CN104404118B - 一种利用海水促进雨生红球藻生产天然虾青素的方法 - Google Patents
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Abstract
一种利用海水促进雨生红球藻生产天然虾青素的方法，涉及雨生红球藻的人工培养技术领域，包括利用海水配制红球藻改良培养基，分步添加海水诱导红球藻营养生长、细胞类型转化与虾青素的累积。该方法适于在海水资源丰富的沿海地区进行大规模养殖雨生红球藻生产天然虾青素，与仅使用淡水的传统培养方法比较，具有生产周期短、虾青素含量高、原料成本低等方面的优势，具有广阔的产业化应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及雨生红球藻的人工培养技术领域，特别涉及一种利用海水促进雨生红球藻生产天然虾青素的方法。
背景技术
虾青素（Astaxanthin）是一种类胡萝卜素类的色素，化学名为3,3'-二羟基-β-胡萝卜素-4,4'-二酮，天然存在于藻类、虾、蟹及鲑鱼等生物中。天然虾青素是一种具有高抗氧化活性的类胡萝卜素，它具有10倍于β-胡萝卜素抗氧化效果和550倍于维生素E的抑制脂质过氧化反应特性，它不能在动物体内合成，但它是人体和动物生命活动所必须的物质。研究表明，虾青素可增强生物体的免疫力，可辅助心血管疾病、免疫系统、炎症和神经退行性等疾病康复，同时具有抗衰老和修复紫外线损伤的功能，可广泛应用于水产及畜牧养殖、食品与化妆品以及医药产业，具有巨大的市场潜力。
虾青素可用化学法利用胡萝卜素进行人工合成，其产品价格非常昂贵，每公斤高达2500美元。但是，人工合成的虾青素含有非天然的同分异构体以及鉴于化学合成品的副作用，人工合成的虾青素仅被批准用作如三文鱼等海产品的着色剂，因此人们对天然虾青素兴趣更高。目前，天然虾青素主要产自于甲壳类动物、红法夫酵母和微藻中，其中，甲壳类动物的外壳中含有虾青素，但含量低而且不易规模开发；法夫酵母（Phaffia rhodozyma）细胞生产的天然虾青素于2000年被FDA批准用于食品添加剂，但法夫酵母中的虾青素平均含量仅有0.4%，生产效率较低。
产虾青素的微藻中，雨生红球藻（Haematococcus pluvialis）是一种单细胞真核绿藻，隶属绿藻门，团藻目、红球藻科、红球藻属。由于该藻能大量累积虾青素（Astaxanthin）而呈现红色，故取名红球藻。在特定的环境下能大量累积虾青素，其含量可达细胞干重的1.5-4%，因此，雨生红球藻是公认最好的用于天然虾青素开发的生物资源，已成为国际天然虾青素产业的研究热点。雨生红球藻软胶囊作为营养保健食品通过了美国FDA批准，可有效预防血液中LDL-胆固醇的氧化损伤、保护皮肤抵御紫外辐射损伤以及缓解年龄相关性黄斑变性等。我国已于2010年经卫生部批准雨生红球藻作为新资源食品，因此开发雨生红球藻生产天然虾青素具有巨大的市场潜力。
在雨生红球藻的规模化培养过程中，需要解决的技术问题是如何提高藻细胞的生长速率并在短时间内尽快完成从藻种分裂繁殖到获得最高虾青素含量的厚壁孢子的周期，以期在单位时间内收获尽可能多的虾青素产量。雨生红球藻的细胞周期大致可分为游动细胞和不动细胞两种。在合适的光照、温度、pH值和营养盐环境中，游动细胞能迅速营养生长及裂殖，提高藻细胞的生物量；而环境不适合时，游动细胞或刚释放的游动孢子褪去鞭毛，直接转化为不动细胞阶段，细胞呈圆形，大小变化幅度较大，通常直径在20-30μm。不动细胞初为绿色，逐渐变成中央红色而外周仍为绿色，最终整个细胞变为鲜红至深红色。因而雨生红球藻积累虾青素阶段需要进行胁迫处理以提高其虾青素产量。
发明内容
本发明的目的在于提供一种能够提高雨生红球藻细胞的生长速率并在短时间内尽快完成从藻种分裂繁殖到获得最高虾青素含量的厚壁孢子的周期的方法，以期在单位时间内收获尽可能多的虾青素产量。
为实现上述目的，本发明提供了一种利用海水促进雨生红球藻生产天然虾青素的方法，其特征在于包括以下步骤：
（1） 利用海水配制营养生长培养基
