CN1362522A - 用离子束生物工程诱变菌生产含花生四烯酸油脂的方法 - Google Patents

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CN1362522A CN 01136956 CN01136956A CN1362522A CN 1362522 A CN1362522 A CN 1362522A CN 01136956 CN01136956 CN 01136956 CN 01136956 A CN01136956 A CN 01136956A CN 1362522 A CN1362522 A CN 1362522A
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余增亮
姚建铭
王纪
王文生
袁成凌
王相勤
唐春落
汪志明
尚耘
贡国鸿
唐孝鹏
何平
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Abstract

本发明涉及一种用离子束生物工程诱变菌生产含花生四烯酸油脂的方法,选用高山被孢霉出发菌为菌种经过N+离子注入诱变得到诱变高产菌,再经过接种、发酵,精炼得到含花生四烯酸油脂产品,该方法所用的诱变菌活性好,油脂生产能力高,花生四烯酸含量高,该产品是一种营养强化剂,是人类重要的保健品。

Description

用离子束生物工程诱变菌生产含花生四烯酸油脂的方法
(一)技术领域
本发明涉及一种用离子束生物工程诱变菌生产含花生四烯酸油脂的方法，属于生物技术。
(二)背景技术
花生四烯酸，英文为Arachidonic.acid，简称AA，是5，8，11，14-二十碳四烯酸，它是一种人体必要脂肪酸，属于n-6系列的多不饱和脂肪酸，简记为20∶4(n-6)大量研究表明，人体缺乏多不饱和脂肪酸将引起机体功能失调，导致某些疾病，而补充多不饱和脂肪酸则可预防或治疗这些疾病，如婴儿缺乏花生四烯酸和DHA，可造成永久性智力低下和视力障碍，6-12岁儿童的皮肤瘙痒、眼角干燥、上课注意力不集中，数学成绩下降等症状与其血浆中花生四烯酸和DHA含量低有明显的正相关。同时研究表明，花生四烯酸对婴儿的大脑发育和视觉功能的完善有着极为重要的意义，花生四烯酸对高血压、高血脂、糖尿病、病毒感染等疾病的预防和治疗也有显著的效果。世界卫生组织和国际粮农组织针对人类花生四烯酸摄入量的不足，建议在婴儿配方奶粉中添加花生四烯酸，提高婴幼儿的健康水平。因此，花生四烯酸既是一种营养强化剂，同时也是人类重要的保健品。
目前市场销售的花生四烯酸产品，主要从深海鱼油中提取，由于原料的限制，花生四烯酸含量低且很不稳定，而且产量低、成本高，无法进行规模化生产。近年来，美国马泰克公司公布了一项专利，公开号：CN1175976A，它采用高山被孢霉菌种，通过发酵法进行小规模实验，但仍然存在菌种活性低、油脂产量低、花生四烯酸生产能力低等缺点。
(三)发明内容
本发明的任务正是为了克服上述已有技术的缺点与不足，而提供一种用高活性的离子束生物工程诱变菌生产含花生四烯酸油脂的方法，从而可得到产量高、花生四烯酸含量高、价格便宜的产品，为人类的保健和预防疾病提供了条件。
本发明的任务是通过下列技术方案实现的：
用离子束生物工程诱变菌生产花生四烯酸油脂的方法，其特征在于它按下列步骤进行：
a)以高山被孢霉为出发菌，按常规方法制菌斑，并置入离子注入机靶室内进行离子注入，靶室内真空度为2×10-4-2×10-6乇，以N+为注入离子，离子注入能量为10-15Kev，注入剂量为2.5×1014-3.5×1014N+/cm2，离子注入完成后，进行单菌落筛选，以摇瓶培养的花生四烯酸产率为标准，挑选高产菌种，反复多次进行离子注入诱变和选育，以花生四烯酸产率大于4g/L，即获得用离子束生物工程诱变的高山被孢霉菌；
b)将离子束生物工程诱变菌菌种，按常规方法进行摇瓶培养后，培养液接种于种子罐进行两级制种，培养基组成为葡萄糖20-30g/L，蛋白胨8-12g/L，酵母粉3-8g/L，花生粉3-5g/L，PH＝8-10，保持罐压0.03Mpa，每级培养时间为48小时，一级制种的制种液再进行二级制种时，其两级种子罐的体积比为1∶10，两级制种得到种子液；
c)再将(b)项的种子液接种于发酵罐中进行发酵，发酵罐的体积为二级种子罐体积的五倍，起始培养基组成为葡萄糖30-40g/L，蛋白胨8-12g/L，酵母粉3-8g/L，花生粉5-10g/L，稳定通气，罐压0.01Mpa，温度30-20℃，逐步降温培养，当发酵罐中的葡萄糖含量低于10g/L时，进行多次补充葡萄糖，使发酵过程葡萄糖的消耗量为60g/L，发酵72小时后进行定期测定花生四烯酸含量，当花生四烯酸含量大于45％，发酵液残留葡萄糖含量低于2.8g/L时，结束发酵，整个发酵时间为7-9天；
d)发酵结束后，进行过滤，收集湿菌体，低温干燥，获得含水量为6-8％干菌体，再用4号溶剂抽提干菌体中油脂，得到粗油，经脱胶、脱酸、脱色、脱臭即制成本发明的含花生四烯酸的油脂产品。
本发明所采用的用离子束生物工程诱变菌种高山被孢霉ALK-1，已在中国典型培养物保藏中心进行菌种保藏：
分类命名：高山被孢霉ALK-1，
拉丁文：Mortierella alpina ALK-1，
保藏单位名称：中国典型培养物保藏中心
保藏单位地址：中国·武汉·武汉大学校内
邮政编码：430072
保藏日期：2001年10月10日
保藏编号：M201036
