CN110184195B - 一株高产油脂的桔青霉Asc2-4-1及其应用 - Google Patents

一株高产油脂的桔青霉Asc2-4-1及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一株高产油脂的桔青霉Asc2‑4‑1及其应用。所述桔青霉Asc2‑4‑1于2019年3月15日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No：60609。本发明以青霉属菌株Asc2‑4作为出发菌株，将其菌悬液进行紫外线和氯化锂复合诱变，通过初筛、摇瓶发酵复筛获得高产油脂的目标菌株，命名为桔青霉Asc2‑4‑1，该菌株可大幅度提高发酵产物中的油脂含量，且遗传稳定性良好，可用于发酵制备生物柴油。采用本发明所述桔青霉Asc2‑4‑1发酵产油脂，油脂含量达到58.0％，比出发菌株的油脂含量提高了93.01％；油脂得率达到7.10g/L，比出发菌株的油脂得率提高了84.41％。

Description

一株高产油脂的桔青霉Asc2-4-1及其应用
技术领域
本发明涉及微生物发酵技术领域，具体地，涉及一株高产油脂的桔青霉Asc2-4-1及其应用。
背景技术
微生物油脂是由酵母、霉菌、细菌和藻类等微生物在一定条件下利用碳源、氮源、辅以无机盐生产的油脂。近些年来，许多国家已从产脂能力强的微生物中获得较多的单细胞油脂。目前发达国家如日本、美国、德国等国已将单细胞油脂作为商业化产品，与真菌油脂的发展息息相关。这是因为真菌对于不同条件适应能力强、繁殖速度较快、生产周期短，且发酵生产无需占用大面积的土地资源、不受原料产地限制，因此真菌可以作为优质脂肪酸的补充来源。
霉菌作为一类主要的产脂真菌，如深黄被孢霉、高山被孢霉和拉曼被孢霉等，菌株中油酸、棕榈酸、亚油酸含量较高，其他多不饱和脂肪酸如亚麻酸、花生酸、花生四烯酸、二十二碳六烯酸等存在于经过诱变的菌株中，不同菌株中脂肪酸成分和含量有很大不同。如张玲等报道对雅致枝霉AS3.3456进行5-氟尿嘧啶、紫外线、氯化锂复合诱变得到 TE7-15，生物量提高了10.12％，产油率提高了58.55％，满足了工业化生产的要求。又如咸漠等用硫酸二乙酯对深黄被孢霉进行化学诱变获得变异株XM-1，其菌体生物量为 15.1g/L，油脂量为7.5g。
综上，针对高产油脂菌株的筛选和定向育种已成为近年来研究热点。因此，寻求高产菌株和研究发酵工艺，是当前研究的主要方向。海鞘共附生桔青霉(Penicilliumcitrinum) Asc2-4是以马铃薯葡萄糖培养基从海鞘内脏分离纯化得到的高产γ-亚麻酸的丝状真菌，虽然桔青霉Asc2-4能在一定条件下发酵产油脂，但油脂的得率和含量较低。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有技术的上述不足，提供一株高产油脂的桔青霉(Penicillium citrinum)Asc2-4-1，该菌株是以青霉属菌株Asc2-4作为出发菌株，将其菌悬液进行紫外线和氯化锂复合诱变，通过初筛、摇瓶发酵复筛后得到的高产油脂的目标菌株。
本发明的另一目的在于提供上述桔青霉Asc2-4-1在发酵生产油脂中的应用。
为了实现上述目的，本发明是通过以下方案予以实现的：
一株高产油脂的桔青霉(Penicillium citrinum)Asc2-4-1，该菌株于2019年3月15日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏编号为GDMCC No：60609。
本发明以青霉属菌株Asc2-4作为出发菌株，将其单孢子菌悬液进行紫外线和氯化锂复合诱变，通过丙二酸初筛、摇瓶发酵复筛获得高产油脂的目标菌株，命名为桔青霉Asc2-4-1，该菌株可大幅度提高发酵产物中的油脂含量，且遗传稳定性良好，可用于发酵制备生物柴油。
