KR20140019840A - 스키조키트리움 종의 돌연변이유발 방법 및 이의 생성되는 변이체 균주 - Google Patents

스키조키트리움 종의 돌연변이유발 방법 및 이의 생성되는 변이체 균주 Download PDF

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Abstract

신규한 스키조키트리움 변이체 균주가 제공된다. 특히, 증가된 DHA 함량 및/또는 향상된 성장 속도의 특성을 갖는 신규한 스키조키트리움 변이체 균주 및 이를 사용한 DHA의 생성 방법이 제공된다. 또한, 스키조키트리움 균주를 UV 복사에 노출시켜, 균주의 돌연변이유발을 유도하는 단계, 및 UV 돌연변이유발에 의해 수득되는 균주를 지방 합성의 주요 효소, 아세틸 보조효소 A 카르복실라제의 저해제 (예를 들어, 퀴잘로포프)에 의한 선택압 하에서 나이브 스키조키트리움 균주에 비하여 향상된 성장 속도 및 증가된 DHA 함량을 갖는 균주에 대하여 스크리닝하는 단계를 포함하는 본 발명의 신규한 스키조키트리움 변이체 균주의 생성 방법이 제공된다.

Description

스키조키트리움 종의 돌연변이유발 방법 및 이의 생성되는 변이체 균주{METHODS OF MUTAGENESIS OF SCHIZOCHYTRIUM SP AND VARIANT STRAINS PRODUCED THEREOF}
본 출원은 미생물의 유전학적 육종 기술 및 생물학적 발효 기술, 특히, DHA (도코사헥사엔산)를 생성하는 미세조류 (microalgae)의 변이체 또는 돌연변이체 균주에 관한 것이다.
DHA (도코사헥사엔산, C22:6, (오메가-3))는 필수 지방산, 다시 말하면, 인간 체내에서 합성할 수 없고, 중요한 생리적 기능을 갖는 장쇄 지방산이다. DHA는 인간 뇌 및 망막 내의 주요 구성성분이다. 전체 DHA의 20%는 대뇌 피질 내에 존재하며, 최대 50%가 망막 내에 존재한다. 따라서, 이는 신경계 및 시각계의 발생, 및 정상의 지능 및 시각 기능의 유지에서 중요한 역할을 수행한다. 또한, DHA는 심혈관 질환, 암, 염증 등의 예방에서 생리적 기능을 갖는다. 게다가, 이는 또한 성장 및 발생을 위하여, 다양한 해수어가 필요로 하는 필수 지방산이며, 이는 치어의 생존률을 향상시킬 수 있으며, 백색증의 발병률을 감소시킬 수 있다. 통상적으로 DHA는 어유로부터 수득된다. 그러나, 어유로부터의 다가불포화 지방산 (PUFA)의 추출은 불안정한 산출량, 낮은 수율 및 높은 비용 및 다른 ω-6 PUFA의 오염과 같은 몇가지 문제를 갖는다. 통상적인 DHA의 자원은 점점 더 제한되는 어업 자원 때문에, 증가하는 시장의 DHA의 요구를 만족시킬 수 없다. 그러므로, 새로운 DHA 자원의 개발은 새로운 핫스팟이 되었다.
스키조키트리움 종은 DHA 및 다른 다가불포화 지방산 (PUFA)을 생성하기 위한 상업적 공급원으로 개발된 해양 미세조류 (또는 가성-진균 (pseudo-fungi))이다. 스키조키트리움 종의 생물안전성이 확인되었다. 하몬드 (Hammond) 등은 랫트 (rat) 및 토끼에 대하여 이를 사용한 일련의 시험을 수행하였고, 부작용이 관찰되지 않았다.
그러나, 발효 공정에서, 스키조키트리움 종 균주의 품질 저하가 불가피하며, 이는 DHA의 수율 감소를 야기한다. 따라서, 스키조키트리움 종 산업에서 지속가능한 개발을 촉진하기 위하여 균주 품질 (주로 성장 속도, 특히 DHA 함량)의 지속적 개선이 중요하다.
아세틸-CoA 카르복실라제 (ACC, (EC 6.4.1.2))는 지방산 합성의 주요 효소이며, 제초제 퀴잘로포프 (Quizalofop) {2-[4-(6-클로로-2-퀴녹살린-옥시)-페녹시] 프로피오네이트}는 이러한 효소의 저해제이다. 세포는 퀴잘로포프의 존재하에서, 지방산 생합성의 방해 때문에, 느리게 성장하거나, 심지어는 사멸한다.
최근에, 몇몇 연구에 의해, 퀴잘로포프를 사용하여, EPA 함량이 증가된 균주에 대하여 돌연변이유발된 미세조류를 스크리닝할 수 있음이 나타났다.
차투르베디 (Chaturvedi) 등 (2004년도)은 MNNG를 사용하여 나노클로롭시스 오쿨라타 (Nannochloropsis oculata)를 돌연변이유발시키고, 퀴잘로포프-내성 균주에 대하여 스크리닝하였다. 스크리닝된 균주로부터의 결과에 의해, 유의미하게 증가된 EPA 함량이 나타났다.
또한, 차투르베디 등 (2006년도)은 EMS를 사용하여 나노클로롭시스 오쿨라타를 돌연변이유발시키고, 세룰레닌 (cerulenin) 및 에리트로마이신 (erythromycin)에 내성인 균주에 대하여 스크리닝하였다. 생성된 균주는 29% 및 12% 증가된 EPA 수율을 보였다.
카오 지아오홍 (Cao Xiaohong) 등 (2007년도)은 규조류 니츠시아 라에비스 (Nitzschia laevis)를 DMSO 및 퀴잘로포프로 처리하였으며, 이는 조류 (algae)의 EPA 함량이 3.00%에서 3.58%로 증가되게 하였다.
지금까지, 퀴잘로포프에 내성이 있는 스키조키트리움 종 돌연변이체 균주는 보고된 적이 없다. 이러한 스키조키트리움 종 돌연변이체가 존재할지라도, 퀴잘로포프 선택을 겪은 돌연변이유발된 균주에 대하여 EPA 또는 DHA의 함량이 증가하는지 여부는 여전히 알려져 있지 않다. 추가로, UV선에 의해 유도되는 스키조키트리움 종 돌연변이체가 퀴잘로포프 선택을 견뎌낼 수 있는지 여부는 명백하지 않다.
