JP2016523529A - 藻類細胞培養液およびバイオマス、脂質化合物および組成物、ならびに関連製品の製造方法 - Google Patents

Abstract

本発明は、藻類バイオマスおよび藻類細胞培養液、ならびに脂肪酸、カロチノイドおよび脂溶性ビタミンなどの脂質化合物およびその組成物の製造方法に関する。さらに本発明は、関連食品ならびに工業用組成物および医薬組成物の調製方法に関する。さまざまな代表的な実施形態において、本方法は、天然由来の窒素を含有する培地または化学添加物および保存料を含まない培地などの、ジュースをベースとした培地中で藻類を増殖させて、すべて有機認証可能な藻類細胞培養液、藻類バイオマス、藻類由来の脂質化合物および組成物、ならびに関連製品を製造することを含む。

Description

本発明は、藻類バイオマスおよび細胞培養液、ならびに脂肪酸、カロチノイドおよび脂溶性ビタミンなどの脂質化合物およびその組成物の製造方法に関する。さらに本発明は、関連の食品ならびに工業用組成物および医薬組成物の調製方法に関する。さまざまな例示的実施形態において、本方法は、化学添加物および保存料を含まない培地など、ジュースをベースとした培地中で藻類を増殖させて、すべて有機認証可能な藻類細胞培養液、藻類バイオマス、脂質化合物および組成物、ならびに関連製品を製造することを含む。

藻類（微細藻類(microalgae)および大型藻類(macroalgae)の両方）は、地球上のほとんどの生態系に生息する多様な生物の集団である。藻類は、最も一般的には、色素によって分類される。緑藻類または緑色植物は、クロロフィルａおよびｂを含有する。紅藻類または紅色植物は、クロロフィルａとフィコビリンの両方を含有する。有色植物類（chromophytes）として知られる褐藻類は、クロロフィルａおよびｃを含有するが、クロロフィルｂは含有しない。

水産養殖に利用される藻類種の例として：ナンノクロロプシス・オクラタ（２〜４μｍ）、イソクリシス・ガルバナ（５〜７μｍ）、スキゾキトリウム属藻類、テトラセルミス・チュイ（７〜１０μｍ）、キートセロス・グラシリス（６〜８μｍ）、デュナリエラ・ターティオレクタ（７〜９μｍ）、および数種のクロレラ（直径３〜９μｍ）、ニッチアおよびクラミドモナスが挙げられる。

水域環境の化学的特徴は、藻類増殖速度およびバイオマスの品質を決定する上で重要な役割を果たす。一般的に、微細藻類の培養に使用する培地組成にはいくつかの共通した特徴がある。いくつかの栄養素は、比較的高濃度で添加する必要がある。これらの栄養素は、主要栄養素として知られ、炭素（Ｃ）、窒素（Ｎ）、リン（Ｐ）、ナトリウム（Ｎａ）、硫黄（Ｓ）、カリウム（Ｋ）およびマグネシウム（Ｍｇ）である。低濃度で必要とされる微量栄養素も添加しなければならない。これらの微量栄養素には、マンガン（Ｍｎ）、亜鉛（Ｚｎ）、銅（Ｃｕ）、モリブデン（Ｍｏ）、コバルト（Ｃｏ）、鉄（Ｆｅ）、塩化物（Ｃｌ）、カルシウム（Ｃａ）およびボリウム（Ｂｏ）が挙げられる。これらの栄養素は、藻類の増殖に必須である。藻類培養培地中に存在する主要栄養素および微量栄養素の化学量論モル量は、培地の重要な特徴であり、培地の処方を開発する際、または改善する際にこれらの比率に留意すべきである。

すべての生物の場合と同様、藻類が吸収できる炭素源を、藻類増殖用合成培地に添加しなければならない。二酸化炭素の形態で添加される炭素は、無機炭素として知られる。この炭素は、光合成プロセスによって固定される。一部の藻類種は、無機炭素源だけで増殖でき、この成長モードを光合成独立栄養成長と呼ぶ。ほとんどの藻類種は、光合成独立栄養成長モードを行うことができる。一部の藻類は、光合成の必要なしに、有機炭素源からエネルギーを得ることも可能であり、この成長モードを従属栄養成長モードと呼ぶ。その他の藻類は、増殖するために、光および二酸化炭素と、有機炭素源とを同時に利用することができ、これを混合栄養成長と呼ぶ。混合栄養成長モードまたは従属栄養成長モードの場合、微細藻類の培養のための炭素源として、グルコース、ブドウ糖、酢酸塩およびメタノール（還元炭素源（a source reduced carbon））が挙げられる。

藻類増殖用培地に添加される一般的な窒素源は、硝酸塩（ＮＯ_３）、亜硝酸塩（ＮＯ_２）、アンモニウム（ＮＨ_４）、尿素、アミノ酸（グルタミン酸ナトリウムまたはアルギニン）、トリプトン、ペプトン、カゼイン、非有機酵母エキスおよびコーンスティープリカーである。

リン、硫黄およびマグネシウムは、すべて必須主要栄養素であり、藻類増殖にこれらの添加は必要である。硫酸塩（ＳＯ_４）は、一般的に、藻類増殖用合成培地に添加される硫黄形態である。無機リン酸塩（Ｈ_２ＰＯ_４またはＨＰＯ_４）は、一般的に藻類培養培地に供給されるリン形態であるが、有機リン酸塩の形態も使用できる。過剰なリン酸塩は、淡水および海洋生態系の両方において水の華（algal bloom）に関連があるとされてきた。

鉄は、藻類細胞中の細胞代謝およびエネルギー生産において重量な役割を果たす鍵となる元素である。一般的に、第二鉄および第一鉄の形態の鉄は、微細藻類に容易に吸収される。鉄添加の初期の試みでは、鉄が溶液から析出する結果となることが多かった。したがって、多くの処方では、鉄を化学的キレート剤（通常、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）ナトリウム）中に懸濁させておかなければならない。ＥＤＴＡは、銅、コバルトおよびカドミウムなどの他の微量元素をキレートする。

微量元素と呼ばれる他の元素は、藻類合成培養培地に添加されなければならない。銅、マンガン、モリブデン、および亜鉛は、通常、微量元素の溶液に含まれる金属である。バナジウム、ホウ素、およびコバルトも微量元素に含まれる場合がある。これらの金属を高濃度で添加することは有害であり、したがってこれらを過剰に添加しないように注意しなければならない。ＥＤＴＡなどの化学的キレート剤を、これらの金属を含有する溶液に添加することは、析出を防止するために行なわれることが多い。

ビタミンの添加によって、スキゾキトリウムの脂肪酸組成を変更し、他の藻類種のバイオマス生産を改善できることが実証されている。したがって、多くの合成増殖培地の処方には追加ビタミンが含まれている。

藻類の商業的応用として、さまざまな脂肪酸および酸化防止剤など、商業的に有用な脂質および親油性化合物を生成する藻類の能力があげられる。例えば、オメガ３脂肪酸は、身体的および精神的健康上、重要な栄養素である。これらの必須脂肪酸は、心臓血管、生殖、免疫と神経系の健康を支える。オメガ３脂肪酸は、脳内に高濃度で存在し、認知機能（脳の記憶および働き）および行動機能にとって重要であると考えられる。実際、妊娠期間中に母親から十分なオメガ３脂肪酸を受けていない乳児には、視覚および神経異常を発症するリスクがある。

スラウストキトリドは、オメガ３脂肪酸の生成に関して重要な研究開発の焦点となってきた微細藻類である。スラウストキトリドは、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ；Ｃ_２２：６ｎ−３）などの多価不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）を合成し、蓄積することが知られている。スラウストキトリド由来のＤＨＡの工業生産は、過去２０年間で著しく進歩してきた。これらの藻類種由来のＤＨＡの経済的生産につながる重要な特徴は、従属栄養成長培地中で増殖するその能力であった。発酵容器中で培養する時に、炭素源としてグルコースを含み、窒素源としてＭＳＧ、コーンスティープリカーまたは酵母エキスを含む従属栄養培地の処方を使用すると、細胞濃度が高く、成長速度が速く、有意な量のＤＨＡが生成される。炭素および窒素に加えて、リン酸塩、硫酸塩、鉄、リン、ナトリウム、硫黄、カリウム、マグネシウム、および微量元素を藻類合成培養培地に添加する。コーンスティープリカーおよび酵母エキスといったより複雑な化学添加物を使用する場合、これらの添加物は、微量元素およびビタミンを十分な量含有するので、こうした栄養素は省いてもよい。

一般的に、既に知られている微細藻類を培養するために用いられる従属栄養培地の処方は、常に化学添加物を含有する。微細元素も化学物質源に由来するものである。主要栄養素および微量栄養素は、化学的に誘導されることが多い。コーンスティープリカーは、トウモロコシの湿式粉砕の際の産業副産物であり、多くの場合、トウモロコシ穀粒をやわらかくするために化学的亜硫酸ガスがスティープに注入される。アンモニウム、硝酸塩、ＭＳＧなどの窒素源はすべて、製品の合成または単離に化学物質を要する工業プロセスの製品である。非有機の酵母エキスは、化学物質に由来する栄養素を含有する培養培地を用いて生成される。スラウストキドリドを工業的に生産するために提案されてきたその他の化合物には、ゲリセート、ペプトン、トリプトン、カゼイン、尿素、ホエー、またはコーングルテンミールがあり、これらはすべて、製品の合成または単離に化学物質を要する工業プロセスの製品である。このような培地は、化学物質を含まない、または有機認証済の藻類ならびに藻類由来の組成物および化合物の生成には不適当である。

全米有機プログラム（ＮＯＰ：Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｐｒｏｇｒａｍ）は、有機製品の実践およびラベリングに関する規則を定めている。認可された物質および認可されていない物質が概説され、一覧に加えられる。この一覧には、ＤＨＡおよびＥＰＡなどの合成的に誘導された物質が含まれている。ＮＯＰ基準の下で認可されていない物質を２、３例を挙げると、非有機酵母および非有機酵母由来の製品、合成的に誘導された硫酸塩、および合成的に誘導された微量元素である。非有機物質は、１）健康上のメリットをもたらすことをＵＳＤＡが認めていることと、２）有機代替物が入手不可能であることと、を条件に、現行法の下で最大５％までの使用が認可されてきた。合成的に誘導されたＤＨＡを含有する有機製品は認可を受け、市場に出て販売されている。藻類ＤＨＡ産業は、藻類ＤＨＡの有機生産のためのプロセスは開発不可能であると主張している。その結果、有機製品のラベリングがされた粉ミルクや他の食品への非有機藻類油の添加は、依然として議論の的になっている。

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したがって、食品、医薬品および化粧品ならびに工業製品に使用するために、例えば有機認証済の、化学添加物および保存料を含まない藻類およびそれらの構成成分の工業規模の製造が必要とされている。

藻類培養液、バイオマス、脂質化合物および脂質組成物、ならびに関連製品の製造方法を提供する。

例示的な一実施形態において、藻類バイオマスまたは藻類細胞培養液の製造方法であって、培養培地中で藻類を増殖させ、培地から藻類バイオマスまたは藻類細胞培養液を回収することを含み、培地が、１種または複数種の果実に由来するジュース、酸素源、および窒素を含み、培地が滅菌されており、培地中の窒素が天然由来の窒素からなる、方法を提供する。

別の例示的な実施形態において、培地に食塩源が添加されていてもよい。別の例示的な実施形態において、食塩源は海水でもよい。さらなる実施形態において、海水の塩分濃度は約１０ｐｐｔ〜約３５ｐｐｔの範囲内であってもよい。

さらなる例示的な実施形態において、いずれかの上記実施形態の培地に糖が添加されていてもよい。別の実施形態において、糖はブドウ糖でも果糖でもよい。別の実施形態において、糖は有機認証済でもよい。

別の例示的な実施形態において、培地は、ジュース、酸素源、窒素、糖および食塩源からなってよい。別の例示的な実施形態において、培地は、ジュース、酸素源、窒素および糖からなってもよい。さらに別の例示的な実施形態において、培地は、ジュース、酸素源、窒素および食塩源からなってもよい。

別の例示的な実施形態において、培養培地中で藻類を増殖させ、培地から藻類バイオマスまたは藻類細胞培養液を回収することを含む、藻類バイオマスまたは藻類細胞培養液の製造方法であって、培地が、１種または複数種の果実もしくは野菜または果実と野菜の任意の組合せに由来するジュース、糖、食塩源、酸素源、および窒素からなり、培地が滅菌されており、培地中の窒素が天然由来の窒素からなる、方法を提供する。

別の例示的な実施形態において、培養培地中で藻類を増殖させ、培地から藻類バイオマスまたは藻類細胞培養液を回収することを含む、藻類バイオマスまたは藻類細胞培養液の製造方法であって、この培地が、１種または複数種の果実もしくは野菜または果実と野菜の任意の組合せに由来するジュース、糖、酸素源、および窒素からなり、培地が滅菌されており、培地中の窒素が天然由来の窒素からなる、方法を提供する。

別の例示的な実施形態において、培養培地中で藻類を増殖させ、培地から藻類バイオマスまたは藻類細胞培養液を回収することを含む、藻類バイオマスまたは藻類細胞培養液の製造方法であって、培地が、１種または複数種の果実もしくは野菜または果実と野菜の任意の組合せに由来するジュース、食塩源、酸素源、および窒素からなり、培地が滅菌されており、培地中の窒素が天然由来の窒素からなる、方法を提供する。

さらなる例示的な実施形態において、前述の４つの段落のいずれかの実施形態における糖は、ブドウ糖でも果糖であってもよい。さらなる例示的な実施形態において、糖は有機認証済でもよい。別の例示的な実施形態において、前述の４つの段落のいずれかの実施形態における食塩源は、海水でもよい。さらなる実施形態において、海水の塩分濃度は約１０ｐｐｔ〜約３５ｐｐｔの範囲でもよい。

別の例示的な実施形態において、培地中で藻類を増殖させ、藻類から脂質化合物または組成物を抽出することを含む、１種または複数種の脂質化合物またはそれらの組成物の製造方法であって、培地が、１種または複数種の果実もしくは野菜または果実と野菜の任意の組合せに由来するジュース、酸素源および窒素を含み、培地が滅菌されており、培地中の窒素が天然由来の窒素からなる、方法を提供する。

