CN106047956A

CN106047956A - 一种利用海鞘共附生桔青霉Asc2‑4发酵制备富含γ‑亚麻酸的油脂的方法

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Publication number: CN106047956A
Application number: CN201610640842.2A
Authority: CN
Inventors: 雷晓凌; 钟敏; 聂芳红; 柴慧子; 刘唤明
Original assignee: Guangdong Ocean University
Current assignee: Guangdong Ocean University
Priority date: 2016-08-05
Filing date: 2016-08-05
Publication date: 2016-10-26
Anticipated expiration: 2036-08-05
Also published as: CN106047956B

Abstract

本发明公开了一种利用海鞘共附生桔青霉（Penicillium citrinum）Asc2‑4发酵制备富含γ‑亚麻酸的油脂的方法。具体是将海鞘共附生桔青霉Asc2‑4接种于发酵培养基，在有氧条件下发酵，获得桔青霉菌丝体，然后从菌丝体中提取富含γ‑亚麻酸的油脂；所述海鞘共附生桔青霉菌Asc2‑4于2016年7月16日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC NO：60059。该方法培养基容易获得，发酵条件稳定、工艺简单，产量高，所得油脂中不饱和脂肪酸油脂含量很高，尤其是γ‑亚麻酸，该γ‑亚麻酸油脂可以用于食品药品和化妆品等的生产，用途广泛，具有很好的推广应用前景。

Description

一种利用海鞘共附生桔青霉Asc2-4发酵制备富含γ-亚麻酸的油脂的方法

技术领域

本发明属于生物技术领域。更具体地，涉及一种利用海鞘共附生桔青霉Asc2-4发酵制备富含γ-亚麻酸的油脂的方法。

背景技术

海鞘是一种海洋生物，属脊索动物门、尾索动物亚门、海鞘纲，在天然海区附着珍珠贝笼上生长。研究表明，海洋无脊椎动物共附生微生物平均每种动物达数百种，其密度高者占宿主动物总重量的40%，多数属于难培养的微生物范畴。海鞘是营固着生活的动物，体外被一层类似植物纤维素的被囊象鞘一样套着，是动物界独一无二的。海鞘独特的摄食、滤食系统使其体内、体表富集了大量的微生物]。与陆地微生物相比，海鞘共附生真菌能够耐受海洋特有的高盐、高压、低氧、低光照等多种极端条件，因此形成了独特的代谢和生理特性，产生了不同化学结构的代谢产物，为人类提供了陆地微生物所不能提供的活性代谢产物。这些活性物质具有抗菌、抗肿瘤、抗病毒、降血压、凝血和溶血等生物活性，成为开发海洋药物资源的重要内容之一。

微生物油脂（microbial oils），是由酵母、霉菌、细菌和藻类等微生物在一定条件下利用碳源、氮源、辅以无机盐生产的油脂。霉菌作为一类主要的产脂真菌如深黄被孢霉、高山被孢霉和拉曼被孢霉等，油酸、棕榈酸、亚油酸含量较高，其他多不饱和脂肪酸如亚麻酸、花生酸、花生四烯酸、二十二碳六烯酸等存在于经过诱变的菌株中，脂肪酸成分和含量有很大不同。不饱和脂肪酸因具有重要的生理功能和较高经济价值已经成为当今产油脂微生物定向育种的发展方向。

γ-亚麻酸(GLA)分子式为C₁₈H₃₀O₂，化学名6,9,12-十八碳三烯酸，为无色油状液体，是人体的一种必需脂肪酸，在人体内可以由亚油酸转化而来。γ-亚麻酸是组成人体各组织生物膜的结构材料，也是合成前列腺素的前体。另有研究表明，γ-亚麻酸可抑制人肝癌细胞生长。抑制人结肠癌、胃癌和胰癌细胞DNA的合成，γ-亚麻酸加Fe(II)对治疗乳腺癌效果显著。目前商业上多不饱和脂肪酸尤其是 ω-3多不饱和脂肪酸主要从深海鱼油中提取，高等植物和动物中很少含有ω-3 多不饱和脂肪酸，其生产工艺复杂、成本高、稳定性差，还受到气候条件和资源的限制。