具体地，所述桔青霉Asc2-4-1的诱变方法包括以下步骤：
将出发菌株青霉属真菌Asc2-4接种到马铃薯葡萄糖斜面培养基上，活化转接3代。待孢子成熟后，用接种环将孢子刮到无菌生理盐水的试管中，制备出菌悬液，调整菌悬液孢子个数达到106～1010个/mL。将所述菌悬液置于磁力搅拌器中，加入氯化锂溶液，并利用紫外灯对菌悬液进行诱变处理。将经诱变处理后的菌悬液进行丙二酸(2～6g/L)筛选培养，筛选出高产油脂的桔青霉诱变菌Asc2-4-1。其中，所述诱变处理的紫外诱变时间为 60～80s，氯化锂的浓度为10～15g/L。
上述诱变方法简单易实施，诱变所得菌株正突变率高，遗传性能稳定。
筛选出的桔青霉诱变菌Asc2-4-1在PDA培养基上培养3d，直径达13mm；培养7d，直径达40mm。菌落表面平坦中间有轻微突起，边缘形状不规则，质地呈绒状中间带轻微絮状。产生大量的灰绿色的分生孢子，菌丝体白色，无渗出液或可溶性色素。菌落反面呈黄色或淡黄色，反面中间轻微凹陷。培养2d后在100倍的油镜下观察，无菌核，菌丝体有隔，孢梗茎无色壁光滑，帚状枝具分枝，两轮或三轮生，瓶梗安瓿形，7.2～9.8×1.8～ 5.2μm，梗颈较短。分生孢子壁光滑，球形、近球形或卵形，呈链状，1.2～3.1×1.1～3.5μm。
采用本发明所述桔青霉Asc2-4-1发酵产油脂，先接种到种子培养基中培养，再接到发酵培养基中摇床培养7～8d，采用超声波辅助酸热法进行提油，经测定，油脂含量达到58.0％，比出发菌株的油脂含量(30.05％)提高了93.01％；油脂得率达到7.10g/L，比出发菌株的油脂得率(3.85g/L)提高了84.41％。
综上，将得到的桔青霉诱变菌Asc2-4-1用于生产油脂，其制备工艺简单，条件易控，效率高，且能显著提高油脂的产量，有利于实现生物油脂的产业化。
因此，本发明请求保护上述桔青霉Asc2-4-1在发酵生产油脂中的应用。
优选地，所述桔青霉诱变菌Asc2-4-1在接种于发酵培养基之前，还需先经过菌种活化、种子液培养的步骤，再将种子液接种于发酵培养基进行发酵培养。
更优选地，所述发酵生产油脂的方法包括如下步骤：
S1.种子培养：将上述桔青霉Asc2-4-1接种到种子培养基中，于150～200rpm、25～30℃条件下培养48～72h，得种子培养液；
S2.发酵培养：将步骤S1所得种子培养液接种到发酵培养基中，接种量为5～10％，于150～200rpm、25～30℃条件下培养6～7d，得发酵培养液；
S3.油脂提取：将步骤S2所得发酵培养液进行固液分离，得到的桔青霉菌丝体置于100～110℃烘干，粉碎并进行破壁处理；再加入10mL 3～8mol/L HCl溶液进行超声处理，超声功率为290～300W，超声温度为25～30℃，处理时间为20～40min；经沸水浴加热8～15min，然后置于-20℃迅速冷却10min，重复上述操作3次；再加入10～30mL氯仿-甲醇混合液，充分振荡，于2000r/min、4℃下离心10～15min，收集下层有机相，挥干氯仿- 甲醇后即得油脂。
优选地，步骤S1中所述种子培养的转速为180rpm，温度为28℃，时间为48h。
优选地，步骤S2中所述接种量为5％，发酵培养的转速为180rpm，温度为28℃，时间为7d。
优选地，步骤S3中所述超声功率为300W，超声温度为26℃，处理时间为30min。
优选地，步骤S3中所述氯仿-甲醇混合液中，氯仿和甲醇的体积比为(2～5)：1。
优选地，步骤S1中所述种子培养基含有以下组分：海精盐15～30g/L，酵母膏1～5g/L，硫酸铵5～15g/L，马铃薯30～50g/L。
更优选地，步骤S1中所述种子培养基含有以下组分：海精盐30g/L，酵母膏1.5g/L，硫酸铵10g/L，马铃薯30g/L。
