CN108220167A - 盐藻纯化分离方法及微藻纯化分离方法 - Google Patents

盐藻纯化分离方法及微藻纯化分离方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于微藻养殖技术领域，尤其涉及一种盐藻纯化分离方法及微藻纯化分离方法。它是在低浓度琼脂凝固前将待分离纯化的盐藻细胞放入其中，混匀后倒入培养皿中，凝固后置于光照培养箱中培养，待单个盐藻细胞生长为细胞团时，将其挑出单独培养。本方法操作简单，成功率高，且不需要专业人员即可完成，为实验和生产盐藻提供纯化的藻种具有重要意义。

Description

盐藻纯化分离方法及微藻纯化分离方法
技术领域
本发明属于微藻养殖技术领域，尤其是涉及一种盐藻纯化分离方法及微藻纯化分离方法。
背景技术
盐藻是盐生杜氏藻的简称，是一种真核藻类，可在饱和氯化钠的极端高盐环境下(NaCl浓度高于30％)生长，在一定条件下，盐藻体内β-胡萝卜素可高达8％～10％(干重)，并富含30％左右甘油和30％～40％蛋白质以及脂肪酸、叶绿素和四烯油等，β-胡萝卜素营养价值极高，国内外已广泛用于医药、食品中。盐藻体内营养物质的积累不仅与培养条件有关，而且与盐藻的品系也有很大的关系。盐藻在养殖一段时间后容易老化也容易感染其他生物，因此，需要定期进行盐藻的分离和纯化才能满足生产上的需要。
目前，盐藻的分离纯化主要采用其他微藻的分离纯化方法，有稀释水滴分离法、涂布法和微细管分离法。稀释水滴分离法操作简单，需要进行大量重复操作培养，且成功率极低；盐藻产生β-胡萝卜素的重要条件之一就是培养基盐度较高，涂布法会导致固体培养基在盐藻生长起来前有盐析出甚至干掉。微细管分离法针对性高，但操作难度大，且盐藻有鞭毛可以游动，增加了其分离难度。
发明内容
有鉴于此，本发明旨在提出一种盐藻纯化分离方法，以解决现有的分离纯化方法需要大量重复操作培养、且成功率极低，或者在盐藻生长起来前有盐析出、甚至干掉，及操作难度大、分离难度大等问题。
为达到上述目的，本发明的技术方案是这样实现的：
一种盐藻纯化分离方法，采用固体培养基与待分离纯化的盐藻细胞混合的方式对盐藻纯化分离。
作为一种进一步的技术方案，盐藻纯化分离方法，采用琼脂浓度为0.7～1.2％的固体培养基，35～45℃条件下，混入待分离纯化的盐藻细胞。
作为一种优选的技术方案，每1000mL0.7～1.2％浓度的琼脂培养基在35～45℃时加入1×103～1×105个盐藻细胞。
作为一种进一步的技术方案，盐藻纯化分离方法，具体包括如下步骤：
步骤一：按固体培养基配方比例称量各组分，加入除维生素外的营养盐，高温高压灭菌；
步骤二：灭菌完成后置于超净工作台中，待温度降至50～60℃时加入维生素，混匀；
步骤三：待培养基温度降至35～45℃时，加入待分离纯化的盐藻细胞，混匀；
步骤四：将培养基倒入已灭菌过的培养皿中，冷却后用封口膜密封；
步骤五：将培养皿置于28～35℃，光照强度3000～10000lx，光暗比L：D＝14h：10h条件下，让盐藻细胞生长繁殖；
步骤六：培养20～35天后，盐藻在固体培养基中均匀分布多个细胞团，将单个细胞团取出单独培养。
作为一种优选的技术方案，步骤一及步骤四中高温高压灭菌条件为：102.9kPa，121～126℃，20～30min。
作为一种进一步的技术方案，步骤六中用接种环或微型镊子将单个细胞团取出放入盐藻液体培养基中培养。
作为一种进一步的技术方案，步骤六中单个细胞团取出放入盐藻液体培养基中培养条件为：28～35℃，光照强度3000～10000lx，光暗比L：D＝14h：10h。
作为一种进一步的技术方案，固体培养基中各组分的含量为：琼脂浓度为0.7～1.2％、氯化钠浓度为5～10％、硝酸钾浓度为2～3g/L、磷酸二氢钾浓度为0.03～0.05g/L、碳酸氢钠浓度为1～3g/L、氯化钙浓度为0.1～0.4g/L、乙二胺四乙酸二钠浓度为4.36mg/L、六水三氯化铁浓度为3.15mg/L、维生素B1浓度为0.1～0.3mg/L、维生素B12浓度为0.5～1.5ug/L、硼酸0.61mg/L、钼酸铵0.38mg/L、氯化锌0.041mg/L、硫酸铜0.06mg/L、氯化钴0.051mg/L、氯化锰0.041mg/L。
一种微藻分离纯化方法，利用上述的一种盐藻纯化分离方法对其他微藻进行纯化分离。
