CN101445815A - 微生物合成γ-亚麻酸油脂的方法 - Google Patents
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Abstract
一种微生物发酵生产γ－亚麻酸油脂的方法。包括培育苹果酸酶及γ－亚麻酸合成酶的高表达菌株，原始菌种的活化扩大培养、一级发酵、二级发酵、三级发酵、四级发酵、脱水、烘干、油脂抽提等工艺步骤，其菌种优良，生产量大，干菌体收率10－30％，油脂35－55％，γ－亚麻酸18－29％，生产成本低，生产工艺原材料成本可降低50－70％，半连续或连续发酵工艺先进科学、成熟，可大规模工业化生产，已达到50－500吨的四级发酵水平。
Description
一 技术领域：
本发明涉及GLA油脂的制备方法，具体是指一种利用微生物发酵法来生物合成GLA油脂的方法。
二 背景技术：
GLA(γ-Linolenic acid)化学名为十八碳三稀酸，是α-亚麻酸的同分异构体，在某种意义上是人体必须脂肪酸之一，它在生物体内经过复杂的代谢过程，产生多种次生代谢产物，主要形成二高一γ-一亚麻酸(DHGL)或花生四烯酸(AA)，进而转化为前列腺素(P)、白三烯(I)和凝血恶烷(T)。由于GLA和其系列代谢物在免疫系统、心血管系统、生殖系统、内分泌系统中都具有重要而广泛的生理作用，其潜在的药用价值表现在以下几个方面：
GLA对多种革兰氏阴性菌、阳性菌及藻类的生长抑制作用已被证实。一般认为GLA进入细胞壁后，结合或插入细胞膜，前列腺素(PG)改变膜的流动性及其它生理性质，从而使生长受到抑制。在革兰氏阴性菌类群中GLA可以抑制铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeluginosa)和大肠杆菌等。当GLA达到500μg/ml时，15分钟即可杀死全部的细菌。同样，许多藻类生物在GLA存在下生长也受到抑制，如绿藻纲(Chlorollyceae)的蛋白核小球藻(Chlorella pyrenoidoa)、莱因衣藻(Chlamydonmras reinhardii)以及针胞藻纲(Raidophyceae)的(Heterosigma akashiwa)。
最新的研究表明GLA具有抗HIV感染作用：在添加γ一亚麻酸锂(LiGLA)的培养基中培育四天后，大约有90％的被HIV感染的细胞被杀死，同时未被感染的对照组细胞只损失了20％。在添加抗氧化剂后，LiGLA的毒性明显降低，所以认为LiGLA对HIV慢性感染细胞的选择性杀伤效果可能与膜脂过氧化状态的变化有关。类似的实验也证实了上述结果。
GLA已被确认对40多种肿瘤细胞有明显的抑制作用，包括乳腺癌、肺癌、皮肤癌、子宫癌、卵巢癌、前列腺癌细胞及胰腺癌细胞等。实验表明在体外培养的3株不同肿瘤细胞中，仅一株不能对吸收的GLA进行延长和脱氢，GLA对其表现最大毒性(致死量5μg/ml)，其余2株能不同程度地将GLA代谢为DGLA或AA，致死量则为10-20μg/ml，因此GLA的抗肿瘤活性可能在于分子自身而非其代谢产物，供给GLA可能改变了细胞的脂肪酸组成，增加了多不饱和脂肪酸的含量，改变了细胞膜脂酰基团的组成，正是这些结构变化影响了膜上运输蛋白、离子通道、一些受体及酶的性质。Jiang等人发现在体外实验中，LiGLA可以抑制HGF/SF引起的肝癌细胞转移性及侵袭性，而且细胞表面E一粘着蛋白也发生了变化，E一粘着蛋白是抑制细胞移动的胞间连接分子，用GLA处理24h后，在肺癌细胞、乳腺癌细胞、黑素癌细胞及肝癌细胞中，E一粘着蛋白表达量显著增加，亚油酸(LA)和花生四烯酸(AA)均不能导致类似的变化。GLA也可以促进a—Catenin(-种在E一粘着蛋白和细胞骨架之间的连接蛋白)的表达，而在许多肿瘤细胞中a—Catenin的含量明显低于正常水平。