优选地，步骤S2中所述发酵培养基含有以下组分：葡萄糖100～150g/L，马铃薯150～ 200g/L，蛋白胨0.5～1.0g/L，酵母膏0.5～1.0g/L，柠檬酸钠0.1～0.5g/L，磷酸二氢钾1.0～ 10g/L，磷酸氢二钾0.1～1.0g/L。
更优选地，步骤S2中所述发酵培养基还含有以下组分：硫酸镁50～100mg/L，氯化铁0.01～0.1mg/L。
更优选地，步骤S2中所述发酵培养基含有以下组分：葡萄糖100g/L，马铃薯200g/L，蛋白胨0.5g/L，酵母膏0.5g/L，柠檬酸钠0.1g/L，磷酸二氢钾5g/L，磷酸氢二钾0.2g/L，硫酸镁50mg/L，氯化铁0.06mg/L。
其中，上述马铃薯的处理方法是将马铃薯洗净之后加入适量人工海水，打浆，过滤，除去马铃薯渣后再添加到培养基中。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
(1)本发明以青霉属菌株Asc2-4作为出发菌株，将其菌悬液进行紫外线和氯化锂复合诱变，通过初筛、摇瓶发酵复筛获得高产油脂的目标菌株，命名为桔青霉Asc2-4-1，该菌株可大幅度提高发酵产物中的油脂含量，且遗传稳定性良好，可用于发酵制备生物柴油。
(2)采用本发明所述桔青霉Asc2-4-1发酵产油脂，油脂含量达到58.0％，比出发菌株的油脂含量提高了93.01％；油脂得率达到7.10g/L，比出发菌株的油脂得率提高了84.41％。
(3)将本发明得到的桔青霉诱变菌Asc2-4-1用于生产油脂，其制备工艺简单，条件易控，效率高，且能显著提高油脂的产量，有利于实现生物油脂的产业化，具有较高的经济应用价值。
附图说明
图1为高产油脂的桔青霉Asc2-4-1的形态图。其中，A为培养基中的菌落形态，B为在显微镜下的形态。
图2为高产油脂的桔青霉Asc2-4-1的筛选过程示意图。
图3为桔青霉诱变菌Asc2-4-1产油脂含量情况。
具体实施方式
下面结合说明书附图及具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
实施例1桔青霉诱变菌Asc2-4-1的产生
为了得到高产油脂的菌株，本实施例以青霉属菌株Asc2-4作为出发菌株，将其单孢子菌悬液进行紫外线和氯化锂复合诱变，通过丙二酸初筛、摇瓶发酵复筛获得高产油脂的目标菌株。
诱变方法的具体步骤如下(如图2所示)：
1、出发菌株Asc2-4的培养
以桔青霉菌Asc2-4为出发菌株，将出发菌种活化转接3代，27～29℃恒温培养3～5天，待孢子成熟后，用接种环将孢子轻轻刮下，倒入盛有无菌生理盐水的试管中，充分振荡，使孢子充分打散，成为单孢子悬液，调整菌个数达到106～1010个/mL。
2、紫外线-氯化锂复合诱变
在黑暗条件下进行紫外诱变(紫外灯功率20W)，在照射之前，开启紫外灯预热30min，取1mL制备好的菌悬液置于直径为9cm的无菌培养皿内，加入1mL 10～15g/L氯化锂溶液，放入一个无菌磁力搅拌器，调整培养皿至紫外灯距离为30cm。然后在黑暗条件下，边搅拌边用紫外线分别照射60～80s，吸取200μL涂PDA平板，诱变结束后避光保存，为防止诱变后光复活。
为了研究紫外线-氯化锂的诱变时间对孢子存活率的影响，以紫外线-氯化锂诱变时间为横坐标，孢子存活率为纵坐标，制作存活率曲线。诱变时间为0s，30s，60s，90s，120s，用移液枪吸取200μL孢子悬液，涂布于PDA平板，28℃避光培养3d，以菌落形成单位(CFU) 计算存活率。对照组为稀释相同倍数未经诱变的孢子液。
存活率＝诱变后菌落形成数/空白对照菌落形成数×100％
结果如表1所示。采用紫外线-氯化锂复合诱变方式诱变菌种，致使桔青霉菌株发生变异，且随诱变时间增加，存活率也呈缓慢下降的趋势，因此选择紫外诱变时间为60～80s作为最佳诱变时间。
表1存活率与复合诱变时间的关系
Figure RE-GDA0002084290460000051
3、初筛