相对于现有技术，本发明所述的盐藻纯化分离方法及微藻纯化分离方法具有以下优势：
本发明所述的盐藻纯化分离方法，能够有效的解决以往盐藻分离过程中操作难的问题，而且还提高了分离纯化的成功率，实现了非专业人员也能很好的完成盐藻的分离和纯化操作，为实验和生产盐藻提供纯化的藻种具有重要意义；
本发明中使用琼脂浓度为0.7～1.2％，这个浓度凝固的培养基非常柔软，而且本申请中低浓度琼脂凝固前与待分离纯化的盐藻藻液充分混合，既可以把盐藻细胞固定在某个位置，同时又可以让盐藻有繁殖生长的空间，能够防止采用涂布法在盐藻生长起来前有盐析出、甚至干掉；
本发明中加入的氯化钠浓度为5～10％，既可以保证琼脂不会短时间内析出盐结晶，又可以保证盐藻生存的环境；
本方法略加修改或修饰也可用于其他微藻的分离纯化，略加修改或修饰与现有技术基本相似，即选择相应藻类的培养基即可，在本申请中不做详细叙述。由此，该微藻分离纯化方法所达到的技术优势及效果包括上述盐藻纯化分离方法所达到的技术优势及效果，此处不再一一赘述。
如有需要，本方法可以用于盐藻藻种和其他微藻的保存。
附图说明
图1为本发明实施例1提供的盐藻纯化分离方法培养出的盐藻细胞团的放大10倍的示意图；
图2为本发明实施例1提供的盐藻纯化分离方法培养出的盐藻细胞团的放大45倍的示意图；
图3为本发明实施例2提供的盐藻纯化分离方法培养出的盐藻细胞团的放大10倍的示意图；
图4为本发明实施例2提供的盐藻纯化分离方法培养出的盐藻细胞团的放大45倍的示意图；
图5为本发明实施例3提供的盐藻纯化分离方法培养出的盐藻细胞团的放大10倍的示意图；
图6为本发明实施例3提供的盐藻纯化分离方法培养出的盐藻细胞团的放大45倍的示意图。
具体实施方式
除有定义外，以下实施例中所用的技术术语具有与本发明所属领域技术人员普遍理解的相同含义。以下实施例中所用的试验试剂，如无特殊说明，均为常规生化试剂；所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
下面结合实施例及附图来详细说明本发明。
实施例1
具体包括如下步骤：
步骤一：称取琼脂7g、氯化钠50g、硝酸钾2g、磷酸二氢钾0.03g，碳酸氢钠1g、氯化钙0.1g、乙二胺四乙酸二钠4.36mg、六水三氯化铁3.15mg、硼酸0.61mg/L、钼酸铵0.38mg/L、氯化锌0.041mg/L、硫酸铜0.06mg/L、氯化钴0.051mg/L、氯化锰0.041mg/L，用蒸馏水溶解，定容到1000毫升后倒入三角烧瓶中，102.9kPa，121℃，20min灭菌。
步骤二：灭菌完成后置于超净工作台中，待温度降至50～60℃时加入维生素B10.1mg，维生素B12 0.5ug，摇匀后放入35℃水浴锅中。
步骤三：待培养基温度降至35℃时，用移液枪加入100微升(盐藻密度为1×105cells/ml)待分离纯化的盐藻藻液，混匀。
步骤四：将培养基倒入已灭菌过的培养皿中，冷却后用封口膜密封；
步骤五：将培养皿置于28℃，光照度3000lx,，光暗比14：10(L：D)条件的光照培养箱内，让藻株生长繁殖。
步骤六：培养30天后，盐藻在固体培养基中均匀分布多个细胞团【见图1、图2】，用接种环或微型镊子将单个细胞团取出放入液体培养基中培养。
实施例2
步骤一：称取琼脂10g、氯化钠80g、硝酸钾2.5g、磷酸二氢钾0.04g，碳酸氢钠2g、氯化钙0.25g、乙二胺四乙酸二钠4.36mg、六水三氯化铁3.15mg、硼酸0.61mg/L、钼酸铵0.38mg/L、氯化锌0.041mg/L、硫酸铜0.06mg/L、氯化钴0.051mg/L、氯化锰0.041mg/L，用蒸馏水溶解，定容到1000毫升后倒入三角烧瓶中，102.9kPa，121℃，20min灭菌。
步骤二：灭菌完成后置于超净工作台中，待温度降至50～60℃时加入维生素B10.2mg；维生素B12 1ug，摇匀后放入40℃水浴锅中。
步骤三：待培养基温度降至40℃时，用移液枪加入500微升(盐藻密度为1×105cells/ml)待分离纯化的盐藻藻液，混匀。
步骤四：将培养基倒入已灭菌过的培养皿中，冷却后用封口膜密封；
步骤五：将培养皿置于30℃，光照度5000lx，光暗比14：10(L：D)条件的光照培养箱内，让藻株生长繁殖。
步骤六：培养35天后，盐藻在固体培养基中均匀分布多个细胞团【见图3、图4】，用接种环或微型镊子将单个细胞团取出放入液体培养基中培养。