近年来的研究发现，GLA对类风湿性关节炎、肠炎、脉管炎、肾炎等多种炎症均具有疗效或改善作用。实验表明，喂服3～6g/d的GLA可以导致血清脂类中的GLA、DHGLA和AA增加，嗜中性白细胞磷脂中DGLA的量亦明显增多，但其中GLA和AA水平无任何变化。嗜中性白细胞合成更少的白三烯I34(P<0.05)和血小板活化因子，这些数据揭示，GLA的抗炎效果是通过在嗜中性白细胞等炎症相关细胞中升高DHGLA含量水平并减弱AA生物合成来实现的。
GLA的抗粥样硬化作用：巨噬细胞和血管平滑肌细胞(VSMC)是粥样硬化中主要反应细胞，将巨噬细胞从喂以不同剂量GLA的雌鼠腹膜中分离，用不同抗体处理后，与VSMC共培养，发现GLA可明显降低VSMC的繁殖，升高cAMP水平。类似的研究也证明了VSMC的DNA合成能被8.2％～i0.1％的GLA所阻止。另外，GLA及其代谢物DHGLA、AA、PGE还具有调节血脂的功能，可以降低血浆总胆固醇、甘油三酯和低密度脂蛋白，升高高密度脂蛋白含量，并能抑制血小板的聚集和动脉粥样斑块的形成，使实验性心肌梗死区缩小。所以GLA在临床上可以用于防治冠心病、心肌梗死、阻塞脉管炎等疾病。
治疗高血压：GLA在肾脏内可以转化为AA，进一步产生血压调节物质一前列腺素(PGE2)，PGE2，能够通过激活血管平滑肌腺苷酸环化酶，增加cAMP水平而舒张血管，调节机体水和电解质代谢，增加肾血流量或与其它血管活性激素相互作用等方式来参与血压调节。此外，GLA还被发现可以用于糖尿病的辅助治疗，锌缺乏症的改善，γ射线放疗的增敏，对于亨廷顿氏舞蹈症、苯丙酮尿症、更年期综合症、帕金氏症、哮喘、湿症、甲状旁腺亢进等多种病症也具有不同的治疗效果。
GLA的生物资源主要有植物和微生物资源两部分。其植物资源主要分布于柳叶菜科(Onagraceae)紫草科(Boraginaceae)、玄参科(Sccrophulariaceae)、虎耳草科(Saxifragaceae)等高等植物中。GLA最初是从月见草中发现的，1919年Heidushka和Luft在月见草种籽中发现了这种物质，他们认为它是α-亚麻酸的同分异构体，把它命名为γ-亚麻酸。1949年Riley证实γ-亚麻酸为全顺式-6，9，12-十八碳三烯酸。月见草含油率在23％～30％之间，其中含亚油酸70％～80％，γ-亚麻酸含量在8％～10％之间，其不饱和脂肪酸总量高达90％以上。目前全世界大约有十多个国家种植这种植物，我国主要产区是东北和内蒙古。除月见草外，还有其它的含油植物种籽中也存在γ-亚麻酸。如后来发现在蛇麻(啤酒花，Hop)和大麻(洋麻，Hemp)中也含有γ-亚麻酸。1994年武丽萍报道了在我国青藏及邻近地区分布的微孔草(Microula Sikkimensis Hemsli)含油量4o％一5o％，亚麻酸8.1％.1988年Whiskey发现玻璃苣(Borago.offieinalis)中γ-亚麻酸含量达21％～25％。1988年和1990年，Traifler和我国的迟仁智分别报道在黑加仑(Black currant，Ribes nigrum L.)种子油中γ-亚麻酸的含量也达到15％～20％。近年来发现的一些GLA含量很高的植物品种。如1998年赵景年报道我国特产的华山松(Pinus Armandi Franch)种子含油量为51.2％，γ一亚麻酸含量为37.93％。2006年赵虹桥等发现三叶木通籽含油量为此31.8％，其中GLA为35.4-42.4％。另外侧柏子，马尾松，满天星(starflower)等也富含GLA。
但是这些植物资源大都分布于高寒地带，来源少，人工种植生长期长，耗费大量土地资源，产量受气候变化的影响很大，因而原料的来源受到限制，远远不能满足日益增长的市场需求。因此GLA的另一种资源-微生物受到了重视。