将经诱变后的菌悬液接种到丙二酸PDA培养基中进行培养，筛选挑取长势较好的突变菌。
确定丙二酸筛选条件：向冷却至50℃的100mL PDA培养基分别加入500g/L的丙二酸溶液0、0.2、0.4、0.8、1.2mL，分别配制出0g/L、1g/L、2g/L、4g/L、6g/L浓度的丙二酸PDA培养基，倒平板涂布，28℃培养3d。观察菌落的生长状况，确定合适的丙二酸筛选浓度。
结果如表2所示，随丙二酸浓度的增加，致死率也呈缓慢增长的趋势，因此选择浓度为2～6g/L的丙二酸进行初筛。
表2不同浓度的丙二酸对桔青霉菌诱变菌Asc2-4-1的抑制作用
丙二酸浓度(g/L) 0 1 2 4 6
菌落长势 +++ ++ + - -
4、复筛
将所得诱变菌株分别接入种子培养基中，于180rpm、28℃培养48h后，按照5％的接种量分别再接入发酵培养基，进行摇瓶复筛，复筛每组做三个平行。
发酵培养条件为：发酵周期为7d，发酵温度为28℃，发酵液初始pH值自然，接种量为5％，发酵培养基装液量为100mL/250mL三角瓶，摇床转速为180rpm。
目标菌株的筛选依据为油脂含量的多少。
5、生物量的测定
发酵结束后，发酵液用真空抽滤并用蒸馏水洗涤2～3次收集得到湿菌体，放入电热鼓风干燥箱中于105℃烘干30min后称重，计算生物量。
Figure RE-GDA0002084290460000061
6、油脂提取，称重
将干菌体剪碎研磨后放入50mL离心管中，加入10mL 4mol/L的盐酸溶液，置于超声波清洗仪中，超声功率为300W，超声温度为26℃，超声处理30min。经沸水浴加热10min，然后置于-20℃迅速冷却10min。重复上述操作3次。加入20mL的氯仿-甲醇混合液(氯仿：甲醇＝2：1)，充分振荡，于2000r/min、4℃下离心10min，收集下层有机相于已称重的培养皿中，挥干氯仿-甲醇后称重，计算油脂含量。
Figure RE-GDA0002084290460000062
结果表明，经过紫外和氯化锂复合诱变产生了一株稳定高产油脂的菌株，将其命名为 Asc2-4-1，其油脂含量达到58.0％，比出发菌株的油脂含量(30.05％)提高了93.01％；油脂得率达到7.10g/L，比出发菌株的油脂得率(3.85g/L)提高了84.41％；且通过传代实验，验证了此菌的遗传稳定。
因此，将该株高产油脂的桔青霉诱变菌Asc2-4-1于2019年3月15日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏编号为GDMCC No：60609。
桔青霉诱变菌Asc2-4-1(如图1所示)在PDA培养基上培养3d，直径达13mm；培养7d，直径达40mm。菌落表面平坦中间有轻微突起，边缘形状不规则，质地呈绒状中间带轻微絮状。产生大量的灰绿色的分生孢子，菌丝体白色，无渗出液或可溶性色素。菌落反面呈黄色或淡黄色，反面中间轻微凹陷。培养2d后在100倍的油镜下观察，无菌核，菌丝体有隔，孢梗茎无色壁光滑，帚状枝具分枝，两轮或三轮生，瓶梗安瓿形，7.2～9.8 ×1.8～5.2μm，梗颈较短。分生孢子壁光滑，球形、近球形或卵形，呈链状，1.2～3.1×1.1～3.5μm。
实施例2一种利用桔青霉Asc2-4-1发酵生产油脂的方法
包括如下步骤：
S1.种子培养：将上述桔青霉Asc2-4-1接种到种子培养基中，于180rpm、28℃条件下培养48h，得种子培养液；
S2.发酵培养：将步骤S1所得种子培养液接种到发酵培养基中，接种量为5％，于180rpm、28℃条件下培养7d，得发酵培养液；
S3.油脂提取：将步骤S2所得发酵培养液进行固液分离，得到的桔青霉菌丝体置于100℃烘干，粉碎并进行破壁处理；再加入10mL 5mol/L HCl溶液进行超声处理，超声功率为300W，超声温度为26℃，处理时间为30min；经沸水浴加热10min，然后置于-20℃迅速冷却10min，重复上述操作3次；再加入20mL氯仿-甲醇混合液(氯仿：甲醇＝2：1)，充分振荡，于2000r/min、4℃下离心10min，收集下层有机相，挥干氯仿-甲醇后即得油脂。
