CN105452442A - 生产藻类细胞培养物和生物质、脂质化合物和组合物以及相关产品的方法 - Google Patents

生产藻类细胞培养物和生物质、脂质化合物和组合物以及相关产品的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及生产藻类生物量和藻类细胞培养物以及脂质化合物及其组合物(包括脂肪酸、类胡萝卜素和脂溶性维生素)的方法。本发明进一步涉及制备相关食品和工业和药物组合物的方法。在各个示例性实施方案中，所述方法包括使藻类在基于汁液的培养基、包括含有天然氮的培养基或不含化学添加剂和防腐剂的培养基中生长，以产生藻类细胞培养物、藻类生物量、源自藻类的脂质化合物和组合物以及相关产物，所有这些都可以是认证为有机的。

Description

生产藻类细胞培养物和生物质、脂质化合物和组合物以及相 关产品的方法
发明领域
本发明涉及生产藻类生物质和细胞培养物以及脂质化合物及其组合物(包括脂肪酸、类胡萝卜素和脂溶性维生素)的方法。本发明进一步涉及制备相关食品和工业和药物组合物的方法。在各个示例性实施方案中，所述方法包括使藻类在基于汁液的培养基（包括不含化学添加剂和防腐剂的培养基）中生长，以生产藻类细胞培养物、藻类生物质、脂质化合物和组合物和相关产物，所有都可以是认证为有机的。
背景
藻类(包括微型和大型-藻类)是栖居地球上的大部分生态系统的生物体的多元化群体。藻类最通常通过色素分类。绿色藻类或绿藻含有叶绿素a和b。红色藻类或红藻含有叶绿素a和藻胆色素。褐色藻类，被称为杂色藻类，含有叶绿素a和c，但缺乏叶绿素b。
水产养殖中利用的藻类物种的实例包括：眼点拟微绿球藻(Nannochloropsisoculata)(2-4 μm)，球等鞭金藻(Isochrysis galbana)(5-7 μm)，裂殖壶菌属种(SSchizochytrium sp.)，chuii四爿藻(Tetraselmis chuii)(7-10 μm)，纤细角毛藻(Chaetoceros gracilis)(6-8 μm)，盐生杜氏藻(Dunaliella tertiolecta)(7-9 μm)，以及小球藻属(Chlorella)(直径3-9 μm)、菱形藻属(Nitzschia)和衣藻属(Chlamydomonas)的几个种。
水生环境的化学特征在决定藻类生长速率和生物质质量中发挥重要作用。通常，用于培养微型藻类的培养基的组成共有几个共同特征。一些营养素必须以相对高浓度提供。这些营养素，被称为常量营养素，是碳(C)、氮(N)、磷(P)、钠(Na)、硫(S)、钾(K)和镁(Mg)。还必须提供以较低浓度的必需的微量营养素。这些微量营养素包括锰(Mn)、锌(Zn)、铜(Cu)、钼(Mo)和钴(Co)、铁(Fe)、氯(Cl)、钙(Ca)和硼(Bo)。藻类生长需要这些营养素。藻类培养基中存在的常量和微量营养素的摩尔化学计量是培养基的关键特征，且当开发或改进培养基配方时必须注意这些比率。
如同所有活生物体，必须提供藻类能够同化的碳源给合成的藻类生长培养基。以二氧化碳的形式提供的碳被称为无机碳。该碳通过光合作用的过程固定。一些藻类可以完全在无机碳源上生长，且该生长模式被称为光合自养生长。大多数藻类的种可以呈现光合自养生长模式。一些藻类也可以具有不需要光合作用而从有机碳源获得能量的能力；该生长模式被称为异养生长模式。其它藻类可以同时利用光和二氧化碳以及有机碳源用于生长，这被称为混合营养生长。在混合营养或异养生长模式的情况下，用于培养微藻的碳源包括葡萄糖、右旋糖、乙酸酯和甲醇(还原性碳源)。
补充至藻类生长培养基的常见氮源是硝酸盐(NO3)、亚硝酸盐((NO2)、铵(NH4)、尿素、氨基酸(谷氨酸单钠或精氨酸)、胰蛋白胨、蛋白胨、酪蛋白、非有机酵母提取物和玉米浆液体。
磷、硫和镁都是必需营养素，其添加是藻类生长需要的。硫酸盐(SO4)是通常添加至合成藻类生长培养基的硫的形式。无机磷酸盐(H2PO4或HPO4)是通常提供至藻类培养基的磷的形式；然而，也可以使用有机磷酸盐的形式。过量磷酸盐已经与新鲜水和海洋生态系统两者中的藻类大量繁殖联系起来。
铁是在藻类细胞中的细胞代谢和能量产生中发挥重要作用的关键元素。通常，铁的三价铁和亚铁形式容易由微藻同化。补充铁的早期尝试经常导致铁从溶液沉淀出。因此，许多配方需要铁悬浮于化学螯合剂中，通常为乙二胺四乙酸(EDTA)钠。EDTA螯合其它痕量元素诸如铜、钴和镉。
被称为痕量元素的其它元素必须补充至合成藻类培养基中。铜、锰、钼和锌是通常包括于痕量元素的溶液中的金属。钒、硼和钴有时同样包括于痕量元素中。具有高浓度的这些金属的补充是有毒的，因此必须小心不过量添加它们。将化学螯合剂诸如EDTA添加至含有这些金属的溶液通常用于防止沉淀。
已经表明，添加维生素可以改变裂殖壶菌属(Schizochytrium)的脂肪酸组成且改善其它种类的藻类的生物质产量。因此，合成生长培养基的许多制剂包括添加的维生素。
藻类的一种商业应用是它们生产有商业价值的脂质和亲脂性化合物诸如各种脂肪酸和抗氧化剂的能力。例如，ω-3脂肪酸是对身体和心理健康重要的营养素。这些必需脂肪酸支持心血管、生殖、免疫和神经系统健康。ω-3脂肪酸在脑中高度集中，且似乎对于认知(脑记忆和性能)和行为功能是重要的。事实上，在妊娠期间没有从其母亲得到足够ω-3脂肪酸的婴儿处于发展视觉和神经病况的风险中。
破囊壶菌属(Thraustochytrids)是就生产ω-3脂肪酸而言已经是的重要研究和开发的焦点的微藻。已知破囊壶菌属合成和积累多不饱和脂肪酸(PUFA)，诸如二十二碳六烯酸(DHA；C22:6 n-3)。从破囊壶菌属工业生产DHA在过去二十年已经大大推进。导致从这些种类的藻类经济生产DHA的关键特征是它们在异养培养基中生长的能力。当在发酵容器生长时，包括葡萄糖作为碳源和MSG、玉米浆液体或酵母提取物作为氮源的异养培养基的制剂产生高细胞浓度、快速生长速率和显著量的DHA。除了碳和氮以外，将磷酸盐、硫酸盐、铁、磷、钠、硫、钾、镁和痕量元素补充至合成藻类培养基中。在其中使用更复杂化学添加剂诸如玉米浆液体和酵母提取物的情况下，可以省略痕量元素和维生素，因为这些添加剂含有足量这些营养素。
通常，用于培养微藻的异养培养基的先前所述配方总是含有化学添加剂。痕量元素也源自化学来源。常量和微量营养素经常是化学衍生的。玉米浆液体是源自湿磨玉米的工业副产品，经常向所述浆中注入化学品二氧化硫气体以促进玉米籽粒的软化。氮源诸如铵、硝酸盐、MSG都是其中需要化学品来合成或分离产物的工业过程的产物。使用含有源自化学品的营养素的培养基产生非有机酵母提取物。已经提出用于工业生产破囊壶菌属的其它化合物是gelysate、蛋白胨、胰蛋白胨、酪蛋白、尿素、乳清或玉米蛋白粉，都是其中需要化学品来合成或分离产物的工业过程的产物。此类培养基不适合用于生产藻类和藻类衍生的组合物和不含化学品或认证为有机的化合物。
美国国家有机计划(US National Organic Program)建立了关于有机实践和标记的规则。概述了允许和不允许的物质，且添加至国家列表中。所述列表包括合成衍生的物质，诸如DHA和EPA。在NOP准则下不允许的物质是非有机酵母和源自非有机酵母的产物、合成衍生的硫酸盐和合成衍生的痕量元素，仅举几例。鉴于1) USDA确定了它们提供健康益处和2)有机替代物不可得到，在现有法律下已经允许多达5％的非有机物质。已经允许含有合成衍生的DHA的有机产品进行销售和出售。藻类DHA行业已经主张无法开发用于有机生产藻类DHA的方法。因此，将非有机藻类油添加至有机标记的婴儿配方和其它食物仍存在争议。
因此，需要商业规模生产不含化学添加剂和防腐剂的藻类及其构成组分，包括认证为有机的那些，以用于食物、药物和美容品和工业产品中。
概述
提供用于生产藻类培养物、生物质、脂质化合物和脂质组合物和相关产品的方法。
在一个说明性实施方案中，提供用于生产藻类生物质或藻类细胞培养物的方法，其包括使藻类在培养基中生长且从所述培养基收获所述藻类生物质或藻类细胞培养物，其中所述培养基包含来自一种或多种水果的汁液、氧源和氮，其中所述培养基是灭菌的，且其中所述培养基中的氮由天然氮组成。
在另一个说明性实施方案中，培养基可以补充有盐源。在另一个说明性实施方案中，所述盐源可以是海水。在一个进一步实施方案中，所述海水可以具有约10 ppt至约35ppt的范围内的盐度。
在进一步说明性实施方案中，任何上述实施方案的培养基可以补充有糖。在另一个实施方案中，所述糖可以是右旋糖或果糖。在另一个实施方案中，所述糖可以是认证为有机的。
在另一个说明性实施方案中，所述培养基可以由汁液、氧源、氮、糖和盐源组成。在另一个说明性实施方案中，所述培养基可以由汁液、氧源、氮和糖组成。在又另一个说明性实施方案中，所述培养基可以由汁液、氧源、氮和盐源组成。
在另一个说明性实施方案中，提供用于生产藻类生物质或藻类细胞培养物的方法，其包括使藻类在培养基中生长且从所述培养基收获所述藻类生物质或藻类细胞培养物，其中所述培养基由来自一种或多种水果或蔬菜或水果和蔬菜的任何组合的汁液、糖、盐源、氧源和氮组成，其中所述培养基是灭菌的，且其中所述培养基中的氮由天然氮组成。
在另一个说明性实施方案中，提供用于生产藻类生物质或藻类细胞培养物的方法，其包括使藻类在培养基中生长且从所述培养基收获所述藻类生物质或藻类细胞培养物，其中所述培养基由来自一种或多种水果或蔬菜或水果和蔬菜的任何组合的汁液、糖、氧源和氮组成，其中所述培养基是灭菌的，且其中所述培养基中的氮由天然氮组成。
在另一个说明性实施方案中，提供用于生产藻类生物质或藻类细胞培养物的方法，其包括使藻类在培养基中生长且从所述培养基收获所述藻类生物质或藻类细胞培养物，其中所述培养基由来自一种或多种水果或蔬菜或水果和蔬菜的任何组合的汁液、盐源、氧源和氮组成，其中所述培养基是灭菌的，且其中所述培养基中的氮由天然氮组成。
在进一步说明性实施方案中，前述四段的任何实施方案的糖可以是右旋糖或果糖。在一个进一步说明性实施方案中，所述糖可以是认证为有机的。在另一个说明性实施方案中，前述四段的任何实施方案的盐源可以是海水。在一个进一步实施方案中，所述海水可以具有约10 ppt至约35 ppt的范围内的盐度。
在另一个说明性实施方案中，提供生产一种或多种脂质化合物或其组合物的方法，其包括使藻类在培养基中生长且从藻类提取所述化合物或组合物，其中所述培养基包含来自一种或多种水果或蔬菜或来自水果和蔬菜的任何组合的汁液、氧源和氮，其中所述培养基是灭菌的，且其中所述培养基中的氮由天然氮组成。
在另一个说明性实施方案中，前述段落的实施方案的培养基可以补充有盐源。在另一个说明性实施方案中，所述盐源可以是海水。在一个进一步实施方案中，所述海水可以具有约10 ppt至约35 ppt的范围内的盐度。
在进一步说明性实施方案中，前述两段的任何实施方案的培养基可以补充有糖。在另一个实施方案中，所述糖可以是右旋糖或果糖。在另一个实施方案中，所述糖可以是认证为有机的。
在另一个说明性实施方案中，所述培养基可以由汁液、氧源、氮、糖和灭菌的盐源组成。在又另一个说明性实施方案中，所述培养基可以由汁液、氧源、氮和糖组成。在另一个说明性实施方案中，所述培养基可以由汁液、氧源、氮和盐源组成。
