CN103642698B - 高山被孢霉突变株及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及高山被孢霉突变株及其应用。本发明提供了一种高山被孢霉突变株（高山被孢霉ZR36，Mortierella？alpine？ZR36），该菌株于2013年9月13日保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC），保藏地址是，中国，武汉，武汉大学，保藏编号为CCTCC？NO:M2013419。并提供了一种高山被孢霉突变株在生产低含量长链饱和脂肪酸的花生四烯酸油脂中的应用。本发明通过以高山被孢霉突变株CCTCC？NO:M2013419所生产的花生四烯酸油脂中长链饱和脂肪酸特别是二十碳以上长链饱和脂肪酸的总含量比较低（二十碳以上饱和脂肪酸的总含量低于15wt%），进而可明显降低由其制备的花生四烯酸油脂的凝固点，使其在较低温度下也不会凝固结晶析出饱和脂肪酸，油脂品质较高。<pb pnum="1" />
Description
技术领域
本发明涉及一种高山被孢霉突变株及其应用。
背景技术
花生四烯酸(Arachidonic acid，简称ARA)是一种重要的多不饱和脂肪酸（Polyunsaturatedfatty acids,PUFAs），它作为一种极为重要的结构脂类广泛存在于哺乳动物的器官、肌肉和血液组织中，除此，它还是许多二十碳酸衍生物如前列腺素E2（PGE2）、前列环素（PGI2）、血栓烷素A2（TXA2）、白三烯B4（LTB4）和C4（LTC4）的直接前体，这些生物活性物质对脂蛋白的代谢、血液流变学、血管弹性、白细胞功能和血小板激活等具有重要的调节作用。
花生四烯酸油脂目前已经进入工业化生产阶段，但是，目前研究多只关注于油脂中花生四烯酸的含量，却忽略了油脂中其他成分，特别是长链饱和脂肪酸的含量。而长链饱和脂肪酸的含量对油脂的品质影响非常大，如花生四烯酸油脂中长链饱和脂肪酸在体系中所占的比例对油脂的凝固点起着决定作用，特别是二十碳以上的长链饱和脂肪酸，例如花生酸(C20:0)，山嵛酸(C22:0)，木蜡酸(C24:0)等，并且饱和脂肪酸的凝固点一般是随烷基碳链长度(即碳原子数)的增加而增加。目前，市售高山被孢霉生产的花生四烯酸油脂产品中二十碳以上的长链饱和脂肪酸的含量在20wt%左右，其在12℃时即会析出饱和脂肪酸、出现体系浑浊的现象，这样就影响了花生四烯酸油脂的质量。
中国发明专利公开号为CN1362522A的专利申请公开了一种以高山被孢霉为出发菌株进行粒子束诱变得到的菌株生产花生四烯酸的方法。但是，其未提及长链饱和脂肪酸的含量的控制。中国发明专利公开号为CN101709297的专利申请公开了一种诱变筛选花生四烯酸产生菌高山被孢霉的方法。其同样也未提及长链饱和脂肪酸的含量的控制。
鉴于现有的高山被孢霉菌种所制得的花生四烯酸油脂中，长链饱和脂肪酸的含量都比较高，因此，提供一种新的能够生产长链饱和脂肪酸含量较低的高山被孢霉突变株实为必要。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于提供一种新的高山被孢霉突变株及其应用。该高山被孢霉突变株能用于低含量长链饱和脂肪酸花生四烯酸油脂的生产。
为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为；
高山被孢霉突变株（高山被孢霉ZR36，Mortierella alpine ZR36）于2013年9月13日保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC），保藏地址是，中国，武汉，武汉大学，保藏编号为CCTCCNO:M2013419。
上述高山被孢霉突变株在生产低含量长链饱和脂肪酸的花生四烯酸油脂中的应用。
按上述方案，所述的花生四烯酸油脂中二十碳以上的长链饱和脂肪酸含量低于15wt%。所述的二十碳以上的长链饱和脂肪酸包括花生酸、山嵛酸、木蜡酸。
按上述方案，所述的花生四烯酸油脂中木蜡酸(C24:0)的含量小于8wt%。