真菌发酵法进行γ-亚麻酸生产要综合考虑菌体生物量、菌体油脂含量以及油脂中γ-亚麻酸含量三个因素，这三个指标都较高的菌株才是进行发酵生产的理想菌株。用真菌发酵来生产GLA的研究和开发工作最初是1976年在英国赫尔大学(University of Hull)Ratledge实验室进行的。经过大量的菌株筛选工作，找到了一个适合于工业化生产的菌株(Mucor circinelloides)。并由J&E Sturge公司在1985年率先进行了商业化生产，发酵规模在220吨。日本的科学家们也较早进行了这方面的研究。1986年开始，日本出光石油化工公司已经采用微生物发酵法制取、生产γ-亚麻酸油脂.两国已推出含微生物γ-亚麻酸油脂的功能性食品和系列化妆品，使微生物油脂的综合利用迈出了实用化的第一步。我国在这方面的研究起步较晚，目前，虽有许多科研单位和高校从事这发面的研究。但大多数还处于实验室研究阶段，尚未形成大规模工业化生产。
三 发明内容：
本发明所要解决的技术问题是提供一种菌种优良、工艺先进、生产成本低、产量高、无环境污染的工业化生产γ-亚麻酸(GLA)油脂的方法。
本发明的制备方法包括：
1.一种高表达苹果酸酶及γ-亚麻酸合成酶的卷枝毛霉(Mucor circinelloides)菌株的筛选。筛选是通过紫外线和甘草酸进行诱变的方法而获得γ-亚麻酸的高产菌株。
2.卷枝毛霉的发酵工艺，其步筹包括：
(1)原始菌种的保持和活化：将冷冻保藏的卷枝毛霉108.16菌种接种到斜面培养基上，在25℃培养四至五天。
(2)液体培养：将活化后的菌种接种于500ml的液体培养介质中培养，培养器皿为带磁力搅拌的1L培养瓶，搅拌速度为120转/分，温度为28-30℃，时间为16-24小时。
(3)扩大培养：液体菌种以10％的比例接种到5L实验室用发酵罐中培养。通气量为1.0-1.5L/min，搅拌400-500转/分，pH为5.5-6.5，温度为此30℃，时间为18-24小时。
(4)一级发酵：将扩大培养的菌种以10％的接种量加入到50-500L的发酵罐中，通气量为1.0-1.5L/min，搅拌400-500转/分，pH为5.5-6.5，温度为此30℃，时间为18-24小时。用显微镜观察，无细菌污染，可转入二级发酵。
(5)二级发酵：将一级发酵得到的菌种以10％的比例加入到500-5000L二级发酵灌中，通气量为1.0-1.5L/min，搅拌400-500转/分，pH为5.5-6.5，温度为此30℃，时间为18-24小时。经观察菌丝粗壮健康无污染，可转入三级发酵。
(6)三级发酵：将二级发酵得到的菌种以10％的比例加入到5000-50000L三级发酵灌中，通气量为1.0-1.5L/min，搅拌400-500转/分，pH为5.5-6.5，温度为此30℃，时间为18-24小时。经观察菌丝粗壮健康无污染，可转入四级发酵。
(7)四级发酵：将三级发酵得到的菌种以5-10％的比例加入到50000-500000L四级发酵灌中，培养液为产脂培养介质。通气量为1.5-2.0L/min，搅拌400-500转/分，pH为5.5-6.5，温度为此30℃，时间为四到五天。
(8)菌丝体收藏：经离心过滤收取菌丝体，然后将菌丝体与GLA促进剂混合在4℃下保存16-24小时。
(9)四级发酵可采用流加式连续化生产工艺，提高生产效率，降低成本。
3.微生物菌丝体的油脂抽提工艺，其步骤包括
(1)将菌丝体在60-90℃下真空干燥15-20分钟。
(2)将干菌丝体机械粉碎后用有机溶剂萃取。萃取剂为石油醚或异己烷，萃取酸度在pH4.5-5.5，最佳配比为50g干菌体/1L石油醚，萃取时间为8-16h，操作温度宜低于50℃。
(3)有机溶剂通过篜溜后回收循环使用。最大程度上减少环境污染。