在另一个说明性实施方案中，提供生产一种或多种脂质化合物或其组合物的方法，其包括使藻类在培养基中生长且从藻类提取所述化合物或组合物，其中所述培养基由来自一种或多种水果或蔬菜或来自水果和蔬菜的任何组合的汁液、氧源、氮、盐源和糖组成，其中所述培养基是灭菌的，且其中所述培养基中的氮由天然氮组成。
在另一个说明性实施方案中，提供生产一种或多种脂质化合物或其组合物的方法，其包括使藻类在培养基中生长且从藻类提取所述化合物或组合物，其中所述培养基由来自一种或多种水果或蔬菜或来自水果和蔬菜的任何组合的汁液、氧源、氮和盐源组成，其中所述培养基是灭菌的，且其中所述培养基中的氮由天然氮组成。
在另一个说明性实施方案中，提供生产一种或多种脂质化合物或其组合物的方法，其包括使藻类在培养基中生长且从藻类提取所述化合物或组合物，其中所述培养基由来自一种或多种水果或蔬菜或来自水果和蔬菜的任何组合的汁液、氧源、氮和糖组成，其中所述培养基是灭菌的，且其中所述培养基中的氮由天然氮组成。
在进一步说明性实施方案中，前述四段的任何实施方案的糖可以是右旋糖或果糖。在一个进一步说明性实施方案中，所述糖可以是认证为有机的。在另一个说明性实施方案中，前述四段的任何实施方案的盐源可以是海水。在一个进一步实施方案中，所述海水可以具有约10 ppt至约35 ppt的范围内的盐度。
在各个说明性实施方案中，任何上述实施方案的化合物可以是脂肪酸、类胡萝卜素或脂溶性维生素。在一个进一步说明性实施方案中，所述脂肪酸可以是多不饱和脂肪酸。在一个进一步说明性实施方案中，所述多不饱和脂肪酸可以选自DHA、EPA、DPA和松油酸。在一个进一步说明性实施方案中，所述多不饱和脂肪酸可以是DHA。在一个进一步说明性实施方案中，所述多不饱和脂肪酸可以是EPA。在一个进一步说明性实施方案中，所述多不饱和脂肪酸可以是松油酸。在一个进一步说明性实施方案中，所述多不饱和脂肪酸可以是DPA。在一个进一步说明性实施方案中，所述类胡萝卜素可以是β-胡萝卜素。
在一个进一步说明性实施方案中，提供生产用于人或动物的食品、美容品、工业组合物或药物组合物的方法，其包括以下步骤：使藻类在培养基中生长且从所述培养基收获藻类生物质或藻类细胞培养物，其中所述培养基包含来自一种或多种水果或蔬菜或水果和蔬菜的任何组合的汁液、氧源和氮，其中所述培养基是灭菌的，且其中所述培养基中的氮由天然氮组成；从所述培养基收获藻类生物质或藻类细胞培养物；和制备所述食品、工业组合物或药物组合物。
在一个进一步说明性实施方案中，前述段落的方法可以进一步包括从所述藻类生物质或藻类细胞培养物提取一种或多种脂质化合物或其组合物和制备所述食品、工业组合物或药物组合物。在一个进一步说明性实施方案中，所述脂质化合物可以是脂肪酸、类胡萝卜素或脂溶性维生素。在一个进一步实施方案中，所述脂肪酸可以是多不饱和脂肪酸。在一个进一步实施方案中，所述多不饱和脂肪酸可以选自DHA、DPA、EPA和松油酸。在一个进一步说明性实施方案中，所述多不饱和脂肪酸可以是DHA。在一个进一步说明性实施方案中，所述多不饱和脂肪酸可以是EPA。在一个进一步说明性实施方案中，所述多不饱和脂肪酸可以是松油酸。在一个进一步说明性实施方案中，所述类胡萝卜素可以是β-胡萝卜素。
在进一步说明性实施方案中，上面前述两段的任何实施方案的培养基可以补充有盐源。在一个进一步实施方案中，所述盐源可以是海水。在一个进一步实施方案中，所述海水可以具有约10 ppt至约35 ppt的范围内的盐度。
在进一步说明性实施方案中，上面前述三段的任何实施方案的培养基可以补充有糖。在一个进一步实施方案中，所述糖可以是右旋糖或果糖。在一个进一步实施方案中，所述糖可以是认证为有机的。在一个进一步实施方案中，所述培养基可以补充有右旋糖和认证为有机的酵母提取物。
在进一步说明性实施方案中，上面前述四段的任何实施方案的制备是食品的制备。在一个进一步说明性实施方案中，所述食品是营养补充剂。
在各个说明性实施方案中，任何上述实施方案的藻类可以属于选自破囊壶菌属(Thraustochytrium)、衣藻属(Chlamydomonas)、拟微绿球藻属(Nannochloropsis)、菱形藻属(Nitzchia)和Aurantiochytrium(以前裂殖壶菌属(Schizochytrium))的属。在一个进一步说明性实施方案中，所述属可以是Aurantiochytrium。在一个进一步说明性实施方案中，所述属可以是拟微绿球藻属。在一个进一步说明性实施方案中，所述属可以是衣藻属。在一个进一步说明性实施方案中，所述属可以是菱形藻属。
在各个说明性实施方案中，任何上述实施方案的藻类的生长可以是异养的(hereterotrophic)或混合营养的。
在各个说明性实施方案中，任何上述实施方案的汁液可以选自番茄汁、甜菜汁、胡萝卜汁、椰子汁和苹果汁。在一个进一步说明性实施方案中，所述汁液可以是甜菜汁。在一个进一步说明性实施方案中，所述汁液可以是番茄汁。在一个进一步说明性实施方案中，所述汁液可以是胡萝卜汁。在一个进一步说明性实施方案中，所述汁液可以是甜菜糖蜜。在一个进一步说明性实施方案中，任何实施方案的汁液用非GMO转化酶水解。在一个进一步说明性实施方案中，本文任何实施方案的汁液是甜菜汁或认证为有机的甜菜糖蜜且所述汁液用非GMO转化酶水解。
在各个说明性实施方案中，任何上述实施方案的汁液可以在培养基中具有约5％至约70％的百分比浓度。在一个进一步说明性实施方案中，所述汁液可以在培养基中具有约10％至约50％的百分比浓度。在一个进一步说明性实施方案中，所述汁液可以在培养基中具有选自约10％、约25％和约50％的百分比浓度。
在进一步说明性实施方案中，任何上述实施方案的汁液可以进行发酵。
在进一步说明性实施方案中，任何上述实施方案的汁液可以进行巴氏灭菌。
在进一步说明性实施方案中，任何上述实施方案的汁液可以是认证为有机的。在一个进一步说明性实施方案中，所述汁液可以是认证为有机的甜菜糖蜜。在一个进一步说明性实施方案中，所述认证为有机的甜菜糖蜜用非GMO转化酶水解。
在进一步说明性实施方案中，任何上述实施方案的培养基可以具有约3至约9的范围内的pH。
在进一步说明性实施方案中，任何上述实施方案的培养基可以不含化学添加剂和防腐剂。
在进一步说明性实施方案中，任何上述实施方案的培养基可以补充有认证为有机的酵母提取物。
在进一步说明性实施方案中，任何上述实施方案的藻类生物质、藻类细胞培养物、脂质化合物或组合物、食品或营养补充剂可以是认证为有机的。
附图简述
图1 (a) – (c)是显示未调节pH的汁液培养基和海水中的A. limacinum(Aurantiochytrium limacinumin)的生长的线型图。
图2 (a) – (c)是显示pH调至6.8的汁液培养基和海水中的A. limacinum的生长的线型图。
图3 (a) – (c)是显示pH调至6.8且补充有右旋糖的汁液培养基和海水中的A.limacinum的生长的线型图。
图4是显示来自含有海水且补充有右旋糖(mg/ml培养基)的汁液培养基中生长的A. limacinum培养物的DHA产率的柱状图。
图5是显示来自含有海水且补充有右旋糖(mg/ml培养基)的汁液培养基中生长的A. limacinum培养物的EPA产率的柱状图。
图6是显示从含有海水且补充有右旋糖(mg/ml培养基)的汁液培养基中生长的A.limacinum培养物提取的DPA的柱状图。
图7是显示甜菜汁培养基(有或没有碳源补充)和F/2培养基中的眼点拟微绿球藻的生长的线型图(细胞数/ml培养基)。
图8是显示基于甜菜糖蜜的培养基中的蛞蝓形裂殖壶菌(S. limacinum)的生长的线型图(细胞数/ml培养基)。
图9是显示补充有右旋糖和/或酵母提取物的基于甜菜汁的培养基中生长的蛞蝓形裂殖壶菌生物质的DHA含量的帕累托图。
图10(a) - (b)是显示悬浮于包括汁液的各种基质中的藻类生物质的自由基清除活性(％)的线型图。
图11(a) - (b)是显示悬浮于包括汁液的各种基质中的藻类生物质中含有的DHA浓度(mg/克干重)线型图和图表。
发明详述
本发明人已经发现使用源自水果和/或蔬菜汁的培养基作为氮源和作为微量营养素、常量营养素和维生素的来源天然产生藻类的成本有效的方式。该培养基，当巴氏灭菌或以其它方式灭菌以保持营养品质和减少天然生物负担时，为藻类生长提供完整和合适的培养基且含有可用于获得高藻类生物质的天然氮和天然生长因子。在一个实施方案中，所述培养基可以补充有碳源，诸如果糖、乙醇、甘油或右旋糖，以加强所需产物诸如ω-3脂肪酸和其它脂质化合物和组合物的产生。在另一个实施方案中，本文任何实施方案的培养基可以补充有右旋糖。在另一个实施方案中，所选汁液和碳补充剂可以是认证为有机的且在不含化学添加剂和防腐剂的情况下产生，使得来自藻类的所得藻类生物质、藻细胞培养物和/或脂质提取物以及相关产品也可以是认证为有机的。在另一个实施方案中，本文任何实施方案的培养基可以补充有右旋糖和认证为有机的酵母提取物。在另一个实施方案中，本文任何实施方案的培养基可以补充有认证为有机的酵母提取物。在另一个实施方案中，可以组合不同类型的水果和/或蔬菜汁类型，以获得用于生产目的脂质提取物诸如ω-3脂肪酸或类胡萝卜素的最佳制剂。在另一个实施方案中，所述汁液可以发酵以释放关键营养素和调节pH值以改善生长。在一些实施方案中，汁液选择可以增强藻类的总油的脂肪酸概况和百分比DHA。在一些实施方案中，所述汁液中的天然抗氧化剂可以改善脂肪酸稳定性和降低脂肪酸的氧化速率。例如，胡萝卜汁中的β-胡萝卜素可以直接提取至油中。所述β-胡萝卜素可以充当用于油的天然稳定剂。在一个实施方案中，本文任何实施方案的汁液增强脂肪酸的稳定性，所述脂肪酸可以是DHA，且所述汁液可以是甜菜汁、认证为有机的甜菜糖蜜、胡萝卜汁或蓝莓汁。在另一个实施方案中，本文任何实施方案的汁液降低脂肪酸的氧化速率，所述脂肪酸可以是DHA，且所述汁液可以是甜菜汁、认证为有机的甜菜糖蜜、胡萝卜汁或蓝莓汁。
本文提供用于生产藻类培养物和生物质和脂质化合物和组合物以及相关产品的方法。
在一个说明性实施方案中，提供用于生产藻类生物质或藻类细胞培养物的方法，其包括使藻类在培养基中生长且从所述培养基收获所述藻类生物质或藻类细胞培养物，其中所述培养基包含来自一种或多种水果或蔬菜或水果和蔬菜的任何组合的汁液、氧源和氮，其中所述培养基是灭菌的，且其中所述培养基中的氮由天然氮组成。
在另一个说明性实施方案中，提供降低脂质化合物或组合物的氧化速率的方法，其包括将所述脂质化合物或组合物悬浮于培养基中，其中所述培养基包含来自一种或多种水果或蔬菜或来自水果和蔬菜的任何组合的汁液。在一个进一步说明性实施方案中，将所述培养基巴氏灭菌或灭菌。在一个进一步说明性实施方案中，所述汁液选自甜菜汁、胡萝卜汁和蓝莓汁。在一个进一步实施方案中，所述汁液是甜菜汁。在一个进一步实施方案中，所述脂质化合物是DHA。在一个进一步实施方案中，所述汁液是认证为有机的。在一个进一步说明性实施方案中，所述脂质化合物或组合物通过任何本文所示的方法来生产。在一个进一步说明性实施方案中，所述脂质化合物或组合物源自藻类。
如本文所使用，“藻类生物质”包括藻类细胞和细胞片段以及它们的构成组分。