別の例示的な実施形態において、前述の段落の実施形態の培地は、食塩源が添加されていてもよい。別の例示的な実施形態において、食塩源は海水でもよい。さらなる実施形態において、海水の塩分濃度は約１０ｐｐｔ〜約３５ｐｐｔの範囲であってもよい。

さらなる例示的な実施形態において、２つの前述の段落のいずれかの実施形態の培地に、糖が添加されていてもよい。別の実施形態において、糖は、ブドウ糖でも果糖であってもよい。別の実施形態において、糖は有機認証済でもよい。

別の例示的な実施形態において、培地は、ジュース、酸素源、窒素、糖および滅菌した食塩源からなってよい。さらに別の例示的な実施形態において、培地は、ジュース、酸素源、窒素および糖からなってよい。別の例示的な実施形態において、培地は、ジュース、酸素源、窒素および食塩源からなってよい。

別の例示的な実施形態において、培地中で藻類を増殖させ、藻類から脂質化合物または組成物を抽出することを含む、１種または複数種の脂質化合物またはそれらの組成物の製造方法であって、培地が、１種または複数種の果実もしくは野菜または果実と野菜の任意の組合せに由来するジュース、酸素源、窒素、食塩源、および糖からなり、培地が滅菌されており、培地中の窒素が天然由来の窒素からなる、方法を提供する。

別の例示的な実施形態において、培地中で藻類を増殖させ、藻類から脂質化合物または組成物を抽出することを含む、１種または複数種の脂質化合物またはそれらの組成物の製造方法であって、培地が、１種または複数種の果実もしくは野菜または果実と野菜の任意の組合せに由来するジュース、酸素源、窒素、および食塩源からなり、培地が滅菌されており、培地中の窒素が天然由来の窒素からなる、方法を提供する。

別の例示的な実施形態において、培地中で藻類を増殖させ、藻類から脂質化合物または組成物を抽出することを含む、１種または複数種の脂質化合物またはそれらの組成物の製造方法であって、培地が、１種または複数種の果実もしくは野菜または果実と野菜の任意の組合せに由来するジュース、酸素源、窒素、および糖からなり、培地が滅菌されており、培地中の窒素が天然由来の窒素からなる、方法を提供する。

さらなる例示的な実施形態において、前述の４つの段落のいずれかの実施形態における糖は、ブドウ糖でも果糖であってもよい。さらなる例示的な実施形態において、糖は有機認証済でもよい。別の例示的な実施形態において、前述の４つの段落のいずれかの実施形態における食塩源は、海水でもよい。さらなる実施形態において、海水の塩分濃度は約１０ｐｐｔ〜約３５ｐｐｔの範囲であってもよい。

さまざまな例示的実施形態において、上記のいずれかの実施形態の前記化合物は、脂肪酸、カロチノイドまたは脂溶性ビタミンであってもよい。さらなる例示的な実施形態において、脂肪酸は、多価不飽和脂肪酸でもよい。さらなる例示的な実施形態において、多価不飽和脂肪酸は、ＤＨＡ、ＥＰＡ、ＤＰＡ、およびピノレン酸からなる群より選択することができる。さらなる例示的な実施形態において、多価不飽和脂肪酸はＤＨＡでもよい。さらなる例示的な実施形態において、多価不飽和脂肪酸はＥＰＡでもよい。さらなる例示的な実施形態において、多価不飽和脂肪酸はピノレン酸でもよい。さらなる例示的な実施形態において、多価不飽和脂肪酸はＤＰＡでもよい。さらなる例示的な実施形態において、カロチノイドはβ−カロチンでもよい。

さらなる例示的な実施形態において、培養培地中で藻類を増殖させる工程と、培地から藻類バイオマスまたは藻類細胞培養液を回収する工程と、食品、工業用組成物または医薬組成物を調製する工程を含む、食品、化粧品、工業用組成物またはヒトもしくは動物用の医薬組成物の製造方法であって、培地が１種または複数種の果実もしくは野菜または果実と野菜の任意の組合せに由来するジュース、酸素源、および窒素を含み、培地が滅菌されており、培地中の窒素が天然由来の窒素からなる、方法を提供する。

さらなる例示的な実施形態において、前述の段落の方法は、藻類バイオマスまたは藻類細胞培養液から１種または複数種の脂質化合物またはそれらの組成物を抽出することと、食品、工業用組成物または医薬組成物を調製することとをさらに含んでもよい。さらなる例示的な実施形態において、脂質化合物は、脂肪酸、カロチノイドまたは脂溶性ビタミンでもよい。さらなる実施形態において、脂肪酸は多価不飽和脂肪酸でもよい。さらなる実施形態において、多価不飽和脂肪酸は、ＤＨＡ、ＤＰＡ、ＥＰＡおよびピノレン酸からなる群より選択することができる。さらなる例示的な実施形態において、多価不飽和脂肪酸はＤＨＡでもよい。さらなる例示的な実施形態において、多価不飽和脂肪酸はＥＰＡでもよい。さらなる例示的な実施形態において、多価不飽和脂肪酸はピノレン酸でもよい。さらなる例示的な実施形態において、カロチノイドはβ−カロチンでもよい。

さらなる例示的な実施形態において、上記の２つの前述の段落のいずれかの実施形態の培地には、食塩源が添加されていてもよい。さらなる実施形態において、食塩源は海水でもよい。さらなる実施形態において、海水の塩分濃度は約１０ｐｐｔ〜約３５ｐｐｔの範囲であってもよい。

さらなる例示的な実施形態において、上記の３つの段落のいずれかの実施形態の培地には、糖が添加されていてもよい。さらなる実施形態において、糖は、ブドウ糖でも果糖であってもよい。さらなる実施形態において、糖は有機認証済でもよい。さらなる実施形態において、培地には、ブドウ糖および有機認証済の酵母エキスが添加されていてもよい。

さらなる例示的な実施形態において、上記の４つの段落のいずれかの実施形態における調製は、食品の調製である。さらなる例示的な実施形態において、食品は栄養補助食品である。

さまざまな例示的実施形態において、いずれかの上記実施形態の藻類は、トラウストキトリウム属、クラミドモナス属、ナンノクロロプシス属、ニッチア属およびオーランチオキトリウム属（元はシゾキトリウム属）からなる群より選択される属である。さらなる例示的な実施形態において、オーランチオキトリウム属でもよい。さらなる例示的な実施形態において、ナンノクロロプシス属でもよい。さらなる例示的な実施形態において、クラミドモナス属でもよい。さらなる例示的な実施形態において、ニッチア属でもよい。

さまざまな例示的実施形態において、いずれかの上記実施形態において藻類の増殖は、従属栄養であっても混合栄養であってもよい。

さまざまな例示的実施形態において、いずれかの上記実施形態のジュースは、トマトジュース、ビートジュース、にんじんジュース、ココナッツジュースおよびりんごジュースからなる群より選択することができる。さらなる例示的な実施形態において、ジュースはビートジュースでもよい。さらなる例示的な実施形態において、ジュースはトマトジュースでもよい。さらなる例示的な実施形態において、ジュースはにんじんジュースでもよい。さらなる例示的な実施形態において、ジュースはビート糖蜜でもよい。さらなる例示的な実施形態において、いずれかの実施形態のジュースは、非ＧＭＯ由来インベルターゼによって加水分解されている。さらなる例示的な実施形態において、本明細書中のいずれかの実施形態のジュースは、ビートジュースまたは有機認証済のビート糖蜜であり、ジュースは、非ＧＭＯ由来インベルターゼによって加水分解されている。

さまざまな例示的実施形態において、いずれかの上記実施形態のジュースは、培地中の％濃度が約５％〜約７０％であり得る。さらなる例示的な実施形態において、ジュースは、培地中の％濃度が約１０％〜約５０％であり得る。さらなる例示的な実施形態において、培地中ジュースの％濃度は約１０％、約２５％および約５０％からなる群より選択されてもよい。

さらなる例示的な実施形態において、いずれかの上記実施形態のジュースは、発酵したものであってもよい。

さらなる例示的な実施形態において、いずれかの上記実施形態のジュースは、低温殺菌したものであってもよい。

さらなる例示的な実施形態において、いずれかの上記実施形態のジュースは、有機認証済でもよい。さらなる例示的な実施形態において、ジュースは有機認証済のビート糖蜜である。さらなる例示的な実施形態において、有機認証済のビート糖蜜は、非ＧＭＯ由来インベルターゼによって加水分解されている。

さらなる例示的な実施形態において、いずれかの上記実施形態の培地のｐＨは、約３〜約９の範囲であり得る。

さらなる例示的な実施形態において、いずれかの上記実施形態の培地は、化学添加物および保存料を含まなくてもよい。

さらなる例示的な実施形態において、いずれかの上記実施形態の培地は有機認証済の酵母エキスが添加されていてもよい。

さらなる例示的な実施形態において、いずれかの上記実施形態の藻類バイオマス、藻類細胞培養液、脂質化合物または組成物、食品または栄養補助食品は、有機認証済でもよい。

（ａ）〜（ｃ）は、ｐＨを調節していないジュース培地および海水中のオーランチオキトリウム・リマシナム（Aurantiochytrium limacinumin）の増殖を示す線グラフである。 （ａ）〜（ｃ）は、ｐＨを６．８に調節したジュース培地および海水中のオーランチオキトリウム・リマシナムの増殖を示す線グラフである。 （ａ）〜（ｃ）は、ｐＨを６．８に調節し、ブドウ糖を添加したジュース培地および海水中のオーランチオキトリウム・リマシナムの増殖を示す線グラフである。 海水を含有し、ブドウ糖を添加したジュース培地中で増殖したオーランチオキトリウム・リマシナム培養液からのＤＨＡ収率（ｍｇ／培地（ｍＬ））を示す棒グラフである。 海水を含有し、ブドウ糖を添加したジュース培地中で増殖したオーランチオキトリウム・リマシナム培養液からのＥＰＡ収率（ｍｇ／培地（ｍＬ））を示す棒グラフである。 海水を含有し、ブドウ糖を添加したジュース培地中で増殖したオーランチオキトリウム・リマシナム培養液から抽出されるＤＰＡ（ｍｇ／培地（ｍＬ））を示す棒グラフである。 （炭素源を添加した、または添加していない）ビートジュース培地およびＦ／２培地中のナンノクロロプシス・オクラタの増殖（細胞数／培地（ｍＬ））を示す線グラフである。 ビート糖蜜ベースの培地中のスキゾキトリウム・リマシナムの増殖（細胞数／培地（ｍＬ））を示す線グラフである。 ブドウ糖および／または酵母エキスを添加したビートジュースベースの培地中で増殖したスキゾキトリウム・リマシナムのバイオマスのＤＨＡ含有量を示すパレート図である。 （ａ）〜（ｂ）は、ジュースを含むさまざまなマトリクス中に懸濁させた藻類バイオマスのラジカル捕捉活性（％）を示す線グラフである。 （ａ）〜（ｂ）は、ジュースを含むさまざまなマトリクス中に懸濁させた藻類バイオマス中に含有されるＤＨＡの濃度（ｍｇ／乾燥重量（ｇｒ））を示す線グラフおよびチャートである。

本発明者らは、果実および／または野菜ジュース由来の培地を窒素源ならびに微量栄養源、主要栄養源およびビタミン源として使用して、藻類を天然の条件で生産するための費用効率が高い手段を発見した。この培地は低温殺菌あるいは殺菌して栄養品質を維持しつつ天然のバイオバーデンを減少させた時に、藻類の成長にとって完全で好適な培地となり、天然由来の窒素および天然の成長因子を含有するため、多量の藻類バイオマスを得るために使用され得る。一実施形態においては、培地に、果糖、エタノール、グリセリンまたはブドウ糖などの炭素源を添加して、オメガ３脂肪酸ならびに他の脂質化合物および組成物などの所望の生成物の産生を増大させてもよい。別の実施形態では、本明細書におけるいずれの実施形態の培地も、ブドウ糖が添加されていてもよい。別の実施形態において、選択したジュースおよび添加炭素源は有機認証済でもよく、化学添加物および保存料を含まずに製造されたものであれば、得られた藻類バイオマス、藻類細胞培養液および／または藻類由来の脂質抽出物ならびに関連製品も有機認証済とすることができる。別の実施形態において、本明細書中のいずれかの実施形態の培地は、ブドウ糖および有機認証済の酵母エキスが添加されていてもよい。別の実施形態において、本明細書中のいずれかの実施形態の培地は、有機認証済の酵母エキスが添加されていてもよい。別の実施形態において、種類の異なる果実および／または野菜のジュースを合わせて、オメガ３脂肪酸またはカロチノイドなど、対象とする脂質抽出物を産生する上で最適な配合を得ることができる。別の実施形態において、ジュースを発酵させて重要な栄養素を放出させ、ｐＨ値を調節して成長を改善することができる。いくつかの実施形態において、ジュースの選択によって、脂肪酸プロファイルおよび藻類における総油量に対するＤＨＡのパーセンテージを高めることができる。いくつかの実施形態において、ジュース中の天然酸化防止剤は、脂肪酸安定性を改善し、脂肪酸の酸化速度を遅くすることができる。例えば、にんじんジュース中のβ−カロチンは、油の中へ直接抽出することができる。β−カロチンは、油の天然安定剤として作用し得る。一実施形態において、本明細書中のいずれかの実施形態のジュースは、脂肪酸の安定性を改善し、脂肪酸はＤＨＡであってよく、ジュースは、ビートジュース、有機認証済のビート糖蜜、にんじんジュースまたはブルーベリージュースであり得る。別の実施形態において、本明細書中のいずれかの実施形態のジュースは、脂肪酸の酸化速度を下げ、脂肪酸はＤＨＡであってよく、ジュースは、ビートジュース、有機認証済のビート糖蜜、にんじんジュースまたはブルーベリージュースであり得る。