所述培养基的组成包括：NaNO3 0.25g/L，K2HPO4 0.175 g/L，MgSO4。7H2O 0.05g/L，CaCl2.2H2O 0.025 g/L，EDTA 0.050 g/L, FeSO4.7H2O 0.0049 g/L，ZnSO4 0.00882g/L，MnCl2•4H2O 0.00144 g/L，MoO3 0.00071 g/L，CuSO4.5H2O 0.00157 g/L，Co(NO3)2.6H2O 0.00049 g/L，Vitamin B12 0.00025 g/L，海水1-5ml/L；所述培养基的pH值为7-8.5；
（2）雨生红球藻营养生长
将雨生红球藻游动细胞接种到经过灭菌处理的步骤（1）配制的培养基中，用机械搅拌的方法使藻类和培养基均匀地流动，控制温度在20-28℃，采用自然光照培养，控制培养基的pH值在8.5以下；
（3）利用海水诱导细胞类型转化
当藻细胞培养到第六天时，提高光照强度至1000-30000Lux，并向每升培养基中加入体积百分比为0.5-1%的海水，诱导红球藻进行细胞类型转化；
（4）利用海水诱导虾青素累积
当显微观察到藻细胞成为不动的厚壁孢子后，再向每升培养基中加入体积百分比为1-10%的海水进行连续培养3天时间。
优选地，添加海水之前，先对海水进行净化处理，以除去海水中的杂质和微生物。
优选地，所述净化处理为高温灭菌处理、膜过滤处理以及紫外或臭氧消毒处理中的至少一种。
优选地，所述膜过滤处理中采用孔径为0.22微米的滤膜。
优选地，步骤（2）中接种到培养基中的雨生红球藻的藻细胞密度为1-5×104个细胞/mL。
优选地，从接种培养后的第二天开始直到第五天，每天向培养基中通入二氧化碳，以使培养基的pH值控制在8.5以下。
进一步地，所述方法还包括雨生红球藻采收与富含虾青素藻粉制备步骤，具体如下：当雨生红球藻培养到第十天，或者雨生红球藻厚壁孢子变为深红色时停止机械搅拌，使红球藻厚壁孢子自然沉淀，排出上清液后，离心收集厚壁孢子并进行干燥处理，从而获得富含虾青素的雨生红球藻藻粉。
有益效果：
本发明提供的方法适于在海水资源丰富的沿海地区进行大规模养殖雨生红球藻生产天然虾青素，具有广阔的产业化应用前景。天然海水中含有非常丰富的氯化纳资源，其盐度在3.0%-3.8%左右，除氯化钠外，还含有许多藻类生长必需的微量元素，非常有利于藻细胞的生长与虾青素的累积。
与现有的仅使用淡水的传统培养方法相比，本发明提供的方法具有以下优点：
（1）生产周期缩短，雨生红球藻营养生长、孢子转化与虾青素累积过程在10天内完成，而目前传统方法一般需要12-15天时间；
（2）藻细胞虾青素含量高，经实际检测发现，采用该方法培养的雨生红球藻粉中虾青素含量达到3.0%以上，而采用传统方法生产的红球藻厚壁孢子中虾青素含量仅在2-3%左右。
（3）生产成本低，因使用天然海水资源，大大减少了氯化钠等无机盐的使用量，降低了原料成本。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步的详细说明，以下实施例是对本发明的解释，本发明并不局限于以下实施例。
本实施例以雨生红球藻的野生株系为材料，分步添加海水到雨生红球藻培养体系中，添加的时间段分别是雨生红球藻细胞营养生长阶段、细胞类型转化阶段和藻细胞虾青素累积阶段。海水取自深圳大亚湾，盐度经ATAGO S28α盐度计测定为3%，海水加入培养体系前先经高温、高压灭菌处理，或膜过滤处理（滤膜孔径为0.22微米），或经过紫外消毒或臭氧消毒处理，然后按比例分步添加到雨生红球藻培养体系中，使整个培养体系中的氯化钠浓度控制在0.01—1%的范围内。详述如下：
（1）雨生红球藻营养生长培养基的配制：在7500L的开放式跑道池培养体系，先将培养池中放入20-25cm深的水，按以下培养体积浓度比例加入各种营养组分：
NaNO3 0.25g/L，K2HPO4 0.175 g/L，MgSO4。7H2O 0.05 g/L，CaCl2.2H2O 0.025 g/L，EDTA 0.050 g/L, FeSO4.7H2O 0.0049 g/L，ZnSO4 0.00882 g/L，MnCl2•4H2O 0.00144 g/L，MoO3 0.00071 g/L，CuSO4.5H2O 0.00157 g/L，Co(NO3)2.6H2O 0.00049 g/L，Vitamin B120.00025 g/L，海水1-5ml/L；
将培养体系的pH 值调至7-8.5范围内，加入水使培养体系达到7500L。