而微生物中含量丰富，并且微生物具有适应性强、生长繁殖迅速、生长周期短、易培养、不受原料产地限制等特点。若体内的γ-亚麻酸合成受阻，会引起生理不调、血脂血压升高、糖尿病、风湿症、皮肤老化等多种疾病。目前已经发现的高产γ-亚麻酸菌株有雅致枝霉(Thamnidium elegans)、卷枝毛霉(Mucor circinelloides)、深黄被孢霉(Mortierella isabellina)等。张玲等报道对雅致枝霉AS3.3456进行5-氟尿嘧啶、紫外线、氯化锂复合诱变得到TE7-15，γ-亚麻酸产量达到1079.95mg/L，满足工业化生产的要求。咸漠等用硫酸二乙酯对深黄被孢霉进行化学诱变获得变异株XM-1，其菌体生物量为15.1g /L，油脂量为7.5g。针对高产GLA菌株的筛选和定向育种已成为近年来研究热点。因此，利用微生物生产多不饱和脂肪酸是一条重要途径，寻求高产菌株和研究发酵工艺，正成为主要的研究方向。

发明内容

本发明的目的是克服上述现有技术的缺陷和不足，提供一株新的菌株海鞘共附生桔青霉Asc2-4在制备γ-亚麻酸方面的应用。

本发明的另一目的是提供一种利用海鞘共附生桔青霉Asc2-4发酵制备γ-亚麻酸的方法，具体是以马铃薯打浆液为主要的发酵培养基原料，并在发酵培养基中添加少量的葡萄糖、酵母膏以及无机盐，然后将上述桔青霉Asc2-4接入发酵培养基中进行有氧发酵获得菌丝体，最后酸热法提取菌丝体中的γ-亚麻酸油脂。该方法培养基容易获得，发酵条件稳定、工艺简单，产量高，所得γ-亚麻酸油脂用途广泛。

本发明上述目的通过以下技术方案实现：

海鞘共附生桔青霉Asc2-4在制备不饱和脂肪酸油脂方面的应用。

优选地，所述不饱和脂肪酸油脂为γ-亚麻酸。

一种利用海鞘共附生桔青霉Asc2-4发酵制备富含γ-亚麻酸的油脂的方法，是将海鞘共附生桔青霉菌Asc2-4接种于发酵培养基，在有氧条件下发酵，获得桔青霉菌丝体，然后从菌丝体中提取富含γ-亚麻酸的油脂。

其中，所述海鞘共附生桔青霉Asc2-4于2016年7月16日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC NO：60059。

该菌株是以马铃薯葡萄糖培养基从海鞘内脏分离纯化得到的高产 γ-亚麻酸的丝状真菌。

所述海鞘共附生桔青霉Asc2-4的形态特征描述如下：

该菌株在马铃薯葡萄糖琼脂培养基上培养2 d后在100 倍的油镜下观察，无菌核，菌丝体有隔，孢梗茎无色壁光滑，帚状枝两轮生或三轮生，偶见单轮生，瓶梗安瓿形，7.2～9.8×1.8～5.2 μm，梗颈较短。分生孢子壁光滑，球形、近球形或卵形，呈链状，1.2～3.1×1.1～3.5 μm。

该菌株在马铃薯葡萄糖琼脂培养基上28℃培养4 d，直径13 mm，培养7 d，直径40mm，菌落表面平坦中间有轻微褶皱突起，边缘呈现不规则的形状，表面质地呈绒状中间带轻微絮状；表面产生大量的灰绿色的分生孢子，菌丝体白色，没有渗出液或可溶性色素；菌落反面呈黄色或淡黄色，反面中间轻微凹陷。

