CN110089623A - 栅藻及其作为饵料/饵料添加剂的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及微生物技术领域，特别涉及栅藻及其作为饵料/饵料添加剂的应用。本发明所述栅藻(Desmodesmus armatus)保藏在中国典型培养物保藏中心，CCTCCNO:M2019211。将该微藻作为饵料、饵料添加剂分别投喂鲤鱼幼鱼，均能够明显提高鲤鱼的体重、体长和肥满度，结果表明本发明所述栅藻可有效促进鲤鱼生长，适合淡水动物养殖，可用于制备淡水动物饵料及饵料添加剂，应用前景较广。

Description

栅藻及其作为饵料/饵料添加剂的应用

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，特别涉及栅藻及其作为饵料/饵料添加剂的 应用。

背景技术

微藻是在全球经济中未被充分利用的广阔的可再生资源。微藻生长所占 耕地面积少，可以有效减轻土地压力。微藻作为丰富且相对容易培养的资源 正在不断增加，并且正在广泛应用到多个领域。微藻不同的代谢途径合成的 化合物种类繁多，可提供多种高附加值营养物质。

当前我国的水产养殖中高密度的养殖模式被普遍采用，养殖过程中产生 大量的残饵和养殖动物的代谢排泄物等有机物分解常造成水体富营养化。微 藻生物饵料具有良好的营养价值、不污染水质等优点。目前，部分微藻已被 用作幼鱼、幼体贝类和鱼类的养殖饲料，以及饲养幼年动物所需的浮游动物。 其营养物质可防御多种疾病，促进鱼、虾、蟹、贝类等水产生物的生长和品 质，是水产养殖过程中应用最普遍的生物饵料。在水产养殖中最常使用的微 藻有螺旋藻、小球藻、扁藻、等鞭金藻、三角褐指藻、角毛藻和骨条藻等。

栅藻是淡水中常见的一种藻类，又称栅列藻，属于绿藻门、绿球藻目、 栅藻科、栅藻属。细胞常为椭圆形或纺锤形，以长轴排成1～2列或多列。栅 藻营养丰富、生长速率快、对水环境污染物具有一定的耐受性，常作为指示 生物应用于水质评价。近年来，栅藻主要用来处理水产养殖废水，减轻水产 养殖环境压力。栅藻在处理养殖废水的同时，能为经济类水产养殖动物提供 饵料，将促进水产养殖的可持续发展。栅藻能产生大量功能化合物，如类胡 萝卜素，不饱和脂肪酸等，在适合的培养条件下还可获得生物柴油、蛋白质 等高附加值产品。大量繁殖的藻体也可作为家禽、水生动物的饲料。

尽管微藻具有良好的应用前景，并且相关的研究正在大力发展，但是目 前已知的微藻，尤其是栅藻，营养价值较高且适合水产养殖的极为少见。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种栅藻及其作为饵料/饵料添加剂的应用，使 得该藻株能够显著提高水产动物的生长。

本发明从自然水体中分离获得一株栅藻(Desmodesmus armatus)，命名 B38，其保藏编号为CCTCC NO:M2019211，分离方法如下：

于自然水体中采集藻种，除去杂物，使用平板划线法将藻种在固体培养 基上进行划线、培养。纯化后的藻株再经平板划线纯化后，通过光学显微就 观察是否为相同藻株，用接种环挑出单藻落，将藻体转移至装有BG11培养基 的无菌试管中培养，然后接种到含BG11培养基的锥形瓶中培养，获得藻株 B38。使用MEGA 7.0对ITS扩增产物进行分析，通过邻接法(Neighbor-Joining) 构建系统发育树对微藻的种属进行鉴定，结合形态学鉴定结果鉴定该微藻为 栅藻(Desmodesmus armatus)，命名为栅藻B38(Desmodesmus armatus B38)。

本发明所述栅藻B38(Desmodesmus armatus B38)已于2019年3月28 日保藏在中国典型培养物保藏中心，地址为:中国，武汉，武汉大学，保藏编 号为CCTCC NO:M2019211。

在一个具体实施例中，将本发明栅藻作为饵料、饵料添加剂分别投喂鲤 鱼幼鱼，均能够明显提高鲤鱼的体重、体长和肥满度，结果表明本发明栅藻 可有效促进鲤鱼生长，且培养期间鲤鱼幼鱼均未出现死亡现象。