如本文所定义，“氧源”是指能够被藻类同化的任何氧源。在各个说明性实施方案中，本文任何实施方案的氧源可以选自过滤的空气、通过搅拌氧化或过滤的氧流。
如本文所定义，“天然氮”是以下中的一种或多种： (i) 汁液中天然存在的任何氮或氮源；和(ii) 用于补充藻类培养基以便为藻类提供氮且是认证为有机的和/或不含化学添加剂和防腐剂的任何氮或氮源。天然氮不同于未认证为有机的或者是化学添加剂或防腐剂的任何氮源，诸如非有机酵母提取物、氯化铵、酪胨、蛋白胨、胰蛋白胨、聚蛋白胨、玉米浆液体、玉米浆固体、乙酸铵和硝酸钠。
在各个说明性实施方案中，本文任何实施方案的天然氮可以是氮和含氮化合物，其中所有都天然存在于汁液中。在进一步说明性实施方案中，本文任何实施方案的天然氮可以是氮和含氮化合物，其中所有都天然存在于汁液中，以及被认证为有机的任何藻类培养基氮补充剂。在另一个说明性实施方案中，所述天然氮是认证为有机的酵母提取物。
在各个说明性实施方案中，使本文任何实施方案的藻类生长至诸如足以用于商业或工业规模生产的量和/或密度生物质。
在各个说明性实施方案中，本文所述的培养基可以补充有盐源。
如本文所使用，“盐源”是指能够被藻类代谢的任何盐或其组合。
在各个说明性实施方案中，本文任何实施方案的盐源可以选自人工海盐、天然海水或天然海盐。在各个说明性实施方案中，所述盐源可以是海水。在一个进一步说明性实施方案中，所述海水可以具有约0.5 ppt至约35 ppt、约0.5至约25 ppt、约0.5至约20 ppt、约0.5至约15 ppt、约5至约15 ppt、约5至约20 ppt、约5至约25 ppt、约10至约20 ppt和约5至约35 ppt的范围内的盐度。在一个进一步说明性实施方案中，所述海水可以具有选自约0.5ppt、约1.0 ppt、约2.0 ppt、约3.0 ppt、约4.0 ppt、约5.0 ppt、约7.0 ppt、约10 ppt、约12ppt、约15 ppt、约20 ppt、约25 ppt、约30 ppt和约35 ppt的盐度。在一个进一步实施方案中，所述海水可以具有约10 ppt、10.7 ppt、12 ppt、12.7 ppt、15 ppt或15.7 ppt的盐度。
在各个说明性实施方案中，本文所述的培养基可以补充有糖。
如本文所使用，“糖”是指任何一种或多种碳水化合物，无论是简单的或复杂的，这是用于藻类的营养来源。“糖”还包括右旋糖、乙醇和认证为有机的蔬菜甘油。
在各个说明性实施方案中，本文任何实施方案的糖可以是乙醇、果糖、右旋糖、蔗糖或右旋糖或其任何组合。在一个进一步说明性实施方案中，所述糖可以是认证为有机的。在另一个实施方案中，所述糖可以以约1％至约20％、约1％至约10％、约2％至约10％、约2％至约8％或约5％至约10％的浓度存在于培养基中。在另一个实施方案中，所述糖可以以约1％、约2％、约3％、约4％、约5％、约6％、约7％、约8％、约9％、约10％、约12％、约15％的浓度存在于培养基中。
在各个说明性实施方案中，本文所述的培养基可以由汁液、氧源、氮、糖和盐源组成。在各个说明性实施方案中，本文所述的培养基可以由汁液、氧源、氮和糖组成。在各个说明性实施方案中，本文所述的培养基可以由汁液、氧源、氮和盐源组成。
在另一个说明性实施方案中，提供生产一种或多种脂质化合物或其组合物的方法，其包括使藻类在培养基中生长且从藻类提取所述化合物或组合物，其中所述培养基包含来自一种或多种水果或蔬菜或水果和蔬菜的任何组合的汁液、氧源和氮，其中所述培养基是灭菌的，且其中所述培养基中的氮由天然氮组成。
如本文所使用，“脂质化合物”是指溶解于脂肪、油、脂质和非极性溶剂诸如己烷或甲苯中的任何脂肪、油、脂质或其它化合物。在各个说明性实施方案中，本文任何实施方案的脂质化合物可以是脂肪酸、类胡萝卜素或脂溶性维生素。
如本文所使用，“脂肪酸”是指由连接至碳链的羧酸残基构成的分子。该碳链可以范围为短(6个碳)至非常长(大于20个碳)，并且可以是饱和的或不饱和的。在各个说明性实施方案中，本文任何实施方案的脂质化合物可以是脂肪酸。在另一个说明性实施方案中，所述脂肪酸可以是阿魏酸(coniferic acid)。在另一个说明性实施方案中，所述脂肪酸可以是不饱和或多不饱和脂肪酸。在另一个说明性实施方案中，所述不饱和脂肪酸可以是ω脂肪酸。在另一个说明性实施方案中，所述ω脂肪酸可以选自ω-3脂肪酸、ω-6脂肪酸、ω-7脂肪酸和ω-9脂肪酸。在另一个说明性实施方案中，所述ω脂肪酸可以是ω-3脂肪酸。在另一个说明性实施方案中，所述ω脂肪酸可以是ω-7脂肪酸。在另一个说明性实施方案中，所述脂肪酸可以是多不饱和脂肪酸。在另一个说明性实施方案中，所述多不饱和脂肪酸可以选自二十二碳六烯酸(DHA)、二十碳五烯酸(EPA)、二十二碳五烯酸(DPA)和松油酸。在一个进一步说明性实施方案中，所述多不饱和脂肪酸可以是DHA。在一个进一步说明性实施方案中，所述多不饱和脂肪酸可以是EPA。在一个进一步说明性实施方案中，所述多不饱和脂肪酸可以是松油酸。在一个进一步说明性实施方案中，所述多不饱和脂肪酸可以是DPA。
如本文所使用，“类胡萝卜素”是指四萜类化合物家族的脂溶性色素。在各个说明性实施方案中，本文任何实施方案的类胡萝卜素可以是选自β-胡萝卜素、虾青素和番茄红素的类胡萝卜素。在一个进一步说明性实施方案中，所述类胡萝卜素可以是虾青素。在一个进一步说明性实施方案中，所述类胡萝卜素可以是β-胡萝卜素。在一个进一步说明性实施方案中，所述类胡萝卜素可以是番茄红素。在一个进一步说明性实施方案中，所述类胡萝卜素可以具有抗氧化剂活性。
如本文所使用，“脂溶性维生素”是指维生素，即对于体内正常代谢以小剂量必需的物质，其分布于且储存于脂肪中。在各个说明性实施方案中，本文任何实施方案的脂溶性维生素可以是选自视黄醛(维生素A)、麦角钙化醇(维生素D2)、胆钙化醇(维生素D3)、α-生育酚(维生素E)、叶绿醌(维生素K)和泛醇(辅酶Q)的维生素。在一个进一步说明性实施方案中，所述脂溶性维生素可以是维生素A。在一个进一步说明性实施方案中，所述脂溶性维生素可以是维生素E。
在一个进一步说明性实施方案中，提供生产用于人或动物的食品、美容品、工业组合物或药物组合物的方法，其包括以下步骤：使藻类在培养基中生长且从所述培养基收获藻类生物质或藻类细胞培养物，其中所述培养基包含来自一种或多种水果或蔬菜或水果和蔬菜的任何组合的汁液、氧源和氮，其中所述培养基是灭菌的，且其中所述培养基中的氮由天然氮组成；从所述培养基收获藻类生物质或藻类细胞培养物；和制备所述食品、美容品、工业组合物或药物组合物。
在一个进一步说明性实施方案中，所述方法可以进一步包括从所述藻类生物质或藻类细胞培养物提取一种或多种脂质化合物或其组合物和制备所述食品、美容品、工业组合物或药物组合物。
在一个进一步说明性实施方案中，所述方法可以进一步包括制备食品。如本文所使用，“食品”是指用于动物或人消耗的任何食物，且包括固体和液体组合物。食品可以是动物或人食物的添加剂。食品包括，但不限于，普通食物；液体产品，包括乳、饮料、治疗性饮料、粉末状饮料和营养饮料；功能性食物；营养补充剂；保健品；婴儿配方，包括用于早产婴儿的配方；用于婴儿的食物；用于孕妇或哺乳妇女的食物；用于成人的食物；老年食品；和动物食物。
在进一步说明性实施方案中，本文任何实施方案的食品是营养补充剂。如本文所定义，“营养补充剂”是意在补充膳食和提供在人的膳食中可能缺失或可能不被足量消耗的营养素诸如维生素、矿物质、纤维、脂肪酸或氨基酸的任何制备物(无论是否呈胶囊、凝胶、液体或粉末形式)。营养补充剂的非限制性实例包括维生素补充剂、多不饱和脂肪酸补充剂、ω-3脂肪酸补充剂、ω-7脂肪酸、含有DHA和/或EPA的补充剂和含有藻类或藻类衍生物的营养补充剂。
在一个说明性实例中，所述营养补充剂含有一种或多种脂溶性维生素。在另一个说明性实例中，所述营养补充剂含有藻类细胞或藻类生物质。在另一个说明性实例中，所述营养补充剂含有ω-3脂肪酸。在另一个说明性实例中，所述营养补充剂含有ω-7脂肪酸。在另一个说明性实例中，所述营养补充剂含有多不饱和脂肪酸。在另一个说明性实例中，所述营养补充剂含有选自DHA、DPA、EPA和松油酸的多不饱和脂肪酸。在另一个说明性实例中，所述营养补充剂含有DHA和EPA。在另一个说明性实例中，所述营养补充剂含有DHA。在另一个说明性实例中，所述营养补充剂含有EPA。在各个说明性实施方案中，本文任何实施方案的营养补充剂可以是认证为有机的。在另一个说明性实例中，所述营养补充剂含有抗氧化剂。
“动物”意指属于动物界的任何非人生物体，并且包括，但不限于，水生动物和陆生动物。术语“动物饲料”或“动物食物”是指意欲用于以下的任何食物：非人动物，无论是否用于鱼；商业鱼；观赏鱼；幼鱼；双壳类动物；软体动物；甲壳类动物；贝类动物；虾；幼虾；卤虫；轮虫类动物；盐水虾；滤食动物；两栖类动物；爬行动物；哺乳动物；家养动物；农场动物；动物园动物；运动动物；种畜；竞赛动物；展览动物；家传动物(heirloom animals)；稀有或濒危动物；伴侣动物；宠物动物，诸如狗，猫，豚鼠，兔，大鼠，小鼠，或马；灵长类动物，诸如猴(例如，卷尾猴，猕猴，非洲绿猴，赤猴，食蟹猴和长尾猴)，猿，猩猩，狒狒，长臂猿，和黑猩猩；犬科动物，诸如狗和狼；猫科动物，诸如猫，狮，虎；马科动物，诸如马，驴和斑马；食用动物，诸如乳牛，牛，猪，羊；有蹄类动物，诸如鹿和长颈鹿；啮齿动物，诸如小鼠，大鼠，仓鼠和豚鼠；等等。动物饲料包括，但不限于，水产养殖饲料、家畜饲料，包括宠物饲料、动物园动物饲料、役用动物饲料、牲畜饲料或其组合。
在一些说明性实施方案中，所述食品是医疗食物。如本文所使用，“医疗食物”是这样的食物，其在组合物中，所述组合物在医生的外部监督下被消耗或施用且意在用于状况(对于所述状况，通过医疗评估建立基于公认的科学原理的独特营养要求)的特定膳食管理。
如本文所定义，“美容品”包括，但不限于，乳液、霜剂、洗剂、面膜、肥皂、洗发水、洗液、面霜、调理剂、化妆品(make-ups)、沐浴剂和分散液。美容剂可以是药用或非药用的。
如本文所定义，“药物组合物”包括，但不限于，抗炎组合物、用于治疗冠心病的药物、用于治疗动脉硬化的药物、化疗剂、活性赋形剂、骨质疏松症药物、抗抑郁药、抗惊厥药、抗幽门螺杆菌药物、用于治疗神经变性疾病的药物、用于治疗退行性肝病的药物、抗生素、降胆固醇的组合物和降低甘油三酯的组合物。