进一步地，提取Asc2-4菌株的DNA，选用ITS4、ITS5引物进行PCR扩增并纯化PCR产物，测得该菌株ITS序列，分子鉴定结果显示，该菌株属于桔青霉（Penicillium citrinum）。

另外，在上述利用海鞘共附生桔青霉Asc2-4发酵制备γ-亚麻酸的方法中，所述发酵培养基的主要成分为马铃薯打浆液，以及少量的葡萄糖、酵母膏和无机盐。

优选地，所述发酵培养基的配方为：每升发酵培养基中含有土豆200～250g、酵母膏0.4～0.6g、磷酸二氢钾1～3g、硫酸铵1～3g、柠檬酸钠0.05～0.2g，70%海水定容。

更优选地，所述发酵培养基的配方为：每升发酵培养基中含有土豆200～250g、酵母膏0.50g、磷酸二氢钾2.00g、硫酸铵2.00g、柠檬酸钠0.10g，70%海水定容。

更优选地，所述发酵培养基的配制方法为：将土豆洗净之后加入70%海水，打浆，过滤，液体沉淀 2～3h，除去土豆渣和淀粉，然后加入酵母膏、磷酸二氢钾、硫酸铵和柠檬酸钠，70%海水定容；pH自然；灭菌条件：121℃，20min。

其中，所述70%海水是指体积比为7：3的海水和蒸馏水的混合水。

另外，上述的方法中，所述在有氧条件下发酵的具体条件为：接种量为5～10%，pH为6，温度为28℃，时间为6～7d。

优选地，所述从菌丝体中提取富含γ-亚麻酸的油脂的具体方法如下：

利用酸热法提取油脂：菌丝体培养结束后，进行固液分离，然后将菌丝体烘干，粉碎进行破壁处理，得到干菌体；然后添加盐酸，室温放置，再于沸水浴加热后，速冷，重复2～3次；最后加入氯仿-甲醇混合液，充分振荡后离心，挥发除去氯仿即得油脂。所得油脂中富含γ-亚麻酸，含量高达23.20%，约占其不饱和脂肪酸的24.50%。

优选地，所述干菌体和盐酸的质量体积比为0.5～2g：5～7mL，所述盐酸的浓度为3～5 mol/L。

更优选地，所述干菌体和盐酸的质量体积比为1g：6mL，所述盐酸的浓度为4.00mol/L。

优选地，所述室温放置的时间为20～40min。

更优选地，所述室温放置的时间为30min。

优选地，所述沸水浴加热的时间为8～15min。

更优选地，所述沸水浴加热的时间为10min。

优选地，所述速冷是-20℃速冷。

优选地，所述氯仿-甲醇混合液中，氯仿和甲醇的体积比为1～3：0.5～1.5。

更优选地，所述氯仿-甲醇混合液中，氯仿和甲醇的体积比为2：1。

优选地，所述氯仿-甲醇混合液的体积是干菌体盐酸溶液的2倍。

优选地，所述离心是2000 r/min条件下离心10～15min。

另外，优选地，所述海鞘共附生桔青霉菌Asc2-4在接种于发酵培养基进行发酵培养之前，还需先经过菌种活化、种子液制备的步骤，再将种子液接种于发酵培养基进行发酵培养。

优选地，所述菌种活化是将保存的菌株移接至马铃薯葡萄糖琼脂斜面培养基上，于25℃培养 5天。

优选地，所述种子液制备是将菌种制成孢子悬浮液，接种于种子培养基中进行培养，种子培养基为马铃薯葡萄糖培养基，接种量为3%，pH为5.5～6.5，培养温度为28℃，培养时间为2d。