本明細書において、藻類培養液およびバイオマスならびに脂質化合物および組成物、ならびに関連製品を製造する方法を提供する。

例示的な一実施形態において、培養培地中で藻類を増殖することと、培地から藻類バイオマスまたは藻類細胞培養液を回収することとを含む、藻類バイオマスまたは藻類細胞培養液の製造方法であって、培地が、１種または複数種の果実もしくは野菜または果実と野菜の任意の組合せに由来するジュース、酸素源、および窒素を含み、培地が滅菌されており、培地中の窒素が天然由来の窒素からなる、方法を提供する。

別の例示的な実施形態において、培地中の脂質化合物または組成物を懸濁させることを含む、脂質化合物または組成物の酸化速度を下げる方法であって、培地が１種または複数種の果実もしくは野菜または果実と野菜の任意の組合せに由来するジュースを含む、方法を提供する。さらなる例示的な実施形態において、培地を低温殺菌または滅菌する。さらなる例示的な実施形態において、ジュースは、ビートジュース、にんじんジュース、およびブルーベリージュースからなる群より選択される。さらなる実施形態において、ジュースは、ビートジュースである。さらなる実施形態において、脂質化合物はＤＨＡである。さらなる実施形態において、ジュースは有機認証済である。さらなる例示的な実施形態において、脂質化合物または組成物は、本明細書に例示する任意の方法によって製造する。さらなる例示的な実施形態において、脂質化合物または組成物は、藻類から得られる。

本明細書で使用する場合、「藻類バイオマス」は、藻類細胞および細胞片ならびにこれらの構成成分を含む。

本明細書に定義する「酸素源」は、藻類が吸収できる任意の酸素源を意味する。さまざまな例示的実施形態において、本明細書中のいずれかの実施形態の酸素源は、濾過空気、攪拌による酸素供給または濾過酸素気流からなる群より選択することができる。

本明細書に定義する「天然由来の窒素」は、次の（ｉ）と（ｉｉ）のいずれかまたは両方である。（ｉ）ジュース中に自然に含まれる任意の窒素または窒素源、（ｉｉ）藻類に窒素を供給することを目的とした藻類培地への添加に使用される任意の窒素または窒素源であって、有機認証済および／または化学添加物および保存料を含まない任意の窒素または窒素源。天然由来の窒素は、非有機酵母エキス、塩化アンモニウム、カジトン、ペプトン、トリプトン、ポリペプトン、コーンスティープリカー、コーンスティープ固形分（corn steep solid）、酢酸アンモニウム、および硝酸ナトリウムなどの有機認証を受けていない、または化学添加剤もしくは保存料である窒素源のいずれとも区別される。

さまざまな例示的実施形態において、本明細書中のいずれかの実施形態の天然由来の窒素は、窒素および窒素含有化合物であってよく、これらはすべてジュース中に自然に含まれるものである。さらなる例示的な実施形態において、本明細書中のいずれかの実施形態の天然由来の窒素は、窒素および窒素含有化合物（これらはすべてジュース中に自然に存在するものである）、ならびに有機認証済の任意の藻類培地の窒素添加物であり得る。別の例示的な実施形態において、天然由来の窒素は、有機認証済の酵母エキスである。

さまざまな例示的実施形態において、本明細書中のいずれかの実施形態の藻類は、バイオマスが商業規模または工業規模の製造に十分な量および／または密度まで増殖する。

さまざまな例示的実施形態において、本明細書に記載の培地は、食塩源を添加してもよい。

本明細書で使用する場合、「食塩源」は、藻類が代謝できる任意の塩、またはその組合せを指す。

さまざまな例示的実施形態において、本明細書中のいずれかの実施形態における食塩源は、人工的海塩、自然海水または自然海塩からなる群より選択することができる。さまざまな例示的実施形態において、食塩源は海水であってもよい。さらなる例示的な実施形態において、海水の塩分濃度は、約０．５ｐｐｔ〜約３５ｐｐｔ、約０．５〜約２５ｐｐｔ、約０．５〜約２０ｐｐｔ、約０．５〜約１５ｐｐｔ、約５〜約１５ｐｐｔ、約５〜約２０ｐｐｔ、約５〜約２５ｐｐｔ、約１０〜約２０ｐｐｔ、および約５〜約３５ｐｐｔの範囲内であり得る。さらなる例示的な実施形態において、海水の塩分濃度は、約０．５ｐｐｔ、約１．０ｐｐｔ、約２．０ｐｐｔ、約３．０ｐｐｔ、約４．０ｐｐｔ、約５．０ｐｐｔ、約７．０ｐｐｔ、約１０ｐｐｔ、約１２ｐｐｔ、約１５ｐｐｔ、約２０ｐｐｔ、約２５ｐｐｔ、約３０ｐｐｔ、および約３５ｐｐｔからなる群より選択することができる。さらなる実施形態において、海水の塩分濃度は、約１０ｐｐｔ、１０．７ｐｐｔ、１２ｐｐｔ、１２．７ｐｐｔ、１５ｐｐｔ、または１５．７ｐｐｔであってもよい。

さまざまな例示的実施形態において、本明細書に記載の培地は、糖が添加されていてもよい。

本明細書で使用する場合、「糖」は、藻類にとって栄養源である、単純糖質または複合糖質のいずれかの任意の１種または複数種の炭水化物を意味する。「糖」には、ブドウ糖、エタノールおよび有機認証済の植物性グリセリンも挙げられる。

さまざまな例示的実施形態において、本明細書中のいずれかの実施形態の糖は、エタノール、果糖、グルコース、ショ糖もしくはブドウ糖、またはこれらの任意の組合せであり得る。さらなる例示的な実施形態において、糖は有機認証済でもよい。別の実施形態において、糖は、約１％〜約２０％、約１％〜約１０％、約２％〜約１０％、約２％〜約８％、または約５％〜約１０％の濃度で培地中に存在することができる。別の実施形態において、糖は、約１％、約２％、約３％、約４％、約５％、約６％、約７％、約８％、約９％、約１０％、約１２％、約１５％の濃度で培地中に存在することができる。

さまざまな例示的実施形態において、本明細書に記載の培地は、ジュース、酸素源、窒素、糖および食塩源からなり得る。さまざまな例示的実施形態において、本明細書に記載の培地は、ジュース、酸素源、窒素および糖からなり得る。さまざまな例示的実施形態において、本明細書に記載の培地は、ジュース、酸素源、窒素および食塩源からなり得る。

別の例示的な実施形態において、培地中で藻類を増殖することと、藻類から脂質化合物または組成物を抽出することとを含む、１種または複数種の脂質化合物またはその組成物の製造方法であって、培地が、１種または複数種の果実もしくは野菜または果実と野菜の任意の組合せに由来するジュース、酸素源、および窒素を含み、培地が滅菌されており、培地中の窒素が天然由来の窒素からなる、方法を提供する。

本明細書で使用する場合、「脂質化合物」は、任意の脂肪、油、脂質、または脂肪、油、脂質および無極性溶媒（ヘキサンもしくはトルエンなど）に溶解する他の化合物を指す。さまざまな例示的実施形態において、本明細書中のいずれかの実施形態の脂質化合物は、脂肪酸、カロチノイドまたは脂溶性ビタミンであり得る。

本明細書で使用する場合、「脂肪酸」は、炭素鎖に結合したカルボン酸残基で構成される分子を指す。この炭素鎖は、短鎖（炭素数６個）から長鎖（炭素数２０個超）までを範囲とし、飽和であっても不飽和であってもよい。さまざまな例示的実施形態において、本明細書中のいずれかの実施形態の脂質化合物は脂肪酸であり得る。別の例示的な実施形態において、脂肪酸はコニフェル酸であり得る。別の例示的な実施形態において、脂肪酸は、不飽和または多価不飽和脂肪酸であり得る。別の例示的な実施形態において、不飽和脂肪酸はオメガ脂肪酸であり得る。別の例示的な実施形態において、オメガ脂肪酸は、オメガ３脂肪酸、オメガ６脂肪酸、オメガ７脂肪酸およびオメガ９脂肪酸からなる群より選択することができる。別の例示的な実施形態において、オメガ脂肪酸はオメガ３脂肪酸であり得る。別の例示的な実施形態において、オメガ脂肪酸はオメガ７脂肪酸であり得る。別の例示的な実施形態において、脂肪酸は多価不飽和脂肪酸であり得る。別の例示的な実施形態において、多価不飽和脂肪酸は、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）、ドコサペンタエン酸（ＤＰＡ）、およびピノレン酸からなる群より選択することができる。さらなる例示的な実施形態において、多価不飽和脂肪酸はＤＨＡであり得る。さらなる例示的な実施形態において、多価不飽和脂肪酸はＥＰＡであり得る。さらなる例示的な実施形態において、多価不飽和脂肪酸はピノレン酸であり得る。さらなる例示的な実施形態において、多価不飽和脂肪酸はＤＰＡであり得る。

本明細書で使用する場合、「カロチノイド」は、テトラテルペノイド系の脂溶性顔料を意味する。さまざまな例示的実施形態において、本明細書中のいずれかの実施形態のカロチノイドは、β−カロチン、アスタキサンチンおよびリコピンからなる群より選択されるカロチノイドであってもよい。さらなる例示的な実施形態において、カロチノイドはアスタキサンチンであり得る。さらなる例示的な実施形態において、カロチノイドはβ−カロチンであり得る。さらなる例示的な実施形態において、カロチノイドはリコピンであり得る。さらなる例示的な実施形態において、カロチノイドは、酸化防止活性を有することができる。

本明細書で使用する場合、「脂溶性ビタミン」は、ビタミン、すなわち脂肪中に分散し保存されている、身体中の正常代謝に少量であるが必須の物質を意味する。さまざまな例示的実施形態において、本明細書中のいずれかの実施形態の脂溶性ビタミンは、レチナール（ビタミンＡ）、エルゴカルシフェロール（ビタミンＤ２）、コレカルシフェロール（ビタミンＤ３）、α−トコフェロール（ビタミンＥ）、フィロキノン（ビタミンＫ）およびユビキノール（コエンザイムＱ）からなる群より選択されるビタミンであり得る。さらなる例示的な実施形態において、脂溶性ビタミンはビタミンＡであり得る。さらなる例示的な実施形態において、脂溶性ビタミンはビタミンＥであり得る。

さらなる例示的な実施形態において、培養培地中で藻類を増殖させる工程と、培地から藻類バイオマスまたは藻類細胞培養液を回収する工程と、食品、工業用組成物または医薬組成物を調製する工程を含む、食品、化粧品、工業用組成物またはヒトもしくは動物用の医薬組成物の製造方法であって、培地が１種または複数種の果実もしくは野菜または果実と野菜の任意の組合せに由来するジュース、酸素源、および窒素を含み、培地が滅菌されており、培地中の窒素が天然由来の窒素からなる、方法を提供する。

さらなる例示的な実施形態において、本方法は、藻類バイオマスまたは藻類細胞培養液から１種または複数種の脂質化合物または組成物を抽出することと、食品、化粧品、工業用組成物または医薬組成物を調製することとをさらに含んでいてもよい。

さらなる例示的な実施形態において、本方法は、食品を調製することをさらに含んでいてもよい。本明細書で使用する場合、「食品」は、動物またはヒトが摂取する任意の食料を指し、固体および液体の組成物の両方を含む。食品は、動物またはヒトの食料への添加物であってもよい。食品は、これらに限定されないが、一般食品；牛乳、飲料、治療用飲料、粉末飲料および栄養ドリンクを含めた液体製品；機能性食品；栄養補助食品；栄養補給食品；早産児のための人工栄養乳を含めた人工栄養乳；乳幼児食品；妊婦または授乳婦のための食品；成人向け食品；高齢者向け食品；および動物用の餌が挙げられる。

さらなる例示的な実施形態において、本明細書中のいずれかの実施形態の食品は、栄養補助食品である。本明細書に定義する「栄養補助食品」は、食事を補完して、ヒトの食事に欠けている、または十分な量を摂取されていない可能性があるビタミン、ミネラル、繊維、脂肪酸、またはアミノ酸などの栄養素を供給することを目的とする任意の製剤（カプセル、ゲル、液体または粉末の形態）である。栄養補助食品の非限定的な例として、ビタミン補給剤、多価不飽和脂肪酸補給剤、オメガ３脂肪酸補給剤、オメガ７脂肪酸、ＤＨＡおよび／またはＥＰＡを含有する補給剤、ならびに藻類または藻類誘導体を含有する栄養補助食品が挙げられる。

例示的な一実施例において、栄養補助食品は、１種または複数種の脂溶性ビタミンを含有する。別の例示的な実施例において、栄養補助食品は、藻類細胞または藻類バイオマスを含有する。別の例示的な実施例において、栄養補助食品は、オメガ３脂肪酸を含有する。別の例示的な実施例において、栄養補助食品は、オメガ７脂肪酸を含有する。別の例示的な実施例において、栄養補助食品は、多価不飽和脂肪酸を含有する。別の例示的な実施例において、栄養補助食品は、ＤＨＡ、ＤＰＡ、ＥＰＡ、およびピノレン酸からなる群より選択される多価不飽和脂肪酸を含有する。別の例示的な実施例において、栄養補助食品は、ＤＨＡおよびＥＰＡを含有する。別の例示的な実施例において、栄養補助食品はＤＨＡを含有する。別の例示的な実施例において、栄養補助食品はＥＰＡを含有する。さまざまな例示的実施例において、本明細書中のいずれかの実施形態の栄養補助食品は、有機認証を受けることができうる。別の例示的な実施例において、栄養補助食品は酸化防止剤を含有する。