4.斜面培养基配方：葡萄糖3-5％，NH4Cl 0.25-0.35％，酵母提取液0.15％，磷酸盐0.3-0.7％，MgSO4 0.15％，琼脂2％，马铃薯汁10％。
5.液体培养基配方：糖蜜3-4％，酵母提取液0.15％，尿素0.5-1.0％，磷酸盐0.3-0.7％，MgSO40.15％，CaCl20.005-0.01％。
6.产脂培养基配方：糖蜜10-15％，酵母提取液0.15-0.3％，尿素0.3-0.5％，磷酸盐0.3-0.7％，MgSO4 0.15％，CaCl2 0.005-0.01％。
7.油脂抽取后的菌饼，可作为氮源加入到培养基中，纤维素可作为造纸工业的原料。
微生物油脂产品质量测定方法：
1.油脂含量的测定：索氏抽提法。
2.GLA含量的测定：
油脂经甲脂化后，进行气相色谱分析。气相色谱分析条件：GC-16A气相色谱仪，G-R3A数据处理器。色谱柱：3mm X 2000mm，担体：Chromosorbw，固定液：5％乙二酸二乙二醇聚酯(DEGS)，载气：N2，流量：42ml/min，检测鉴定器：氢火焰，柱温：195℃，进样温度：245℃，检测器温度：245℃。
本发明的优点：
1.其菌种优良，生产量大，本发明所采用的菌种为卷枝毛霉(Mucor circinelloides)菌种编号为108.16。该菌种生长快，三天就形成孢子，在连续的四级发酵中，该菌生长健康迅速，工业生产性能稳定，在50吨以上的发酵罐中达到很高的发酵水平。干菌体收率10-30％，油脂35-55％，γ-亚麻酸18-29％，是目前生产GLA油脂的高产菌株。
2.原材料成本低。在发酵工艺中，采用炼糖厂的下脚料-糖蜜作碳源，无机氮以及豆饼或菌饼为氮源。在最大程度上降低了生产成本，可比原有的生产工艺降低成本约80％。
3.工艺先进科学。本发明工艺流程先进成熟，从一级到三级发酵采用间歇式操作流程，而四级发酵采用连续式发酵工艺流程，大大提高了生产率，是目前国内外最先进的发酵工艺。在连续50吨的规模生产中，保持稳定及高产量。本发明的技术指标与国内外同行业比较见下表。
微生物发酵生产GLA油脂的产量
生产或研究单位 干菌体(％) 油脂/菌体(％) GLA(％)
上海工业微生物所 8.96
南开大学天津药业 1.9-2.8 44-44.7 9.76
南开大学生物工程 25-29.3 32.8-44.7 9.44
北京医学院生化室 1.95 15.43 27.16
安徽大学生物工程系 1.45-2.0 51 9.31
华南理工大学生物系 1.85 24.8-44.8 11.27
山东农科院原子能所 3.12 26.28 14.13
沈阳药科大学制药 4.92 38.6 12.7
长春圣洁生物科技有限公司3.5-4.1 25-39 20-24
日本出光石油公司 28-30 8-10
英国J&E Sturge Ltd 20 15-18
本发明 10-30 35-55 18-29
月见草 12-15 7-8
4.发酵水平已达到大规模工业化生产阶段。本发明技术已达到50-500吨四级发酵水平，而目前国内的几家研究单位工艺水平尚处以实验室或中试研究阶段，并未形成工业化生产规模。
四 具体实施方案：
实施例1
(1).原始菌种的保持和活化：将卷枝毛霉108.16菌种接种到斜面培养基上，在25℃培养四至五天。
(2).液体培养：将活化后的菌种接种于500ml的液体培养介质中培养，培养器皿为带磁力搅拌的1L培养瓶，搅拌速度为120转/分，温度为28-30℃，时间为18小时。
(3).扩大培养：液体菌种以10％的比例接种到5L实验室用发酵罐中培养。通气量为1.2L/min，搅拌420转/分，pH为5.5-6.0，温度为此30℃，时间为18-24小时。
(4).一级发酵：将扩大培养的菌种以10％的接种量加入到50-500L的发酵罐中，通气量为1.2L/min，搅拌420转/分，pH为5.5-6.0，温度为此30℃，时间为18-24小时。用显微镜观察，无细菌污染，可转入二级发酵。