본 출원의 발명자들은 놀랍게도 스키조키트리움 종 균주에 UV 복사의 돌연변이유발을 가한 다음, 퀴잘로포프를 포함하나 이에 한정되지 않는 지방산 합성의 주요 효소 (예를 들어, 아세틸 보조효소 A 카르복실라제)에 대한 저해제를 사용함에 의해 방향성 선택 (directional selection)을 수행함으로써, DHA 함량이 증가된 스키조키트리움 종 변이체 또는 돌연변이체가 수득될 수 있음을 발견하였다. 추가로, 수득된 변이체 또는 돌연변이체는 나이브 (naive) 스키조키트리움 종 균주에 비하여 높은 DHA 함량뿐 아니라 향상된 성장 속도를 갖는다.
따라서, 제1 양태에서, UV 복사를 사용하여 스키조키트리움 종 균주에서 돌연변이유발을 유도하여, 돌연변이체 균주를 생성하는 단계; 돌연변이체 균주를 아세틸 보조효소 A 카르복실라제 저해제와 접촉시키는 단계; 및 나이브 스키조키트리움 종 균주에 비하여 DHA 함량이 증가된 스키조키트리움 종 균주의 변이체를 선택하는 단계를 포함하는 나이브 스키조키트리움 종 균주에 비하여 DHA 함량이 증가된 스키조키트리움 종 균주의 변이체의 생성 방법이 제공된다.
본 명세서에 개시된 구현예에서, 아세틸 보조효소 A 카르복실라제에 대한 저해제는 퀴잘로포프이다. 특정 구현예에서, DHA 함량이 증가된 선택된 변이체는 또한 나이브 스키조키트리움 종 균주의 성장 속도에 비하여 성장 속도가 향상되어, DHA 생성 효율이 나이브 스키조키트리움 종 균주의 DHA 생성 효율에 비하여 증가되게 한다.
본 명세서에 개시된 다른 구현예에서, 스키조키트리움 종 균주의 변이체는 이의 출발 균주 또는 나이브 스키조키트리움 종 균주의 DHA 함량에 비하여 더 높은 DHA 함량을 갖는다. 전형적으로, 아세틸 보조효소 A 카르복실라제에 대한 저해제를 사용함에 의한 선택을 사용하거나 사용하지 않는 UV 복사-유도된 돌연변이유발 후에, 스키조키트리움 종 균주의 변이체는 출발 또는 나이브 균주의 DHA 함량에 비하여 더 높은 DHA 함량을 갖는다.
제2 양태에서, 스키조키트리움 종 균주의 변이체, 예를 들어, 2011년 1월 21일에 CCTCC (Chinese Center for Type Culture Collection)에 기탁된, 기탁 참조 번호가 CCTCC M 2011024인 균주 2010-0321이 제공된다.
일 구현예에서, 본 명세서에 제공되는 변이체 균주는 나이브 스키조키트리움 종 균주의 DHA 함량에 비해 증가된 DHA 함량을 갖는다. 다른 구현예에서, 본 명세서에 제공된 변이체는 UV 복사를 사용하여 스키조키트리움 종 균주에서 돌연변이유발을 유도하여, 변이체 균주를 생성하는 단계, 돌연변이체 균주를 아세틸 보조효소 A 카르복실라제 저해제와 접촉시키는 단계; 및 나이브 스키조키트리움 종 균주에 비하여 증가된 DHA 함량 및/또는 향상된 성장 속도를 갖는 스키조키트리움 종 균주의 변이체를 선택하는 단계를 포함하는 본 명세서에 개시된 방법에 의해 수득된다.
제3 양태에서, 본 명세서에 개시된 스키조키트리움 종 균주의 변이체를 배양 배지에서 배양하는 단계를 포함하고, 선택적으로 스키조키트리움 종 균주의 배양된 변이체의 바이오매스 또는 이의 배양 배지로부터 DHA를 수집하는 단계를 포함하는 DHA의 생성 방법이 제공된다. 일 구현예에 따르면, 이는 또한 이러한 방법에 의해 생성되는 바이오매스와 관련이 있다.
다른 양태에서, 식품이 제공된다. 특히, 식품은 본 명세서에 개시된 방법에 따라 생성되는 바이오매스 (즉, 나이브 스키조키트리움 종 균주에 비하여 증가된 농도의 DHA를 갖는 바이오매스) 또는 DHA를 함유한다.
도 1은 스키조키트리움 종에 대한 자외선 복사의 치사 효과를 보여준다.
도 2는 퀴잘로포프의 농도와 상응하는 스키조키트리움 종의 치사율의 관계를 보여준다.
도 3은 대조군 균주 (또는 나이브 균주) 및 몇몇 변이체 균주의 성장 속도 및 DHA 함량을 보여준다.
도 4는 50-리터 발효기 실험에서 대조군 균주 및 3가지 변이체의 성장 속도 및 DHA 함량을 보여준다.
도 5a 내지 도 5c는 대조군 균주와 변이체 균주 2010-0321 간의 18S rRNA 서열의 정렬 비교를 보여준다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "균주"는 단일의 세포 또는 단리된 콜로니로부터 수득되는 스키조키트리움 종 균주를 비롯한 조류 또는 미세조류 종과 같은 미생물의 임의의 배양물, 일반적으로 순수 배양물을 말한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 참조 균주 X의 "변이체" 또는 "돌연변이체"는 참조 균주 X로부터 수득되는 임의의 균주를 말한다. 본 출원서의 맥락에서, 용어 "변이체"는 더욱 특별히 참조 균주 X 상에 수행되는 돌연변이 및 선택에 의해 주로 수득되는 균주를 말하며, 용어 "돌연변이체"는 더욱 특별히 참조 균주 X에 적용되는 무작위 또는 지향적 (directed) 돌연변이유발 (예를 들어, UV 복사)에 의해 수득되는 균주를 말한다.