「動物」は、動物界に属する任意の非ヒト生物を意味し、これらに限定されないが、水生動物および陸生動物を含む。用語「動物用飼料」または「動物用の餌」は、非ヒト動物向けの、すなわち魚；商業用魚；鑑賞魚；稚魚；二枚貝；軟体動物；甲殻類動物；シェルフィッシュ；エビ；幼生エビ；アルテミア；ワムシ；ブラインシュリンプ；フィルター・フィーダー；両生類動物；爬虫類動物；哺乳類動物；飼育動物；家畜；動物園の動物；スポーツ動物；種畜；レース用の動物；ショー用の動物；在来動物（heirloom animal）；希少動物または絶滅危惧動物；コンパニオンアニマル；イヌ、ネコ、モルモット、ウサギ、ラット、ネズミまたはウマなどの愛玩動物；サル（例えば、オマキザル、アカゲザル、アフリカミドリザル、パタス、カニクイザル、およびオナガザル）、猿人類、オランウータン、ヒヒ、テナガザル、およびチンパンジーなどの霊長類；イヌおよびオオカミなどのイヌ科；ネコ、ライオン、およびトラなどのネコ科；ウマ、ロバ、およびシマウマなどのウマ科；ウシ、畜牛、ブタ、およびヒツジなどの食用動物；シカおよびキリンなどの有蹄動物；ネズミ、ラット、ハムスターおよびモルモットなどの齧歯類動物などに向けた任意の食料を意味する。動物の飼料には、これらに限定されないが、水産養殖用飼料、飼育動物用飼料、例えば愛玩動物用飼料、動物園の動物用（zoological animal）飼料、労働用動物用飼料、家畜飼料、またはこれらの組合せが挙げられる。

いくつかの例示的な実施形態において、食品は医療食品である。本明細書で使用する場合、「医療食品」は、医師の監視下で摂取または外部から投与される組成物中の食料であり、認知されている科学原理に基づいて特有の栄養必要量が医学的評価によって設定されている、特定の病態の食事管理を目的とする。

本明細書に定義する「化粧品」には、これらに限定されないが、乳液、クリーム、ローション、マスク、せっけん、シャンプー、洗浄剤、美顔クリーム、コンディショナー、メーキャップ類、入浴剤、および分散液が挙げられる。化粧料は、薬用であっても非薬用であってもよい。

本明細書に定義する「医薬組成物」には、これらに限定されないが、抗炎症性組成物、冠状動脈性心疾患用治療薬、動脈硬化症用治療薬、化学療法剤、活性賦形剤、骨粗しょう症薬、抗うつ薬、抗痙攣薬、抗ヘリコバクター・ピロリ薬、神経変性疾患用治療薬、変性肝疾患用治療薬、抗生物質、コレステロール低下組成物、およびトリグリセリド低下組成物が挙げられる。

さらなる例示的な実施形態において、本明細書中のいずれかの実施形態の藻類は、緑藻植物門、例えばＣｈａｒｏｉｄｅｓ目（例えば、Ｃｈａｒｏｉｄｅｓ、シラタマモ、ホシツリモ、およびフラスコモ）、チリモ目（Zynematales）（例えば、ホシミドロ、ミカヅキモ、およびネトリウム）、ミル目（例えば、ミル、サボテングサ、およびイワズタ）、ハネモ目（例えば、ハネモ、ニセハネモ、Ｂｒｙｏｐｓｉｄｅｌｌａ、ツユノイト、およびアシツキイトゲ）、カサノリ目（例えば、カサノリ、イソスギナ、フデノホ、ウスガサネ、ミズタマ、およびホソエガサ）、ミドリゲ目（例えば、バロニアおよびアオモグサ）、シオグサ目（例えば、ウキオリソウ、シオグサ、マリモ、およびジュズモ）、アオサ目（例えば、アオサおよびアオノリ）、ヒビミドロ目（例えば、モツレグサ、ランソウモドキ、ヒトエグサ、およびＣｈｌｏｒｏｃｙｓｔｉｄａｃｅａｅ）、プラシオラ（Prasiola）目、クロレラ目、クロロコックム目（例えば、ケンショウモおよびアミミドロ）、オーランチオキトリウム目（例えば、オーランチオキトリウム・リマシナム）、ナンノクロロプシス目（例えば、ナンノクロロプシス・オクラタ）、ニッチア目、クラミドモナス目（例えば、コナミドリムシ）、およびボルボックス目（Volvocales）（例えば、クラミドモナス、パンドリナ、プレオドリナ、およびボルボックス）が使用可能である。

さらなる例示的な実施形態において、藻類は、トラウストキトリウム属、クラミドモナス属、ニッチア属、ナンノクロロプシス属およびオーランチオキトリウム属からなる群より選択されるものでもよい。さらなる例示的な実施形態において、オーランチオキトリウム属でもよい。さらなる例示的な実施形態において、ナンノクロロプシス属でもよい。さらなる例示的な実施形態において、クラミドモナス属でもよい。さらなる例示的な実施形態において、ニッチア属でもよい。

さらなる例示的な実施形態において、本明細書中のいずれかの実施形態の藻類は、遺伝子組換えされていない生物（例えば、非遺伝子組換え生物；非ＧＭＯ）またはトランスジェニック生物ではなく、また、遺伝子工学を用いて変更された遺伝物質を含まないものである。

さまざまな例示的実施形態において、本明細書中のいずれかの実施形態の藻類の増殖は、従属栄養であっても混合栄養であってもよい。

さまざまな例示的実施形態において、本明細書中のいずれかの実施形態の培地は、藻類の播種および培養の両方のために用いることができる。例示的な一実施形態において、藻類細胞は、本明細書のいずれの実施形態においても、先ず、培地に播種し、後続して種菌を、より容量の大きい同一の培地に移し、種菌が、最終培養培地の全容量に対してある特定のパーセンテージ（例えば１０％）を占めるようにする。

本明細書で使用する場合、「ジュース」は、１種または複数種の果実もしくは野菜または果実と野菜の任意の組合せ、１種または複数種の果実もしくは野菜または果実と野菜の任意の組合せの可食部分のピューレ、あるいはこうした液体またはピューレの任意の濃縮物から搾り出した、または抽出した水性液を意味する。本明細書で使用する場合、用語「ジュース」は、ビート糖蜜も含む。さまざまな例示的実施形態において、本明細書中のいずれかの実施形態のジュースは、ジュース中に自然に含まれるすべての化合物（糖、窒素および他の天然に生じるビタミン、ミネラルならびに主要栄養素など）を含有しており、こうしたジュースに対し、これら任意の化合物を除去してしまうような処理や変更は行なわなかった。本明細書で使用する場合、「果実」または「野菜」は、食用の植物または植物の一部を指し、これは子孫を残すための繁殖ができるものとできないものの両方があり得る。

さまざまな例示的実施形態において、本明細書中のいずれかの実施形態のジュースは、アセロラ、りんご、アンズ、バナナ、ブラックベリー、ブルーベリー、ボイゼンベリー、カンタロープ、サクランボ、ココナッツ、野生りんご、クランベリー、スグリ、ナツメヤシ、デューベリー、エルダーベリー、イチジク、グズベリー、ブドウ、グレープフルーツ、グアナバナ、グアバ、キーウィ、レモン、ライム、ローガンベリー、メロン、マンゴー、ネクタリン、オレンジ、パパイヤ、パッションフルーツ、モモ、ナシ、パイナップル、プラム、ザクロ、プルーン、マルメロ、ラズベリー、ルバーブ、イチゴ、タンジェリン、トマト、スイカ、ビート、ピーマン、ブロッコリー、キャベツ、にんじん、セロリー、トウモロコシ、キュウリ、ウイキョウ、ケール、アメリカボウフウ、カボチャ、赤チコリ、ダイズ、サツマイモ、ラディッシュ、トマティロ、カブ、ヤマイモ、およびズッキーニからなる群より選択される１種または複数種の果実もしくは野菜、または果実と野菜の任意の組合せに由来するジュースであってもよい。

さらなる例示的な実施形態において、ジュースは、トマトジュース、ビートジュース、にんじんジュース、ココナッツジュースおよびりんごジュースからなる群より選択されるジュースであり得る。さらなる例示的な実施形態において、ジュースは、トマトジュース、ビートジュース、にんじんジュース、およびりんごジュースからなる群より選択されるジュースであり得る。さらなる例示的な実施形態において、ジュースは、トマトジュース、ビートジュース、およびにんじんジュースからなる群より選択されるジュースであり得る。別の例示的な実施形態において、ジュースは、ビートジュースであり得る。さらなる例示的な実施形態において、ジュースは、トマトジュースであり得る。さらなる例示的な実施形態において、ジュースは、にんじんジュースであり得る。さらなる例示的な実施形態において、本明細書中のいずれかの実施形態のジュースは、ビート糖蜜である。さらなる例示的な実施形態において、ビート糖蜜は、有機認証済である。

さらなる例示的な実施形態において、本明細書中のいずれかの実施形態のジュースは、ジュース中の糖を分解することができる１種または複数種の酵素によって加水分解され得る。例示的な一実施形態において、酵素は、非ＧＭＯ由来インベルターゼである。別の例示的な実施形態において、非ＧＭＯ由来インベルターゼで加水分解されるジュースは、ビート糖蜜、有機認証済のビート糖蜜またはビートジュースである。

さまざまな例示的実施形態において、ジュース中の生物学的に利用可能な全窒素量は、窒素２０ｍｇ／Ｌ以上であり得る。さまざまな例示的実施形態において、ジュース中の生物学的に利用可能な全窒素量は、窒素４０ｍｇ／Ｌ以上であり得る。さまざまな例示的実施形態において、ジュース中の生物学的に利用可能な全窒素量は、窒素１００ｍｇ／Ｌ以上であり得る。さまざまな例示的実施形態において、ジュース中の生物学的に利用可能な全窒素量は、窒素２００ｍｇ／Ｌ以上であり得る。さまざまな例示的実施形態において、ジュース中の生物学的に利用可能な全窒素量は、窒素３００ｍｇ／Ｌ以上であり得る。さまざまなさらなる例示的な実施形態において、ジュース中の生物学的に利用可能な全窒素量は、窒素３３４ｍｇ／Ｌ以上であり得る。さまざまなさらなる例示的な実施形態において、ジュース中の生物学的に利用可能な全窒素量は、窒素３５０ｍｇ／Ｌ以上であり得る。さまざまなさらなる実施形態において、ジュース中の生物学的に利用可能な全窒素量は、窒素４００ｍｇ／Ｌ以上であり得る。さまざまなさらなる実施形態において、ジュース中の生物学的に利用可能な全窒素量は、窒素５５０ｍｇ／Ｌ以上であり得る。さまざまな例示的実施形態において、ジュース中の生物学的に利用可能な全窒素量は、窒素６００ｍｇ／Ｌ以上であり得る。さまざまな例示的実施形態において、ジュース中の生物学的に利用可能な全窒素量は、窒素７００ｍｇ／Ｌ以上であり得る。さまざまなさらなる例示的な実施形態において、ジュース中の生物学的に利用可能な全窒素量は、窒素７３２ｍｇ／Ｌ以上であり得る。さまざまな例示的実施形態において、ジュース中の生物学的に利用可能な全窒素量は、窒素８００ｍｇ／Ｌ以上であり得る。

さまざまなさらなる実施形態において、ジュース中の生物学的に利用可能な全窒素量は、窒素約１０ｍｇ／Ｌから窒素約１７００ｍｇ／Ｌの範囲であり得る。さらなる実施形態において、ジュース中の生物学的に利用可能な全窒素量は、窒素約２０ｍｇ／Ｌから窒素約９００ｍｇ／Ｌの範囲であり得る。さらなる実施形態において、ジュース中の生物学的に利用可能な全窒素量は、窒素約３０ｍｇ／Ｌから窒素約８５０ｍｇ／Ｌの範囲であり得る。さらなる実施形態において、ジュース中の生物学的に利用可能な全窒素量は、窒素約３５ｍｇ／Ｌから窒素約８２０ｍｇ／Ｌの範囲であり得る。

さらなる実施形態において、ジュース中の生物学的に利用可能な全窒素量は、窒素約１０ｍｇ／Ｌ、窒素約２０ｍｇ／Ｌ、窒素約３０ｍｇ／Ｌ、窒素約４０ｍｇ／Ｌ、窒素約５０ｍｇ／Ｌ、窒素約８０ｍｇ／Ｌ、窒素約９０ｍｇ／Ｌ、窒素約１００ｍｇ／Ｌ、窒素約１１０ｍｇ／Ｌ、窒素約１１８ｍｇ／Ｌ、窒素約１２０ｍｇ／Ｌ、窒素約１３０ｍｇ／Ｌ、窒素約１４０ｍｇ／Ｌ、窒素約１５０ｍｇ／Ｌ、窒素約２００ｍｇ／Ｌ、窒素約２５０ｍｇ／Ｌ、窒素約３００ｍｇ／Ｌ、窒素約３１０ｍｇ／Ｌ、窒素約３２０ｍｇ／Ｌ、窒素約３３０ｍｇ／Ｌ、窒素約３３４ｍｇ／Ｌ、窒素約３４０ｍｇ／Ｌ、窒素約３５０ｍｇ／Ｌ、窒素約４００ｍｇ／Ｌ、窒素約４５０ｍｇＬ、窒素約５００ｍｇ／Ｌ、窒素約５５０ｍｇ／Ｌ、窒素約６００ｍｇ／Ｌ、窒素約６５０ｍｇ／Ｌ、窒素約７００ｍｇ／Ｌ、窒素約７１０ｍｇ／Ｌ、窒素約７２０ｍｇ／Ｌ、窒素約７３０ｍｇ／Ｌ、窒素約７３２ｍｇ／Ｌ、窒素約７４０ｍｇ／Ｌ、窒素約７５０ｍｇ／Ｌ、窒素約８００ｍｇ／Ｌ、窒素約８１０ｍｇ／Ｌ、窒素約８１３ｍｇ／Ｌ、窒素約８２０ｍｇ／Ｌ、窒素約８３０ｍｇ／Ｌ、窒素約８５０ｍｇ／Ｌ、窒素約９００ｍｇ／Ｌ、窒素約９５０ｍｇ／Ｌ、窒素約１０００ｍｇ／Ｌ、窒素約１５００ｍｇ／Ｌおよび窒素約１７００ｍｇ／Ｌからなる群より選択することができる。