在进一步说明性实施方案中，可以使用的本文任何实施方案的藻类包括绿藻门(Chlorophyta)，诸如 Charoides(例如Charoides、丽枝藻属(Lamprothamnium)、拟丽藻属(Nitellopsis)和丽藻属(Nitella))、双星藻目(Zynematales)(例如双星藻属(Zygnema)、新月藻属(Closterium)和梭形鼓藻属(Netrium))、Codials (例如刺松藻(Codiumfragile)、Helimida opunta和蕨藻属(Caulerpa))、羽藻(Bryopsis plumosa)(例如羽藻属(Bryopsis)、假羽藻属(Pseudobryopsis)、Bryopsidella、德氏藻属(Derbesis)和拍道藻属(Pedobesia))、琉球伞藻(Acetabularia Ryukyuensis)(例如琉球伞藻(AcetabulariaRyukyuensis)、赖氏海棍藻(Halicoryne wrightii)、环蠕藻(Neomeris annulata)、Cymopolia van bossei、Bornettella ovalis和伞藻(Acetabularia calyculus))、管枝藻目(Siphonocladales)(例如法囊藻科(Valoniaceae)和棉絮藻科(Boodleaceae))、刚毛藻属(Cladophora)(例如Anadyomene writii、刚毛藻属(Cladophora)、苏氏刚毛藻(Cladophora sauteri)和厚孢藻属(Chaetomorpha))、石莼属(Ulva)(例如石莼属(Ulva)和浒苔属(Fnteromorpha))、丝藻目(Ulotrichales)(例如顶管藻科(Acrosiphoniaceae)、胶衣科(Collinsiellaceae)、礁膜科(Monostromaceae)和Chlorocystidaceae)、溪菜属(Prasiola)、小球藻属(Chlorella)、绿球藻目(Chlorococcales)(例如盘星藻属(Pediastrum)和水网藻属(Hydrodictyon))、Aurantiochytrium (例如，Aurantiochytriumlimacinum)、拟微绿球藻属(Nannochloropsis)(例如，眼点拟微绿球藻(Nannochloropsisoculata))、菱形藻属(Nitzchia)、衣藻属(Chlamydomonas) (例如，莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii))以及团藻目(Volvocales)(例如衣藻属(Chlamydomonus)、实球藻属(Pandorina)、杂球藻属(Pleodorina)和团藻属(Volvox))。
在一个进一步说明性实施方案中，所述藻类可以属于选自破囊壶菌属(Thraustochytrium)、衣藻属(Chlamydomonas)、菱形藻属(Nitzchia)、拟微绿球藻属(Nannochloropsis)和Aurantiochytrium的属。在一个进一步说明性实施方案中，所述属可以是Aurantiochytrium。在一个进一步说明性实施方案中，所述属可以是拟微绿球藻属。在一个进一步说明性实施方案中，所述属可以是衣藻属。在一个进一步说明性实施方案中，所述属可以是菱形藻属。
在一个进一步说明性实施方案中，本文任何实施方案的藻类不是遗传修饰的生物体(即非遗传修饰的生物体或非-GMO)或转基因生物体，或以其它方式不含已经使用遗传工程改造改变的遗传物质。
在各个说明性实施方案中，本文任何实施方案的藻类的生长可以是异养的(hereterotrophic)或混合营养的。
在各个说明性实施方案中，本文任何实施方案的培养基可以用于接种和培养藻类。在一个说明性实施方案中，将藻类细胞首先接种于其中任何实施方案的培养基中，随后将接种物转移至较高体积的相同培养基，使得所述接种物占最终培养基的总体积的特定比例(例如10％)。
如本文所使用，“汁液”是指从一种或多种水果或蔬菜或水果和蔬菜的任何组合表达或提取的水性液体，一种或多种水果或蔬菜或水果和蔬菜的任何组合的可食用部分的汁汤，或此类液体或汁汤的任何浓缩物。如本文所使用，术语“汁液”还包括甜菜糖蜜。在各个说明性实施方案中，本文任何实施方案的汁液含有所述汁液中天然存在的所有化合物(包括糖、氮和其它天然存在的维生素、矿物质和常量营养素)，且此类汁液没有处理或改变以去除任何此类化合物。如本文所使用，“水果”或“蔬菜”是指可以或不可繁殖为后代的可食用植物或植物部分。
在各个说明性实施方案中，本文任何实施方案的汁液可以来自一种或多种水果或蔬菜或水果和蔬菜的任何组合的汁液，所述水果和/或蔬菜选自金虎尾樱桃(acerolas)、苹果、杏、香蕉、黑莓、蓝莓、波森杂交草莓(boysenberries)、哈密瓜(cantaloupes)、樱桃、椰子、海棠、蔓越莓、醋栗果、枣、欧洲木莓(dewberries)、接骨木莓、无花果、醋栗、葡萄、葡萄柚、guanabanas、番石榴、猕猴桃、柠檬、酸橙、罗甘莓、甜瓜、芒果、油桃、橙子、木瓜、西番莲果、桃、梨、菠萝、李子、石榴、西梅、温柏、树莓、大黄、草莓、柑橘、番茄、西瓜、甜菜、灯笼椒、花椰菜、卷心菜、胡萝卜、芹菜、玉米、黄瓜、茴香、羽衣甘蓝、欧洲萝卜、南瓜、菊苣、大豆、红薯、小萝卜(radish)、树蕃茄、芜菁甘蓝(turnip)、山药、和西葫芦。
在一个进一步说明性实施方案中，所述汁液可以是选自番茄汁、甜菜汁、胡萝卜汁、椰子汁和苹果汁的汁液。在一个进一步说明性实施方案中，所述汁液可以是选自番茄汁、甜菜汁、胡萝卜汁和苹果汁的汁液。在一个进一步说明性实施方案中，所述汁液可以是选自番茄汁、甜菜汁和胡萝卜汁的汁液。在另一个说明性实施方案中，所述汁液可以是甜菜汁。在一个进一步说明性实施方案中，所述汁液可以是番茄汁。在一个进一步说明性实施方案中，所述汁液可以是胡萝卜汁。在进一步说明性实施方案中，本文任何实施方案的汁液是甜菜糖蜜。在一个进一步说明性实施方案中，所述甜菜糖蜜是认证为有机的。
在进一步说明性实施方案中，本文任何实施方案的汁液可以用一种或多种能够分解所述汁液中的糖的酶进行水解。在一个说明性实施方案中，所述酶是非-GMO转化酶。在另一个说明性实施方案中，用非-GMO转化酶水解的汁液是甜菜糖蜜、认证为有机的甜菜糖蜜或甜菜汁。
在各个说明性实施方案中，所述汁液中的生物可利用的氮的总量可以是大于或等于20 mg氮/L。在各个说明性实施方案中，所述汁液中的生物可利用的氮的总量可以是大于或等于40 mg氮/L。在各个说明性实施方案中，所述汁液中的生物可利用的氮的总量可以是大于或等于100 mg氮/L。在各个说明性实施方案中，所述汁液中的生物可利用的氮的总量可以是大于或等于200 mg氮/L。在各个说明性实施方案中，所述汁液中的生物可利用的氮的总量可以是大于或等于300 mg氮/L。在各个进一步说明性实施方案中，所述汁液中的生物可利用的氮的总量可以是大于或等于334 mg氮/L。在各个进一步说明性实施方案中，所述汁液中的生物可利用的氮的总量可以是大于或等于350 mg氮/L。在各个进一步实施方案中，所述汁液中的生物可利用的氮的总量可以是大于或等于400 mg氮/L。在各个进一步实施方案中，所述汁液中的生物可利用的氮的总量可以是大于或等于550 mg氮/L。在各个说明性实施方案中，所述汁液中的生物可利用的氮的总量可以是大于或等于600 mg氮/L。在各个说明性实施方案中，所述汁液中的生物可利用的氮的总量可以是大于或等于700 mg氮/L。在各个进一步说明性实施方案中，所述汁液中的生物可利用的氮的总量可以是大于或等于732 mg氮/L。在各个说明性实施方案中，所述汁液中的生物可利用的氮的总量可以是大于或等于800 mg氮/L。
在各个进一步实施方案中，所述汁液中的生物可利用的氮的总量可以在约10 mg氮/L至约1700 mg氮/L的范围内。在一个进一步实施方案中，所述汁液中的生物可利用的氮的总量可以在约20 mg氮/L至约900 mg氮/L的范围内。在一个进一步实施方案中，所述汁液中的生物可利用的氮的总量可以在约30 mg氮/L至约850 mg氮/L的范围内。在一个进一步实施方案中，所述汁液中的生物可利用的氮的总量可以在约35 mg氮/L至约820 mg氮/L的范围内。
在一个进一步实施方案中，所述汁液中的生物可利用的氮的总量可以选自约：10mg氮/L、20 mg氮/L、30 mg氮/L、40 mg氮/L、50 mg氮/L、80 mg氮/L、90 mg氮/L、100 mg氮/L、110 mg氮/L、118 mg氮/L、120 mg氮/L、130 mg氮/L、140 mg氮/L、150 mg氮/L、200 mg氮/L、250 mg氮/L、300 mg氮/L、310 mg氮/L、320 mg氮/L、330 mg氮/L、334 mg氮/L、340 mg氮/L、350 mg氮/L、400 mg氮/L、450 mg氮/L、500 mg氮/L、550 mg氮/L、600 mg氮/L、650 mg氮/L、700 mg氮/L、710 mg氮/L、720 mg氮/L、730 mg氮/L、732 mg氮/L、740 mg氮/L、750 mg氮/L、800 mg氮/L、810 mg氮/L、813 mg氮/L、820 mg氮/L、830 mg氮/L、850 mg氮/L、900 mg氮/L、950 mg氮/L、1000 mg氮/L、1500 mg氮/L和1700 mg氮/L。
在各个说明性实施方案中，本文任何实施方案的汁液可以在培养基中具有一定百分比浓度，所述百分比浓度在约5％至约100％的范围内。在一个进一步说明性实施方案中，所述培养基中的汁液的百分比浓度可以是选自以下的百分比浓度：5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、80%、90%和100%. 在一个进一步说明性实施方案中，所述培养基中的汁液的百分比浓度可以是约5％至约70％范围内的百分比浓度。在一个进一步说明性实施方案中，所述培养基中的汁液的百分比浓度可以是约10％至约50％范围内的百分比浓度。在一个进一步说明性实施方案中，所述培养基中的汁液的百分比浓度可以是选自10%、25%和50%的百分比浓度。
在各个说明性实施方案中，本文任何实施方案的汁液可以进行发酵。在各个说明性实施方案中，本文任何实施方案的汁液可以通过蒸汽灭菌或巴氏灭菌进行灭菌。在一个进一步说明性实施方案中，所述汁液可以通过巴氏灭菌进行灭菌。
在进一步说明性实施方案中，本文任何实施方案的汁液可以是认证为有机的。
在进一步说明性实施方案中，本文任何实施方案的培养基可以具有选自约3、约4、约5、约6、约7、约8和约9的pH。在一个进一步说明性实施方案中，任何上述实施方案的培养基可以具有约3至约8、约3至约7、约4至约7、约5至约8、约6至约7或约6至约8或约8至约9范围内的pH。在一个进一步说明性实施方案中，所述培养基可以具有约5.2、约5.5、约5.8、约6.2、约6.5、约6.8、约7.2、约7.5、约7.8或约8.0或约9.0的pH。
在进一步说明性实施方案中，本文任何实施方案的培养基可以不含化学添加剂和防腐剂。
如本文所使用，“化学添加剂” 或“化学防腐剂”是指除了认证为有机的物质以外的任何物质，即：(i)自然界中未发现，或者通过化学或工业过程合成或提取的天然存在的物质，和(ii)被添加(无论是直接还是间接)至藻类培养基、培养物或生物质或至其任何组分或成分，以便在某种程度上保持、处理或增强，或作为工业过程的副产物。化学添加剂或防腐剂的非限制性实例包括乙二胺四乙酸(EDTA)和其它化学螯合剂、谷氨酸钠(MSG)、玉米浆液体、玉米浆固体、非有机的酵母提取物、乙酸铵、氯化铵、硝酸钠、gelysate、蛋白胨、胰蛋白胨、酪蛋白胨、酪蛋白、尿素、乳清、玉米蛋白粉(corn gluten meal)、合成衍生的硫酸盐和痕量元素、硫酸、盐酸、人工海水、和使用合成方法分离的酶(所述酶的非限制性实例包括α-淀粉酶、呋喃果糖苷酶和葡糖淀粉酶和已经从遗传修饰的生物体分离的酶)。