(5).二级发酵：将一级发酵得到的菌种以10％的比例加入到500-5000L二级发酵灌中，通气量为1.2L/min，搅拌420转/分，pH为5.5-6.0，温度为此30℃，时间为18-24小时。经观察菌丝粗壮健康无污染，可转入三级发酵。
(6).三级发酵：将二级发酵得到的菌种以10％的比例加入到5000-50000L三级发酵灌中，通气量为1.2L/min，搅拌420转/分，pH为5.5-6.0，温度为此30℃，时间为18-24小时。经观察菌丝粗壮健康无污染，可转入四级发酵。
(7).四级发酵：将三级发酵得到的菌种以5％的比例加入到50000-500000L四级发酵灌中，培养液为产脂培养介质。通气量为1.2L/min，搅拌420转/分，pH为5.5-6.0，温度为此30℃，时间为四到五天。
(8).菌丝体收藏：经离心过滤收取菌丝体，然后将菌丝体与GLA促进剂混合在4℃下保存16-24小时。
(9).将菌丝体在60-90℃下真空干燥15-20分钟。得干菌体裁20g/l。
(10).将干菌丝体机械粉碎后用有机溶剂萃取。萃取剂为石油醚，萃取酸度在pH5.0，配比为50g干菌体/1L石油醚，萃取时间为9h，操作温度宜低于50℃。油脂得率39％，GLA 25％。
上述实施例中培养基配方：
斜面培养基配方：葡萄糖3.5％，NH4Cl 0.3％，酵母提取液0.15％，磷酸盐0.4％，MgSO4 0.15％，琼脂2％，马铃薯汁10％。
液体培养基配方：糖蜜3-4％，酵母提取液0.15％，尿素0.5-1.0％，磷酸盐0.3-0.7％，MgSO4 0.15％，CaCl20.005-0.01％。
产脂培养基配方：糖蜜10-15％，酵母提取液0.15-0.3％，尿素0.3-0.5％，磷酸盐0.3-0.7％，MgSO4 0.15％，CaCl2 0.005-0.01％。
实施例2
(1).原始菌种的保持和活化：将卷枝毛霉108.16菌种接种到斜面培养基上，在25℃培养四至五天。
(2).液体培养：将活化后的菌种接种于500ml的液体培养介质中培养，培养器皿为带磁力搅拌的1L培养瓶，搅拌速度为125转/分，温度为28-30℃，时间为19小时。
(3).扩大培养：液体菌种以10％的比例接种到5L实验室用发酵罐中培养。通气量为1.3L/min，搅拌450转/分，pH为6.0-6.5，温度为此30℃，时间为18-24小时。
(4).一级发酵：将扩大培养的菌种以10％的接种量加入到50-500L的发酵罐中，通气量为1.3L/min，搅拌450转/分，pH为6.0-6.5，温度为此30℃，时间为18-24小时。用显微镜观察，无细菌污染，可转入二级发酵。
(5).二级发酵：将一级发酵得到的菌种以10％的比例加入到500-5000L二级发酵灌中，通气量为1.3L/min，搅拌450转/分，pH为6.0-6.5，温度为此30℃，时间为18-24小时。经观察菌丝粗壮健康无污染，可转入三级发酵。
(6).三级发酵：将二级发酵得到的菌种以10％的比例加入到5000-50000L三级发酵灌中，通气量为1.3L/min，搅拌450转/分，pH为6.0-6.5，温度为此30℃，时间为18-24小时。经观察菌丝粗壮健康无污染，可转入四级发酵。
(7).四级发酵：将三级发酵得到的菌种以6％的比例加入到50000-500000L四级发酵灌中，培养液为产脂培养介质。通气量为1.3L/min，搅拌450转/分，pH为6.0-6.5，温度为此30℃，时间为四到五天。
(8).菌丝体收藏：经离心过滤收取菌丝体，然后将菌丝体与GLA促进剂混合在4℃下保存16-24小时。
(9).将菌丝体在60-90℃下真空干燥15-20分钟。得干菌体15g/l。