さまざまな例示的実施形態において、本明細書中のいずれかの実施形態のジュースは、培地中で約５％〜約１００％の範囲の％濃度を有することができる。さらなる例示的な実施形態において、培地中のジュースの％濃度は、約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約８０％、約９０％および約１００％からなる群より選択される％濃度であってもよい。さらなる例示的な実施形態において、培地中のジュースの％濃度は、約５％〜約７０％の範囲の％濃度であり得る。さらなる例示的な実施形態において、培地中のジュースの％濃度は、約１０％〜約５０％の範囲の％濃度であり得る。さらなる例示的な実施形態において、培地中のジュースの％濃度は、１０％、２５％および５０％からなる群より選択される％濃度であってもよい。

さまざまな例示的実施形態において、本明細書中のいずれかの実施形態のジュースは、発酵していてもよい。さまざまな例示的実施形態において、本明細書中のいずれかの実施形態のジュースは、蒸気滅菌または低温殺菌によって滅菌することができる。さらなる例示的な実施形態において、ジュースは、低温殺菌によって滅菌することができる。

さらなる例示的な実施形態において、本明細書中のいずれかの実施形態のジュースは、有機認証済でもよい。

さらなる例示的な実施形態において、本明細書中のいずれかの実施形態の培地のｐＨは、約３、約４、約５、約６、約７、約８、および約９からなる群より選択することができる。さらなる例示的な実施形態において、上記のいずれの実施形態の培地のｐＨも約３〜約８、約３〜約７、約４〜約７、約５〜約８、約６〜約７、または約６〜約８、または約８〜約９の範囲とすることができる。さらなる例示的な実施形態において、培地のｐＨは、約５．２、約５．５、約５．８、約６．２、約６．５、約６．８、約７．２、約７．５、約７．８、または約８．０、または約９．０とすることができる。

さらなる例示的な実施形態において、本明細書中のいずれかの実施形態の培地は、化学添加物および保存料を含まなくてもよい。

本明細書で使用する場合、「化学添加物」または「化学保存料」は、有機認証済の物質以外の任意の物質であって、（ｉ）自然界には存在しない、または化学もしくは工業プロセスによって合成もしくは抽出された天然物質であり、（ｉｉ）何らかの方法でまたは工業プロセスの副産物として、藻類培地、培養液もしくはバイオマス、またはこれらの任意の成分もしくは構成要素に、保存、処理または強化のために直接的または間接的に添加される物質である。化学添加物または保存料の非限定的な例として、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）および他の化学キレート剤、グルタミン酸ナトリウム（ＭＳＧ）、コーンスティープリカー、コーンスティープ固形物、非有機酵母エキス、酢酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硝酸ナトリウム、ゲリセート、ペプトン、トリプトン、カジトン、カゼイン、尿素、ホエー、コーングルテンミール、合成して誘導された硫酸塩および微量元素、硫酸、塩酸、人工海水、および合成法を用いて単離した酵素（酵素の非限定的な例としてはα−アミラーゼ、フルクトフラノシダーゼおよびグルコアミラーゼ、ならびに遺伝子組換え生物から単離された酵素など）が挙げられる。

本明細書で使用する場合、例えば、非ＧＭＯ由来インベルターゼなどの「非ＧＭＯ由来」酵素は、遺伝子組換え生物から単離されていない酵素である。

本明細書で使用する場合、「化学添加物および保存料を含有しない」培地または物質は、化学添加物および／もしくは保存料を使用せずに製造もしくは処理した培地もしくは物質、または製造、増殖、安定化、単離もしくは抽出のために化学添加物もしくは保存料を添加しなかった培地もしくは物質を含む。このような培地として、例えば、非ＧＭＯ由来インベルターゼまたは非ＧＭＯ由来インベルターゼで加水分解された糖を含むことができる。

さらなる例示的な実施形態において、本明細書中のいずれかの実施形態の藻類細胞培養液、藻類バイオマス、脂質化合物または組成物は、有機認証済でもよい。

本明細書で使用する場合、「有機認証済」とは、ラベルまたは認証を発行する司法権において権限を有する、任意の政府または政府認可を受けた組織もしくは団体による、製品または物質の有機としての認証またはラベリングを意味する。非限定的な例は、製品または物質が「有機」、「９５％有機」または「１００％有機」であることを認証する、米国農務省の権限下で発行される認証である。本明細書で使用する場合、「非有機」は、有機認証を受けていない任意の物質または製品を意味する。

上記の実施形態の培地は、当技術分野において知られている技法を用いて調製することができる。培地を調製する上で、本明細書で「ジュース」として記載されているジュースはいずれも使用できる。果実および野菜ジュースは、多種多様な糖、ビタミン、植物性栄養素、顔料、植物ホルモン、アミノ酸およびミネラルを含有する。したがって、果実および野菜ジュースは、藻類用合成培養培地中に普通に存在するすべての構成成分を含有する。

代表的な一実施形態において、トマトジュースを使用する。トマトジュースは比較的安価なため、藻類および関連の化合物、組成物および製品の経済的大規模製造に向いている。このような特性のためにトマトジュースは、化学物質を含まない微細藻類の培養にあたって代表的に選ばれる。別の代表的な実施形態において、有機認証済のトマトジュースを使用して培地を調製してもよい。得られた藻類バイオマスは、ＮＯＰ（有機）基準を満たすはずである。

別の代表的な実施形態において、自然発酵したビートジュースを使用して培地を調製してもよい。

本明細書中のいずれかの実施形態のジュースは、例えば、１種または複数種の果実または野菜を搾って調製してもよい。調製されたジュースは、全内容が参照により本明細書に組み込まれる非特許文献１に記載の、当技術分野で周知の技法にしたがって滅菌される。

本明細書に定義する、「滅菌処理（sterilization）」、「滅菌済（sterilized）」または「無菌（sterile）」は、藻類と競合して増殖することができなくなるレベルまでバイオバーデンを低減または除去するプロセスを意味する。非限定的な例として、低温殺菌、高静水圧、蒸気滅菌およびパルス電場、および他の当技術分野において知られており、非特許文献１に記載されている技法が挙げられる。

さまざまな代表的な実施形態において、本明細書中のいずれかの実施形態のジュースは、約５０℃、約５５℃、約６０℃、約６５℃、約７０℃、約７５℃、約８０℃、約８５℃、約９０℃、約９５℃および約１００℃からなる群より選択される温度で低温殺菌することができる。

代表的な一実施形態において、低温殺菌したジュースを培地処方に直接使用してもよい。別の代表的な実施形態において、ジュースは、例えば、乳酸を生成する細菌または酵母を使用してあらかじめ自然発酵させてから低温殺菌してバイオバーデンを低減してもよい。酵母または細菌をジュースに添加し、容器を密封して発酵を開始する。ジュースの発酵は、不要なまたは有害な副産物および腐敗物を回避するために厳しく制御する。最終生成物の品質は、発酵培地に使用した果実の特定組成物およびジュースを発酵するために選択した酵母または細菌の菌株の特性によって決まる。代表的な一実施形態において、外部から他の成長因子、肥料、化学試薬または栄養素を与えずに最小限に加工されたジュース中で発酵を実施する。別の代表的な実施形態において、培地は滅菌した糖および／または滅菌した食塩源を添加して、藻類の増殖を促進させる。

酸素源も培地に添加する。代表的な一実施形態において、培地は、オゾン化淡水または紫外線殺菌した海水と混合してもよい。オゾン化および紫外線殺菌は、当技術分野において周知の技法にしたがって実施することができ、これらは、例えば、全内容が参照により本明細書に組み込まれる、非特許文献２および非特許文献３に開示されている。

当技術分野において知られる技法によって培地を滅菌することができる。例示的な一実施形態において、先ず、当技術分野において知られ、非特許文献１に記載の１つ以上の滅菌法にしたがって、ジュース、糖および食塩源など、培地の個々の成分を個別に滅菌し、次いで無菌条件下で合わせて無菌培地を生成することができる。別の例示的な実施形態において、ジュース、糖および食塩源など、培地の個々の滅菌していない成分を最初に合わせてから得られる培地を、当技術分野において知られ、非特許文献１に記載の１つ以上の技法にしたがって滅菌してもよい。

次いで、この基礎ジュース培地を藻類の培養に使用することができる。藻類は、当技術分野において周知の技法にしたがって培養することができる。代表的な一実施形態において、藻類を無菌の発酵容器中で培養して、バイオマスまたは細胞培養液が得られる。発酵中は培養藻類に通気して、ミトコンドリア呼吸を促す。

次いで、得られた藻類細胞培養液または藻類バイオマスを回収し、当技術分野において周知の技法にしたがって保存することができる（例えば、全内容が本明細書に組み込まれる非特許文献４を参照）。

別の代表的な実施形態において、得られた藻類は、脂質組成物および化合物を回収するために使用することができる。こうした化合物および組成物を藻類から抽出するための方法は当技術分野において周知である。いくつかの例示的な実施形態において、脂質化合物および組成物を、湿潤藻類バイオマス（１０％超の水分を有する藻類ペーストまたは培養藻類）または乾燥藻類バイオマス（１０％超の水分を有する藻類ペーストまたは培養藻類）から取り出すための方法が用いられる。限定されるものではないが、その方法は、機械的、化学的、超臨界的または生理学的であり得る。

代表的な一実施形態において、脂質化合物および組成物を抽出するために化学溶媒を使用してもよい。化学溶媒は、安価であり、揮発性（後に除去が容易）であり、毒性または反応性の不純物を含まず（脂質との反応が回避でき）、水により二相系を形成でき（非脂質を除去することが可能）、不要な成分（例えば、プロテオリピドタンパク質および小分子など）を抽出しにくい。このような溶媒は、脂質を分解せずに、脂質と他の非脂質細胞成分との間の結合を切断することによって、脂質化合物の抽出を促進させる。代表的な一実施形態において、藻類細胞を有機溶媒で繰り返し洗浄することによって、脂質化合物および組成物を藻類バイオマスから分離することができる。限定されるものではないがそのような有機溶媒として、ヘキサン、エタノールまたはメタノールが挙げられる。

さらなる代表的な実施形態において、超臨界流体を溶媒として使用して脂質化合物を抽出することを含む超臨界流体抽出法によって、脂質化合物および組成物を藻類から抽出することができる。超臨界抽出に使用する溶媒の非限定的な例には、中程度の臨界温度および圧力（３１．３℃、７２．９ａｔｍ）を有する二酸化炭素がある。臨界温度および圧力を超えて上昇すると、ＣＯ_２はガスの輸送特性を維持したまま、液体の溶媒特性を得ることができる。脂質化合物は、この超臨界流体中に抽出される。超流体を大気圧に戻すと、溶媒は蒸気の形態になるため脂質化合物中には残留物が一切残らない。超臨界流体／ＣＯ_２抽出を行う際、ＣＯ_２は加圧下で液化され、液体と気体の両方の特徴を有する所まで加熱される。次いで、この液化ガスは、油を抽出する時に溶媒としてふるまう。このプロセスは、油またはその成分の熱分解の軽減（油の色が薄い）、溶媒を含まない油、および選択的に一部の成分に富んだ油など、溶媒抽出法に優る利点を有することができる。超臨界流体抽出法は、ほぼ１００％の脂質を抽出できる。超臨界抽出法は、従来の溶媒抽出法と比べると高価な方法である。製品の価値が高く、量が少なければ、超臨界抽出法は理にかなったものであり得る。超臨界ＣＯ_２法もまた、油を藻類バイオマスから抽出する時に合成化学物質を利用しないという利点がある。得られた脂質は、本明細書に記載のジュースベース培地をその製造に使用する場合、化学添加物を含まないと考えることができる。

別の代表的な実施形態において、脂質化合物および組成物は、物理的に藻類膜を破壊して脂質化合物および組成物を放出させる機械的油抽出法によって抽出することができる。機械的油抽出法の非限定的な例として、加圧、ミリング、均一化および超音波補助抽出法（キャビテーション）が挙げられる。

別の代表的な実施形態において、脂質化合物および組成物は、藻類細胞の生理的完全性を乱すことによる生理的油抽出法によって抽出できる。非限定的な例として、細胞膜の酵素分解および浸透圧ショックが挙げられ、これらの方法は、細胞壁の膜を破壊して脂質化合物を放出させる。浸透圧ショックは、培養培地の浸透圧を急激に低下させて細胞壁の溶解を誘導する。

別の例示的な実施形態において、超音波補助抽出法を用いて抽出することができる。超音波抽出は、抽出プロセスを大幅に加速することができる。超音波反応器を使用して、超音波によって溶媒物質中にキャビテーション気泡を作る。これらの気泡が細胞壁近くで割れると、衝撃波および液体ジェットが作られ、これらが細胞壁を破壊し、その内容物が放出される。超音波化学分解は、高エネルギー分子を誘導する最も効果的な方法の１つである。超音波化学分解は、超音波照射を用いて、音響キャビテーションを形成する、すなわち液体中の気泡の形成、成長、および爆縮崩壊（implosive collapse）を行う。音響キャビテーションは、局所的に５０００Ｋおよび１０００ａｔｍの条件を作る。キャビテーションプロセス中は、加熱速度および冷却速度は１０^９Ｋ／Ｈｚを超え、４００ｋｍ／ｈｒの液体ジェット流が発生する。

機械的破砕、溶媒抽出および超臨界流体による抽出では、処理前に藻類バイオマスを先ず、水分が低率（１０％未満）になるまで乾燥させることが必要となる。酵素および浸透圧による細胞破壊など、他の方法では、予備乾燥の工程を必要としないこともある。

代表的な一実施形態において、藻類バイオマスを凍結乾燥したのち脂質化合物および組成物を溶媒抽出する。凍結プロセスとは材料を凍結させることである。研究室では、この凍結プロセスは、材料を凍結乾燥用フラスコに入れ、機械冷凍、ドライアイスとメタノール、または液体窒素によって冷却するシェルフリーザーと呼ばれる槽の中でこのフラスコ回転させることによって行なわれることが多い。大規模の場合、通常、市販の凍結乾燥機を使用して凍結する。この工程では、材料をその固相および液相が共存する最低温度である共融点より低い温度まで冷却することが重要である。そのため、後続する工程では融解ではなく昇華が確実に起こる。大きな結晶はより凍結乾燥しやすい。大きな結晶を生成するには、生成物をゆっくり凍結させる必要がある、または温度を繰り返し上下させてもよい。この繰り返しのプロセスをアニーリングと呼ぶ。しかし、食品、または元が生体細胞であった物体の場合、大きな氷晶が細胞壁を破壊する。Ｃｌａｒｅｎｃｅ Ｂｉｒｄｓｅｙｅが発見したように、食品は−４０℃から−４５℃以下で凍結すると、よりおいしくなる。通常、凍結温度は−５０℃から−８０℃の間である。次いで、凍結乾燥した藻類を、より極性の溶媒に徐々に晒していき、存在する脂質を完全に分留する。