更具体地，作为一种优选的可实施方案，上述利用海鞘共附生桔青霉菌Asc2-4发酵制备γ-亚麻酸的方法包括如下步骤：

（1）菌种活化（固体菌种培养）：

将由冻干管或者沙土管保存的菌株移接至马铃薯葡萄糖琼脂斜面培养基上，于25℃培养 5天，进行菌种活化；

（2）种子液制备（液体菌种培养）：

将斜面菌种制成孢子悬浮液，接种于种子培养基中培养，种子培养基为马铃薯葡萄糖培养基，接种量为3%，pH为5.5～6.5，培养温度为28℃，培养时间为2d；

（3）发酵培养

1）发酵培养基制备：按照每升发酵培养基中200～250g马铃薯的比例，准确称取马铃薯，洗净之后加入450～500mL无菌70%海水，利用土豆打浆机或搅拌机打浆，将打浆液用4层纱布挤压过滤，液体沉淀 2～3h，除去土豆渣和淀粉，然后加入酵母膏0.50 g，磷酸二氢钾2.00g，硫酸铵2 .00g，柠檬酸钠0.10g，70%海水定容至1L；pH自然；灭菌条件：121℃，20min。

2）发酵培养：按照5～10%的接种量，将生长良好的种子液接入发酵培养基中培养，pH 为6，发酵培养温度为28℃，培养时间为6～7d。

（4）油脂提取：

1）菌丝体培养结束后，用抽滤泵进行固液分离，然后用沸腾干燥机进行菌丝体烘干，粉碎进行破壁处理，得到干菌体。

2）然后每1.00 g干菌体添加4.00 mol/L的盐酸6.00mL，室温下放置30 min后，再于沸水浴加热10 min，-20℃速冷，以此重复2～3次。之后加入2倍体积的氯仿-甲醇（2：1，V/V）混合液，充分振荡，2000 r/min条件下离心10～15 min，挥发除去氯仿即得油脂。

本发明具有以下有益效果：

本发明从海鞘内脏分离得到的海鞘共附生桔青霉Asc2-4，生长速度快，生命力顽强，可用于生产 γ-亚麻酸油脂。

将所述的桔青霉Asc2-4在有氧条件下发酵获得桔青霉菌丝体，然后利用酸热法从菌丝体中提取富含γ-亚麻酸的油脂，所得油脂中 γ-亚麻酸含量很高，可以到达 20% 以上，该γ-亚麻酸油脂可以用于食品药品和化妆品的生产。

本方法所用发酵培养基主要成分为马铃薯打浆液，成本低廉，培养基容易获得，发酵条件稳定，工艺简单，具有很好的推广应用前景。

附图说明

图1为Asc-2-4菌株的形态；其中，A-B：PDA培养基上培养7 d的菌落；C-E：分生孢子梗；F：分生孢子；标尺=10μm。

图2为本发明利用海鞘共附生真菌桔青霉Asc2-4发酵制备的油脂中的成分分析结果。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

实施例1 海鞘共附生真菌桔青霉Asc2-4的分离和鉴定

1、菌株分离

（1）样品：海鞘，采自广东省雷州市流沙虾塘。

取海鞘内脏10g，用均质机均质后，放入90 mL无菌海水中，充分震荡混匀。再用无菌海水分别按10^-2～10^-6稀释涂布于固体培养基，28℃培养24～72h，分离得到单菌落。

上述单菌落进一步接种于液体种子培养基，28℃摇床培养72h，显微镜观察菌丝中脂肪粒，选择菌丝中脂肪粒较多的菌株接种于发酵培养基中28℃摇床培养144h，然后抽滤烘干发酵好的菌丝体，酸热法提取菌丝体中的油脂，并用气相色谱仪测定油脂中γ-亚麻酸含量，选择γ-亚麻酸含量最高的菌株，作为本发明的菌种。

其中，所述固体培养基即为马铃薯葡萄糖琼脂培养基，配方为：马铃薯150g，葡萄糖15g，琼脂15g，70%海水1000mL，自然pH；灭菌条件：121℃，20min。