按上述方案，所述花生四烯酸油脂的凝固点为4℃-11℃。
本发明的有益效果：
本发明通过以高山被孢霉为出发菌种经诱变筛选得到的高山被孢霉突变株CCTCC NO:M2013419所生产的花生四烯酸油脂中，可大大降低长链饱和脂肪酸特别是二十碳以上长链饱和脂肪酸的总含量（二十碳以上饱和脂肪酸的总含量低于15wt%），进而可明显降低由其制备的花生四烯酸油脂的凝固点，使其在较低温度下也不会凝固结晶析出饱和脂肪酸，油脂品质较高。特别地，长链的饱和脂肪酸木蜡酸(C24:0)的含量较低（小于8wt%），由此可进一步有效地降低花生四烯酸油脂的凝固点，更好地保证花生四烯酸油脂的品质。
具体实施方式
为了能够更清楚地理解本发明的技术内容，特举以下实施例详细说明，有助于理解本专利。
实施例1.高山被孢霉突变株的选育方法
（1）取市售高山被孢霉为出发菌株。
（2）将菌种接种于马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基上在28℃恒温条件下培养8天至孢子成熟。
（3）通过纱布或滤纸过滤得到纯的孢子液，将孢子液注入到无菌培养皿上经过紫外灯照射,紫外灯照射距离为30厘米，照射时间为60秒，紫外灯的功率为30瓦。
（4）经过紫外诱变后的孢子液经无菌风风干，成为菌斑。将含菌斑的培养皿无菌移入高能粒子束注入机中，经过高能离子束注入诱变。
（5）将菌斑用无菌水洗脱，稀释，涂于马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基平板上进行培养，随机挑取10个单菌落。
（6）将上述挑取的单菌落进行液体摇瓶培养，根据各菌获得的微生物油酯的脂肪酸分布，选取长链饱和脂肪酸花生酸（C20:0）、山嵛酸（C22:0）、木蜡酸（C24:0）总含量最低（低于10wt%）的菌和花生四烯酸含量最高的菌(高于50wt%)。将由此筛选的两株菌分别接到马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基平板上，于25℃，湿度50%的恒温培养箱培养5天，在两株菌的结合区域挑取菌丝或孢子，转接到新鲜的马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基平板上进行培养，得到本发明的高山被孢霉突变株（高山被孢霉ZR36，Mortierella alpine ZR36），该菌株于2013年9月13日保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC），保藏地址是，中国，武汉，武汉大学，保藏编号为CCTCC NO:M2013419。
上述高山被孢霉菌株CCTCC NO:M2013419具有以下生理生化特性：
（1）生长于PDA斜面培养基，在28℃下生长2天后，在培养基表面会形成白色菌落，3天后生长进入对数生长期，气生菌丝颜色雪白，6天后，菌丝布满整个斜面；
（2）孢子形成期非常晚，7天后气生菌丝顶部开始变黄，之后开始分化为黄色孢子囊；
（2）最适宜培养温度为28℃；
（4）用于培养的培养基中可利用的碳源为：葡萄糖、蔗糖、淀粉，不利用或很少利用甘油；可利用的氮源主要为酵母粉、酵母浸膏、酵母浸粉。
实施例2利用高山被孢霉突变株生产花生四烯酸
a)孢子悬浮液准备：分别取市售的高山被孢霉和本发明所述的保藏编号：CCTCC M2013419的高山被孢霉突变株接种到马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基平板上，25-28℃培养7天至孢子成熟，，后将马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基平板上的孢子和菌丝刮到装有10毫升无菌水，震荡获得孢子悬浮液。
b)种子摇瓶培养：将步骤（1）的孢子悬浮液接种到放有培养基的种子瓶中，接种量10%（体积比），置于25℃，120转/分钟的摇床上培养36小时，所述的培养基为：碳源葡萄糖20g/l；氮源酵母粉5g/l；pH5.5。