別の実施形態において、亜臨界水抽出法を果実ジュース溶媒に使用して、抽出プロセスの間、ＰＵＦＡを安定化することができる。

ジュースの窒素含量
第一級アミノ基の窒素（Ｌ−アルギニンおよびグルタミン酸を含む）、尿素およびアンモニアなどの生物学的に利用可能な総窒素量は、Ｋ−ＰＡＮＯＰＡ、Ｋ−ＬａｒｇｅおよびＫ−Ｇｌｕｔ生化学キット（Ｍｅｇａｚｙｍｅ、アイルランド）を使用して測定した。有機認証済のビートジュースの発酵物、トマトジュース、有機認証済のにんじんジュース、有機認証済のりんごジュース、およびココナッツォーターの５種のジュースを試験した。各ジュースは、低温殺菌し、１０％濃度（ｖｏｌ／ｖｏｌ）に希釈してから試験した。測定値は１００％ジュースの値に換算した。

試験した低温殺菌ジュースは、種々の窒素プロファイルを有する。ビートジュース、トマトジュースおよびにんじんジュースは、生物学的に利用可能な総窒素量が最も高かった。りんごジュースおよびココナッツォーターは、生物学的に利用可能な総窒素量が最も低かった。

ｐＨを調節していない、海水を含有するジュース培地におけるのオーランチオキトリウム・リマシナムの増殖
オーランチオキトリウム・リマシナムを、ｐＨを調節していないジュース培地中で増殖させた。（藻類の播種および培養の両方を使用目的とした）合計１５個の培地を、以下の各ジュース濃度となるように調製した：（１）１０％濃度の有機認証済のビートジュース、（２）２５％濃度の有機認証済のビートジュース、（３）５０％濃度の有機認証済のビートジュース、（４）１０％濃度の有機認証済のりんごジュース、（５）２５％濃度の有機認証済のりんごジュース、（６）５０％濃度の有機認証済のりんごジュース、（７）１０％濃度のトマトジュース、（８）２５％濃度のトマトジュース、（９）５０％濃度のトマトジュース、（１０）１０％濃度のココナッツォーター、（１１）２５％濃度のココナッツォーター、（１２）５０％濃度のココナッツォーター、（１３）１０％濃度の有機認証済のにんじんジュース、（１４）２５％濃度の有機認証済のにんじんジュース、および（１５）５０％濃度の有機認証済のにんじんジュース。各培地は、塩分濃度が１２．７ｐｐｔとなるように海水をさらに含有していた。培地を低温殺菌法によって滅菌した。

結果を図１に示す。ジュースのｐＨを調節しなかったとき、トマト、ビートおよびにんじんのジュースそれぞれを含有する培地からは、りんごおよびココナッツォーターそれぞれを含有する培地と比べて、より多くのバイオマスが得られた。さらに、トマトジュースベース培地中で増殖させた藻類が２２時間後に最高密度に達したのに対し、ココナッツォーターベース培地中で増殖させた藻類は、最高密度に達するのに１３７時間かかり、最も時間を要した。

海水を含有し、ｐＨを６．８に調節したジュース培地におけるオーランチオキトリウム・リマシナムの増殖
オーランチオキトリウム・リマシナムを、ｐＨを６．８に調節したジュース培地で増殖させた。（藻類の播種および培養の両方を使用目的とした）合計１５個の培地を、以下の各ジュース濃度となるように調製した：（１）１０％濃度の有機認証済のビートジュース、（２）２５％濃度の有機認証済のビートジュース、（３）５０％濃度の有機認証済のビートジュース、（４）１０％濃度の有機認証済のりんごジュース、（５）２５％濃度の有機認証済のりんごジュース、（６）５０％濃度の有機認証済のりんごジュース、（７）１０％濃度のトマトジュース、（８）２５％濃度のトマトジュース、（９）５０％濃度のトマトジュース、（１０）１０％濃度のココナッツォーター、（１１）２５％濃度のココナッツォーター、（１２）５０％濃度のココナッツォーター、（１３）１０％濃度の有機認証済のにんじんジュース、（１４）２５％濃度の有機認証済のにんじんジュース、および（１５）５０％濃度の有機認証済のにんじんジュース。各培地は、塩分濃度が１２．７ｐｐｔとなるのに十分な海水をさらに含有していた。培地を低温殺菌法によって滅菌した。

結果を図２に示す。ｐＨ６．８では、５０％濃度のトマトジュースおよび２５％濃度のビートジュースそれぞれを含有する培地から、最も多くの藻類バイオマスが得られた。細胞増殖速度が最も速かったのはトマトジュースベース培地で、最高密度に達するまでの時間が２２時間であった。トマトジュースには、天然のグルタミン酸が最も多く含有されており、増殖速度を高める一因となった可能性がある。ココナッツォーターおよびりんごジュースベース培地から得られたバイオマスは最も少量であった。ｐＨがグルタミン酸の解離速度に影響を及ぼすことがあり、特にグルタミン酸の形態の場合、生物学的に利用できる窒素量に影響を及ぼしうることが報告されている（非特許文献５）。ｐＨが高いほど、生物学的に利用可能なグルタミン酸の量が増えるため、いずれの培地処方、とりわけグルタミン酸濃度の高いトマトおよびビートジュースベース培地などでは、得られるバイオマス量が増加する。

ブドウ糖を添加したジュース培地におけるオーランチオキトリウム・リマシナムの増殖
オーランチオキトリウム・リマシナムを、ブドウ糖を添加したジュース培地で増殖させた。（藻類の播種および培養の両方を使用目的とした）合計５種の培地を、以下の各ジュース濃度となるように調製した：（１）２５％濃度の有機認証済のビートジュース、（２）５０％濃度のトマトジュース、（３）５０％濃度の有機認証済のにんじんジュース、（４）５０％濃度の有機認証済のりんごジュース、および（５）５０％濃度のココナッツォーター。各培地は、６％濃度になるようにブドウ糖を添加した。培地を低温殺菌法によって滅菌した。

結果を図３に示す。トマトジュース５０％、ビートジュース２５％、およびにんじんジュース５０％濃度で含有する培地中でオーランチオキトリウム・リマシナム細胞を増殖させた場合に、最も多量のバイオマス（それぞれ９．０Ｅ＋０７、９．８３Ｅ＋０７および６．８８Ｅ＋０７のバイオマス）が得られた。一方、ココナッツォーターおよびりんごジュースそれぞれを含有する培地中で藻類細胞を増殖させた場合、最も少量のバイオマス（それぞれ４．２３Ｅ＋０７および４．２８Ｅ＋０６のバイオマス）が得られた。５０％トマトジュースを含有し、ブドウ糖を添加した培地中でオーランチオキトリウム・リマシナムを増殖させた場合に、最も速く、増殖から５０時間後に最高密度に達した。

ジュース培地で増殖させた培養オーランチオキトリウム・リマシナムにおけるＤＨＡ収率
オーランチオキトリウム・リマシナムを、さまざまなジュース培地中で増殖させた。（藻類の播種および培養の両方を使用目的とした）合計１５種の培地を、以下の各ジュース濃度となるように調製した：（１）１０％濃度の有機認証済のビートジュース、（２）２５％濃度の有機認証済のビートジュース、（３）５０％濃度の有機認証済のビートジュース、（４）１０％濃度の有機認証済のりんごジュース、（５）２５％濃度の有機認証済のりんごジュース、（６）５０％濃度の有機認証済のりんごジュース、（７）１０％濃度のトマトジュース、（８）２５％濃度のトマトジュース、（９）５０％濃度のトマトジュース、（１０）１０％濃度のココナッツォーター、（１１）２５％濃度のココナッツォーター、（１２）５０％濃度のココナッツォーター、（１３）１０％濃度の有機認証済のにんじんジュース、（１４）２５％濃度の有機認証済のにんじんジュース、および（１５）５０％濃度の有機認証済のにんじんジュース。各培地は、塩分濃度が１２．７ｐｐｔとなるように海水をさらに含有し、濃度６％となるように有機認証済のブドウ糖が添加されている。培地を低温殺菌法によって滅菌した。

藻類細胞を真空濾過によって乾燥し、サンプルをその状態でエステル交換に付した。ＤＨＡの定量には、ガスクロマトグラフィーを用い、内部標準および外部標準との比較によって求めた。

結果を図４に示す。培地ｍＬ当たりのＤＨＡ収率が最も高かったのは、有機認証済のブドウ糖を添加した、５０％濃度のトマトジュース含有培地および５０％濃度のビートジュース含有培地であり、それぞれＤＨＡ５．０ｍｇ／ジュース培地（Ｌ）およびＤＨＡ４．４ｍｇ／ジュース培地（Ｌ）であった。

ジュース培地で増殖させたオーランチオキトリウム・リマシナムにおけるＥＰＡ収率
オーランチオキトリウム・リマシナムを、さまざまなジュース培地中で増殖させた。（藻類の播種および培養の両方を使用目的とした）合計１５種の培地を、以下の各ジュース濃度となるように調製した：（１）１０％濃度の有機認証済のビートジュース、（２）２５％濃度の有機認証済のビートジュース、（３）５０％濃度の有機認証済のビートジュース、（４）１０％濃度の有機認証済のりんごジュース、（５）２５％濃度の有機認証済のりんごジュース、（６）５０％濃度の有機認証済のりんごジュース、（７）１０％濃度のトマトジュース、（８）２５％濃度のトマトジュース、（９）５０％濃度のトマトジュース、（１０）１０％濃度のココナッツォーター、（１１）２５％濃度のココナッツォーター、（１２）５０％濃度のココナッツォーター、（１３）１０％濃度の有機認証済のにんじんジュース、（１４）２５％濃度の有機認証済のにんじんジュース、および（１５）５０％濃度の有機認証済のにんじんジュース。各培地は、塩分濃度が１２．７ｐｐｔとなるように海水をさらに含有し、濃度６％となるように有機認証済のブドウ糖が添加されている。培地を低温殺菌法によって滅菌した。

藻類細胞を真空濾過によって乾燥し、サンプルをその状態でエステル交換に付した。ＥＰＡの定量には、ガスクロマトグラフィーを用い、内部標準および外部標準との比較によって求めた。

結果を図５に示す。培地ｍＬ当たりのＥＰＡ収率が最も高かったのは、有機認証済のブドウ糖を添加した、５０％濃度のトマトジュース含有培地および５０％濃度のビートジュース含有培地であった。

ジュース培地中で増殖させたオーランチオキトリウム・リマシナムにおけるＤＰＡ収率
オーランチオキトリウム・リマシナムを、さまざまなジュース培地中で増殖させた。（藻類の播種および培養の両方を使用目的とした）合計１５種の培地を、以下の各ジュース濃度となるように調製した：（１）１０％濃度の有機認証済のビートジュース、（２）２５％濃度の有機認証済のビートジュース、（３）５０％濃度の有機認証済のビートジュース、（４）１０％濃度の有機認証済のりんごジュース、（５）２５％濃度の有機認証済のりんごジュース、（６）５０％濃度の有機認証済のりんごジュース、（７）１０％濃度のトマトジュース、（８）２５％濃度のトマトジュース、（９）５０％濃度のトマトジュース、（１０）１０％濃度のココナッツォーター、（１１）２５％濃度のココナッツォーター、（１２）５０％濃度のココナッツォーター、（１３）１０％濃度の有機認証済のにんじんジュース、（１４）２５％濃度の有機認証済のにんじんジュース、および（１５）５０％濃度の有機認証済のにんじんジュース。各培地は、塩分濃度が１２．７ｐｐｔとなるように海水をさらに含有し、濃度６％となるように有機認証済のブドウ糖を添加されている。培地を低温殺菌法によって滅菌した。

藻類細胞を真空濾過によって乾燥し、サンプルをその状態でエステル交換に付した。ＤＰＡの定量化には、ガスクロマトグラフィーを用い、内部標準および外部標準との比較によって求めた。

結果を図６に示す。培地ｍＬ当たりのＤＰＡ収率が最も高かったのは、有機認証済のブドウ糖を添加した、５０％濃度のトマトジュース含有培地および５０％濃度のビートジュース含有培地であった。

ビートジュース培地におけるナンノクロロプシス・オクラタの増殖
ナンノクロロプシス・オクラタを、ビートジュース培地で増殖させた。１×１０^６個のナンノクロロプシス・オクラタ細胞を、以下の各培地に播種し、培養した：（１）Ｆ／２培地（市販の標準合成培地）、（２）（ｐＨを７．６に調節し、海水で塩分濃度を２５ｐｐｔに調節した）自然発酵ビートジュース、（３）（ｐＨを７．６に調節し、海水で塩分濃度を２５ｐｐｔに調節した）３０ｍＭブドウ糖を添加した自然発酵ビートジュース、および（４）（ｐＨを７．６に調節し、海水で塩分濃度を２５ｐｐｔに調節した）３０ｍＭエタノールを添加した自然発酵ビートジュース。ビートジュース培地を低温殺菌法によって滅菌した。細胞を２２℃にて１６０ｒｐｍで振盪させながら５日間インキュベートした。

結果を図７に示す。ビートジュース培地で増殖させたナンノクロロプシス・オクラタ細胞からは、市販のＦ／２培地で増殖させたナンノクロロプシス・オクラタ細胞よりも多くのバイオマスが得られた。