（2）接种及雨生红球藻细胞营养生长：将雨生红球藻游动细胞接种到经过灭菌处理的7500L营养生长培养基中，使藻细胞密度达到1-5×104个细胞/mL。用机械搅拌的方法使藻类和培养基均匀地流动，控制温度在20-28℃，采用自然光照培养。从第二天开始直到第五天均通过充气泵向培养基中通入二氧化碳，控制培养基pH值在8.5以下。利用海水配制的改良培养基能促进藻细胞快速进行营养生长，藻细胞快速生长繁殖，为游动孢子状态，每天通过显微镜检查藻细胞的生长状态。当藻细胞培养到第六天，藻细胞密度达到1-5×106个细胞/mL左右。
（3）利用海水诱导细胞类型转化：在7500L开放式跑道池培养体系中培养雨生红球藻到藻细胞密度达到1-5×106个细胞/mL左右时，提高光照强度至1000-30000Lux，同时在培养基中加入经过净化处理的天然海水10-50ml/L，诱导红球藻进行细胞类型转化。
（4）利用海水诱导虾青素累积：当显微观察到藻细胞失去鞭毛，外周为绿色而中央呈现红色，并且藻细胞95%成为不动的厚壁孢子时，再次向每升培养基中加入经过净化处理的天然海水50-300 ml/L进行连续培养3天时间。
（5）雨生红球藻采收与富含虾青素藻粉制备：当海水诱导雨生红球藻培养到第十天，或红球藻厚壁孢子变为深红色时，停止机械搅拌系统，使红球藻厚壁孢子自然沉淀，排出上请液后，离心收集厚壁孢子，并进行干燥处理（80℃左右），获得富含虾青素的雨生红球藻藻粉。
采用高效液相色谱法[孙伟红、肖荣辉、冷凯良等. 分析测试学报，2010，29(8):841-845]，对先后五批次培养采收的藻粉进行检测，其海水诱导红球藻虾青素含量均达到细胞干重的3.0%以上，而未添加海水的培养体系中采收的红球藻藻粉虾青素含量仅在2.0-2.5%之间。
Claims (6)
1.一种利用海水促进雨生红球藻生产天然虾青素的方法，其特征在于包括以下步骤：
（1） 利用海水配制营养生长培养基
所述培养基的组成包括：NaNO3 0.25g/L，K2HPO4 0.175 g/L，MgSO4 7H2O 0.05 g/L，CaCl2.2H2O 0.025 g/L，EDTA 0.050 g/L, FeSO4.7H2O 0.0049 g/L，ZnSO4 0.00882 g/L，MnCl2•4H2O 0.00144 g/L，MoO3 0.00071 g/L，CuSO4.5H2O 0.00157 g/L，Co(NO3)2.6H2O0.00049 g/L，Vitamin B12 0.00025 g/L，海水1-5ml/L；所述培养基的pH值为7-8.5；
（2）雨生红球藻营养生长
将雨生红球藻游动细胞接种到经过灭菌处理的步骤（1）配制的培养基中，用机械搅拌的方法使藻类和培养基均匀地流动，控制温度在20-28℃，采用自然光照培养，控制培养基的pH值在8.5以下，从接种培养后的第二天开始直到第五天，每天向培养基中通入二氧化碳，以使培养基的pH值控制在8.5以下;
（3）利用海水诱导细胞类型转化
当藻细胞培养到第六天时，提高光照强度至1000-30000Lux，并向每升培养基中加入体积百分比为0.5-1%的海水，诱导红球藻进行细胞类型转化；
（4）利用海水诱导虾青素累积
当显微观察到藻细胞成为不动的厚壁孢子后，再向每升培养基中加入体积百分比为1-10%的海水进行连续培养3天时间。
2.根据权利要求1所述的利用海水促进雨生红球藻生产天然虾青素的方法，其特征在于：添加海水之前，先对海水进行净化处理，以除去海水中的杂质和微生物。
3.根据权利要求2所述的利用海水促进雨生红球藻生产天然虾青素的方法，其特征在于：所述净化处理为高温灭菌处理、膜过滤处理以及紫外或臭氧消毒处理中的至少一种。
4.根据权利要求3所述的利用海水促进雨生红球藻生产天然虾青素的方法，其特征在于：所述膜过滤处理中采用孔径为0.22微米的滤膜。
5.根据权利要求1至4任意一项所述的利用海水促进雨生红球藻生产天然虾青素的方法，其特征在于：步骤（2）中接种到培养基中的雨生红球藻的藻细胞密度为1-5×104个细胞/mL。
6.根据权利要求1至4任意一项所述的利用海水促进雨生红球藻生产天然虾青素的方法，其特征在于：所述方法还包括雨生红球藻采收与富含虾青素藻粉制备步骤，具体如下：当雨生红球藻培养到第十天，或者雨生红球藻厚壁孢子变为深红色时停止机械搅拌，使红球藻厚壁孢子自然沉淀，排出上清液后，离心收集厚壁孢子并进行干燥处理，从而获得富含虾青素的雨生红球藻藻粉。
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