CN101805760A - 一种生产含有花生四烯酸的微生物油脂的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种利用含木糖的底物发酵生产含有花生四烯酸的微生物油脂的方法，采用低能离子束诱变的方法，诱变筛选出可以高效利用木糖的高山被孢霉，以葡萄糖和木糖的混合糖作为碳源发酵生产富含花生四烯酸的微生物油脂。本发明利用廉价的木质纤维素水解糖为发酵底物，经产油微生物转化获取油脂，将显著降低微生物油脂生产成本，形成节约耕地、可连续生产的油脂获取路线，并且还有利于环境保护和社会经济可持续发展。

Description

一种生产含有花生四烯酸的微生物油脂的方法

技术领域

本发明涉及一种生产微生物油脂的方法，具体是一种生产含有花生四烯酸的微生物油脂的方法。

技术领域

花生四烯酸(Arachidonic Acid)简称ARA，是5，8，11，14-二十碳四烯酸。它是人体的一种必需脂肪酸，其分子结构式为：

从分子结构式中可见，该脂肪酸含有20个碳原子，4个双键，其中第一个双键起始于甲基端起第6个碳原子上，故属于n-6系列的多不饱和脂肪酸，简记为20:4(n-6)。

ARA是人体中含量最丰富也是最活跃的C20PUFA。它主要存在于器官、肌肉和血液组织中，在血液、肝脏、肌肉和其它器官系统中作为主要与磷脂结合的结构脂类起着重要作用。除了主要的结构脂类作用之外，ARA还是许多循环二十烯酸衍生的生物活性物质(eicosenoid)，例如前列腺素E：(PGE2)，前列腺环素(PG12)，血栓烷A：(TxA：)，和白细胞三烯leukotireneB+(LTB4)和C，(LTC4)的直接前体。这些eicosenoid具有对脂蛋白代谢，血液流变学，血管弹性，白细胞功能和血小板激活的调节作用。

尽管ARA对人体很重要，但是它不能在体内从头合成。ARA是通过必需脂肪酸亚油酸(LOA)的延长和去饱和来合成的。该过程需要酶Δ6-去饱和酶的存在，该酶在人体内含量很低。所以，大多数ARA必须靠饮食提供，这一点在身体的快速成长期，例如婴儿期，尤为重要。婴儿在第一年中其体重可增至2至3倍。所以，需要大量的饮食ARA。世界粮农组织和卫生组织(FAO/WHO)在“人类营养油脂”(1995)的报告中建议孕妇与婴幼儿食谱每天应有60mg/kg(体重)ARA的摄入量。

花生四烯酸主要来源有植物、动物组织、鱼油以及微生物和微藻类等，但花生四烯酸在动物组织中含量低，一般小于0.2％(wt/wt)，来源也有限，而微生物发酵法则为生产花生四烯酸开辟了新途径，它具有不受原材料及气候限制、生长周期短、培养工艺简单、花生四烯酸含量高等特点，近几年已成为国内外研究的热点。而利用各种廉价原材料培养产油微生物，可进一步降低微生物油脂的生产成本。

微生物发酵底物范围较广，包括可直接利用的葡萄糖、果糖、蔗糖、糖蜜等，以及需要经过预处理的淀粉、纤维素等。目前国内外发酵法生产花生四烯酸的主要原料是葡萄糖等粮食作物。利用廉价碳源，如木质纤维素水解产物，直接发酵生产微生物油脂的方法尚未见公开报道。每年有大量的农林业废弃物(如玉米秸秆)等木质纤维素材料用焚烧等方式不当处理，既造成浪费又污染环境。通过技术进步，以秸秆等木质纤维素材料为原料生产花生四烯酸的成本有望低于粮食发酵生产花生四烯酸的成本。

木质纤维素是地球上最丰富的有机资源之一，它占地球生物质总量的60-80％。，主要由纤维素、半纤维素和木质素组成，在农业废弃物中的三者的含量大约是：30-40％纤维素，20-30％半纤维素，10-25％木质素。其中，葡萄糖是纤维素的组成单元，木糖是半纤维素的主要组成单元。在植物纤维材料水解液中木糖占30％左右，是继葡萄糖之后自然界中最丰富的糖分，因此，葡萄糖木糖的共利用是开发木质纤维素的关键技术之一。