ビート糖蜜培地におけるスキゾキトリウム・リマシナムの増殖
スキゾキトリウム・リマシナムを、ビート糖蜜培地で増殖させた。１×１０^６個のスキゾキトリウム・リマシナム細胞を、以下の各培地中に播種し、培養した：（１）６％ブドウ糖を添加した発酵ビートジュース（「ＢＪ」）、（２）６％ブドウ糖を添加した、有機認証済の８．４％ビート糖蜜（「ＢＭ」）、および（３）酵素インベルターゼで加水分解した、有機認証済の８．４％ビート糖蜜（「ＢＭ−Ｈ」）。培地を低温殺菌法または濾過法によって滅菌した。窒素含有量を等しくするために、ビートジュースおよびビート糖蜜の処方を調整した。細胞を２２℃にて２００ｒｐｍで振盪させながら５日間インキュベートした。

結果を図８に示す。有機認証済のビート糖蜜培地でスキゾキトリウム・リマシナムを増殖することができた。いずれのビート培地の窒素量もスキゾキトリウム・リマシナムの増殖には十分であったが、６％ブドウ糖を添加したビート糖蜜培地（ＢＭ）では、スキゾキトリウム・リマシナムの増殖はいくぶんか阻害された。ビート糖蜜の糖含有量が既に高いため、追加された糖がスキゾキトリウム・リマシナムの増殖を阻害した可能性がある。スキゾキトリウム・リマシナムは、ビート糖蜜の主要成分であるショ糖を利用することがでない。そこでビート糖蜜中のショ糖が果糖とグルコースに変換されるように、ショ糖を加水分解することによる効果を検証した。果糖およびグルコースは、スキゾキトリウム・リマシナムの代謝において生物学的に利用可能な形態の糖である。この場合、加水分解されたビート糖蜜培地（ＢＭ−Ｈ）は、ブドウ糖の添加を必要としないと思われる。加水分解されたビート糖蜜培地（ＢＭ−Ｈ）では、６％ブドウ糖を添加した自然発酵ビートジュース培地（ＢＪ）に遜色なくスキゾキトリウム・リマシナムが増殖できた。ビートジュースもショ糖を含有するため、スキゾキトリウム・リマシナムの増殖に寄与させるために加水分解してもよい。

ブドウ糖および果糖を得るための、ビートジュースおよびビート糖蜜の加水分解
１０％ビート糖蜜、２０％ビート糖蜜および１００％ビートジュースそれぞれを含有する溶液（低温殺菌（９５℃）、ｐＨ３．７）を、食品等級有機酸を使用してｐＨ４．５に調節し、パン酵母（Ｓｉｇｍａ−Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．）由来のインベルターゼで無菌条件下にて処理した。得られた溶液をＫ−ＳＵＦＲＧキット（Ｍｅｇａｚｙｍｅ、アイルランド）を用いて分析し、酵素処理の前と後における各処方中のショ糖、果糖およびグルコースの濃度を決定した。サンプルに標準グルコース、標準果糖および標準ショ糖を添加して濃度を上げた。溶液を５５℃で２４時間インキュベートした。結果を表１０に示す。

１０％ビート糖蜜溶液、２０％ビート糖蜜溶液および１００％ビートジュースにおける加水分解効率は、それぞれ７７％、７８％および８７％であった。

ビート糖蜜培地で増殖させたオーランチオキトリウム・リマシナムにおけるＤＨＡ収率
スキゾキトリウム・リマシナムを、ビート糖蜜培地で増殖させた。１×１０^６個のスキゾキトリウム・リマシナム細胞を、以下の各培地中に播種し、培養した：（１）市販の基礎培地（３％ブドウ糖、１％酵母エキスおよび海水）、（２）６％ブドウ糖を添加した発酵ビートジュース、（３）６％ブドウ糖を添加した８．４％ビート糖蜜、および（４）酵素インベルターゼで加水分解した８．４％ビート糖蜜。培地を低温殺菌法または濾過法によって滅菌した。窒素含有量を等しくするために、ビートジュースおよびビート糖蜜の処方を調整した。細胞を２２℃にて２００ｒｐｍで振盪させながら５日間インキュベートした。各培地で１２０時間増殖させた後に、同等数の細胞（２×１０^８個の細胞）を含有する培養を一定量回収した。培養サンプルを凍結乾燥し、標準方法を用いたガスクロマトグラフィーにより、ＤＨＡ含有量を求めた。

結果を表１１に示す。

インベルターゼで加水分解した糖蜜培地でスキゾキトリウム・リマシナムを増殖することができ、加水分解糖蜜培地では市販の基礎培地と比較して、培地ｍＬ当たりのＤＨＡも多く得られた。

ブドウ糖および酵母エキスを添加したビートジュース培地で増殖させた培養オーランチオキトリウム・リマシナムの増殖性およびこれに由来するＤＨＡの収率

統計的実験計画法を用いて、低温殺菌したビートジュース培地におけるスキゾキトリウム・リマシナムのバイオマスおよびＤＨＡ産生に対する複数の変数の影響を評価した。本研究においては、酵母エキス（ビタミン源）および糖（オメガ−３脂肪酸の生成に必須）の添加が与える複合的影響を評価した。ＤＨＡおよびスキゾキトリウム・リマシナムバイオマスの産生におけるこれら２つの変数の複合的影響を調べるために、２因子の、３水準の一部実施要因計画を実施した。２水準の実施計画では、実際応用ではすぐに大きくなり過ぎてしまうため、変数の数が増えるにつれて、一部実施要因計画に変更した。実験誤差を推定するために、因子を中間点に定めた４つの中心点を含めた。

この計画（表１４）は、市販のソフトウェアであるＤｅｓｉｇｎ Ｅｘｐｅｒｔ Ｍｏｄｄｅ ９．０（Ｓｔａｔ−Ｅａｓｅ Ｉｎｃ．、ＭＮ州ミネアポリス）を使用して、ＲＳＭの原理によって作成した。この計画を実施するために３種の酵母エキス濃度：０．１％、０．５５％および１％（因子１、Ｘ_１）を評価した。さらに３種の糖濃度：ブドウ糖２％、４％および６％（因子２、Ｘ_２）を評価した。モニタリングした応答は、バイオマス（ＣＦＵ／ｍＬ、Ｙ_１）およびＤＨＡ含有量（ＤＨＡ（ｍｇ）／２×１０^８個の細胞、Ｙ_２）であった。パレート図を使用し、実験値（Ｙ_１、Ｙ_２）に基づき、モデル係数を推定し、この係数から変数の効果または各応答に与える変数の影響の大きさを推定した。３つのモデルの不適合度も統計的に求めた。

ＤＨＡ含有量（ＤＨＡ（ｍｇ）／２×１０^８個の細胞、Ｙ_２）を、細胞増殖４８時間目、７２時間目および９６時間目にモニタリングした（表１３）。９６時間の時点で得られた値が、ＤＨＡの産生に最も有意であることが見出された。したがって、応答曲面法を用いて、９６時間に得た実験データをさらに評価した。ＡＮＯＶＡ分析に基づくと、モデル（ＤＨＡ）のＦ値が１１３．４７であることは、このモデルが有意であることを示唆している。また、不適合度値が０．３１８４であることも、純誤差に対する不適合度が有意でないことを示唆する。さらに「予測Ｒ二乗（Pred R-Squared）」が０．８７であることは、「調整済Ｒ二乗（Adj R-Squared）」が０．９８であることと適正に一致していた。ＡＮＯＶＡ分析に基づき、モデルの個々の項それぞれについての確率値を得、その結果、ブドウ糖の濃度（ｐ値（Prob>F）、＜０．０００１）および酵母エキスの濃度（ｐ値、０．００２７）の両方の因子は、細胞のＤＨＡ含有量に有意に影響を及ぼしたことが観測された。パレート式の効果図（図９）は、これらの最大のものから最小のものまでの順序予測値（ordered estimate）をグラフに表したものである。図９は、ＤＨＡ含有量が酵母エキスの添加およびブドウ糖の添加の両方によって正の影響を受けることを示している。最も有意な因子は、寄与率（contribution）８４．０１％のブドウ糖濃度であり、これに対し、酵母エキス濃度の寄与率は１２．８５％である。これは、ブドウ糖炭素鎖が、ＤＨＡを生成する構成ブロックとして必須と考えられるため、予測されていたことである。

９６時間の時点で、細胞は非常に後期の定常期にあるため、７２時間の時点のデータの方が、バイオマスに与える２つの因子の影響を評価する上でより適切であると判断した。バイオマス（ＣＦＵ／ｍＬ、Ｙ_１）のデータに対する適合モデルのＡＮＯＶＡ分析に基づくと、モデルＦ値が１８．０であることは、このモデルが有意であることを示唆している。また、不適合度値が０．７９７５であることは、純誤差に対する不適合度が有意でないことを示唆する。「予測Ｒ二乗」が０．８５であることは、「修正済みＲ二乗」が０．８８であることと適正に一致していた。ＡＮＯＶＡ分析およびパレート図から、バイオマスがブドウ糖濃度によって有意に負の影響を受けることが観測された（寄与率４３．７２％）。酵母エキスは、バイオマスに対し有意な影響はなかった（寄与率２．４７％）。しかし、ブドウ糖と酵母エキス濃度の相互作用は、バイオマスに対し有意な負の影響を示した（寄与率４６．９１％）。これは、高濃度の糖がスキゾキトリウム・リマシナムの増殖を阻害し得るとの報告から予測されていたことである。

細胞によって合成されたＤＨＡとバイオマスとの間の相関性も調査した。０．８５％を超える負の相関がみられた。観察された結果をまとめると、天然ビートジュースに酵母エキスおよびブドウ糖を添加して、スキゾキトリウム・リマシナムによるＤＨＡ収率を大きく増加させることができる。試験した濃度において、ブドウ糖濃度は、細胞当たりのＤＨＡ含有量に最も大きな正の影響を与え、細胞バイオマスには負の影響をもたらす。

ビート糖蜜および他のジュースの窒素含量
第一級アミノ基の窒素（Ｌ−アルギニンおよびグルタミン酸を含む）、尿素およびアンモニアなどの生物学的に利用可能な窒素の総量を、Ｋ−ＰＡＮＯＰＡ、Ｋ−ＬａｒｇｅおよびＫ−Ｇｌｕｔ生化学キット（Ｍｅｇａｚｙｍｅ、アイルランド）を使用して測定した。ビート糖蜜を試験した。サンプルを１０％濃度（ｖｏｌ／ｖｏｌ）に希釈してから試験した。測定値は１００％ジュースの値に換算した。結果を表１５にまとめる。

ビート糖蜜は、窒素量が２９９０ｍｇ／Ｌを超える、高濃度の生物学的に利用可能な窒素を有する。

ジュースベース培地で藻類を増殖させることによる、脂肪酸の安定性の改善
スキゾキトリウム・リマシナムを、トマトジュースベース培地に播種した。等容積の培養液を遠心分離にかけ、培地をデカントした。得られた藻類ペレットを、それぞれ個別にビートジュース、にんじんジュース、ブルーベリージュースまたは水中に９：１の比率で懸濁させた。各混合物のサンプル約０．８ｇを試験して開始時のＤＨＡ濃度を求めた。新たにサンプル約０．８ｇを等量に分配し、それぞれを１．５ｍＬ管に密封し、次いで最長６日間、６０℃で加熱した。ＦＡＭＥのガスクロマトグラフィーによってＤＨＡレベルを定量した。結果を表１６にまとめる。

水に懸濁させた藻類サンプルに含まれるＤＨＡは、さまざまなジュースに懸濁させた藻類サンプルに含まれるＤＨＡと比較して、６日後には酸化度が非常に高い（開始ＤＨＡ含有量の約７３．３％が酸化した）ことが観測された。ビートジュースは、最も高い保護効果を示し、６０℃で６日間のインキュベーション後に、開始時からわずか１１．５９％のＤＨＡ分子しか酸化されていなかった。ジュースは高濃度の抗酸化防止剤を有し、こうした生物活性物質は、藻類サンプル中のＤＨＡの安定性に寄与したと考えられる。

ジュースベース培地における藻類の安定化
スキゾキトリウム・リマシナムを、基礎培地に播種した。等容積の培養液を遠心分離にかけ、培地をデカントした。得られた藻類ペレットを、１：１の比率で水中に均一化し、以下の混合物中にそれぞれ１：１の比率で懸濁させた：（ｉ）にんじんジュース、（ｉｉ）ビートジュース、（ｉｉｉ）ビートジュース＋緑茶エキス、（ｉｖ）ブルーベリージュース、（ｖ）水、（ｖｉ）水＋６％ショ糖（遮光）、または（ｖｉｉ）水＋６％ショ糖＋緑茶エキス。緑茶エキスは、酸化防止性ポリフェノールフラボノイドであるエピガロカテキン没食子酸塩（ＥＧＣＧ）源として添加した。緑茶エキスを添加した水およびビートジュースは、１０００ｐｐｍのＥＧＣＧを含有していた。約０．１グラムのサンプルを等量に分配し、１．５ｍＬ管に密封して、９日間にわたり、３日毎にＤＨＡ含有量を求めた。サンプルは６０℃に維持した。新たに約１グラムのサンプルを等量に分配し、１．５ｍＬ管に密封して、１２日間にわたり、３日毎に混合物の酸化防止活性を求めた。サンプルを６０℃に維持した。ＦＡＭＥのガスクロマトグラフィーによってＤＨＡレベルを定量化し、一方で混合物の酸化防止剤含有量を、ラジカル捕捉活性をパーセンテージで表すＤＰＰＨ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）分析法によって決定した。結果を図１０（ａ）〜（ｂ）および図１１（ａ）〜（ｂ）にまとめる。