돌연변이체 또는 변이체가 본 명세서에 개시된 다양한 양태에 따른 특징, 특히 나이브 조류 또는 미세조류 종, 특히 스키조키트리움 종 균주에 비하여 더 높거나 증가된 DHA 함량을 가지면, 이는 본 출원서에 청구되는 보호 범주 내에 속한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "식품"은 인간 또는 동물에서 영양소를 공급하기 위해 의도된 임의의 제품을 말한다. 특히, 식품은 유아, 아동, 청소년 및 성인에게 먹이기 위해 의도된 제품을 포함한다. 본 명세서에 개시된 식품의 전부 또는 일부는 본 명세서에 개시된 방법에 의해 수득되는 적어도 하나의 바이오매스 또는 DHA를 함유할 수 있다. 본 명세서에 개시된 식품은 또한 농업 또는 식품 산업에 보통 사용되는 다른 성분, 예를 들어, 첨가제, 보존제, 과일 또는 과일 추출물, 향미제, 착색제, 증점제, 곡물, 초콜렛 등을 함유할 수 있다.
특정 구현예에서, 식품은 유제품이다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "유제품"은 밀크 (milk)에 더하여, 밀크로부터 유래되는 임의의 제품, 예를 들어, 분유, 크림, 아이스크림, 버터, 치즈, 요구르트, 발효유, 또는 밀크로부터 유래되는 부산물, 예를 들어, 락토세럼 (lactoserum) 및 카제인뿐 아니라, 밀크 또는 밀크 분획을 주 성분으로 함유하는 다양한 제조된 식품을 말한다. 밀크는 일반적으로 소로부터의 것이나, 다른 포유동물, 예를 들어, 염소, 양, 말, 낙타 또는 버펄로로부터 수득할 수도 있다. 유제품은 본 명세서에 개시된 방법에 따라 생성되는 바이오매스 또는 DHA를 포함한다.
본 명세서에 개시된 돌연변이/돌연변이유발 및/또는 선택을 위한 출발 균주 또는 나이브/대조군 균주로 소용되기에 적절한 미생물은 스키조키트리움 속의 구성원을 포함하는 종속영양 미세조류를 포함한다. 스키조키트리움 속의 특정 구성원은 스키조키트리움 리마시눔 (Schizochytrium limacinum)이다. 적절한 유기체는 천연의 환경으로부터의 수집에 의한 것을 포함하는 다수의 공중-입수가능한 공급원으로부터 수득될 수 있다. 예를 들어, 본 출원에 사용될 수 있는 스키조키트리움 종은 스키조키트리움 리마시눔 SR21, 스키조키트리움 종 (S8) (ATCC 20889), 스키조키트리움 종 (LC-RM) (ATCC 18915) 및 스키조키트리움 리마시눔 IFO 32693 (Honda et Yokochi, Institute for Fermentation (IFO), Osaka, Japan)을 포함한다. 스키조키트리움 리마시눔 SR21 또는 스키조키트리움 리마시눔 IFO 32693이 바람직하다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 임의의 미생물 또는 임의의 특정 유형의 유기체는 야생형 균주, 돌연변이체 균주 또는 재조합 균주를 포함한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "바이오매스"는 본 명세서에 개시된 바와 같은 조류 또는 미세조류 종, 예를 들어, 스키조키트리움 종 균주, 스키조키트리움 종 균주의 변이체 등의 배양 배지 중의 세포 또는 배양물을 말한다. 대안적으로, 용어 "바이오매스"는 적어도 부분적으로 탈수된 조류 또는 미세조류 배양물 또는 탈수된 배양물을 말한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 수치와 함께 사용되는 경우 용어 "약" 또는 "대략"은 참조된 숫자의 1, 5 또는 10% 가변성 내의 임의의 값을 말한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 동사 "포함한다" 및 이의 활용형은 이들의 비제한적인 의미로 사용되며, 후술되는 물품이 포함되는 것을 의미하나, 특별히 언급되지 않은 물품이 배제되지는 않는다.
또한, 부정 관사 "하나" ("a" 또는 "an")에 의한 요소에 대한 참조는 문맥에서 명백히 다르게 지시/시사되지 않는 한, 하나 초과의 요소가 존재할 가능성을 배제하지 않는다. 따라서, 부정 관사 "하나"는 보통 "적어도 하나"를 의미한다.
스키조키트리움 종의 돌연변이의 일 구현예에서, 스키조키트리움 종 균주는 약 10 내지 140초, 바람직하게는 약 20초 내지 120초, 더욱 바람직하게는 약 30초 내지 100초, 가장 바람직하게는 약 70초 내지 90초 동안 자외선 복사에 노출된다. 특정 구현예에서, 스키조키트리움 종 균주는 약 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89 및 90초로 구성된 군으로부터 선택되는 기간 동안 자외선 복사에 노출된다. 생존된 콜로니를 수집하고, 아세틸 보조효소 A 카르복실라제 저해제, 예를 들어, 퀴잘로포프에 의한 방향성 선택에서 사용한다.
일 구현예에서, 퀴잘로포프를 소정의 농도로 배양 배지에 첨가하여, 퀴잘로포프-내성 균주를 선택한다. 선택에 사용되는 퀴잘로포프의 농도는 배양 배지 중에 약 5 μmol/ℓ 내지 약 100 μmol/ℓ, 또는 약 10 μmol/ℓ 내지 약 90 μmol/ℓ, 또는 약 50 μmol/ℓ 내지 80 μmol/ℓ의 범위로 존재한다. 특정 구현예에서, 퀴잘로포프의 농도는 배양 배지 중에서 약 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79 및 80 μmol/ℓ로 구성된 군으로부터 선택된다. 특정 구현예에서, 퀴잘로포프는 퀴잘로포프-p {(R)-2-[4-(6-클로로-2-퀴녹살리니)옥시]페녹시]프로파노에이트}, 예를 들어, 퀴잘로포프 에틸이다.
특정 구현예에서, 퀴잘로포프-내성 스키조키트리움 종 콜로니에 대한 선택을 퀴잘로포프를 함유하는 고체 배양 배지에서 행한다. 이어서, 생존된 콜로니를 고체 배양 배지로부터 선택하고, 이후에 퀴잘로포프를 함유하는 액체 또는 반고체 배양 배지에서 배양하여, 퀴잘로포프 내성을 확인한다.
선택된 퀴잘로포프-내성 콜로니를 스키조키트리움 종 균주와 같은 나이브 균주에 비하여 증가된 성장 속도 및 DHA 함량에 대하여 추가로 스크리닝한다.