如本文所使用，“非-GMO”酶，诸如例如非-GMO转化酶，是尚未从遗传修饰的生物体分离的酶。
如本文所使用，“不含化学添加剂和防腐剂”的培养基或其它物质包括未使用化学添加剂和/或防腐剂生产或加工的培养基或物质，或对于其制造、生长、稳定分离或提取不添加化学添加剂或防腐剂的培养基或物质。此类培养基可以包括，例如，非-GMO转化酶或已经用非-GMO转化酶水解的糖。
在进一步说明性实施方案中，本文任何实施方案的藻类细胞培养物、藻类生物质、脂质化合物或组合物可以是认证为有机的。
如本文所使用，“认证为有机的”是指由任何政府或在其管辖范围内具有颁发此类标记或认证的授权的政府批准的机构或实体，将产品或物质认证或标记为有机的。非限制性实例是根据美国农业部的授权颁发的认证产品或物质是“有机”、“95％有机”或“100％有机” 的认证。如本文所使用，“非有机”是指未认证为有机的任何物质或产品。
上述实施方案的培养基可以使用本领域中已知的技术来制备。任何汁液，如该术语在本文所使用，可以用于制备培养基。水果和蔬菜汁含有各种不同的糖、维生素、植物营养素、色素、植物激素、氨基酸和矿物质。因此，水果和蔬菜汁含有合成藻类培养基中通常发现的所有构成组分。
在一个示例性实施方案中，使用番茄汁。番茄汁适于经济、大规模产生藻类和相关化合物、组合物和产品，因为它是相对便宜的。番茄汁的这些特征使得该汁液是用于微型藻类的不含化学品的培养的一种示例性选择。在另一个示例性实施方案中，认证为有机的番茄汁可以用于制备培养基。所得藻类生物质将满足NOP(有机)标准。
在另一个示例性实施方案中，天然发酵的甜菜汁可以用于制备培养基。
本文任何实施方案的汁液可以通过例如将一种或多种水果或蔬菜榨汁来制备。所得汁液根据本领域中众所周知的技术灭菌，所述技术描述于Rupasinghe和Yu (2012)，其以其整体通过引用并入本文。
如本文所定义，“灭菌(sterilization)”、“灭菌(sterilized)”或“无菌(sterile)”是指将生物负担减少或消除至其无法与藻类竞争生长的水平的方法。非限制性实例包括巴氏灭菌、高静水压力、蒸汽灭菌和脉冲电场，以及本领域已知的且描述于Rupasinghe和Yu (2012)中的其它技术。
在各个示例性实施方案中，本文任何实施方案的汁液可以在选自约50℃、约55℃、约60℃、约65℃、约70℃、约75℃、约80℃、约85℃、约90℃、约95℃和约100℃的温度进行巴氏灭菌。
在一个示例性实施方案中，巴氏灭菌的汁液可以直接用于培养基制剂中。在另一个示例性实施方案中，所述汁液可以使用例如产生乳酸的细菌或酵母进行天然预发酵，然后巴氏灭菌，以减少生物负担。将酵母或细菌添加至所述汁液且封入容器以起始发酵。严格控制汁液的发酵，以避免不希望或有毒的副产物和腐败。最终产物的质量决定于发酵培养基中使用的水果的特定组成和发酵所述汁液的所选酵母或细菌菌株的特征。在一个示例性实施方案中，在最少加工的汁液中实施发酵，而无其它外源添加的生长因子、肥料、化学试剂或营养素。在另一个示例性实施方案中，所述培养基补充有灭菌的糖和/或灭菌的盐源，以促进藻类生长。
还将氧源添加至培养基中。在一个示例性实施方案中，所述培养基可以与臭氧化的新鲜水或UV灭菌的海水混合。臭氧化和UV灭菌可以根据本领域中众所周知的技术实施，所述技术公开于，例如Kelley (1961)和Restaino等人(1995)，其以其整体通过引用并入本文。
培养基的灭菌可以通过本领域中已知的技术来实现。在一个说明性实施方案中，所述培养基的各组分，诸如汁液、糖和盐源，可以首先根据一种或多种本领域中已知且描述于Rupasinghe和Yu (2012)的灭菌技术各自灭菌，然后在无菌条件下组合以产生无菌培养基。在另一个说明性实施方案中，所述培养基的各未灭菌组分，诸如汁液、糖和盐源，可以首先组合，且所得培养基然后可以根据一种或多种本领域中已知且描述于Rupasinghe和Yu(2012)的技术进行灭菌。
该基础汁培养基然后可以用于培养藻类。藻类可以根据本领域中众所周知的技术进行培养。在一个示例性实施方案中，藻类在无菌发酵容器中培养以获得生物质或细胞培养物。在发酵过程中，将藻类培养物充气以促进线粒体呼吸。
然后可以根据本领域中众所周知的技术收获和保存所得藻类细胞培养物或藻类生物质(参见例如Shelef等人(1984)，其以其整体并入本文)。
在另一个示例性实施方案中，所得藻类可以用于收获脂质组合物和化合物。可以从藻类提取此类化合物和组合物的方法是本领域中众所周知的。在一些说明性实施方案中，方法用于从湿藻类生物质(具有大于10％水分的藻类糊剂或培养物)或干燥藻类生物质(具有大于(小于)10％水分的藻类糊剂或培养物)去除脂质化合物和组合物。非限制性方法可以是机械的、化学的、超临界的或生理的。
在一个示例性实施方案中，化学溶剂可以用于提取脂质化合物和组合物。化学溶剂是便宜的，挥发性的(准备用于以后去除)，不含毒性或活性杂质(以避免与脂质反应)，能够与水形成两相系统(以去除非脂质)，并且是不期望的组分(例如，蛋白脂质蛋白和小分子)的不良提取剂。此类溶剂促进通过破坏脂质和其它非脂质细胞组分之间的连接而提取脂质化合物，而不降解脂质。在一个示例性实施方案中，可以通过用有机溶剂重复洗涤藻类细胞而从藻类生物质分离脂质化合物和组合物。非限制性有机溶剂包括己烷、乙醇或甲醇。
在进一步示例性实施方案中，可以通过超临界流体提取(其涉及使用超临界流体作为溶剂以提取脂质化合物)从藻类提取脂质化合物和组合物。用于超临界提取的溶剂的非限制性实例是二氧化碳，其具有适度的临界温度和压力(31.3℃，72.9 atm.)。当升高于其临界温度和压力时，CO2可以获取液体的溶剂化特性，同时保持气体的传输特性。将脂质化合物提取至该超临界流体中。使超流体返回至大气压允许溶剂呈现其蒸气形式，使得没有残余物留在脂质化合物中。在超临界流体/ CO2提取中，CO2在压力下液化，且加热至其具有液体和气体两者的特性的点。该液化气然后充当提取油中的溶剂。该方法可以相对于溶剂提取具有优点，包括油或其组分的更少热降解(更亮外观)，不含溶剂的油和选择性富含一些组分的油。超临界流体提取可以提取几乎100％的脂质。当与常规溶剂提取相比时，超临界提取是昂贵的方法。如果产物是高价值和低体积的，则超临界提取可以是合理的。超临界CO2方法也具有不利用合成化学品来从藻类生物质提取油的优点。当如本文所述的基于汁液的培养基用于生产脂质时，所得脂质可以被认为不含化学添加剂。
在另一个示例性实施方案中，可以通过机械油提取(其涉及物理破坏藻类膜以释放脂质化合物和组合物)来提取脂质化合物和组合物。机械油提取的非限制性实例包括压制、研磨、均质化和超声辅助提取(空化(cavitation))。
在另一个示例性实施方案中，可以通过生理油提取(其涉及破坏藻类细胞的生理完整性)来提取脂质化合物和组合物。非限制性实例包括细胞膜的酶促降解和渗透压休克，破坏细胞壁膜以释放脂质化合物的方法。渗透压休克涉及快速降低培养基的渗透压以诱导细胞壁裂解。
在另一个说明性实施方案中，所述提取可以使用超声辅助提取来进行。超声提取可以大大加速提取过程。使用超声反应器，超声波用于在溶剂材料中生成空化泡。当这些泡在细胞壁附近破裂时，其生成引起那些细胞壁破裂和释放其内容物的冲击波和液体射流。声化学是用于用能量诱导分子的最有效的方法之一。声化学使用超声照射以形成声空化：在液体中形成、生长和内爆性破裂气泡。声空化产生5000K和1000 atm的局部条件。在空化过程期间，加热和冷却速率超过10e9 K/Hz，其中发生400 km/小时的液体射流。
机械破碎、溶剂提取和通过超临界流体提取需要在处理前将藻类生物质首先干燥至低百分比水分，<10％。其它方法，诸如酶促和渗透压细胞破碎，可能不需要预干燥步骤。
在一个示例性实施方案中，冷冻干燥藻类生物质，随后溶剂提取脂质化合物和组合物。冷冻过程由冷冻材料组成。在实验室中，这经常通过以下进行：将材料置于冷冻干燥烧瓶中且在被称为壳冰箱的浴中旋转所述烧瓶，所述浴通过机械制冷、干冰和甲醇或液氮冷却。在更大规模上，冷冻通常使用商业冷冻干燥机进行。在该步骤中，将材料冷却至低于其共熔点(所述材料的固相和液相可以共存的最低温度)是重要的。这确保在以下步骤中将发生升华而不是熔化。更大晶体更易于冷冻干燥。为了产生更大晶体，所述产物应当缓慢冷冻或可以温度上下循环。该循环过程被称为退火。然而，在食物或以前具有活细胞的对象的情况下，大冰晶将破裂细胞壁。如Clarence Birdseye所发现，当食物被冷冻在-40℃至-45℃或以下时，则其味道更好。通常，冷冻温度为-50℃至-80℃。冷冻干燥的藻类然后进行逐渐更极性的溶剂以完全分级提取存在的脂质。
在另一个实施方案中，可以用果汁溶剂使用亚临界水提取以便在提取过程期间稳定PUFA。
实施例1
汁液的氮含量
使用K-PANOPA、K-Large和K-Glut生化试剂盒(Megazyme, Ireland)测量总生物可利用氮，包括伯氨基氮(包括L-精氨酸和谷氨酸)、尿素和氨。测试五种汁液：发酵的认证为有机的甜菜汁、番茄汁、认证为有机的胡萝卜汁、认证为有机的苹果汁和椰子汁。将各汁液巴氏灭菌，稀释至10％浓度(体积/体积)，然后进行测试。针对100％汁液调整报道值。
表 1
测试的巴氏灭菌汁液含有不同的氮概况。甜菜汁、番茄汁和胡萝卜汁具有最高的总生物可利用的氮。苹果汁和椰子水具有最低的生物可利用的氮。
实施例2
未调节pH的含有海水的汁液培养基中A. limacinum的生长
在未调节pH的汁液培养基中繁殖A. limacinum。制备总共十五(15)种培养基(用于接种和培养藻类)，其具有以下各汁液浓度： (1) 10％浓度的认证为有机的甜菜汁；(2) 25％浓度的认证为有机的甜菜汁；(3) 50％浓度的认证为有机的甜菜汁；(4) 10％浓度的认证为有机的苹果汁；(5) 25％浓度的认证为有机的苹果汁；(6) 50％浓度的认证为有机的苹果汁；(7) 10％浓度的番茄汁；(8) 25％浓度的番茄汁；(9) 50％浓度的番茄汁；(10) 10％浓度的椰子水；(11) 25％浓度的椰子水；(12) 50％浓度的椰子水；(13) 10％浓度的认证为有机的胡萝卜汁；(14) 25％浓度的认证的胡萝卜汁；和(15) 50％浓度的认证为有机的胡萝卜汁。各培养基额外含有具有12.7 ppt的盐度的海水。将培养基通过巴氏灭菌法灭菌。
表 2：汁液培养基的起始pH值
调节至12.7 ppt.盐度的汁液类型 pH
10％苹果汁 3.61
25%苹果汁 3.46
50%苹果汁 3.38
10％甜菜汁 4.18
25%甜菜汁 4.08
50%甜菜汁 4.1
10％胡萝卜汁 4.17
25%胡萝卜汁 4.09
50%胡萝卜汁 4.1
10%椰子水 6.7
25%椰子水 6.17
50%椰子水 5.78
10％番茄汁 4.1
25%番茄汁 4.1
50%番茄汁 4.11
表 3：未调节pH的汁液培养基中A. limacinum的生长最大值参数
汁液类型 百分比％ 最大密度细胞数/ml培养基 达到最大密度的小时数(h)