因此，本发明还提供了所述栅藻在制备促进水产动物生长的产品中的应 用。

作为优选，所述水产动物为鱼类。

在一些具体实施例中，所述鱼类为鲤鱼。

作为优选，所述产品为水产动物饵料或水产动物饵料添加剂。

本发明还提供了由所述栅藻制得的水产动物饵料。

所述水产动物饵料的制备方法为：将保藏编号为CCTCC NO:M2019211 的栅藻经絮凝、离心、洗涤、冻干，获得所述鱼类饵料。

本发明还提供一种复合饵料，所述水产动物饵料和基础饵料组成的

本发明提供的复合饵料中，基础饵料可以为水产动物养殖领域中常用的 种类。优选的，本发明采用以蛋白质为主要成分的基础饵料，基础饵料的营 养成分为：粗蛋白含量≥40％；粗脂肪含量≥5％；粗纤维含量≥3％；水分含 量≥10％。

在一些实施方案中，所述水产动物饵料添加剂和所述基础饵料的质量比 为1:1～1:4。

在一些具体实施例中，所述水产动物饵料添加剂和所述基础饵料的质量 比为1:2。

经检测，本发明所述栅藻B38蛋白质含量丰富，可达49％及以上，将其 作为饵料、饵料添加剂分别投喂鲤鱼幼鱼，均能够明显提高鲤鱼的体重、体 长和肥满度，结果表明本发明所述栅藻可有效促进鲤鱼生长，适合淡水动物 养殖，可用于制备淡水动物饵料及饵料添加剂，应用前景较广。

生物保藏说明

栅藻B38(Desmodesmus armatus B38)，于2019年3月28日保藏在中 国典型培养物保藏中心，地址为:中国，武汉，武汉大学，保藏编号为CCTCC NO:M2019211。

附图说明

图1为栅藻细胞显微镜图像(40×)；

图2为ITS序列的系统发育树。

具体实施方式

本发明公开了一种栅藻及其作为饵料/饵料添加剂的应用，本领域技术人 员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类 似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在 本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明 显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动 或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1藻种的分离、纯化

实验藻种采集于自然水体中，除去杂物，使用平板划线法将藻种在固体 培养基上进行划线，于27±1℃，光照强度108μmol m^-2s^-1，光照周期12：12h 条件下培养20d。纯化后的藻株再经平板划线纯化后，通过光学显微就观察是 否为相同藻株，用接种环挑出单藻落，将藻体转移至装有10mL培养基的无菌 试管中，在相同条件下培养15d后，将BG11培养基分装于500mL锥形瓶中， 每瓶250mL，121℃灭菌30min，待培养基冷却后，取5mL长势良好的藻液接 种于锥形瓶中，置于光照摇床中培养15d，光照摇床设置为转速120rpm，温 度27±1℃，光密度光照强度108μmol m^-2s^-1。

表1 BG11培养基组成

实施例2藻种鉴定

微藻的形态学鉴定：使用光学显微镜观察微藻的形态，根据形态学初步 鉴定。

藻种分子生物学鉴定：取待测藻粉50mg,根据植物DNA提取试剂盒(HP Plant DNAKit)使用手册上的方法对微藻的基因组总DNA进行提取。使用紫 外分光光度计在260nm下对DNA的存在和浓度进行检测。使用PCR仪对提 取出的微藻DNA进行扩增。PCR反应采用ITS序列通用引物进行扩增。ITS 序列为：5'–TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'(Forward)和5'-T C CT C C G CTTATTGATATGC-3'(Reverse)。

PCR(50μL)反应体系：2μL DNA模板，1μL(10μmmol/L)前引物， 1μL(10μmmol/L)后引物，5μL(2μmmol/L)dNTPs，5μL 10×Dream Taq^TM Buffer，0.5μL Dream Taq^TM DNA聚合酶和35.5μL ddH₂O.

PCR热循环反应条件：95℃预变性5min，94℃变性30s循环35次，59℃ 退火30s，72℃延伸1min，最后72℃终延伸10min。

扩增产物使用1.5％琼脂糖凝胶电泳进行分离检测，最终产物与Mark DNA进行对比从而分析它们的分子量和衔接性。最终，PCR产物送至广东华 大基因进行进一步测序。

使用MEGA 7.0对ITS扩增产物进行分析，运用邻接法(Neighbor-Joining) 构建系统发育树对微藻的种属进行鉴定。

使用光学显微镜观察微藻的形态，微藻的显微镜图像见图1。通过形态学 鉴定，初步鉴定B38为栅藻。

提取微藻DNA后，使用PCR扩增仪扩增通用引物ITS。通过紫外-可见 光分光光度计的检测发现微藻目标DNA片段扩增情况良好。ITS的PCR扩增 产物(用于鉴定B38)的分子量约为500–800bp。从BLAST中选取相应的 基因序列，可能的基因序列与B38进行比对，相似性分别达到97％。且由图 2可知，比对序列与系统发育树比对结果吻合。因此，B38被初步鉴定为D. armatus。