(10).将干菌丝体机械粉碎后用有机溶剂萃取。萃取剂为石油醚，萃取酸度在pH5.1，配比为52g干菌体/1L石油醚，萃取时间为11h，操作温度宜低于50℃。油脂得率51％，GLA19％。
本实例中培养基配方：
斜面培养基配方：葡萄糖3-5％，NH4Cl 0.25-0.35％，酵母提取液0.15％，磷酸盐0.3-0.7％，MgSO4 0.15％，琼脂2％，马铃薯汁10％。
液体培养基配方：糖蜜3-4％，酵母提取液0.15％，尿素0.5-1.0％，磷酸盐0.3-0.7％，MgSO4 0.15％，CaCl20.005-0.01％。
6.产脂培养基配方：糖蜜10-15％，酵母提取液0.15-0.3％，尿素0.3-0.5％，磷酸盐0.3-0.7％，MgSO4 0.15％，CaCl2 0.005-0.01％。
实施例3
(1)原始菌种的保持和活化：将卷枝毛霉108.16菌种接种到斜面培养基上，在25℃培养四至五天。
(2)液体培养：将活化后的菌种接种于500ml的液体培养介质中培养，培养器皿为带磁力搅拌的1L培养瓶，搅拌速度为130转/分，温度为28-30℃，时间为20小时。
(3)扩大培养：液体菌种以10％的比例接种到5L实验室用发酵罐中培养。通气量为1.5L/min，搅拌480转/分，pH为5.8-6.2，温度为此30℃，时间为18-24小时。
(4)一级发酵：将扩大培养的菌种以10％的接种量加入到50-500L的发酵罐中，通气量为1.5L/min，搅拌480转/分，pH为5.8-6.2，温度为此30℃，时间为18-24小时。用显微镜观察，无细菌污染，可转入二级发酵。
(5)二级发酵：将一级发酵得到的菌种以10％的比例加入到500-5000L二级发酵灌中，通气量为1.5L/min，搅拌480转/分，pH为5.8-6.2，温度为此30℃，时间为18-24小时。经观察菌丝粗壮健康无污染，可转入三级发酵。
(6)三级发酵：将二级发酵得到的菌种以10％的比例加入到5000-50000L三级发酵灌中，通气量为1.5L/min，搅拌480转/分，pH为5.8-6.2，温度为此30℃，时间为18-24小时。经观察菌丝粗壮健康无污染，可转入四级发酵。
(7)四级发酵：将三级发酵得到的菌种以7％的比例加入到50000-500000L四级发酵灌中，培养液为产脂培养介质。通气量为1.5L/min，搅拌480转/分，pH为5.8-6.2，温度为此30℃，时间为四到五天。
(8)菌丝体收藏：经离心过滤收取菌丝体，然后将菌丝体与GLA促进剂混合在4℃下保存16-24小时。
(9)将菌丝体在60-90℃下真空干燥15-20分钟。得干菌体25g/l。
(10)将干菌丝体机械粉碎后用有机溶剂萃取。萃取剂为异己烷，萃取酸度在pH5.2，配比为49g干菌体/1L异己烷，萃取时间为12h，操作温度低于50℃。油脂得率46％，GLA22％。有机溶剂通过篜溜后回收循环使用。
本实例中培养基配方：
斜面培养基配方：葡萄糖3-5％，NH4Cl0.25-0.35％，酵母提取液0.15％，磷酸盐0.3-0.7％，MgSO4 0.15％，琼脂2％，马铃薯汁10％。
液体培养基配方：糖蜜3-4％，酵母提取液0.15％，尿素0.5-1.0％，磷酸盐0.3-0.7％，MgSO4 0.15％，CaCl20.005-0.01％。
产脂培养基配方：糖蜜10-15％，酵母提取液0.15-0.3％，尿素0.3-0.5％，磷酸盐0.3-0.7％，MgSO4 0.15％，CaCl2 0.005-0.01％。
Claims (8)
1.一种微生物合成高含γ-亚麻酸(GLA)油脂的方法，其特征在于先通过发酵法来培养卷枝毛霉本(Mucorcircinelloides 108.16)，然后用萃取的方法从卷枝毛霉的菌丝体中提取油脂，即得成品高含γ-亚麻酸(GLA)油脂.萃取后所得菌饼可作为氮源加入到发酵培养液中.