c)发酵瓶培养：待种子瓶中菌浓达到15%（体积比），接入到放有发酵培养基的发酵瓶中，接种量10%（体积比），置于25℃，120转/分钟的摇床上培养9天。所述发酵培养基为：碳源葡萄糖50g/l；氮源酵母粉10g/l；pH5.5。
d)后处理：将发酵培养得到的发酵液分离，得到湿菌体，烘干得到干菌体30g。向干菌体中加入萃取剂正己烷进行萃取，萃取后分离得到的固相物转入萃取容器中进行重复萃取，如此，直至萃取液中无油时结束萃取过程，第一次萃取时加入200毫升正己烷，之后每次加入150毫升正己烷，将每次萃取充后过滤分离得到的混合油，脱溶，得到微生物油酯。
e)将该微生物油脂进行气相色谱分析，同时进行凝固点试验，该微生物油脂中的主要不饱和脂肪酸和长链饱和脂肪酸的含量包括棕榈酸(C16:0)、硬脂酸(C18:0)、油酸(C18:1)、亚油酸(C18:2)、γ-亚麻酸(C18:3)、花生酸(C20:0)、二十碳三烯酸(C20:3)、花生四烯酸(C20:4)、山嵛酸(C22:0)、木蜡酸(C24:0)见下表：
表1实施例2中花生四烯酸油脂中各脂肪酸含量
| 市售菌种(wt%) | 本发明用菌种(wt%) | |
| 棕榈酸(C16:0) | 7.99 | 9.19 |
| 硬脂酸(C18:0) | 6.52 | 10.2 |
| 油酸(C18:1) | 9.52 | 9.21 |
| 亚油酸(C18:2) | 8.22 | 8.45 |
| γ-亚麻酸(C18:3) | 5.21 | 6.33 |
| 二十碳三烯酸(C20:3) | 8.09 | 5.46 |
| 花生四烯酸(C20:4) | 35.3 | 35.6 |
| 花生酸(C20:0) | 3.28 | 3.43 |
| 山嵛酸(C22:0) | 4.1 | 4.12 |
| 木蜡酸(C24:0) | 11.78 | 7.26 |
本实施例用高山被孢霉突变株菌种所制备的花生四烯酸油脂中，甘油三脂的含量为91wt%，另结合表1可知：该花生四烯酸油脂中花生四烯酸油脂的含量为35.3wt%，三种长链饱和脂肪酸即花生酸（C20:0）、山嵛酸（C22:0）、木蜡酸（C24:0）的总含量为14.81wt%，其中木蜡酸（C24:0）的含量为7.26wt%。明显低于市售菌种所制备的花生四烯酸油脂中三种长链饱和脂肪酸的总含量（19.16wt%），而木蜡酸（C24:0）的含量也明显低于市售菌种所制备的花生四烯酸油脂中木蜡酸（C24:0）的含量（11.78wt%）。另，经凝固点测定:本发明用高山被孢霉突变株菌种所制备的花生四烯酸油脂凝固点为9℃，其远低于市售菌种所制备的花生四烯酸油脂的凝固点（18℃）。
实施例3利用高山被孢霉突变株生产花生四烯酸
a)孢子悬浮液准备：分别取市售的高山被孢霉和本发明所使用的高山被孢霉（保藏编号：CCTCC M2013419）接种到马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基平板上，25-28℃培养8天至孢子成熟，后将马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基平板上的孢子和菌丝刮到装有20毫升无菌水，震荡获得孢子悬浮液。
b)摇瓶种子培养：将步骤（1）的孢子悬浮液接种到放有培养基的种子瓶中，接种量15%（体积比），置于28℃，220转/分钟的摇床上培养48小时，所述培养基为：碳源蔗糖35g/l；氮源酵母浸粉12g/l；pH7。
c)种子扩大培养：最终发酵罐培养采用50L的容积，因此种子罐选用10L种子扩大发酵罐。将步骤（2）的摇瓶种子发酵液接种到种子罐中进行种子扩大培养，其中的种子培养基碳源蔗糖35g/l；氮源酵母浸粉12g/l，控制pH7，发酵温度为28℃，搅拌速度220转/分钟，通气量1vvm（L/L.min），罐压0.1Mpa，培养42h。