所述液体种子培养基：马铃薯150g，葡萄糖15g，70%海水1000mL，自然pH；灭菌条件：121℃，20min。

所述发酵培养基的配制方法为：称取去皮的新鲜土豆200～250g，搅拌机搅拌打碎成浆；4层纱布挤压过滤，将液体沉淀3 h，去除淀粉定容至1 L；然后添加葡萄糖110 g，酵母膏0.50 g，磷酸二氢钾2.00g，硫酸铵2 .00g，柠檬酸钠0.10g，70%的人工海水，加海水补足1000mL，pH自然；灭菌条件：121℃，20min。

（2）上述得到的γ-亚麻酸含量最高的菌株，利用固体斜面培养基4℃保存。

2、形态鉴定

上述γ-亚麻酸含量最高的菌株在马铃薯葡萄糖琼脂培养基上培养2d后在100 倍的油镜下观察，无菌核，菌丝体有隔，孢梗茎无色壁光滑，帚状枝两轮生或三轮生，偶见单轮生，瓶梗安瓿形，7.2-9.8×1.8-5.2 μm，梗颈较短。分生孢子壁光滑，球形、近球形或卵形，呈链状，1.2-3.1×1.1-3.5 μm。

该菌株在马铃薯葡萄糖琼脂培养基上28℃培养3～4d，直径13 mm；培养7d，直径40mm，菌落表面平坦中间有轻微褶皱突起，边缘呈现不规则的形状，表面质地呈绒状中间带轻微絮状；表面产生大量的灰绿色的分生孢子，菌丝体白色，没有渗出液或可溶性色素；菌落反面呈黄色或淡黄色，反面中间轻微凹陷（如附图1所示）。

根据形态描述判断该菌株为青霉属。

3、分子鉴定

提取上述γ-亚麻酸含量最高的菌株的DNA，选用ITS4、ITS5引物进行PCR扩增并纯化PCR产物，测得该菌株的ITS序列，并以ITS序列进行分子鉴定，结果显示，该菌株属于桔青霉（Penicillium citrinum），命名为桔青霉菌Asc2-4，并于2016年7月16日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC NO：60059，保藏地址是广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。

实施例2 利用海鞘共附生真菌桔青霉Asc2-4发酵制备γ-亚麻酸油脂

1、利用海鞘共附生真菌桔青霉Asc2-4发酵制备γ-亚麻酸油脂的方法，包括如下步骤：

（1）菌种活化（固体菌种培养）：

（2）种子液制备（液体菌种培养）：

将斜面菌种制成孢子悬浮液，接种于种子培养基中进行培养，种子培养基为马铃薯葡萄糖培养基，接种量为3%，pH为5.5～6.5，培养温度为28℃，培养时间为2d；

（3）发酵培养

2）发酵培养：按照5～10%的接种量，将生长良好的种子液接入三角瓶中培养，500mL三角瓶装200mL发酵培养基，pH 为6，发酵培养温度为28℃，摇床培养，转速180 rpm，培养时间为6～7d。

（4）油脂提取（酸热法）：

1）菌丝体培养结束后，用抽滤泵进行固液分离，然后用沸腾干燥机进行菌丝体烘干，粉碎进行破壁处理。

2）然后每1.00 g干菌体添加4 .00 mol/L的盐酸6.00mL，室温下放置30 min后，再于沸水浴加热10 min，-20℃速冷，以此重复2～3次。之后加入2倍体积的氯仿-甲醇（2：1，V/V）混合液，充分振荡，2000 r/min条件下离心10～15 min，挥发除去氯仿即得油脂。

2、经过测定，海鞘共附生真菌桔青霉Asc2-4中油脂含量为20.70%，油脂中不饱和脂肪酸含量高达93.9%，其中γ-C18:3(γ)亚麻酸、C16:1棕榈一稀酸和C18:1油酸所占比例最大，尤其是γ-C18:3(γ)亚麻酸达到23.2%，约占其不饱和脂肪酸总量的24.5%，可作为选育高产γ-亚麻酸的优良菌种，具有良好的开发应用前景。具体在湛江市质量计量监督检测所的检测记录如附图2所示。