따라서, UV 노출 및 퀴잘로포프 선택을 포함하는 본 명세서에 개시된 방법에 의해 수득되는 스키조키트리움 종 변이체는 출발 또는 나이브 스키조키트리움 종 균주에 비하여 더 많거나 증가된 양의 DHA를 생성할 수 있다. 특정 구현예들에서, 스키조키트리움 종 변이체는 3 내지 7일 또는 5일 배양물 또는 바이오매스에서, 출발 또는 나이브 균주에 의해 생성되는 DHA의 양보다 적어도 약 10, 20, 25, 30, 35, 40%, 또는 적어도 약 20, 25, 30, 35, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70% 더 많은 양의 DHA를 생성할 수 있다. 일 구현예에서, 스키조키트리움 종 변이체에 의해 생성되는 DHA의 양은 스키조키트리움 종 변이체의 바이오매스의 건조 중량에 기초하여, 적어도 1.0% (w/w), 2.0% (w/w), 3.0% (w/w), 3.5% (w/w), 4.0% (w/w), 4.5% (w/w), 5.0% (w/w), 5.5% (w/w), 6.0% (w/w) 또는 6.5% (w/w) 또는 3.0 내지 6.5% (w w)이다.
다른 구현예에서, 선택된 스키조키트리움 종 변이체의 성장 속도는 3 내지 7일 배양에 걸쳐, 더욱 바람직하게는 5일 배양에 걸쳐, 출발 또는 나이브 균주의 성장 속도보다 적어도 약 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10% 더 높다.
본 발명의 다른 구현예들에서, 선택된 스키조키트리움 종 변이체 균주는 상이한 배양 조건, 예를 들어, 상이한 글루코스의 농도, 상이한 질소원 및 상이한 pH 값 하에서 출발 또는 나이브 균주에 비하여, 안정한 성장 속도와 DHA를 다량으로 생성하는 능력을 갖는다.
선택적 실시형태에서, 스키조키트리움 종 변이체의 18S RNA를 분석하여, 출발 또는 나이브 균주와 비교하여 유전적 변이를 확인할 수 있다.
일 구현예에서, 스키조키트리움 종 변이체의 예에는 균주 321-1, 2010-0321, 및 303-11, 특히 균주 2010-0321이 포함되나 이들에 한정되지 않는다.
일 구현예에서, 보다 많은 양의 DHA를 갖는 바이오매스를 생성하기 위하여, 본 명세서에 개시된 스키조키트리움 종 변이체, 특히 균주 321-1, 2010-0321, 303-11 및 이들의 임의의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 균주 또는 균주 2010-0321을 스키조키트리움 종 균주를 배양하는데 적절한 배양 조건 하에서 배양한다.
구현예들에서, 배양 조건은 본 명세서에 전문이 참고로 포함되는 미국 특허 제5,130,242호 및 미국 특허 제7,022,512호에 개시된 방법을 포함하는 당업계에 널리 공지되어 있는 배양 방법에 따라 확립할 수 있으며, 최적의 배양 조건은 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 다른 구현예들에서, 배양은 임의의 적절한 발효기, 예를 들어, 교반식 탱크 발효기 또는 에어-리프트 (air-lift) 발효기에서 수행할 수 있으며, 이는 산소원을 제공한다. 미생물은 용존 산소 농도가 배양물의 성장 및 DHA의 생성을 지지하는데 충분하면서, 진탕이 미생물을 절단시키거나 다르게는 손상시키지 않도록 소정의 수준으로 진탕시킬 수 있다. 적절한 수준의 용존 산소는 공기 포화 수준의 적어도 10%이다. 더욱 특별히, 용존 산소의 수준은 공기 포화 수준의 약 10% 내지 약 50%로 유지된다. 본 명세서에 개시된 방법에 사용되는 예시적인 발효기는 약 70 내지 100 rpm의 회전 속도와 함께 1 VVM의 통기율 (aeration rate)을 제공할 수 있다.
일 구현예에서, 발효기의 용량은 적어도 10 내지 60 리터, 예를 들어, 10, 20, 30, 40, 50 또는 60 리터이다. 최대 100 또는 심지어 150 리터의 용량을 갖는 발효기가 사용될 수 있다.
배양은 미생물의 생존을 유지하는데 적절한 임의의 온도에서 수행될 수 있다. 특히, 미생물은 약 15℃ 내지 약 34℃의 온도에서 배양할 수 있다. 바람직하게는, 배양 온도는 약 20℃ 내지 약 28℃, 더욱 바람직하게는 약 22℃ 내지 약 27℃로 유지한다.
일 구현예에서, 발효 동안 배양 배지의 pH는 4 내지 10, 예를 들어, 5 내지 8, 바람직하게는 6 내지 7일 수 있다.
전형적으로, 발효는 10일 이하, 또는 9일 이하, 또는 8일 이하 동안 지속될 것이다. 일부 구현예들에서, 발효 기간은 적어도 3, 4, 5, 6 또는 7일일 수 있거나, 이것이다.
선택적으로, 발효 기간은 150 내지 200시간, 예를 들어, 160 내지 190시간 또는 170 내지 180시간일 수 있다.
구현예들에서, 본 명세서에 개시된 스키조키트리움 종 변이체를 배양하기 위한 방법에 사용되는 배지는 액체 배지이며, 이는 모두 본 명세서에 전문이 참고로 포함되는 미국 특허 제5,130,242호 및 미국 특허 제7,022,512호에 개시된 구성성분을 포함하는 상업적으로 실현가능한 규모로 성장 및 DHA의 생성을 촉진시킬 수 있는 구성성분을 포함할 수 있다.
특히, 본 명세서에 개시된 스키조키트리움 종 변이체를 배양하여, DHA를 생성하는데 사용되는 배지는 탄소원, 및 유기 또는 무기 질소원을 포함한다.
일 구현예에서, 탄소원은 글루코스, 각종 전분, 당밀, 분쇄된 옥수수 또는 이들의 조합을 포함한다. 다른 구현예에서, 질소원은 질산염, 요소, 암모늄 염, 아미노산, 효모 추출물 등을 포함할 수 있으나, 이들에 한정되지 않는다. 동화가능한 인 (예를 들어, 인산염) 및/또는 황 (예를 들어, 황산염) 공급원도 또한 배지에 제공될 수 있다.
배지는 추가로 발효를 촉진시키는 다른 물질, 예를 들어, 킬레이트제 (예를 들어, 시트르산), 소포제 (예를 들어, 대두유), 비타민 (예를 들어, 티아민 및/또는 리보플라빈), 필수 촉매 금속 (예를 들어, 알칼리 토금속, 예를 들어, 마그네슘 또는 칼슘 또는 아연 또는 철 및/또는 기타 금속, 예를 들어, 코발트 및 구리)을 함유할 수 있다.