d)发酵培养：种子罐中菌浓达到20%后，通过移种管道接入到装有30L发酵培养基的50L发酵罐中进行培养，接种量15%（体积比），发酵罐控制温度28℃，搅拌速度220转/分钟，通气量1vvm（L/L.min），罐压0.1Mpa，培养170h。发酵过程中通过流加碳源来控制发酵液中碳源浓度在10g/L，所述发酵罐中的发酵培养基为：碳源蔗糖35g/l；氮源酵母浸粉12g/l；pH7。
e)后处理：将发酵培养得到的发酵液分离，得到湿菌体，烘干得到干菌体40g。向干菌体中加入萃取剂正己烷进行萃取，萃取后分离得到的固相物转入萃取容器中进行重复萃取，如此，直至萃取液中无油时结束萃取过程，第一次萃取时加入200毫升正己烷，之后每次加入150毫升正己烷，将每次萃取充后过滤分离得到的混合油，脱溶，得到微生物油酯。
f)将该微生物油脂进行气相色谱分析，同时进行凝固点试验，该微生物油脂中的主要不饱和脂肪酸和长链饱和脂肪酸的含量包括棕榈酸(C16:0)、硬脂酸(C18:0)、油酸(C18:1)、亚油酸(C18:2)、γ-亚麻酸(C18:3)、花生酸(C20:0)、二十碳三烯酸(C20:3)、花生四烯酸(C20:4)、山嵛酸(C22:0)、木蜡酸(C24:0)如下：
表2实施例3中花生四烯酸油脂中各脂肪酸含量
| 市售菌种(wt%) | 本发明所用菌种(wt%) | |
| 棕榈酸(C16:0) | 7.81 | 9.02 |
| 硬脂酸(C18:0) | 7.32 | 11.3 |
| 油酸(C18:1) | 8.21 | 9.08 |
| 亚油酸(C18:2) | 7.89 | 6.01 |
| γ-亚麻酸(C18:3) | 3.9 | 5.8 |
| 二十碳三烯酸(C20:3) | 4.7 | 6.5 |
| 花生四烯酸(C20:4) | 40.8 | 41.3 |
| 花生酸(C20:0) | 3.2 | 3.1 |
| 山嵛酸(C22:0) | 4.3 | 4 |
| 木蜡酸(C24:0) | 11.23 | 3.2 |
本实施例用高山被孢霉突变株菌种所制备的花生四烯酸油脂中，甘油三脂的含量为93wt%，另结合表2可知：该花生四烯酸油脂中花生四烯酸油脂的含量为40.8wt%，三种长链饱和脂肪酸，即花生酸（C20:0）、山嵛酸（C22:0）、木蜡酸（C24:0）的总含量为10.3wt%，其中木蜡酸（C24:0）的含量为3.2wt%，明显低于市售菌种所制备的花生四烯酸油脂中三种长链饱和脂肪酸的总含量（18.73wt%），另木蜡酸（C24:0）的含量也明显低于市售菌种所制备的花生四烯酸油脂中木蜡酸（C24:0）的含量（11.23wt%）。另，经凝固点测定:本发明生产的花生四烯酸油脂凝固点为6℃。其远低于市售菌种所制备的花生四烯酸油脂的凝固点（15℃）。
实施例4利用高山被孢霉突变株生产花生四烯酸
1)孢子悬浮液准备：分别取市售的高山被孢霉和本发明所使用的高山被孢霉突变株（保藏编号：CCTCC M2013419）接种到马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基平板上，？-？℃培养8天至孢子成熟，后将马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基平板上的孢子和菌丝刮到装有30毫升无菌水，震荡获得孢子悬浮液。
2)摇瓶种子培养：将步骤（1）的孢子悬浮液接种到放有培养基的种子瓶中，接种量20%（体积比），置于30℃，300转/分钟的摇床上培养50小时，所述培养基为：碳源蔗糖50g/l；氮源酵母浸粉12g/l；pH8.5。
3)种子扩大培养：最终发酵罐的体积为200m3，依次选用容积为10L，50L，5m3，50m3的种子罐扩大培养种子液，种子罐中培养基装量为60%（体积比），培养过程工艺控制为：温度30℃，搅拌速度300转/分钟，通气量1.5vvm（L/L.min），培养时间48h。所述种子罐中的种子培养基为：碳源淀粉50g/l；氮源酵母浸膏20g/l；pH8.5，将上述步骤的摇瓶培养液逐级扩大培养。