3、油脂测定

（1）油脂甲酯化：

直接称取油脂0.05g于离心管中或在油脂中加5mL正己烷将油脂充分溶解，再加1mL 的2mol/L氢氧化钾-甲醇溶液，加塞后猛烈振摇30s后放置至澄清。向溶液中加入约1g硫酸氢钠，猛烈振摇，中和氢氧化钾。待盐沉淀后，取上层液过0.45μm滤膜待测。

（2）气相色谱测定γ-亚麻酸油脂

0.2g油脂加入皂化液（0.5 mol/L KOH-甲醇）2 mL，混匀，于60℃水浴皂化至油珠消失，冷却后加入甲酯化液（14 %三氟化硼-甲醇）2mL，于60℃水浴甲酯化30min，冷却后加入正己烷1mL，饱和氯化钠1mL，离心后取上清夜，即可进行气相色谱分析油脂组成。

柱子型号HXDT-FFAP（30m×0.32mm×0.25μm），分流比： 30:1 ；进样口温度：250℃；检测器温度：260℃；进样量：1.0μL ；升温程序：开始温度90℃保持1min，以5℃/min上升到240℃，保持30min。

4、结论：

本发明制备的油脂成分中不饱和脂肪酸占93.90%。其中，十八碳烯酸含量最高为58.92%，其次是十六碳烯酸19.10%，尤其是γ-C18:3(γ)亚麻酸含量为23.20%，约占其不饱和脂肪酸的24.50%。

Claims

1.海鞘共附生桔青霉菌Asc2-4在制备不饱和脂肪酸油脂方面的应用。

2. 一种利用海鞘共附生桔青霉Asc2-4发酵制备富含γ-亚麻酸的油脂的方法，其特征在于，是将海鞘共附生桔青霉Asc2-4接种于发酵培养基，在有氧条件下发酵，获得桔青霉菌丝体，然后从菌丝体中提取富含γ-亚麻酸的油脂；所述海鞘共附生桔青霉菌Asc2-4于2016年7月16日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC NO：60059。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述发酵培养基的主要成分为马铃薯打浆液，还包含有葡萄糖、酵母膏和无机盐。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述发酵培养基的配方为：每升发酵培养基中含有土豆200～250g、酵母膏0.4～0.6g、磷酸二氢钾1～3g、硫酸铵1～3g、柠檬酸钠0.05～0.2g，70%海水定容。

5. 根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述发酵培养基的配制方法为：将土豆洗净之后加入70%海水，打浆，过滤，液体沉淀 2～3h，除去土豆渣和淀粉，然后加入酵母膏、磷酸二氢钾、硫酸铵和柠檬酸钠，70%海水定容；pH自然；灭菌条件：121℃，20min。

6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，在有氧条件下发酵的具体条件为：接种量为5～10%，pH为6，温度为28℃，时间为6～7d。

7.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述从菌丝体中提取富含γ-亚麻酸的油脂的方法是酸热法，具体步骤如下：菌丝体培养结束后，进行固液分离，然后将菌丝体烘干，粉碎进行破壁处理，得到干菌体；然后添加盐酸，室温放置，再于沸水浴加热后，速冷，重复2～3次；最后加入氯仿-甲醇混合液，充分振荡后离心，挥发除去氯仿即得油脂。

8. 根据权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤S1中所述干菌体和盐酸的质量体积比为0.5～2g：5～7mL，所述盐酸的浓度为3～5 mol/L。

9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤S1中所述室温放置的时间为20～40min；所述沸水浴加热的时间为8～15min。

10.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤S1中所述氯仿-甲醇混合液中，氯仿和甲醇的体积比为1～3：0.5～1.5。