番茄 25 5.13E+07 22
甜菜 25 4.33E+07 95
胡萝卜 50 5.57E+07 95
椰子 50 2.68E+07 137
苹果 50 7.59 E+06 22
结果呈现于图1中。当汁液不调节pH时，与分别含有苹果水和椰子水的培养基相比，分别含有番茄汁、甜菜汁和胡萝卜汁的培养基得到更大的生物质。此外，在基于番茄汁的培养基中生长的藻类在22小时之后达到最大密度，而在基于椰子水的培养基中生长的藻类花费最多时间(137小时)达到最大密度。
实施例3
含有海水且调节至PH 6.8的汁液培养基中A. limacinum的生长
在调节至6.8的pH的汁液培养基中繁殖A. limacinum。制备总共十五(15)种培养基(用于接种和培养藻类)，其具有以下各汁液浓度： (1) 10％浓度的认证为有机的甜菜汁；(2)25％浓度的认证为有机的甜菜汁；(3) 50％浓度的认证为有机的甜菜汁；(4) 10％浓度的认证为有机的苹果汁；(5) 25％浓度的认证为有机的苹果汁；(6) 50％浓度的认证为有机的苹果汁；(7) 10％浓度的番茄汁；(8) 25％浓度的番茄汁；(9) 50％浓度的番茄汁；(10)10％浓度的椰子水；(11) 25％浓度的椰子水；(12) 50％浓度的椰子水；(13) 10％浓度的认证为有机的胡萝卜汁；(14) 25％浓度的认证的胡萝卜汁；和(15) 50％浓度的认证为有机的胡萝卜汁。各培养基额外含有足以获得12.7 ppt的盐度的海水。将培养基通过巴氏灭菌法灭菌。
表 3：调节至pH 6.8的汁液培养基中A. limacinum的生长最大值参数
汁液类型 百分比％ 最大密度细胞数/ml培养基 达到最大密度的小时数(h)
番茄 50 1.07E+08 22
甜菜 25 1.07E+08 95
胡萝卜 50 6.00E+07 45
椰子 50 3.88E+07 95
苹果 50 1.28E+07 22
结果呈现于图2中。在pH 6.8，分别含有50％浓度的番茄汁和25％浓度的甜菜汁的培养基得到最高的藻类生物质。细胞生长速率在基于番茄汁的培养基中是最快的： 其花费22小时达到最大密度。番茄汁含有最高含量的天然谷氨酸，这可为更快生长速率作出贡献。基于椰子水和苹果汁的培养基得到最低生物质。据报道，pH可以影响谷氨酸的解离速率，因此影响氮的生物利用度，特别是当呈谷氨酸的形式时(Ault, A. (2004) “The monosodiumglutamate story: The commercial production of MSG and other animo acids”Journal of Chemical Education)。在较高pH，更多谷氨酸是生物可利用的，使得对于各培养基制剂，特别是具有较高浓度的谷氨酸的那些，诸如基于番茄汁和甜菜汁的培养基，生物质增加。
实施例4
补充有右旋糖的汁液培养基中A. limacinum的生长
在补充有右旋糖的汁液培养基中繁殖A. limacinum。制备总共五(5)种培养基(用于接种和培养藻类)，其具有以下各汁液浓度： (1) 25％浓度的认证为有机的甜菜汁；(2) 50％浓度的番茄汁； (3) 50％浓度的认证为有机的胡萝卜汁；(4) 50％浓度的认证为有机的苹果汁；和(5) 50％浓度的椰子水。各培养基用右旋糖补充至6％的浓度。将培养基通过巴氏灭菌法灭菌。
表 4： 补充有右旋糖的培养基中生长的A. limacinum的生长最大值参数
汁液类型 百分比％ 最大密度细胞数/ml培养基 最大密度g/L干细胞重量 达到最大密度的小时数(h)
番茄 50 9.08 E+07 30.36 50
甜菜 50 9.83 E+07 30.38 97
胡萝卜 50 6.88 E+07 16.64 97
椰子 50 4.23 E+07 NA 97
苹果 50 4.28 E+06 NA 120
结果呈现于图3中。在分别含有50％、25%和50%浓度的番茄汁、甜菜汁和胡萝卜汁的培养基中生长的A. limacinum细胞分别得到9.0 E+07、9.83 E+07和6.88 E+07的最高的藻类生物质。相反，在分别含有椰子水和苹果汁的培养基中生长的藻类细胞分别得到最低生物质，4.23 E+07和4.28 E+06。含有50％番茄汁且补充有右旋糖的培养基中生长的A.limacinum在生长50小时之后最快达到最大密度。
实施例5
来自汁液培养基中生长的A. LIMACINUM培养物的DHA产率
使A. limacinum生长于各种汁液培养基中。制备总共十五(15)种培养基(用于接种和培养藻类)，其具有以下各汁液浓度： (1) 10％浓度的认证为有机的甜菜汁；(2) 25％浓度的认证为有机的甜菜汁；(3) 50％浓度的认证为有机的甜菜汁；(4) 10％浓度的认证为有机的苹果汁；(5) 25％浓度的认证为有机的苹果汁；(6) 50％浓度的认证为有机的苹果汁；(7) 10％浓度的番茄汁；(8) 25％浓度的番茄汁；(9) 50％浓度的番茄汁；(10) 10％浓度的椰子水；(11) 25％浓度的椰子水；(12) 50％浓度的椰子水；(13) 10％浓度的认证为有机的胡萝卜汁；(14) 25％浓度的认证的胡萝卜汁；和(15) 50％浓度的认证为有机的胡萝卜汁。各培养基额外含有具有12.7 ppt的盐度的海水，且补充有6％的浓度的认证为有机的右旋糖。将培养基通过巴氏灭菌法灭菌。
藻类细胞通过真空过滤干燥，且样品在原位进行酯转移。通过气相层析通过与内部和外部标准品比较来定量DHA。
表 5：基于汁液的培养基(具有50％汁液浓度)的最大DHA产率
汁液制剂 DHA产率mg/ml 收获的小时数(h)
50%甜菜 4.4 120
50%番茄 5.0 72
50%胡萝卜 1.7 72
50%椰子 0.7 72
50%苹果 0.3 72
结果呈现于图4中。对于分别含有50％浓度番茄汁和50％浓度甜菜汁的补充有认证为有机的右旋糖的培养基、5.0 mg DHA/L汁液培养基和4.4 mg DHA/L汁液培养基，DHA产率/ml培养基是最高的。
实施例6
来自汁液培养基中生长的A. LIMACINUM培养物的EPA产率
使A. limacinum生长于各种汁液培养基中。制备总共十五(15)种培养基(用于接种和培养藻类)，其具有以下各汁液浓度： (1) 10％浓度的认证为有机的甜菜汁；(2) 25％浓度的认证为有机的甜菜汁；(3) 50％浓度的认证为有机的甜菜汁；(4) 10％浓度的认证为有机的苹果汁；(5) 25％浓度的认证为有机的苹果汁；(6) 50％浓度的认证为有机的苹果汁；(7) 10％浓度的番茄汁；(8) 25％浓度的番茄汁；(9) 50％浓度的番茄汁；(10) 10％浓度的椰子水；(11) 25％浓度的椰子水；(12) 50％浓度的椰子水；(13) 10％浓度的认证为有机的胡萝卜汁；(14) 25％浓度的认证的胡萝卜汁；和(15) 50％浓度的认证为有机的胡萝卜汁。各培养基额外含有具有12.7 ppt的盐度的海水，且补充有6％的浓度的认证为有机的右旋糖。将培养基通过巴氏灭菌法灭菌。
藻类细胞通过真空过滤干燥，且样品在原位进行酯转移。通过气相层析通过与内部和外部标准品比较来定量EPA。
表 5：基于汁液的培养基(具有50％汁液浓度)的最大EPA产率
汁液制剂 EPA产率(mg/ml) 收获的小时数(h)
50%甜菜 0.039 120
50%番茄 0.035 72
50%胡萝卜 0.012 120
50%椰子 0.004 72
50%苹果 0.003 120
结果呈现于图5中。对于分别含有50％浓度番茄汁和50％浓度甜菜汁的补充有认证为有机的右旋糖的培养基，EPA产率/ml培养基是最高的。
实施例7
来自汁液培养基中生长的A. LIMACINUM培养物的DPA产率
使A. limacinum生长于各种汁液培养基中。制备总共十五(15)种培养基(用于接种和培养藻类)，其具有以下各汁液浓度： (1) 10％浓度的认证为有机的甜菜汁；(2) 25％浓度的认证为有机的甜菜汁；(3) 50％浓度的认证为有机的甜菜汁；(4) 10％浓度的认证为有机的苹果汁；(5) 25％浓度的认证为有机的苹果汁；(6) 50％浓度的认证为有机的苹果汁；(7) 10％浓度的番茄汁；(8) 25％浓度的番茄汁；(9) 50％浓度的番茄汁；(10) 10％浓度的椰子水；(11) 25％浓度的椰子水；(12) 50％浓度的椰子水；(13) 10％浓度的认证为有机的胡萝卜汁；(14) 25％浓度的认证的胡萝卜汁；和(15) 50％浓度的认证为有机的胡萝卜汁。各培养基额外含有具有12.7 ppt的盐度的海水，且补充有6％的浓度的认证为有机的右旋糖。将培养基通过巴氏灭菌法灭菌。
藻类细胞通过真空过滤干燥，且样品在原位进行酯转移。通过气相层析通过与内部和外部标准品比较来定量DPA。
结果呈现于图6中。对于分别含有50％浓度番茄汁和50％浓度甜菜汁的补充有认证为有机的右旋糖的培养基，DPA产率/ml培养基是最高的。
表 6：各汁液类型的最大DPA产率
汁液制剂 DPA产率(mg/ml) 收获的小时数(h)
50%甜菜 0.75 120
50%番茄 0.85 72
50%胡萝卜 0.27 120
50%胡萝卜 0.11 72
10%苹果 0.17 120
实施例8
甜菜汁培养基中眼点拟微绿球藻的生长
在甜菜汁培养基中繁殖眼点拟微绿球藻。在以下各培养基中接种和培养1 x 106个眼点拟微绿球藻细胞： (1) F/2培养基(标准合成商业培养基)；(2) 天然发酵的甜菜汁(pH调节至7.6；盐度用海水调节至25 ppt)；(3) 补充有30 mM右旋糖的天然发酵的甜菜汁(pH调节至7.6；盐度用海水调节至25 ppt)；和； (4) 补充有30 mM乙醇的天然发酵的甜菜汁(pH调节至7.6；盐度用海水调节至25 ppt)。将甜菜汁培养基通过巴氏灭菌法灭菌。在以160rpm振摇的情况下在22℃孵育细胞5天。
表 7： 甜菜汁培养基中生长的眼点拟微绿球藻的生长最大值参数
结果呈现于图7中。与在商业F/2培养基中生长的眼点拟微绿球藻细胞相比，在甜菜汁培养基中生长的眼点拟微绿球藻细胞得到更高的生物质。
实施例9
甜菜糖蜜培养基中蛞蝓形裂殖壶菌的生长
在甜菜糖蜜培养基中繁殖蛞蝓形裂殖壶菌。在以下各培养基中接种和培养1 x 106个蛞蝓形裂殖壶菌细胞： (1) 补充有6％右旋糖的发酵的甜菜汁(“BJ”)；(2) 补充有6％右旋糖的有机认证的8.4％甜菜糖蜜(“BM”)；和(3) 用酶转化酶水解的有机认证的8.4％甜菜糖蜜(“BM-H”)。将培养基通过巴氏灭菌法或过滤灭菌。调节甜菜汁和甜菜糖蜜制剂以确保相等氮含量。在以200 rpm振摇的情况下在22℃孵育细胞5天。
结果呈现于图8中。有机认证的甜菜糖蜜培养基可以支持蛞蝓形裂殖壶菌生长。所有甜菜培养基含有足以支持蛞蝓形裂殖壶菌生长的氮；然而，补充有6％右旋糖(BM)的甜菜糖蜜培养基中的蛞蝓形裂殖壶菌生长受到部分抑制。由于甜菜糖蜜具有高糖含量，所以额外的糖可抑制蛞蝓形裂殖壶菌生长。蛞蝓形裂殖壶菌不能利用蔗糖，甜菜糖蜜的主要组分；因此，研究蔗糖的水解，使得甜菜糖蜜中的蔗糖可以被转化为果糖和葡萄糖。果糖和葡萄糖是用于蛞蝓形裂殖壶菌代谢的糖的生物可利用形式。在这种情况下，水解的甜菜糖蜜培养基(BM-H)不需要补充有右旋糖。水解的甜菜糖蜜培养基(BM-H)的确将蛞蝓形裂殖壶菌生长支持到与补充有6%右旋糖的天然发酵的甜菜汁培养基(BJ)相比类似的水平。由于甜菜汁还含有蔗糖，所以其也可以任选地水解，以支持蛞蝓形裂殖壶菌生长。
