 것이다.
실시예
1:
CNCN
I-4702 균주의 배양 조건
프로토콜은 스키조키트리움 만그로베이 CNCM I-4702 균주에 대해 0.1 g/l의 바이오매스로 발효기 접종을 위한 예비 배양을 포함한다.
예비 배양
500 ml 배플 포함 에를렌마이어 플라스크 중 예비 배양(100 ml 배지)을 28℃에서 24 h 동안 지속한다.
모든 배지 성분을 여과에 의해 멸균화한다.
배양
배지를 3 부분으로 멸균화한다.
글루코스를 T0 직전에 첨가를 위해 KH2PO4로 멸균화한다.
나머지 염을 0.75 ml/l의 Clearol FBA 3107로 발효기에서 멸균화한다. 미량 원소 및 비타민을 여과에 의해 멸균화한다.
T0에서의 부피는 최종 부피의 75%를 차지한다. pH는 암모니아수를 이용해서 T0에서 조정한 뒤, 여전히 암모니아수로 6으로 조절한다.
글루코스 공급 배치(농도: 500 g/l)를 20 g/l 미만 농도가 되지 않도록 일정한 속도로(계산에 따라 조정됨) T0부터 시작해서 연속 공급한다. 말기에, 글루코스는 발효가 정지되는 시점에 5 g/l 미만으로 떨어지지 않고 고갈될 것이다.
배양을 28℃에서 수행하고 20 mmol 내지 30 mmol의 O2/l/h의 고정된 일정한 OTR(산소 섭취율)로 70시간 내지 85시간 지속한다.
스톡
용액
2가지 발효 조건을 실행한다:
- 대조군으로: O2의 제한 없이, 탄소-계 기질이 아닌 질소 공급을 방해함으로써 본질적으로 지질을 생산하기 위해, C/N 비(소비된 질소 대비 소비된 탄소)를 최대화하는 "표준" 조건. 이에 따라 이들 조건은 질소 결핍성이다.
질소 공급의 억제는 하나 이상의 염이 고갈되는 경우 일어난다. 이어서 실제 성장이 불가능하거나 매우 제한된다: 존재하는 세포의 지질 농축의 이익까지 세포 증식률이 감소한다. 전반적 세포 물질은 증가하지만 성장률이 떨어지므로 세포수는 거의 변화하지 않는다.
- 본 발명에 따라: 바람직하게는 암모니아수를 이용한 pH의 조절을 통해 글루코스 및 질소 공급을 유지하는 것과 동시에, μ가 0.2 미만의 μ/μmax까지 신속히 감소하도록 O2 전달을 제한함으로써 성장률을 제한하여 아르기닌 및 글루탐산이 풍부한 아미노산을 함유하는 DHA가 풍부한 지질을 생산할 수 있도록 하는 조건.
도 1은 배양 말기에 계산되는 C/N의 함수로서 아미노산 중 아르기닌 및 글루탐산의 비율 변화를 나타낸다.
본 방법은 C/N 비가 15 미만(#μ/μmax 0.2 미만)인 한 아르기닌 및 글루탐산 아미노산의 생산을 촉진하는 것으로 나타난다.
아래 표 3은 CNCN I-4702 균주에 있어서, "통상적" 작동 조건 및 본 발명에 따른 작동 조건에 따라 생산되는 바이오매스의 지방산 및 아미노산 조성을 반영한다.
아미노산의 합 대비 글루탐산 비율은 3.75배가 되고 아미노산의 합 대비 아르기닌 비율은 2.75배가 된다.
지질 조성은 감소되지만, 지방산의 DHA 함량은 거의 2배가 된다.
실시예
2:
CNCN
I-4469 균주의 배양 조건
상기 미세조류의 배양 조건은 실시예 1에서와(예비 배양에서 선택된 접종물 수준이 스키조키트리움 sp.에 있어서 약 5 g/l인 것을 제외하고) 동일하다.
"통상적으로" 실행된 2가지 배양 조건에 따라 그리고 본 발명에 따라.
아래의 표 4는 "통상적" 작동 조건 및 본 발명에 따른 작동 조건에 따라 생산되는 바이오매스의 지방산 및 아미노산 조성을 반영한다.
스키조키트리움 sp. 균주에 있어서, 효과가 동일하지만 더 작다. 또한, 아미노산 중 프롤린 비율에서 75% 증가가 또한 주지된다.