다른 구현예에서, 배지는 또한 단세포 미생물의 종속영양 성장을 증진시킬 수 있는 명시되지 않은 화합물 또는 명시된 화합물인 미생물 성장 인자의 공급원을 함유할 수도 있다.
스키조키트리움 종을 배양하기 위한 예시적인 배지는 문헌 [Jiang and Chen, Process Biochemistry 35 (2000) 1205-1209]; 문헌 [Jiang and Chen, Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology, (1999) Vol. 23,508-513]; 문헌 [Vazhappilly and Chen, Journal of the American Oil Chemists Society, (1998) Vol. 75, No. 3 p 393-397]에서 찾을 수 있다.
일 예로서, 본 명세서에 개시된 방법에 사용되는 배지는 글루코스 40 내지 60, 효모 추출물 10 내지 15, 글루탐산 4 내지 8, 염화나트륨 2.4 내지 4.0, 고즙염 (bitter salt) 3.0 내지 6.0 및 암모니아 설페이트 3.0 내지 6.0 (g/ℓ (배지))을 함유한다. 일 구현예에서, 본 명세서에 개시된 방법에 사용되는 배지는 글루코스 40 내지 60, 효모 추출물 10 내지 15, 글루탐산나트륨 4 내지 8, 염화나트륨 2.4 내지 4.0, 고즙염 3.0 내지 6.0 및 암모니아 설페이트 3.0 내지 6.0 (g/ℓ (배지))으로 구성된다. 본 명세서에 사용되는 배지의 일 예는 글루코스 60.0, 효모 추출물 15.0, 글루탐산나트륨 4.0, 염화나트륨 3.0, 고즙염 5.0 및 암모니아 설페이트 5.0 (g/ℓ (배지))로 구성된다.
유기체 또는 바이오매스는 원심분리, 응집 또는 여과와 같은 수단으로 획득할 수 있으며 즉시 처리하거나, 장래의 처리를 위해 건조시킬 수 있다. 선택적으로, 지질을 추출할 수 있다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "지질"은 인지질; 유리 지방산; 지방산 에스테르; 트리아실글리세롤; 디아실글리세리드; 모노아실글리세리드; 라이소포스포리피드; 비누; 포스파티드; 스테롤 및 스테롤 에스테르; 카로테노이드; 잔토필 (예를 들어, 옥시카로테노이드); 탄화수소; 및 기타 당업자에게 알려진 지질을 포함한다. 당업자에게 잘 이해되는 바와 같이, 본 명세서에 개시된 DHA는 이들 다양한 지질 형태일 수 있으며, 본 명세서에 개시된 식품에서 한 형태일 수 있는 유리 지방산으로 제한되지 않는다. 상이한 형태 또는 분획의 지질을 사용되는 추출 기술에 따라 추출할 수 있다.
지질은 유효량의 용매로 추출할 수 있다. 추출에 사용되는 적절한 용매 중에, 극성 지질 (예를 들어, 인지질)은 일반적으로 극성 용매 (예를 들어, 클로로포름/메탄올)로 추출하며 중성 지질 (예를 들어, 트리아실글리세롤)은 일반적으로 비극성 용매 (예를 들어, 헥산)로 추출한다. 특정 용매는 순수 헥산이다. 헥산 대 건조 바이오매스의 적절한 비는 건조 바이오매스 킬로그램당 약 4 리터의 헥산이다. 특정 구현예에서, 헥산은 약 50℃의 온도에서 약 2시간 동안 교반식 반응기에서 바이오매스와 혼합한다. 혼합 후, 바이오매스를 여과하며 오일을 함유하는 헥산으로부터 분리한다. 헥산은 증류 기술에 의해 오일로부터 제거된다. 통상적인 오일시드 (oilseed) 처리 장치는 여과, 분리 및 증류를 수행하는데 적절하다. 추가적인 처리 단계는 특정 응용에 필요하거나 바람직한 경우 수행할 수 있다. 지질 회수의 대안적인 방법은 본 명세서에 전문이 참고로 포함되는 하기의 참고문헌에 기술되어 있다: PCT 공개 WO 01/76715호 (발명의 명칭: "Method for the Fractionation of Oil and Polar Lipid-Containing Native Raw Materials"); PCT 공개 WO 01/76385호 (발명의 명칭: "Method For The Fractionation Of Oil And Polar Lipid-Containing Native Raw Materials Using Alcohol And Centrifugation"); PCT 공개 WO 00/153512호 (발명의 명칭: "Solventless Extraction Process").
본 출원이 특정 유기체 및 방법을 사용하여 입증되어 있지만, 이는 본 명세서에 개시된 교시를 고려하여 수득할 수 있는 모든 방법 및 유기체를 포함하는 것으로 의도된다. 본 발명의 범주와 사상으로부터 벗어남 없이, 임의의 치환, 변형 및 최적화가 당업자에게 명백할 것이다. 또한, 본 명세서에 수반되는 임의의 요소, 예를 들어, 단계, 조건 또는 균주를 바람직한 임의의 방식으로 조합하여, 본 발명의 목적을 달성할 수 있다.
하기의 실시예는 단지 예시의 목적으로 제공되며, 청구되는 바와 같은 대상 물질의 범주를 제한하고자 하지 않는다.
실시예
실시예 1 스키조키트리움 종에 대한 자외선 복사의 돌연변이 효과
하기의 실시예에서 대조군 또는 나이브 균주로도 사용한 스키조키트리움 리마시눔 SR21을 디쉬 (dish)에 도말하고, 각각 0초 (대조군), 30초, 40초, 50초, 60초, 70초, 80초, 90초 및 100초 (실험군) 동안 UV 복사에 노출시켰다. 복사 후에, 디쉬를 암 중에서 24시간 동안 유지하고, 각 디쉬 상의 콜로니의 개수를 계수하였다. 대조군에서 콜로니의 개수를 100%로 정의하고, 이에 따라 각 실험군에서의 치사율을 계산하였다 (도 1). 도 1에 나타낸 바와 같이, 연장된 복사 기간과 함께, 스키노키트리움 종에서 보다 높은 치사율이 관찰되었으며, 이는 용량-의존적인 효과를 나타낸다. 특히, 스키조키트리움 종에서 60% 내지 80%의 치사율을 야기한 70 내지 90초의 복사 기간을 사용하여, 스키조키트리움 종에서 돌연변이유발을 유도하였다.