实施例10
水解甜菜汁​​和甜菜糖蜜以得到右旋糖和果糖
分别含有10％甜菜糖蜜、20％甜菜糖蜜和100％甜菜汁的溶液(巴氏灭菌(95℃)；pH3.7)使用食品级有机酸调节至4.5的pH，且在无菌条件下用来自面包酵母的转化酶(Sigma-Chemical Co.)处理。K-SUFRG试剂盒(Megazyme, Ireland)用于分析溶液以测定酶处理之前和之后各制剂中的蔗糖、果糖和葡萄糖浓度。将葡萄糖、果糖和蔗糖标准品掺入样品。所述溶液在55℃孵育24小时。结果呈现于表8中。
表 8： 水解甜菜汁​​和甜菜糖蜜以得到右旋糖和果糖
样品 D-葡萄糖(g/L) 蔗糖(g/L) D-果糖(g/L) 水解效率(%)
4.7％蔗糖溶液 5.92
4.7％蔗糖溶液，水解之后 3.84 3.87 65.17
9.4 %蔗糖溶液 7.89
9.4%蔗糖溶液，水解之后 6.64 6.91 85.88
10％甜菜糖蜜溶液 5.13
10％甜菜糖蜜溶液，水解之后 3.94 3.98 77.23
20 %甜菜糖蜜溶液 0.42 8.28
20 %甜菜糖蜜溶液，水解之后 6.44 6.49 78.01
100％巴氏灭菌的甜菜汁(95℃，pH3.7) 8.51 52.99 7.47
100％巴氏灭菌的甜菜汁，水解之后 55.78 52.89 87.45
10％甜菜糖蜜溶液、20％甜菜糖蜜溶液和100％甜菜汁中的水解效率分别被发现为77％、78％和87％。
实施例11
来自甜菜糖蜜培养基中生长的A. LIMACINUM培养物的DHA产率
在甜菜糖蜜培养基中繁殖蛞蝓形裂殖壶菌。在以下各培养基中接种和培养1 x 106个蛞蝓形裂殖壶菌细胞： (1) 商业基础培养基(3％右旋糖，1％酵母提取物和海水)；(2) 补充有6％右旋糖的发酵甜菜汁；(3)补充有6％右旋糖的8.4％甜菜糖蜜；和(4) 用酶转化酶水解的8.4％甜菜糖蜜。将培养基通过巴氏灭菌法或过滤灭菌。调节甜菜汁和甜菜糖蜜制剂以确保相等氮含量。在以200 rpm振摇的情况下在22℃孵育细胞5天。生长120小时之后，对于各培养基收获含有相等数目细胞(2 x 108个细胞)的一定体积的培养物。将培养物样品冷冻干燥，且通过气相层析使用标准方法测定DHA含量。
结果呈现于表9中。
表 9：基于糖蜜的培养基的最高DHA产率
培养基制剂 DHA mg/2 x 108个细胞120小时
基础培养基，3％右旋糖 1.99
甜菜糖蜜培养基-未水解，6％右旋糖 0.00
甜菜糖蜜培养基-经水解 4.11
发酵甜菜汁培养基，6％右旋糖 9.11
用转化酶水解的糖蜜培养基可以支持蛞蝓形裂殖壶菌生长且得到与商业基础培养基相比更高的DHA/ml培养基。
实施例12
补充有右旋糖和酵母提取物的甜菜糖蜜培养基中生长的A. LIMACINUM培养物的生长 和DHA产率
表 10： 组合的酵母提取物补充和糖补充对巴氏灭菌的甜菜汁培养基中的蛞蝓形裂殖壶菌生长的影响
*1 (60%巴氏灭菌的甜菜汁{BJ}，2%右旋糖{D}，0.1%酵母提取物{YE})，2 (60% BJ，2%D，1% YE)，3 (60% BJ，4% D，0.55% YE)，4 (60% BJ，6%D，0.1% YE)，5 (60% BJ，6% D，1%YE)。
表 11： 组合的酵母提取物补充和糖补充对巴氏灭菌的甜菜汁培养基中的蛞蝓形裂殖壶菌中的DHA的影响
; *1 (60%巴氏灭菌的甜菜汁{BJ}，2%右旋糖{D}，0.1%酵母提取物{YE})，2 (60% BJ，2% D，1% YE)，3 (60% BJ，4% D，0.55% YE)，4 (60% BJ，6%D，0.1% YE)，5 (60% BJ，6% D，1%YE)。
统计实验设计用于评价多个变量对巴氏灭菌的甜菜汁培养基中的蛞蝓形裂殖壶菌生物质和DHA产生的影响。在该研究中，评价添加酵母提取物(维生素来源)和糖(ω-3脂肪酸生产所需要)的组合影响。为了检查这两个变量对DHA和蛞蝓形裂殖壶菌生物质生产的组合影响，实施2-因子、3-水平部分因子设计。由于两-水平因子设计随着变量的数目增加而快速变得对于实际应用太大，所以选择部分设计。为了估计实验误差，包括四个中心点，其中将因子设定在它们的中点。该设计(表12)通过RSM的原理使用商业软件Design ExpertModde 9.0 (Stat-Ease Inc.; Minneapolis, MN)来生成。为了支持该设计，评价三种酵母提取物浓度，0.1％、0.55％和1％(因子1，X1)。此外，评价三种糖浓度，2％、4％和6％右旋糖(因子2，X2)。所监测的响应是生物质(CFU/mL，Y1)和DHA含量(mg DHA/2 x 108个细胞，Y2)。基于实验值(Y1，Y2)，估计模型系数，由其使用帕累托图估计变量对各响应的影响或变量对各响应的影响程度。同样统计学确定三种模型的拟合的缺乏。
表 12： 对于补充有酵母提取物和右旋糖的甜菜汁培养基中的蛞蝓形裂殖壶菌的生长的实际和编码实验值的部分因子设计排列。
在细胞生长的48、72和96小时监测DHA含量(mg DHA/2 x 108个细胞，Y2)(表11)。发现在96小时时间点获得的值对于DHA生产是最显著的。因此，在96小时获得的实验数据使用响应面方法进一步评估。基于ANOVA分析，113.47的模型(DHA) F-值意味着该模型是显著的。0.3184的拟合值的缺乏也暗示相对于纯误差的拟合的缺乏是不显著的。此外，0.87 的“预定决定系数(Pred R-Squared)”与0.98的“调整决定系数(Adj R-Squared)”合理一致。基于ANOVA分析，获得模型中各单独术语的概率值，且因此观察到这两个因素，包括右旋糖浓度(Prob>F，<0.0001)和酵母提取物浓度(Prob>F，0.0027)显著影响细胞的DHA含量。帕累托式|效应|图(图9)代表从最大到最小排序的这些估计值的示意图。如图9显示，酵母提取物和右旋糖两者添加正面影响DHA含量。最显著的因素是右旋糖浓度，贡献为84.01％，相比之下，酵母提取物浓度的贡献为12.85％。这是预期的，因为DHA生产可能需要右旋糖碳链作为构建块。
因为细胞在96小时时处于非常晚的稳定期，所以这决定了72小时数据点对于评价两种因素对生物质的影响而言是更相关的。基于生物质(CFU/mL，Y1)数据的拟合模型的ANOVA分析，18.0的模型F-值暗示该模型是显著的。0.7975的拟合值的缺乏也暗示相对于纯误差的拟合的缺乏是不显著的。0.85 的“预定决定系数(Pred R-Squared)”与0.88的“调整决定系数(Adj R-Squared)”合理一致。基于ANOVA分析和帕累托式图表，观察到生物质受右旋糖浓度(43.72％贡献)显著负面影响。酵母提取物对生物质没有显著影响(2.47％贡献)。然而，右旋糖和酵母提取物浓度的相互作用显示对生物质的显著负面影响(46.91％贡献)。这是预期的，因为据报道，高糖浓度可以抑制蛞蝓形裂殖壶菌生长。
还研究细胞合成的DHA和生物质之间的相关性。观察到超过0.85％的负相关性。为了概述观察到的结果，天然甜菜汁可以用酵母提取物和右旋糖补充，以显著增加蛞蝓形裂殖壶菌中的DHA产率。右旋糖浓度在测试的浓度具有对DHA含量/细胞的最大正面影响和对细胞生物质的负面影响。
实施例13
甜菜糖蜜和其它汁液的氮含量
使用K-PANOPA、K-Large和K-Glut生化试剂盒(Megazyme, Ireland)测量总生物可利用氮，包括伯氨基氮(包括L-精氨酸和谷氨酸)、尿素和氨。测试甜菜糖蜜。将样品稀释至10％浓度(体积/体积)，然后进行测试。针对100％汁液调整报道值。结果概述于表13中。
表 13： 甜菜糖蜜的氮浓度
汁液类型(100％) L-谷氨酸　(mg氮/L) 伯氨基氮(PAN，包括L-谷氨酸和L-精氨酸)　 (mg氮/L) 总生物可利用氮(PAN、氨和尿素)　 (mg氮/L)
甜菜糖蜜 1.81±0.2% 2273.04±14.79% 2990.68 ± 14.85%
甜菜糖蜜具有> 2990 mg氮/L的高浓度的总生物可利用氮。
实施例14
使藻类在基于汁液的培养基中生长改善脂肪酸稳定性
将蛞蝓形裂殖壶菌接种于基于番茄汁的培养基中。离心等体积的培养物且倒出培养基。将所得藻类沉淀以9:1的比率各自单独悬浮于甜菜汁、胡萝卜汁、蓝莓汁或水中。测试各混合物的~ 0.8g克样品以测定起始DHA浓度。将额外~0.8g样品分成等分试样，在1.5ml管中密封，然后在60℃加热长达六天。通过FAME的气相色谱定量DHA水平。结果概述于表14中。
表 14： 汁液可以保护蛞蝓形裂殖壶菌藻类生物质或糊剂中的DHA免于氧化
样品描述 起始DHA浓度 (mg/g) WCW 在60℃孵育6天之后的DHA浓度 (mg/g) WCW %氧化的DHA
甜菜汁，藻类悬浮液 9:1 2.07 1.83 11.59
胡萝卜汁，藻类悬浮液 9:1 1.40 1.00 28.69
蓝莓汁，藻类悬浮液 9:1 2.99 2.02 32.44
水，藻类悬浮液 9:1 2.21 0.59 73.30
据观察，6天之后，与悬浮于各种汁液中的藻类样品中含有的DHA相比，悬浮于水中的藻类样品中含有的DHA在更大的程度被氧化(~73.3%的起始DHA含量被氧化)。甜菜汁表明最高的保护作用，且在60℃孵育6天之后，仅11.59％的起始DHA分子被氧化。汁液中的抗氧化剂高，且这些生物活性剂可对藻类样品中的DHA稳定性作出贡献。
实施例15
在基于汁液的培养基中稳定藻类
将蛞蝓形裂殖壶菌接种于基础培养基中。离心等体积的培养物且倒出培养基。将所得藻类沉淀以1:1的比率用水均质化，且以1:1的比率单独悬浮于以下混合物中：(i) 胡萝卜汁；(ii) 甜菜汁；(iii) 甜菜汁 + 绿茶提取物；(iv) 蓝莓汁；(v) 水；(vi) 水+ 6％蔗糖(避光)；或(vii) 水 + 6％蔗糖+绿茶提取物。添加绿茶提取物作为表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)的来源，所述EGCG是一种抗氧化剂多酚类黄酮。掺入绿茶提取物的水和甜菜汁含有1000 ppm EGCG。将～0.1克样品分成等分试样，在1.5mL管中密封，用于每3天测定DHA含量，持续9天期间。将样品保持在60℃。将额外~1克样品分成等分试样，在1.5mL管中密封，用于经12天期间每三天测定混合物的抗氧化剂活性。将样品保持在60℃。通过FAME的气相层析定量DHA水平，而通过DPPH (Sigma-Aldrich)分析方法测定混合物的抗氧化剂含量，其中自由基清除活性以百分比呈现。结果概述于图10 (a) – (b)和图11 (a)-(b)。