实施例3：
步骤一：称取琼脂12g、氯化钠100g、硝酸钾3g、磷酸二氢钾0.05g，碳酸氢钠3g、氯化钙0.4g、乙二胺四乙酸二钠4.36mg、六水三氯化铁3.15mg、硼酸0.61mg/L、钼酸铵0.38mg/L、氯化锌0.041mg/L、硫酸铜0.06mg/L、氯化钴0.051mg/L、氯化锰0.041mg/L，用蒸馏水溶解，定容到1000毫升后倒入三角烧瓶中，102.9kPa，121℃，20min灭菌。
步骤二：灭菌完成后置于超净工作台中，待温度降至50～60℃时加入维生素B10.3mg；维生素B12 1.5ug，摇匀后放入45℃水浴锅中。
步骤三：待培养基温度降至45℃时，用移液枪加入1000微升(盐藻密度为1×105cells/ml)待分离纯化的盐藻藻液，混匀。
步骤四：将培养基倒入已灭菌过的培养皿中，冷却后用封口膜密封；
步骤五：将培养皿置于35℃，光照度10000lx,，光暗比14：10(L：D)条件的光照培养箱内，让藻株生长繁殖。
步骤六：培养30天后，盐藻在固体培养基中均匀分布多个细胞团【见图5、图6】，用接种环或微型镊子将单个细胞团取出放入液体培养基中培养。
实施例1-3中的盐藻来自中盐工程技术研究院有限公司，另外采用本申请提供的方法对其他盐藻进行纯化，也能很好的完成盐藻的分离和纯化操作。
实施例1-3中的液体培养基的配方为：Johnsons培养基。
另外，液体培养基也可采用其他现有的盐藻培养基。
本方法略加修改或修饰也可用于其他微藻的分离纯化，略加修改或修饰与现有技术基本相似，即选择相应藻类的培养基即可，在本申请中不做详细叙述。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (8)

1.一种盐藻纯化分离方法，其特征在于：采用固体培养基与待分离纯化的盐藻细胞混合的方式对盐藻纯化分离。
2.根据权利要求1所述的盐藻纯化分离方法，其特征在于：采用琼脂浓度为0.7～1.2％的固体培养基，高温灭菌后温度降至35～45℃，加入待分离纯化的盐藻细胞；
优选的，每1000mL0.7～1.2％浓度的琼脂培养基在35～45℃时加入1×103～1×105个盐藻细胞。
3.根据权利要求2所述的盐藻纯化分离方法，其特征在于：具体包括如下步骤：
步骤一：按固体培养基配方比例称量各组分，加入除维生素外的营养盐，高温高压灭菌；
步骤二：灭菌完成后置于超净工作台中，待温度降至50～60℃时加入维生素，混匀；
步骤三：待培养基温度降至35～45℃时，加入待分离纯化的盐藻细胞，混匀；
步骤四：将培养基倒入已灭菌过的培养皿中，冷却后用封口膜密封；
步骤五：将培养皿置于28～35℃，光照强度3000～10000lx，光暗比L：D＝14h：10h条件下，让盐藻细胞生长繁殖；
步骤六：培养20～35天后，盐藻在固体培养基中均匀分布多个细胞团，将单个细胞团取出单独培养。
4.根据权利要求3所述的盐藻纯化分离方法，其特征在于：步骤一及步骤四中灭菌条件为：102.9kPa，121～126℃，20～30min。
5.根据权利要求3所述的盐藻纯化分离方法，其特征在于：步骤六中用接种环或微型镊子将单个细胞团取出放入盐藻液体培养基中培养。
6.根据权利要求5所述的盐藻纯化分离方法，其特征在于：步骤六中单个细胞团取出放入盐藻液体培养基中培养条件为：28～35℃，光照强度3000～10000lx，光暗比L：D＝14h：10h。
7.根据权利要求3～6任一项所述的盐藻纯化分离方法，其特征在于：固体培养基中各组分的含量为：琼脂浓度为0.7～1.2％、氯化钠浓度为5～10％、硝酸钾浓度为2～3g/L、磷酸二氢钾浓度为0.03～0.05g/L、碳酸氢钠浓度为1～3g/L、氯化钙浓度为0.1～0.4g/L、乙二胺四乙酸二钠浓度为4.36mg/L、六水三氯化铁浓度为3.15mg/L、维生素B1浓度为0.1～0.3mg/L、维生素B12浓度为0.5～1.5ug/L、硼酸0.61mg/L、钼酸铵0.38mg/L、氯化锌0.041mg/L、硫酸铜0.06mg/L、氯化钴0.051mg/L、氯化锰0.041mg/L。
8.一种微藻分离纯化方法，其特征在于：利用权利要求1-7任一项所述的一种盐藻纯化分离方法对其他微藻进行纯化分离。
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