4)发酵培养：待50m3种子罐中的菌浓达到30%（体积比）后，通过移种管道接入到装有130m3发酵培养基的200m3发酵罐中进行培养，接种量20%（体积比），发酵罐控制温度30℃，搅拌速度300转/分钟，通气量1.5vvm（L/L.min），罐压0.15Mpa，培养180h。发酵过程中通过流加碳源来控制发酵液中碳源浓度在20g/L，所述发酵罐培养基为：碳源淀粉50g/l；氮源酵母浸膏20g/l；pH8.5。
5)后处理：将发酵培养得到的发酵液分离，得到湿菌体，烘干得到干菌体50g。向干菌体中加入萃取剂正己烷进行萃取，萃取后分离得到的固相物转入萃取容器中进行重复萃取，如此，直至萃取液中无油时结束萃取过程，第一次萃取时加入200毫升正己烷，之后每次加入150毫升正己烷，将每次萃取充后过滤分离得到的混合油，脱溶，得到微生物油酯。
6)将该微生物油脂进行气相色谱分析，同时进行凝固点试验，该微生物油脂中的主要不饱和脂肪酸和长链饱和脂肪酸的含量包括棕榈酸(C16:0)、硬脂酸(C18:0)、油酸(C18:1)、亚油酸(C18:2)、γ-亚麻酸(C18:3)、花生酸(C20:0)、二十碳三烯酸(C20:3)、花生四烯酸(C20:4)、山嵛酸(C22:0)、木蜡酸(C24:0)如下：
表3实施例4中花生四烯酸油脂中各脂肪酸含量
| 对照菌种(ｗt%) | 本发明所用菌种(ｗt%) | |
| 棕榈酸(C16:0) | 7.99 | 9.78 |
| 硬脂酸(C18:0) | 7.31 | 10.52 |
| 油酸(C18:1) | 6.77 | 9.32 |
| 亚油酸(C18:2) | 7.36 | 8.37 |
| γ-亚麻酸(C18:3) | 2.65 | 3.1 |
| 二十碳三烯酸(C20:3) | 4.63 | 6.27 |
| 花生四烯酸(C20:4) | 44.97 | 44.56 |
| 花生酸(C20:0) | 3.1 | 1.5 |
| 山嵛酸(C22:0) | 4 | 3.08 |
| 木蜡酸(C24:0) | 12 | 2.92 |
本实施例用高山被孢霉突变株菌种所制备的花生四烯酸油脂中，甘油三脂的含量为95wt%，另结合表2可知：该花生四烯酸油脂中花生四烯酸油脂的含量为44.97wt%，三种长链饱和脂肪酸，即花生酸（C20:0）、山嵛酸（C22:0）、木蜡酸（C24:0）的总含量为7.5wt%，其中木蜡酸（C24:0）的含量为2.92wt%，明显低于市售菌种所制备的花生四烯酸油脂中三种长链饱和脂肪酸的总含量（19.1wt%），另木蜡酸（C24:0）的含量也明显低于市售菌种所制备的花生四烯酸油脂中木蜡酸（C24:0）的含量（12wt%）。另，经凝固点测定:本发明生产的花生四烯酸油脂凝固点为4℃，其远低于市售菌种所制备的花生四烯酸油脂的凝固点（15℃）。
综合以上实施例可以看出，利用本发明所述的高山被孢霉突变株生产的花生四烯酸油脂，其花生四烯酸的含量与市售产品差别不大，但是二十碳以上长链饱和脂肪酸的总含量明显较低，特别是二十四碳饱和脂肪酸的含量明显较低，由此使花生四烯酸油脂的凝固点也比较低（最低可低至4℃），其即使在较低温度下也不会凝固结晶析出饱和脂肪酸，可保持清亮透明，具有较高的品质。
Claims (5)
1.高山被孢霉突变株，其特征在于：该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC），保藏地址是，中国，武汉，武汉大学，保藏编号为CCTCC NO:M2013419。
2.权利要求1所述的高山被孢霉突变株在生产低含量长链饱和脂肪酸的花生四烯酸油脂中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述的花生四烯酸油脂中二十碳以上的长链饱和脂肪酸含量低于15wt%。
4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述的花生四烯酸油脂中木蜡酸的含量小于8wt%。
5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述花生四烯酸油脂的凝固点为4℃-11℃。
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