尽管藻类糊剂具有固有的抗氧化剂活性，添加天然抗氧化剂高的汁液和/或添加天然抗氧化剂诸如绿茶提取物在加速条件下延长DHA稳定性。如图10(a)中所说明，藻类膏与甜菜汁的混合物、甜菜汁+绿茶提取物和蓝莓汁的抗氧化剂活性经12天期间在加速温度条件下经历稍微降低。甜菜汁、甜菜汁+绿茶提取物和蓝莓汁混合物的抗氧化剂活性中观察到的百分比降低分别仅为12.6％、6.8％和3.1％。藻类膏和胡萝卜汁的混合物中观察到的百分比降低与其它汁液相比更高(56.74％)，然而，当看看第9天的图11(a)中的样品的DHA含量时，没有观察到由于氧化导致的显著水平的DHA损失，这显示胡萝卜汁中剩余的抗氧剂仍能够防止氧化。另一方面，含有含有藻类膏和水或含有6％蔗糖的水的对照样品表明由于氧化导致的高水平的DHA损失。发现含有水的对照样品中在第9天的DHA水平降低的百分比为92.6%，如图11(b)中所说明。该效果可能是由于这样的事实，即单独的藻类糊剂中的天然抗氧化剂的水平在加速条件下无法稳定DHA，且还突出汁液对DHA的稳定性的保护效果。如图10(b)中所呈现，含有藻类膏和水或含有蔗糖的水的对照样品的抗氧化剂活性降低77.07%和75.83％。果汁在藻类膏背景中显示与单独的绿茶提取物相比优异的抗氧化剂活性(74.9％损失)；然而，当绿茶提取物和甜菜汁两者添加至藻类霜时，该混合物的抗氧化剂活性证明经12天更稳定(6.8％损失)。
实施例16
藻类膏和果汁含有天然抗氧化剂
将蛞蝓形裂殖壶菌接种于基础培养基中。离心等体积的培养物且倒出培养基。将所得藻类沉淀以1:1的比率用水均质化，且以1:1的比率单独悬浮于以下混合物中：(i) 胡萝卜汁；(ii) 甜菜汁；(iii) 蓝莓汁；(iv) 水。使用DPPH (Sigma-Aldrich)分析方法测试~1克样品的抗氧化剂含量，其中自由基清除活性以百分比呈现。这些结果概述于表15中。
表 15：
样品 平均自由基清除活性(％) STD RSD (%)
藻类膏：胡萝卜汁(1:1) 54.54 0.15 0.27
藻类膏：甜菜汁(1:1) 95.62 0.87 0.91
藻类膏：蓝莓汁(1:1) 93.60 7.11 7.60
藻类膏：水(1:1) 44.12 3.09 7.01
藻类霜表明44.12％自由基清除活性，且添加汁液使甜菜汁中的藻类霜制剂的抗氧化剂活性增加直至95.62％。蓝莓汁和胡萝卜汁分别使自由基清除活性％增加至93.60和54.54。
尽管本文公开本发明的各个实施方案，但可以根据本领域技术人员的众所周知常识在本发明的范围内进行许多改变和修改。此类修改包括取代本发明的任何方面的已知等同方案，以便以基本上相同的方式实现相同的结果。数字范围包括限定该范围的数字。在说明书中，词语“包含(comprising)”用作开放式术语，基本上等同于短语“包括，但不限于”，且词语“包含(comprises)”具有相应的含义。本文参考文献的引用不应被解释为承认此类参考文献是本发明的现有技术。本发明包括基本上如上文描述且参考实施例和附图的所有实施方案和变化。
参考文献：
。

Claims (89)

1.生产藻类生物质或藻类细胞培养物的方法，其包括使藻类在培养基中生长且从所述培养基收获所述藻类生物质或藻类细胞培养物，
其中所述培养基包含来自一种或多种水果或蔬菜或水果和蔬菜的任何组合的汁液、氧源和氮；
其中所述培养基是灭菌的；且
其中所述氮由天然氮组成。
2.权利要求1的方法，其中所述培养基补充有盐源。
3.权利要求2的方法，其中所述盐源是海水。
4.权利要求3的方法，其中所述海水具有约10 ppt至约35 ppt的范围内的盐度。
5.权利要求4的方法，其中所述海水具有约12.7 ppt的盐度。
6.权利要求1至5的方法，其中所述培养基补充有糖。
7.权利要求6的方法，其中所述糖是右旋糖或果糖。
8.权利要求7的方法，其中所述糖是有机的。
9.权利要求1的方法，其中所述培养基由所述汁液、所述氧源、所述氮、盐源和糖组成。
10.权利要求1的方法，其中所述培养基由所述汁液、所述氧源、所述氮和盐源组成。
11.权利要求1的方法，其中所述培养基由所述汁液、所述氧源、所述氮和糖组成。
12.权利要求9和11的方法，其中所述糖选自果糖和右旋糖。
13.权利要求12的方法，其中所述糖是认证为有机的。
14.权利要求9和10的方法，其中所述盐源是海水。
15.权利要求14的方法，其中所述海水具有约10 ppt至约35 ppt的范围内的盐度。
16.权利要求15的方法，其中所述海水具有约12.7 ppt的盐度。
17.生产一种或多种脂质化合物或其组合物的方法，其包括使藻类在培养基中生长，且从所述藻类提取所述化合物或组合物，
其中所述培养基包含来自一种或多种水果或蔬菜或水果和蔬菜的任何组合的汁液、氧源和氮；
其中所述培养基是灭菌的；且
其中所述培养基中的氮由天然氮组成。
18.权利要求17的方法，其中所述培养基补充有盐源。
19.权利要求18的方法，其中所述盐源是海水。
20.权利要求19的方法，其中所述海水具有约10 ppt至约35 ppt的范围内的盐度。
21.权利要求20的方法，其中所述海水具有约12.7 ppt的盐度。
22.权利要求17至21的方法，其中所述培养基补充有糖。
23.权利要求22的方法，其中所述糖是右旋糖或果糖。
24.权利要求23的方法，其中所述糖是有机的。
25.权利要求17的方法，其中所述培养基由所述汁液、所述氧源、所述氮、盐源和糖组成。
26.权利要求17的方法，其中所述培养基由所述汁液、所述氧源、所述氮和盐源组成。
27.权利要求17的方法，其中所述培养基由所述汁液、所述氧源、所述氮和糖组成。
28.权利要求25和27的方法，其中所述糖选自果糖和右旋糖。
29.权利要求28的方法，其中所述糖是认证为有机的。
30.权利要求25和26的方法，其中所述培养基补充有盐源。
31.权利要求30的方法，其中所述盐源是海水。
32.权利要求31的方法，其中所述海水具有约10 ppt至约35 ppt的范围内的盐度。
33.权利要求32的方法，其中所述海水具有约12.7 ppt的盐度。
34.权利要求17至33的方法，其中所述化合物是脂肪酸。
35.权利要求34的方法，其中所述脂肪酸是多不饱和脂肪酸。
36.权利要求35的方法，其中所述多不饱和脂肪酸选自DHA、DPA、松油酸和EPA。
37.权利要求36的方法，其中所述多不饱和脂肪酸是DHA。
38.权利要求36的方法，其中所述多不饱和脂肪酸是EPA。
39.权利要求36的方法，其中所述多不饱和脂肪酸是松油酸。
40.权利要求17至33的方法，其中所述化合物是类胡萝卜素或脂溶性维生素。
41.权利要求40的方法，其中所述类胡萝卜素是β-胡萝卜素。
42.生产用于人或动物的食品、美容品、工业组合物或药物组合物的方法，其包括以下步骤：
使藻类在培养基中生长且从所述培养基收获所述藻类生物质或藻类细胞培养物，
其中所述培养基包含来自一种或多种水果或蔬菜或水果和蔬菜的任何组合的汁液、氧源和氮；
其中所述培养基是灭菌的；且
其中所述培养基中的氮由天然氮组成，
从所述培养基收获藻类生物质或藻类细胞培养物；且
制备所述食品、工业组合物或药物组合物。
43.权利要求42的方法，其进一步包括从所述藻类生物质或藻类细胞培养物提取一种或多种脂质化合物或其组合物和制备所述食品、工业组合物或药物组合物。
44.权利要求43的方法，其中所述脂质化合物是脂肪酸。
45.权利要求44的方法，其中所述脂肪酸是多不饱和脂肪酸。
46.权利要求45的方法，其中所述多不饱和脂肪酸选自DHA、DPA、EPA和松油酸。
47.权利要求46的方法，其中所述多不饱和脂肪酸是DHA。
48.权利要求46的方法，其中所述多不饱和脂肪酸是EPA。
49.权利要求46的方法，其中所述多不饱和脂肪酸是松油酸。
50.权利要求42至49的方法，其中所述培养基补充有盐源。
51.权利要求50的方法，其中所述盐源是海水。
52.权利要求51的方法，其中所述海水具有约10 ppt至约35 ppt的范围内的盐度。
53.权利要求52的方法，其中所述海水具有约12.7 ppt的盐度。
54.权利要求42至53的方法，其中所述培养基补充有糖。
55.权利要求54的方法，其中所述糖是右旋糖或果糖。
56.权利要求55的方法，其中所述糖是有机的。
57.权利要求42至56的方法，其中所述制备是食品的制备。
58.权利要求57的方法，其中所述食品是营养补充剂。
59.权利要求1至58的方法，其中所述藻类选自破囊壶菌属、衣藻属、菱形藻属、拟微绿球藻属和Aurantiochytrium。
60.权利要求59的方法，其中所述属是Aurantiochytrium。
61.权利要求59的方法，其中所述属是衣藻属。
62.权利要求59的方法，其中所述属是拟微绿球藻属。
63.权利要求1至62的方法，其中所述汁液选自番茄汁、甜菜汁、胡萝卜汁、苹果汁、蓝莓汁、认证为有机的甜菜糖蜜和椰子汁。
64.权利要求63的方法，其中所述汁液是甜菜汁。
65.权利要求63的方法，其中所述汁液是番茄汁。
66.权利要求63的方法，其中所述汁液是胡萝卜汁。
67.权利要求1至66的方法，其中所述培养基中的汁液的百分比浓度是约5％至约70％范围内的百分比浓度。
68.权利要求67的方法，其中所述培养基中的汁液的百分比浓度是约10％至约50％范围内的百分比浓度。
69.权利要求68的方法，其中所述培养基中的汁液的百分比浓度是选自约10％、约25％和约50％的百分比浓度。
70.权利要求1至69的方法，其中所述汁液是发酵的。
71.权利要求1至70的方法，其中所述汁液是巴氏灭菌的。
72.权利要求1至71的方法，其中所述汁液是认证为有机的。
73.权利要求1至72的方法，其中所述培养基的pH在约3至约7的范围内。
74.权利要求73的方法，其中所述培养基的pH是约6.8。
75.权利要求1至74的方法，其中所述培养基不含化学添加剂和防腐剂。
76.权利要求1至16和权利要求59至75的方法，其中所述藻类生物质或藻类细胞培养物是认证为有机的。
77.权利要求17至41和权利要求59至75的方法，其中所述脂质化合物或组合物是认证为有机的。
78.权利要求42至75的方法，其中所述食品是认证为有机的。
79.权利要求58的方法，其中所述营养补充剂是认证为有机的。
80.权利要求17的方法，其中所述汁液是甜菜汁或认证为有机的甜菜糖蜜且其中所述汁液用非GMO转化酶水解。
81.权利要求17的方法，其中所述培养基补充有右旋糖和认证为有机的酵母提取物。
82.权利要求17的方法，其中所述汁液降低所述脂质化合物或组合物的氧化速率。
83.权利要求82的方法，其中所述脂质化合物是DHA。
84.权利要求82的方法，其中所述汁液选自胡萝卜汁、蓝莓汁和甜菜汁。
85.降低脂质化合物或组合物的氧化速率的方法，其包括将所述脂质化合物或组合物悬浮于培养基中，其中所述培养基包含来自一种或多种水果或蔬菜或来自水果和蔬菜的任何组合的汁液。
86.权利要求85的方法，其中所述汁液选自甜菜汁、胡萝卜汁和蓝莓汁。
87.权利要求85的方法，其中所述脂质化合物是DHA。
88.权利要求85的方法，其中所述脂质化合物或组合物通过权利要求1-84中任一项的方法生产。
89.权利要求85的方法，其中所述脂质化合物或组合物源自藻类。
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