其中，步骤S1中所述种子培养基含有以下组分：海精盐30g/L，酵母膏0.5g/L，硫酸铵10g/L，马铃薯30g/L。
步骤S2中所述发酵培养基含有以下组分：葡萄糖100g/L，马铃薯200g/L，蛋白胨0.5g/L，酵母膏0.5g/L，柠檬酸钠0.1g/L，磷酸二氢钾5g/L，磷酸氢二钾0.2g/L，硫酸镁50mg/L，氯化铁0.06mg/L。发酵培养基装液量为100mL/250mL三角瓶。
其中，上述马铃薯的处理方法是将马铃薯洗净之后加入适量人工海水，打浆，过滤，除去马铃薯渣后再添加到培养基中。
经培养基优化后，采本发明所述桔青霉Asc2-4-1的油脂含量达到58.0％，油脂得率达到7.10g/L。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，对于本领域的普通技术人员来说，在上述说明及思路的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。

Claims (7)

1.一株高产油脂的桔青霉(Penicillium citrinum)Asc2-4-1，其特征在于，该菌株于2019年3月15日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No：60609。
2.权利要求1所述桔青霉Asc2-4-1在发酵生产油脂中的应用。
3.根据权利要求2所述应用，其特征在于，所述发酵生产油脂的方法包括如下步骤：
S1.种子培养：将权利要求1所述桔青霉Asc2-4-1接种到种子培养基中，于150～200rpm、25～30℃条件下培养48～72h，得种子培养液；
S2.发酵培养：将步骤S1所得种子培养液接种到发酵培养基中，接种量为5～10％，于150～200rpm、25～30℃条件下培养6～7d，得发酵培养液；
S3.油脂提取：将步骤S2所得发酵培养液进行固液分离，得到的桔青霉菌丝体置于100～110℃烘干，粉碎并进行破壁处理；再加入10mL3～8mol/L HCl溶液进行超声处理，超声功率为290～300W，超声温度为25～30℃，处理时间为20～40min；经沸水浴加热8～15min，然后置于-20℃迅速冷却10min，重复上述操作3次；再加入10～30mL氯仿-甲醇混合液，充分振荡，于2000r/min、4℃下离心10～15min，收集下层有机相，挥干氯仿-甲醇后即得油脂；
步骤S1中所述种子培养基含有以下组分：海精盐15～30g/L，酵母膏1～5g/L，硫酸铵5～15g/L，马铃薯30～50g/L；
步骤S2中所述发酵培养基含有以下组分：葡萄糖100～150g/L，马铃薯150～200g/L，蛋白胨0.5～1.0g/L，酵母膏0.5～1.0g/L，柠檬酸钠0.1～0.5g/L，磷酸二氢钾1.0～10g/L，磷酸氢二钾0.1～1.0g/L，硫酸镁50～100mg/L，氯化铁0.01～0.1mg/L。
4.根据权利要求3所述应用，其特征在于，步骤S1中所述种子培养的转速为180rpm，温度为28℃，时间为48h。
5.根据权利要求3所述应用，其特征在于，步骤S2中所述接种量为5％，发酵培养的转速为180rpm，温度为28℃，时间为7d。
6.根据权利要求3所述应用，其特征在于，步骤S3中所述超声功率为300W，超声温度为26℃，处理时间为30min。
7.根据权利要求3所述应用，其特征在于，步骤S3中所述氯仿-甲醇混合液中，氯仿和甲醇的体积比为(2～5)：1。
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