实施例3栅藻户外大规模培养及基础营养成分测定

室外的大规模培养，首先通过40L柱式光生物反应器进行初级放大获得 充足藻种，然后将藻种接种到800L管式光生物反应器中。采用一次培养的培 养方式，在户外进行大规模培养。由于户外温度较高，使用淋水系统将温度 控制在28-30℃之间。培养期间每隔24h取样，通过紫外分光光度计于680nm 下测量藻液的OD₆₈₀值，监测藻类生长。12d后，藻液通过絮凝采收，剩余水 分通过离心机去除，转速为8000rpm，离心时间为5min，所得藻泥用去离子 水洗涤三次以去除无机盐。将收获的藻泥置于冷冻干燥机中冻干，获得藻粉， 即本发明栅藻饵料，称量藻粉质量，生物量计算公式如下：

P_biomass：生物量；

M：干燥后藻粉的质量(g)；

V：藻液体积(L).

培养12d后，栅藻的生物量可达0.89g L^-1。

按照GB 5009.5-2016测蛋白质的含量，按照GB 5413.5-2010测总糖的 含量，按照GB 5009.6-2016测油脂的含量，按照GB 5009.4-2016测灰分的 含量，按照GB/T 5009.10-2003测粗纤维的含量，按照GB 5009.3-2010测水 分的含量。

表2栅藻营养成分含量(以每100g可食部计算)

实施例4不同饵料对鲤鱼幼鱼生长的影响

(1)幼鱼投喂

实验设置栅藻饵料组、基础饵料组、复合饵料组，对照组，每组设置3 个平行组。鱼苗暂养驯化3d后，进行分组，并开始投喂食物。在鱼缸 (40cm×25cm×27cm)中注入淡水，随机放入10尾鱼苗，充气增氧，整个实 验持续30d。每天9:00、15：00、21:00各投喂一次。

实验组合如下：

栅藻饵料组：从仔鱼开始一直投喂本发明栅藻B38，每次投喂1g。

基础饵料组：从仔鱼开始一直投喂基础饵料，每次投喂1g，基础饵料购 自亚峰实业有限公司，营养成分为：粗蛋白含量≥40％；粗脂肪含量≥5％； 粗纤维含量≥3％；水分含量≥10％。

复合饵料组：从仔鱼开始一直投喂基础饵料和栅藻饵料的混合饵料(栅 藻饵料作为添加剂)，每次投喂1g基础饵料和0.5g栅藻饵料。

对照组：从仔鱼开始一直投喂基础饵料和小球藻(Chlorella sorokiniana) 饵料的混合饵料，每次投喂1g基础饵料和0.5g小球藻饵料。

上述各组采用相同的基础饵料。

(2)取样和测量

实验期间每天记录鱼苗死亡情况，并将死亡的鱼苗及时捞出以免影响水 质。在实验开始和结束时测量鱼苗的全长，并用滤纸吸附鱼体水分测量鱼苗 体重。

(3)数据处理

实验鱼的增重率、特定生长率、肥满度的计算公式如下：

式中：W₁、W₂分别表示前后两次测量个体的平均体重(g)，L₁、L₂为 前后两次测量个体的平均体长(cm)，t₁、t₂为前后两次测量的时间(d)。 培养期间鲤鱼幼鱼均未出现死亡现象。

表3栅藻对鲤鱼生长的影响

注：字母不一样表示差异显著(p<0.05)。

表4栅藻对鲤鱼肥满度的影响

注：字母不一样表示差异显著(p<0.05)。

由表3和表4结果可以看出，栅藻饵料组和复合饵料组均能够显著提高鲤 鱼幼鱼的增重率、特定生长率和肥满度，与不添加栅藻的基础饵料组相比， 均具有显著差异(p<0.05)，且栅藻的作用效果优于小球藻，差异显著(p<0.05)。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普 通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润 饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.栅藻(Desmodesmus armatus)，其特征在于，其保藏编号为CCTCC NO:M2019211。

2.权利要求1所述的栅藻在制备促进水产动物生长的产品中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述水产动物为鱼类。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述鱼类为鲤鱼。

5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述产品为水产动物饵料或水产动物饵料添加剂。

6.权利要求1所述的栅藻制得的水产动物饵料。

7.权利要求6所述的水产动物饵料的制备方法，其特征在于，将保藏编号为CCTCC NO:M2019211的栅藻经絮凝、离心、洗涤、冻干，获得所述水产动物饵料。

8.一种复合饵料，其特征在于，包括权利要求6所述的水产动物饵料和基础饵料。

9.根据权利要求8所述的复合饵料，其特征在于，所述水产动物饵料和所述基础饵料的质量比为1:1～1:4。

10.根据权利要求9所述的复合饵料，其特征在于，所述水产动物饵料和所述基础饵料的质量比为1:2。