离子注入诱变是一种集物理和化学诱变特征于一体的综合诱变，具有能量沉积、质量沉积、动量传递以及电荷交换等广泛效应，因此获得的离子束生物工程诱变菌积累油脂和花生四烯酸的能力有了极为显著的提高，生物量和油脂总量同步发展，干菌体含油可达30％以上，油脂中花生四烯酸含量可达50％以上，而且具有较高的碳源转化利用率，同时培养条件粗放，对发酵生产设备要求不高，因而是一种非常适合于生产含花生四烯酸油脂的微生物菌种。
由于采取上述技术方案，使本发明技术与已有技术相比具有如下优点及效果。
a)采用离子生物工程诱变菌，油脂生产能力可提高1-5倍以上，花生四烯酸生产能力提高1-5倍以上；
b)发酵条件简单，发酵过程操作方便，易控制；
c)原料转化利用率提高30％以上。
(四)具体实施方式
实施例1：选择高山被孢霉出发菌菌种，按常规方法经母斜面、子斜面培养后，制成含95％以上的单孢子的悬浮液，风干制成菌斑，再将菌斑置入离子注入机靶室内进行离子注入，靶室内真空度为2×10-4乇，以N+为注入离子，离子注入能量为10Kev，注入剂量为2.5×1014N+/cm2；离子注入完成后，菌斑经洗脱，培养，进行单菌落筛选，以摇瓶培养的花生四烯酸产率为标准，挑选高产菌种，经反复多次进行离子注入诱变和选育，以花生四烯酸产率大于4g/L，即获得用离子束生物工程诱变的高山被孢霉菌，将离子束生物工程诱变的菌种，按常规方法进行摇瓶培养后，培养液接种于1T种子罐进行一级制种，培养基组成为葡萄糖20g/L，蛋白胨12g/L，酵母粉5g/L，花生粉5g/L，PH＝8，保持罐压0.03Mpa，一级培养时间为48小时，将一级制种液再进行二级制种，其二级种子罐的体积为10T，接种48小时后，得到种子液；种子液接种于发酵罐中进行发酵，发酵罐的体积为50T，起始培养基组成为葡萄糖40g/L，蛋白胨8g/L，酵母粉3g/L，花生粉10g/L，稳定通气，罐压0.01Mpa，温度30-20℃，逐步降温培养，当发酵罐中的葡萄糖含量低于10g/L时，进行多次补充葡萄糖，使发酵过程葡萄糖的消耗量为60g/L，发酵72小时后进行定期测定花生四烯酸含量，当花生四烯酸含量大于45％，发酵液残留葡萄糖含量低于2.8g/L时，结束发酵，整个发酵时间为7天；发酵结束后，进行过滤，收集湿菌体，低温干燥，获得含水量为6％干菌体，再用4号溶剂抽提干菌体中油脂，得到粗油，经脱胶、脱酸、脱色、脱臭即制成本发明的含花生四烯酸的油脂产品。干菌体产量为30.7g/L，油脂10.8g/L，花生四烯酸产率4.65g/L，脂肪酸组成见表1：
          表1含花生四烯酸油脂产品的脂肪酸组成
    脂肪酸   含量(％)     脂肪酸   含量(％)
    14：0     0.38     16：0     8.01
    16：1     0.86     18：0     11.78
    18：1     16.96     18：2     6.88
    18：3(n-6)     3.93     20：0     1.06
    18：3(n-3)     0.24     20：1     0.42
    20：4     47.93     其它     1.55
实施例2：选择高山被孢霉出发菌菌种，按常规方法经母斜面、子斜面培养后，制成含95％以上的单孢子的悬浮液，风干制成菌斑，再将菌斑置入离子注入机靶室内进行离子注入，靶室内真空度为2×10-6乇，以N+为注入离子，离子注入能量为15Kev，注入剂量为3.5×1014N+/cm2；离子注入完成后，菌斑经洗脱，培养，进行单菌落筛选，以摇瓶培养的花生四烯酸产率为标准，挑选高产菌种，经反复多次进行离子注入诱变和选育，以花生四烯酸产率大于4g/L，即获得用离子束生物工程诱变的高山被孢霉菌，将离子束生物工程诱变的菌种，按常规方法进行摇瓶培养后，培养液接种于1T种子罐进行一级制种，培养基组成为葡萄糖30g/L，蛋白胨8g/L，酵母粉8g/L，花生粉3g/L，PH＝10，保持罐压0.03Mpa，一级培养时间为48小时，将一级制种液再进行二级制种，其二级种子罐的体积为10T，接种48小时后，得到种子液；种子液接种于发酵罐中进行发酵，发酵罐的体积为50T，起始培养基组成为葡萄糖30g/L，蛋白胨12g/L，酵母粉3g/L，花生粉5g/L，稳定通气，罐压0.01Mpa，温度30-20℃，逐步降温培养，当发酵罐中的葡萄糖含量低于10g/L时，进行多次补充葡萄糖，使发酵过程葡萄糖的消耗量为60g/L，发酵72小时后进行定期测定花生四烯酸含量，当花生四烯酸含量大于45％，发酵液残留葡萄糖含量低于2.8g/L时，结束发酵，整个发酵时间为9天；发酵结束后，进行过滤，收集湿菌体，低温干燥，获得含水量为8％干菌体，再用4号溶剂抽提干菌体中油脂，得到粗油，经脱胶、脱酸、脱色、脱臭即制成本发明的含花生四烯酸的油脂产品。干菌体产量为29.5g/L，含油量为39.4％，油脂为11.6g/L，花生四烯酸含量为52.2％，花生四烯酸产率为6.07g/L，其脂肪酸组成见表2：
        表2含花生四烯酸油脂产品的脂肪酸组成
  脂肪酸   含量(％)   脂肪酸  含量(％)
    14：0     1.01   16：0   10.78
    18：1     6.04   18：1   6.97
    18：2     4.31   18：3(n-6)   2.77
    20：3     5.67     其它   10.25
    20：4     52.2