배양 조건은 다음과 같다:
A. 글루코스 55 g/ℓ,
효모 추출물 10 g/ℓ,
글루탐산나트륨 5 g/ℓ,
염화나트륨 2.4 g/ℓ,
고즙염 4.0 g/ℓ,
암모니아 설페이트 4.0 g/ℓ;
수분 잔량으로 구성된 배양 배지;
B. 배양 온도: 22 내지 27℃; 및
C. 초기 pH: 5.0 내지 7.0.
실시예 2 스키조키트리움 종에 대한 퀴잘로포프 선택
퀴잘로포프 에틸을 0 μmol/ℓ, 10 μmol/ℓ, 30 μmol/ℓ, 50 μmol/ℓ, 70 μmol/ℓ, 80 μmol/ℓ 및 90 μmol/ℓ의 농도로 스키조키트리움 종을 배양하기 위한 배지에 첨가하였다. 대조군 (0 μmol/ℓ)에서의 콜로니의 개수를 100%로 정하였다. 각 그룹에서 콜로니를 계수하고, 대조군에서의 콜로니의 개수에 기초하여 치사율을 계산하였다 (도 2). 도 2에 나타낸 바와 같이, 실험 범위 내에서, 스키조키트리움 종의 치사율과 퀴잘로포프의 농도 간의 양의 상관관계가 관찰되었다. 내성 균주를 선택하는데 사용되는 퀴잘로포프의 농도는 50 μmol/ℓ 내지 80 μmol/ℓ로 설정하였다.
조작의 용이성을 위하여, 퀴잘로포프를 배지에 첨가하고, UV 복사-생존 균주를 추가의 방향성 선택을 위하여 도말하였다.
선택된 균주를 액체 또는 반고체 퀴잘로포프-함유 배지에서 배양하여, 이들의 퀴잘로포프 내성을 입증할 수 있다.
배양 조건은 다음과 같다:
A. 글루코스 60 g/ℓ,
효모 추출물 15 g/ℓ,
글루탐산나트륨 4 g/ℓ,
염화나트륨 3 g/ℓ,
고즙염 5.0 g/ℓ,
암모니아 설페이트 5.0 g/ℓ;
수분 잔량으로 구성된 배양 배지;
B. 배양 온도: 22 내지 27℃; 및
C. 초기 pH: 5.0 내지 7.0.
실시예 3 나이브 균주와 변이체 균주 간의 성장 속도와 DHA 함량의 차이
실시예 2에 따른 선택과 입증 후에, 200개 초과의 퀴잘로포프-내성 스키조키트리움 종 균주를 수득하였다. 이어서, 이들 퀴잘로포프-내성 스키조키트리움 종 균주를 보다 높은 성장 속도 및 DHA 함량에 대하여 2 라운드 동안 스크리닝한다. 제1 라운드 후에, 20 내지 50개의 균주를 스크리닝하였으며, 제2 라운드 후에는 3개의 균주를 스크리닝하였다. 3개의 균주 각각은 성장 속도와 DHA 함량이 대조군 (나이브) 균주의 성장 속도와 DHA 함량보다 10% 넘게 더 높았다.
배양 조건은 다음과 같다:
A. 글루코스 60 g/ℓ,
효모 추출물 15 g/ℓ,
글루탐산나트륨 4 g/ℓ,
염화나트륨 3 g/ℓ,
고즙염 5.0 g/ℓ,
암모니아 설페이트 5.0 g/ℓ;
수분 잔량으로 구성된 배양 배지;
B. 배양 온도: 22 내지 27℃; 및
C. 초기 pH: 5.0 내지 7.0.
도 3은 UV 돌연변이유발에 이어서 퀴잘로포프 선택을 겪은 대조군 균주 (제일 왼쪽) 및 변이체의 일부의 바이오매스 및 DHA 함량을 보여준다. 도 3에 나타낸 바와 같이, 일부 돌연변이체 균주, 예를 들어, 321-6, 321-7 및 321-8은 성장 속도와 DHA 함량이 대조군 균주의 성장 속도와 DHA 함량보다 더 낮았으며, 일부, 예를 들어, 321-4, 321-5 및 321-19는 성장 속도와 DHA 함량이 대조군 균주의 성장 속도와 DHA 함량와 유의미하게 상이하지 않았다. 돌연변이체 중에, 이들 중 다수, 예를 들어, 321-1, 2010-0321, 321-12, 321-13, 321-14, 321-15, 321-16, 321-17 및 321-18은 증가된 DHA 함량을 가졌다. 뛰어난 균주는 321-1 및 2010-0321이며, 이는 각각 10.5% 및 31.5% 증가된 성장 속도와, 64.5% 및 66.4% 증가된 DHA 함량을 가졌다.
이들 2가지 돌연변이체 균주에 더하여, 돌연변이체 균주 303-11은 또한 우수한 성장 속도와 DHA 함량을 보였다.
3가지 변이체 균주, 다시 말하면, 균주 2010-0321, 321-1 및 303-11을 실시예 4 내지 7에 기술된 바와 같은 시험을 위해 선택하여, 출원의 방법에 의해 수득된 변이체가 높은 DHA 함량과 성장 속도를 가졌으며, 상기 특성이 상이한 배양 조건 하에서 안정적으로 유지될 수 있었음을 입증하였다.
실시예 4 내지 7에서 실험에 사용되는 일반적인 배양 조건은 다음과 같다:
A. 글루코스 60 g/ℓ,
효모 추출물 15 g/ℓ,
글루탐산나트륨 4 g/ℓ,
염화나트륨 3 g/ℓ,
고즙염 5.0 g/ℓ,
암모니아 설페이트 5.0 g/ℓ;
수분 잔량으로 구성된 배양 배지;
B. 배양 온도: 22 내지 27℃;
C. 초기 pH: 5.0 내지 7.0;
D. 통기율이 1VVM이고 회전 속도가 70-100 rpm인 50-ℓ 발효기; 및
E. 배양 기간: 4 내지 7일.
실시예 4 상이한 글루코스 농도 하에 배양한 대조군 균주 및 균주 321-1, 2010-0321 및 303-11의 성장 속도 및 DHA 함량
배양 조건은 글루코스의 농도를 제외하고, 상기 기술된 일반적 조건에서의 것과 동일하다.