단백질 함량이 2배가 되는 반면, 아르기닌 및 글루탐산 아미노산 함량은 각각 60% 및 75% 증가한다.
지방산에서 DHA 함량은 23% 증가한다.
SEQUENCE LISTING
<110> ROQUETTE FRERES
<120> PROCEDE D'ENRICHISSEMENT DE LA BIOMASSE DE MICROALGUES DU GENRE
TRAUSTOCHYTRIUM EN DHA ET EN ACIDES AMINES ARG ET GLU
<130> B1954PC
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 479
<212> DNA
<213> Schizochytrium sp
<400> 1
gagggtttta cattgctctc attccaatag caagacgcga agcgccccgc attgatattt 60
ctcgtcacta cctcgtggag tccacattgg gtaatttacg cgcctgctgc cttccttgga 120
tgtggtagcc gtctctcagg ctccctctcc ggagtcgagc cctaactccc cgtcacccgt 180
tatagtcacc gtaggccaat accctaccgt cgacaactga tggggcagaa actcaaacga 240
ttcatcgctc cgaaaagcga tctgctcaat tatcatgact caccaagaga gttggcttag 300
acctaataag tgcggccctc cccgaaagtc gggcccgtac agcacgtatt aattccagaa 360
ttactgcagg tatccgtata aaggaactac cgaagggatt ataactgata taatgagccg 420
ttcgcagttt cacagtataa ttcgcttata cttacacatg catggcttag tctttgaga 479
<210> 2
<211> 454
<212> DNA
<213> Schizochytrium mangrovei
<400> 2
ggttttacat tgctctcatt ccgatagcaa aacgcataca cgcttcgcat cgatatttct 60
cgtcctacct cgtggagtcc acagtgggta atttacgcgc ctgctgctat ccttggatat 120
ggtagccgtc tctcaggctc cctctccgga gtcgagccct aactctccgt cacccgttat 180
agtcaccgta gtccaataca ctaccgtcga caactgatgg ggcagaaact caaacgattc 240
atcgaccaaa awagtcaatc tgctcaatta tcatgattca ccaataaaat cggcttcaat 300
ctaataagtg cagccccata cagggctctt acagcatgta ttatttccag aattactgca 360
ggtatccata taaaagaaac taccgaagaa attattactg atataatgag ccgttcgcag 420
tctcacagta caatcgctta tacttacaca gcag 454
Claims (7)
- 도코사헥사엔산(DHA) 및, 아르기닌 및 글루탐산 아미노산을 갖는, 트라우스토키트리움(Thraustochytrium) 속 미세조류 바이오매스를 농축하는 방법으로서, 미세조류의 성장률의 비 μ/μmax의 값이 0.2 미만이 되자마자 발효 배지 중에 질소원을 유지하거나 발효 배지 내로 질소원을 연속 도입하는 것과 동시에 미세조류의 성장률을 제한하는 것을 목표로 하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항에 있어서, 미세조류가 스키조키트리움(Schizochytrium) sp . 또는 스키조키트리움 만그로베이(Schizochytrium mangrovei) 속인 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서,
미세조류가 각각 2011년 4월 14일 및 2012년 11월 22일에 파스퇴르 연구소의 프랑스 국립 미생물 배양 수집처(Collection Nationale de Cultures de Microorganismes)에 기탁된 균주 CNCM I-4469 및 CNCM I-4702로부터 선택된 균주인 것을 특징으로 하는 방법. - 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 미세조류의 성장률 제한이 발효 배지 중 미량 원소의 감소 또는 고갈에 의해 또는 O2 전달의 제한에 의해, 바람직하게는 O2 전달의 제한에 의해 수득되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 또한 바이오매스를 수확하는 단계, 선택적으로 상기 바이오매스로부터 세포 추출물 또는 용해물을 제조하는 단계, 이어서 선택적으로 DHA가 풍부한 미정제 오일을 추출하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 수득되는 바이오매스가 총 지방산의 적어도 45중량%의 DHA를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 수득되는 바이오매스가 총 아미노산에 대해 적어도 10중량%의 아르기닌 및 적어도 25중량%의 글루탐산을 함유하는, N.6.25로 표시되는 바이오매스의 적어도 40중량% 단백질(g/g)을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
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Country Status (11)
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