2.根据权利要求1所述一种微生物合成高含γ-亚麻酸(GLA)油脂的方法，其特征在于所述卷枝毛霉(Mucor circinelloides 108.16)是一枝高表达苹果酸酶及γ-亚麻酸合成酶的菌枝.
3.根据权利要求1所述一种微生物合成高含γ-亚麻酸(GLA)油脂的方法，其特征在于所述：卷枝毛霉的发酵工艺包括如下步骤：(1)原始菌种的活化：卷枝毛霉108.16将菌种接种到斜面培养基上，在25℃培养四至五天.(2)液体培养：将活化后的菌种接种于500ml的液体培养介质中培养，培养器皿为带磁力搅拌的1L培养瓶，搅拌速度为120转/分，温度为28-30℃，时间为16-24小时.(3)扩大培养：液体菌种以10％的比例接种到5L实验室用发酵罐中培养.通气量为1.0-1.5L/min，搅拌400-500转/分，pH为5.5-6.5，温度为此30℃，时间为18-24小时.(4)一级发酵：将扩大培养的菌种以10％的接种量加入到50-500L的发酵罐中，通气量为1.0-1.5L/min，搅拌400-500转/分，pH为5.5-6.5，温度为30℃，时间为18-24小时.用显微镜观察，无细菌污染，可转入二级发酵.(5)二级发酵：将一级发酵得到的菌种以10％的比例加入到500-5000L二级发酵灌中，通气量为1.0-1.5L/min，搅拌400-500转/分，pH为5.5-6.5，温度为30℃，时间为18-24小时.经观察菌丝粗壮健康无污染，可转入三级发酵.(6)三级发酵：将二级发酵得到的菌种以10％的比例加入到5000-50000L三级发酵灌中，通气量为1.0-1.5L/min，搅拌400-500转/分，pH为5.5-6.5，温度为30℃，时间为18-24小时.经观察菌丝粗壮健康无污染，可转入四级发酵.(7)四级发酵：将三级发酵得到的菌种以5-10％的比例加入到50000-500000L四级发酵灌中，培养液为产脂培养介质.通气量为1.5-2.0L/min，搅拌400-500转/分，pH为5.5-6.5，温度为30℃，时间为四到五天.(8)菌丝体收藏：经离心过滤收取菌丝体，然后将菌丝体与GLA促进剂混合在4℃下保存16-24小时.
4.根据权利要求3所述一种微生物合成高含γ-亚麻酸(GLA)油脂的方法，其特征在于所述四级发酵可采用流加式连续化生产工艺，提高生产效率，降低成本.
5.根据权利要求1所述一种微生物合成高含γ-亚麻酸(GLA)油脂的方法，其特征在于所述微生物菌丝体的油脂抽提工艺包括：(1)将菌丝体在60-90℃下真空干燥15-20分钟.(2)将干菌丝体机械粉碎后用有机溶剂萃取.萃取剂为石油醚或异己烷，萃取酸度在pH 4.5-5.5，最佳配比为50g干菌体/1L石油醚，萃取时间为8-16h，操作温度宜低于50℃.(3)有机溶剂通过蒸溜后回收循环使用.最大程度上减少环境污染.
6.根据权利要求3所述一种微生物合成高含γ-亚麻酸(GLA)油脂的方法，其特征在于所述斜面培养基配方为：葡萄糖3-5％，NH4Cl 0.25-0.35％，酵母提取液0.15％，磷酸盐0.3-0.7％，MgSO4 0.15％，琼脂2％，马铃薯汁10％.
7.根据权利要求3所述一种微生物合成高含γ-亚麻酸(GLA)油脂的方法，其特征在于所述液体培养基配方为：糖蜜3-4％，酵母提取液0.15％，尿素0.5-1.0％，磷酸盐0.3-0.7％，MgSO4 0.15％，CaCl2 0.005-0.01％.
8.根据权利要求3所述一种微生物合成高含γ-亚麻酸(GLA)油脂的方法，其特征在于所述产脂培养基配方为：糖蜜10-15％，酵母提取液0.15-0.3％，尿素0.3-0.5％，磷酸盐0.3-0.7％，MgSO4 0.15％，CaCl20.005-0.01％。
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