藻類ペーストは固有の酸化防止活性を有するが、天然の酸化防止剤に富むジュースの添加および／または緑茶エキスなどの天然酸化防止剤の添加は、酸化促進条件下におけるＤＨＡの安定性を高めた。図１０（ａ）に例示するように、ビートジュース、ビートジュース＋緑茶エキスおよびブルーベリージュースを含む藻類クリーム混合物の酸化防止活性は、１２日間にわたり高温条件下でほとんど低下しなかった。ビートジュース、ビートジュース＋緑茶エキスおよびブルーベリージュース混合物における酸化防止活性の低下率は、それぞれたった１２．６％、６．８％および３．１％であった。藻類クリームとにんじんジュースとの混合物でみられた低下率は、他のジュースと比べて高かった（５６．７４％）が、図１１（ａ）のサンプルのＤＨＡ含有量を見ると、９日目に、酸化によるＤＨＡレベルの大きな損失はみられず、これは、にんじんジュース中に残存する酸化防止剤が依然として酸化を防止できたことを示す。対照的に、藻類クリームおよび水または６％ショ糖を含有する水を含む対照サンプルは、酸化によるＤＨＡレベルの大きな損失を示した。図１１（ｂ）に例示した水を含む対照サンプルにおける９日目のＤＨＡレベルの低下率は９２．６０％であった。この効果は、藻類ペースト中の天然酸化防止剤のレベルのみでは、酸化促進条件下においてＤＨＡを安定させることはできないという事実に基づくと考えられ、またＤＨＡの安定性におけるジュースの保護効果を際立たせている。図１０（ｂ）に示すように、藻類クリームおよび水またはショ糖を含む水を含有する対照サンプルの酸化防止活性は、７７．０７％および７５．８３％低下した。藻類クリームの存在下において、果実ジュースは、緑茶エキスのみ（損失７４．９％）と比較して優れた酸化防止活性を示すが、緑茶エキスとビートジュースの両方を藻類クリームに添加すると、混合物の酸化防止活性は１２日間にわたって、より安定であることが証明された（損失６．８％）。

藻類クリームおよび果実ジュースに含まれる天然酸化防止剤
スキゾキトリウム・リマシナムを、基礎培地に播種した。等容積の培養液を遠心分離にかけ、培地をデカントした。得られた藻類ペレットを、１：１の比率で水中に均一化し、以下の混合物中にそれぞれ１：１の比率で懸濁させた：（ｉ）にんじんジュース、（ｉｉ）ビートジュース、（ｉｉｉ）ブルーベリージュース、（ｉｖ）水。約１グラムのサンプルを、ラジカル捕捉活性をパーセンテージで表すＤＰＰＨ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）分析法を用いて酸化防止活性について試験した。これらの結果を表１７にまとめる。

藻類クリームは、４４．１２％のラジカル捕捉活性を示し、ジュースを添加することによって、ビートジュース中で藻類クリーム配合物の酸化防止活性は最大９５．６２％まで向上した。

ブルーベリーおよびにんじんジュースによって、ラジカル捕捉活性％はそれぞれ９３．６０および５４．５４まで増加した。

本明細書中、本発明のさまざまな実施形態を開示するが、当業者に共通の一般知識にしたがって、多くの適合および変更を、本発明の範囲内で行なうことが可能である。そのような変更として、実質的に同じ方法で同じ結果を達成するために、本発明の任意の態様に対する既知の同等物による代替が挙げられる。数値範囲は、その範囲を規定する数値を含める。本明細書において、単語「含む（comprising）」は、語句「含む(include)が、限定されない」と実質的に同義の、制約がない用語として用いられ、単語「含む（comprises）」は同等の意味を持つ。本明細書中の参考文献の引用は、これらの参考文献が、本発明に対して従来技術であることを認めるものであると解釈すべきではない。本発明は、実施例および図面に関連する実質的に前述されたすべての実施形態および変形形態を含む。

Claims (89)

1. 培養培地中で藻類を増殖させ、前記培地から藻類バイオマスまたは藻類細胞培養液を回収することを含む、藻類バイオマスまたは藻類細胞培養物の製造方法であって、
   前記培地が、１種または複数種の果実もしくは野菜または果実と野菜の任意の組合せより得られたジュース、酸素源、および窒素を含み、
   前記培地が、滅菌されており、
   前記窒素が、天然由来の窒素からなる、方法。
2. 前記培地に食塩源が添加されている、請求項１に記載の方法。
3. 前記食塩源が海水である、請求項２に記載の方法。
4. 前記海水の塩分濃度が約１０ｐｐｔ〜約３５ｐｐｔの範囲である、請求項３に記載の方法。
5. 前記海水の塩分濃度が約１２．７ｐｐｔである、請求項４に記載の方法。
6. 前記培地に糖が添加されている、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
7. 前記糖が、ブドウ糖または果糖である、請求項６に記載の方法。
8. 前記糖が有機である、請求項７に記載の方法。
9. 前記培地が、ジュース、酸素源、窒素、食塩源および糖からなる、請求項１に記載の方法。
10. 前記培地が、ジュース、酸素源、窒素および食塩源からなる、請求項１に記載の方法。
11. 前記培地が、ジュース、酸素源、窒素および糖からなる、請求項１に記載の方法。
12. 前記糖が、果糖およびブドウ糖からなる群より選択されるものである、請求項９または１１に記載の方法。
13. 前記糖が有機認証済である、請求項１２に記載の方法。
14. 前記食塩源が海水である、請求項９または１０に記載の方法。
15. 前記海水の塩分濃度が約１０ｐｐｔ〜約３５ｐｐｔの範囲である、請求項１４に記載の方法。
16. 前記海水の塩分濃度が約１２．７ｐｐｔである、請求項１５に記載の方法。
17. 培地中で藻類を増殖させ、前記藻類から脂質化合物または組成物を抽出することを含む、１種または複数種の脂質化合物またはそれらの組成物の製造方法であって、
    前記培地が、１種または複数種の果実もしくは野菜または果実と野菜の任意の組合せより得られたジュース、酸素源および窒素を含み、
    前記培地が、滅菌されており、
    前記培地中の窒素が、天然由来の窒素からなる、方法。
18. 前記培地に食塩源が添加されている、請求項１７に記載の方法。
19. 前記食塩源が海水である、請求項１８に記載の方法。
20. 前記海水の塩分濃度が約１０ｐｐｔ〜約３５ｐｐｔの範囲である、請求項１９に記載の方法。
21. 前記海水の塩分濃度が約１２．７ｐｐｔである、請求項２０に記載の方法。
22. 前記培地に糖が添加されている、請求項１７〜２１のいずれか一項に記載の方法。
23. 前記糖が、ブドウ糖または果糖である、請求項２２に記載の方法。
24. 前記糖が有機である、請求項２３に記載の方法。
25. 前記培地が、ジュース、酸素源、窒素、食塩源および糖からなる、請求項１７に記載の方法。
26. 前記培地が、ジュース、酸素源、窒素および食塩源からなる、請求項１７に記載の方法。
27. 前記培地が、ジュース、酸素源、窒素および糖からなる、請求項１７に記載の方法。
28. 前記糖が、果糖およびブドウ糖からなる群より選択されるものである、請求項２５または２７に記載の方法。
29. 前記糖が有機認証済である、請求項２８に記載の方法。
30. 前記培地に食塩源が添加されている、請求項２５または２６に記載の方法。
31. 前記食塩源が海水である、請求項３０に記載の方法。
32. 前記海水の塩分濃度が約１０ｐｐｔ〜約３５ｐｐｔの範囲である、請求項３１に記載の方法。
33. 前記海水の塩分濃度が約１２．７ｐｐｔである、請求項３２に記載の方法。
34. 前記化合物が脂肪酸である、請求項１７〜３３のいずれか一項に記載の方法。
35. 前記脂肪酸が多価不飽和脂肪酸である、請求項３４に記載の方法。
36. 前記多価不飽和脂肪酸が、ＤＨＡ、ＤＰＡ、ピノレン酸およびＥＰＡからなる群より選択されるものである、請求項３５に記載の方法。
37. 前記多価不飽和脂肪酸がＤＨＡである、請求項３６に記載の方法。
38. 前記多価不飽和脂肪酸がＥＰＡである、請求項３６に記載の方法。
39. 前記多価不飽和脂肪酸がピノレン酸である、請求項３６に記載の方法。
40. 前記化合物がカロチノイドまたは脂溶性ビタミンである、請求項１７〜３３のいずれか一項に記載の方法。
41. 前記カロチノイドがβ−カロチンである、請求項４０に記載の方法。
42. 食品、化粧品、工業用組成物またはヒトもしくは動物用の医薬組成物の製造方法であって、
    培養培地中で藻類を増殖させ、前記培地から藻類バイオマスまたは藻類細胞培養液を回収する工程であって、
    前記培地が、１種または複数種の果実もしくは野菜または果実と野菜の任意の組合せに由来するジュース、酸素源、および窒素を含み、
    前記培地が滅菌されており、
    前記培地中の窒素が天然由来の窒素からなる、工程と、
    前記培地から藻類バイオマスまたは藻類細胞培養液を回収する工程と、
    前記食品、工業用組成物または医薬組成物を調製する工程
    とを含む、方法。
43. 藻類バイオマスまたは藻類細胞培養液から１種または複数種の脂質化合物またはそれらの組成物を抽出し、食品、工業用組成物または医薬組成物を調製する工程をさらに含む、請求項４２に記載の方法。
44. 前記脂質化合物が脂肪酸である、請求項４３に記載の方法。
45. 前記脂肪酸が多価不飽和脂肪酸である、請求項４４に記載の方法。
46. 前記多価不飽和脂肪酸が、ＤＨＡ、ＤＰＡ、ＥＰＡおよびピノレン酸からなる群より選択されるものである、請求項４５に記載の方法。
47. 前記多価不飽和脂肪酸がＤＨＡである、請求項４６に記載の方法。
48. 前記多価不飽和脂肪酸がＥＰＡである、請求項４６に記載の方法。
49. 前記多価不飽和脂肪酸がピノレン酸である、請求項４６に記載の方法。
50. 前記培地に食塩源が添加されている、請求項４２〜４９のいずれか一項に記載の方法。
51. 前記食塩源が海水である、請求項５０に記載の方法。
52. 前記海水の塩分濃度が約１０ｐｐｔ〜約３５ｐｐｔの範囲である、請求項５１に記載の方法。
53. 前記海水の塩分濃度が約１２．７ｐｐｔである、請求項５２に記載の方法。
54. 前記培地に糖が添加されている、請求項４２〜５３のいずれか一項に記載の方法。
55. 前記糖が、ブドウ糖または果糖である、請求項５４に記載の方法。
56. 前記糖が有機である、請求項５５に記載の方法。
57. 前記調製する工程は食品を調整する工程である、請求項４２〜５６のいずれか一項に記載の方法。
58. 前記食品が栄養補助食品である、請求項５７に記載の方法。
59. 前記藻類が、トラウストキトリウム属、クラミドモナス属、ニッチア属、ナンノクロロプシス属およびオーランチオキトリウム属から選択される属である、請求項１〜５８のいずれか一項に記載の方法。
60. 前記属がオーランチオキトリウム属である、請求項５９に記載の方法。
61. 前記属がクラミドモナス属である、請求項５９に記載の方法。
62. 前記属がナンノクロロプシス属である、請求項５９に記載の方法。
63. 前記ジュースが、トマトジュース、ビートジュース、にんじんジュース、りんごジュース、ブルーベリージュース、有機認証済のビート糖蜜およびココナッツジュースからなる群より選択されるものである、請求項１〜６２のいずれか一項に記載の方法。
64. 前記ジュースがビートジュースである、請求項６３に記載の方法。
65. 前記ジュースがトマトジュースである、請求項６３に記載の方法。
66. 前記ジュースがにんじんジュースである、請求項６３に記載の方法。
67. 前記培地中のジュースの％濃度が、約５％〜約７０％の範囲内である、請求項１〜６６のいずれか一項に記載の方法。
68. 前記培地中のジュースの％濃度が、約１０％〜約５０％の範囲内である、請求項６７に記載の方法。
69. 前記培地中のジュースの％濃度が、約１０％、約２５％および約５０％からなる群より選択される％濃度である、請求項６８に記載の方法。
70. 前記ジュースが発酵したものである、請求項１〜６９のいずれか一項に記載の方法。
71. 前記ジュースが低温殺菌済である、請求項１〜７０のいずれか一項に記載の方法。
72. 前記ジュースが有機認証済である、請求項１〜７１のいずれか一項に記載の方法。
73. 前記培地のｐＨが約３〜約７の範囲である、請求項１〜７２のいずれか一項に記載の方法。
74. 前記培地のｐＨが約６．８である、請求項７３に記載の方法。
75. 前記培地が、化学添加物および保存料を含まない、請求項１〜７４のいずれか一項に記載の方法。
76. 前記藻類バイオマスまたは藻類細胞培養液が、有機認証済である、請求項１〜１６および請求項５９〜７５のいずれか一項に記載の方法。
77. 前記脂質化合物または組成物が有機認証済である、請求項１７〜４１および請求項５９〜７５のいずれか一項に記載の方法。
78. 前記食品が有機認証済である、請求項４２〜７５のいずれか一項に記載の方法。
79. 前記栄養補助食品が有機認証済である、請求項５８に記載の方法。
80. 前記ジュースが、ビートジュースまたは有機認証済のビート糖蜜であり、前記ジュースが非ＧＭＯ由来インベルターゼによって加水分解されている、請求項１７に記載の方法。
81. 前記培地にブドウ糖および有機認証済の酵母エキスが添加されている、請求項１７に記載の方法。
82. 前記ジュースが、脂質化合物または組成物の酸化速度を下げる、請求項１７に記載の方法。
83. 前記脂質化合物がＤＨＡである、請求項８２に記載の方法。
84. 前記ジュースが、にんじんジュース、ブルーベリージュースおよびビートジュースからなる群より選択されるものである、請求項８２に記載の方法。
85. 脂質化合物または組成物の酸化速度を下げる方法であって、脂質化合物または組成物を培地中に懸濁させることを含み、前記培地が、１種または複数種の果実もしくは野菜に由来するジュースまたは果実と野菜の任意の組合せに由来するジュースを含む、方法。
86. 前記ジュースが、ビートジュース、にんじんジュース、およびブルーベリージュースからなる群より選択されるものである、請求項８５に記載の方法。
87. 前記脂質化合物がＤＨＡである、請求項８５に記載の方法。
88. 前記脂質化合物または組成物が、請求項１〜８４のいずれか一項に記載の方法によって製造されるものである、請求項８５に記載の方法。
89. 前記脂質化合物または組成物が藻類由来である、請求項８５に記載の方法。
    

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