상이한 배양 조건에 대한 대조군 (나이브) 균주와 돌연변이체 균주 321-1, 2010-0321 및 303-11의 반응을 비교하고, 대조군 균주에 대한 선택된 균주의 이점을 추가로 확인하기 위하여, 일련의 시험 및 비교를 행하였다. 이러한 실시예에서, 상이한 탄소원 농도 하에 배양한 대조군 균주 및 돌연변이체 균주의 성장 속도 및 DHA 함량을 비교하고 (표 1), 여기서, 초기 배지 중의 탄소원을 상이한 시험 농도를 갖는 탄소원으로 대체하였다. 표 1에 나타낸 바와 같이, 상이한 글루코스 농도 (50 g/ℓ, 60 g/ℓ 및 70 g/ℓ) 하에 배양되는 경우, 모든 3개 돌연변이체에서 관찰된 결과는 대조군 균주에서의 결과보다 뛰어났으며, 여기서, 2010-0321이 최고였고, 그 다음은 321-1 및 303-11이었다.
Figure pct00001
실시예 5 상이한 질소원 하에 배양한 대조군 균주 및 균주 321-1, 2010-0321 및 303-11의 성장 속도 및 DHA 함량
배양 조건은 질소원을 제외하고는 상술된 바와 같은 일반적 조건과 동일하다.
실시예를 행하여, 상이한 질소원에서 배양한 대조군 (나이브) 균주와 돌연변이체 균주 321-1, 2010-0321 및 303-11의 성장 속도 및 DHA 함량을 비교하였다. 초기 배지에서 질소원을 하기의 질소원으로 대체하였다: (a) 효모 추출물 (20 g/ℓ); (b) 효모 추출물 (20 g/ℓ)+글루탐산나트륨 (10 g/ℓ); (c) 효모 추출물 (40 g/ℓ)+글루탐산나트륨 (10 g/ℓ) 및 (d) 옥수수 시럽 (40 g/ℓ)+글루탐산나트륨 (10 g/ℓ). 표 2에 나타낸 바와 같이, 돌연변이체 균주 321-1 및 2010-0321의 성장 속도 및 DHA 함량은 상이한 질소원에서 배양되는 경우, 대조군 균주의 성장 속도 및 DHA 함량보다 뛰어났으며, 여기서, 균주 2010-0321은 DHA 함량이 균주 321-1보다 더 나았고, 균주 303-11은 대조군 균주에 비하여 보다 높은 DHA 함량을 보였다.
Figure pct00002
　　　
실시예 6 상이한 pH 값 하에 배양한 대조군 균주 및 균주 321-1, 2010-0321 및 303-11의 성장 속도 및 DHA 함량
배양 조건은 pH 값을 제외하고는 상술된 바와 같은 일반적 조건에서의 것과 동일하다.
이러한 실시예를 행하여, 상이한 pH 하에 배양한 대조군 (나이브) 균주와 3개의 돌연변이체의 성장 속도 및 DHA 함량을 평가하였다 (표 3). 표 3으로부터 알 수 있는 바와 같이, 균주 2010-0321 및 321-1은 대조군 균주의 성장 속도 및 DHA 축적보다 높은 성장 속도 및 DHA 축적을 보였으며, 돌연변이체 균주 303-11은 대조군 균주에 비하여 DHA 축적에는 약간의 이점을 나타내고, 성장 속도에서는 이점을 나타내지 않았다.
Figure pct00003
실시예 7 50ℓ 발효기에서 배양한 대조군 균주와 균주 321-1, 2010-0321 및 303-11의 성장 속도 및 DHA 함량
실시예 7을 행하여, 50ℓ 발효기에서 배양한 대조군 (나이브) 균주와 균주 321-1, 2010-0321 및 303-11의 성장 속도 및 DHA 축적을 평가하였다 (도 4). 균주를 상술된 바와 같은 일반 조건 하에 배양하였다. 균주 321-1은 대조군 균주에 비하여 각각 9.5% 증가된 바이오매스와 16.7% 증가된 DHA 함량을 보였다. 균주 2010-0321에 있어서, 바이오매스 및 DHA 함량은 각각 6.7% 및 48.1% 증가하였다. 균주 303-11에 있어서, 바이오매스는 대조군 균주와 실질적으로 동일하였으며, DHA 함량은 오직 7.9%만 증가하였다. 3개의 돌연변이체 균주 간의 포괄적 비교로, 2010-0321은 특히 DHA 함량에 관하여 가장 두드러졌다.
실시예 8 대조군 균주와 균주 2010-0321 간의 생화학적 조성의 차이
표 4 및 표 5는 대조군 (나이브) 균주와 균주 2010-0321 간의 단백질, 아미노산 및 지방산의 조성을 비롯한 생화학적 조성의 차이를 보여주었다. 단백질의 함량을 켈달 (Kjeldahl)법으로 측정하였다. 아미노산의 함량을 아미노산 분석기로 분석하였다. 지방의 함량을 지질 분석기로 분석하였다.
표 4에 나타낸 바와 같이, 균주 2010-0321은 대조군 균주의 단백질 함량 (22.3%)보다 더 높은 단백질 함량 (23.8%)을 가졌다. 일치하게, 균주 2010-0321은 대부분의 아미노산의 함량에 관하여 대조군 균주보다 더 높은 수준을 보였다.
표 5에 나타낸 바와 같이, 균주 2010-0321은 지방산의 조성에서 대조군 균주와 주목할만한 차이를 가졌다. 먼저, 균주 2010-0321은 대조군 균주의 C16:0 함량 (7.7%)보다 더 높은 C16:0 함량 (8.2%)을 가졌다. 두번째로, C16:1은 2010-0321에서는 부재였으나, 대조군 균주의 C16:1 함량은 1.0%였다. 세번째로, 균주 2010-0321은 대조군 균주의 DHA (C22:6) 함량에 비해 유의미하게 더 높은 DHA (C22:6) 함량을 가졌다.