Claims (1)

1、用离子束生物工程诱变菌生产含花生四烯酸油脂的方法，其特征在于它按下列步骤进行：
a)以高山被孢霉为出发菌，按常规方法制菌斑，并置入离子注入机靶室内进行离子注入，靶室内真空度为2×10-4-2×10-6乇，以N+为注入离子，离子注入能量为10-15Kev，注入剂量为2.5×1014-3.5×1014N+/cm2，离子注入完成后，进行单菌落筛选，以摇瓶培养的花生四烯酸产率为标准，挑选高产菌种，反复多次进行离子注入诱变和选育，以花生四烯酸产率大于4g/L，即获得用离子束生物工程诱变的高山被孢霉菌；
b)将离子束生物工程诱变菌菌种，按常规方法进行摇瓶培养后，培养液接种于种子罐进行两级制种，培养基组成为葡萄糖20-30g/L，蛋白胨8-12g/L，酵母粉3-8g/L，花生粉3-5g/L，PH＝8-10，保持罐压0.03Mpa，每级培养时间为48小时，一级制种的制种液再进行二级制种时，其两级种子罐的体积比为1∶10，两级制种得到种子液；
c)再将(b)项的种子液接种于发酵罐中进行发酵，发酵罐的体积为二级种子罐体积的五倍，起始培养基组成为葡萄糖30-40g/L，蛋白胨8-12g/L，酵母粉3-8g/L，花生粉5-10g/L，稳定通气，罐压0.01Mpa，温度30-20℃，逐步降温培养，当发酵罐中的葡萄糖含量低于10g/L时，进行多次补充葡萄糖，使发酵过程葡萄糖的消耗量为60g/L，发酵72小时后进行定期测定花生四烯酸含量，当花生四烯酸含量大于45％，发酵液残留葡萄糖含量低于2.8g/L时，结束发酵，整个发酵时间为7-9天；
d)发酵结束后，进行过滤，收集湿菌体，低温干燥，获得含水量为6-8％干菌体，再用4号溶剂抽提干菌体中油脂，得到粗油，经脱胶、脱酸、脱色、脱臭即制成本发明的含花生四烯酸的油脂产品。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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