Figure pct00004
Figure pct00005
실시예 9 대조군 균주와 균주 2010-0321 간의 18S rRNA 유전자의 서열의 비교
전체 RNA를 용해 방법에 의해 시험 균주로부터 추출하였다. 18S RNA 유전자를 cDNA로 역전사시킨 후에, 정방향 프라이머 5'-CCAACCTGGTTGATCCTGCCAGTA-3' (SEQ ID NO: 3) 및 역방향 프라이머 5'-CCTTGTTACGACTTCACCTTCCTCT-3' (SEQ ID NO: 4)으로 증폭시켰다. 앰플리콘 (amplicon)을 회수하고, 이를 사용하여 이. 콜라이 (E. coli) DH 5α 컴피턴트 (competent) 세포를 형질전환시켰다. 양성 콜로니를 시퀀싱 (sequencing)을 위해 선택하였다. 대조군 (나이브) 균주와 균주 2010-0321의 18S RNA 유전자의 서열을 블라스트 (Blast) 소프트웨어를 사용하여 정렬하고 비교하였다. 결과는 도 5a 내지 도 5c에 나타나 있다.
도 5a 내지 도 5c는 상동성 비교를 위한 대조군 균주 및 균주 2010-0321의 18S rRNA 유전자의 정렬을 보여준다. 도면에 나타낸 바와 같이, 대조군 균주의 18S rRNA 유전자 (SEQ ID NO: 1)는 길이가 1757 bp인 한편, 균주 2010-0321의 18S rRNA 유전자 (SEQ ID NO: 2)는 길이가 1751 bp이며, 여기서, 9쌍의 염기가 가변적이었다. 대조군 균주의 18S rRNA 유전자와 균주 2010-0321의 18S rRNA 유전자 간의 상동성 백분율은 99%였다.
중국 표준 배양물 보존센터 CCTCCM2011024 20110121
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Claims (17)

  1. 2010-0321로 식별되고, CCTCC (Chinese Center for Type Culture Collection)에 CCTCC M 2011024의 기탁 참조 번호로 기탁된 스키조키트리움 (Schizochytrium) 종 균주의 변이체.
  2. 제1항에 있어서, 상기 변이체가 나이브 (naive) 스키조키트리움 종 균주에 비하여 증가된 DHA 함량 및/또는 향상된 성장 속도의 특성을 갖는 변이체.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 변이체가 나이브 스키조키트리움 종 균주에 비하여 상이한 단백질 함량, 단백질의 아미노산 조성 및/또는 지방산의 조성을 갖는 변이체.
  4. 스키조키트리움 종 균주를 UV 복사에 노출시킴으로써 상기 스키조키트리움 종 균주에서 돌연변이유발을 유도하여 돌연변이체 균주를 생성하는 단계;
    상기 돌연변이체 균주를 아세틸 보조효소 A 카르복실라제 저해제와 접촉시키는 단계; 및
    나이브 스키조키트리움 종 균주에 비하여 증가된 DHA 함량 및/또는 향상된 성장 속도를 갖는 스키조키트리움 종 균주의 변이체를 선택하는 단계를 포함하는 스키조키트리움 종 균주의 변이체의 생성 방법.
  5. 제4항에 있어서, 상기 아세틸 보조효소 A 카르복실라제 저해제가 퀴잘로포프 (Quizalofop)인 방법.
  6. 제4항 또는 제5항에 있어서, 상기 변이체가 증가된 DHA 함량 및 향상된 성장 속도를 갖는 방법.
  7. 제4항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 변이체가 상이한 단백질 함량, 단백질의 아미노산 조성 및/또는 지방산의 조성을 갖는 방법.
  8. 제4항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 스키조키트리움 종 균주가 약 30초 내지 약 100초 또는 약 70초 내지 약 90초의 기간 동안 UV 복사에 노출되는 방법.
  9. 제4항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 퀴잘로포프가 약 10 μmol/ℓ 내지 약 90 μmol/ℓ, 또는 약 50 μmol/ℓ 내지 약 80 μmol/ℓ의 범위의 농도로 사용되는 방법.
  10. 제4항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 스키조키트리움 종 균주의 변이체가 2010-0321로 식별되고, CCTCC에 CCTCC M 2011024의 기탁 참조 번호로 기탁된 균주인 방법.
  11. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 스키조키트리움 종 균주의 변이체, 또는 제4항 내지 제10항 중 어느 한 항의 방법에 의해 생성되는 스키조키트리움 종 균주의 변이체를 스키조키트리움 종 균주를 배양하는데 적절한 조건 하에서 배양하여, DHA를 생성하는 단계; 및 선택적으로,
    스키조키트리움 종 균주의 배양된 변이체의 바이오매스 또는 이의 배양 배지로부터 DHA를 수집하는 단계를 포함하는 DHA의 생성 방법.
  12. 제11항에 있어서, 상기 조건이 약 50 내지 70 g/ℓ의 탄소원 및 10 내지 20 g/ℓ의 질소원을 포함하는 배양 배지;
    약 20℃ 내지 약 28℃, 또는 약 22℃ 내지 약 27℃의 배양 온도; 및/또는
    3 내지 10, 예를 들어, 4 내지 8, 또는 5 내지 7의 pH를 포함하는 방법.
  13. 제11항 또는 제12항에 있어서, 상기 배양 배지가
    글루코스 50 내지 70 g/ℓ,
    효모 추출물 10 내지 30 g/ℓ,
    글루탐산나트륨 10 내지 20 g/ℓ,
    염화나트륨 2.4 내지 4.0 g/ℓ,
    고즙염 (bitter salt) 3.0 내지 6.0 g/ℓ,
    암모니아 설페이트 3.0 내지 6.0 g/ℓ를 포함하는 방법.
  14. 제11항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 생성되는 바이오매스.
  15. 제14항에 따른 바이오매스 또는 상기 바이오매스로부터 추출되는 DHA를 포함하는 식품으로서, 상기 식품이 유아, 소아, 청소년 및 성인에게 먹이기 위해 의도되는 제품을 포함하거나, 상기 식품이 유제품인 식품.
  16. 3 내지 7일 배양 또는 5일 배양에 걸쳐, 변이체에 의해 생성되는 DHA의 양이 나이브 스키조키트리움 종 균주에 의해 생성되는 DHA의 양보다 적어도 약 10, 20, 25, 30, 35, 40%, 또는 약 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70% 더 많은 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 변이체 또는 제4항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 방법.
  17. 3 내지 7일 배양 또는 5일 배양에 걸쳐, 스키조키트리움 종 균주의 변이체의 성장 속도가 나이브 스키조키트리움 종 균주의 성장 속도보다 적어도 약 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10% 더 높은 제1항 내지 제3항 및 제16항 중 어느 한 항에 따른 변이체 또는 제4항 내지 제13항 및 제16항 중 어느 한 항에 따른 방법.
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