发明内容

本发明提供了一种利用含木糖的底物发酵生产含有花生四烯酸的微生物油脂的方法，利用廉价的木质纤维素水解糖为发酵底物，经产油微生物转化获取油脂，将显著降低微生物油脂生产成本，形成节约耕地、可连续生产的油脂获取路线，并且还有利于环境保护和社会经济可持续发展。

本发明的技术方案为：

利用含木糖的底物发酵生产含有花生四烯酸的微生物油脂的方法，其特征在于：包括以下步骤：

(1)、原始菌种的活化：将高山被孢霉菌种接种到斜面培养基上在25-30℃下培养7-10天，选取菌丝和孢子生长旺盛的新鲜平板，洗脱下平板孢子，过滤得孢子悬液；

(2)、离子束诱变：将孢子悬液涂布于无菌平皿上，风干，进行脉冲式N⁺离子注入，选用N⁺离子的能量和剂量分别是10Kev和1.3×10¹⁵N⁺/cm²；然后将离子注入过的孢子悬液用无菌水洗脱后，稀释涂布于木糖筛选平板培养基上在25-30℃下培养，挑选出能在木糖筛选平板培养基上生长且菌丝生长旺盛的的菌落，作为初筛的单菌落，将初筛的单菌落转接斜面培养，接入摇瓶发酵培养转接摇瓶发酵培养基中发酵，挑选出生物量和油脂含量高的菌种作为复筛的结果，然后对复筛的结果重复进行离子束诱变、初筛和复筛过程；所述的木糖筛选平板培养基中主要组分的重量百分含量为：木糖2％，蛋白胨0.5％，酵母膏1.0％，基质蒸馏水，pH8.0，28℃；

(3)、液体培养：将离子束诱变、筛选过的菌种于PH值为7.5-8.5液体培养基中在28-30℃下培养18-24小时，液体培养基中主要原料组分的重量百分比为：葡萄糖4-6％、木糖2-5％、蛋白胨0.5-1％、豆粕0.5-1.5％，基质蒸馏水；

(4)、扩大培养：将液体培养后的菌种接种于发酵罐中的发酵培养基中在28-30℃下培养10-12天，发酵培养基中原料组分的重量百分比为：葡萄糖4-6％、木糖2-5％、蛋白胨0.5-1％、豆粕0.5-1.5％，基质为蒸馏水；

(5)、菌丝体的油脂提取：将扩大培养后得到的菌丝体进行收集，然后进行离心、洗涤、100-110℃干燥、萃取得成品。

所述的生产含有花生四烯酸的微生物油脂的方法，其特征在于：所述的斜面培养基中主要原料成分的重量百分份比为：葡萄糖1.5-2.5％，马铃薯浸出液18-22％，琼脂1.5-2％。

所述的生产含有花生四烯酸的微生物油脂的方法，其特征在于：所述的液体培养的摇床转度为180-230rpm，PH值为8，液体培养基中主要原料组分的重量百分比为：葡萄糖5％、木糖3％、蛋白胨0.7％、豆粕1％；所述的扩大培养是将液体培养后的菌种以8-12％的比例接种于发酵罐中，发酵罐的通气量为1.0-1.5L/min，搅拌速度为400-500转/分，发酵罐内PH值为7.5-8.5，温度为28℃，时间为10-12天，发酵培养基中主要原料组分的重量百分比为：葡萄糖5％、木糖3％、蛋白胨0.7％、豆粕1％，基质为蒸馏水，发酵培养基的PH值为7.5-8.5，温度为28℃；

所述的生产含有花生四烯酸的微生物油脂的方法，其特征在于：所述的木糖选用含有五碳糖的木质纤维素水解糖；所述的油脂的萃取选用石油醚、正己烷。

本发明各种培养基的基质一般均为蒸馏水。

本发明采用离子束修饰细胞技术诱变筛选微生物菌种，获得能高效利用木糖的高山被孢霉优良菌株，按照常规方法将该菌株接种到含木糖的发酵培养基中，通气培养至发酵液中总还原糖浓度降至1％以下时停止，离心收集菌体，经常规的有机溶剂提取方法获得微生物油脂，并采用气相色谱法检测油脂中多不饱和脂肪酸的含量。

在本发明中，在适合于生产含ARA油脂的条件下培养真菌。一般，真菌培养技术是本领域技术人员所熟知的，这些技术可以用于本发明方法。例如，可以在摇瓶中进行真菌接种量的深层培养。摇瓶中装有生长培养基，植入真菌菌丝，在往复式摇床上培养约5至10天。

本发明所述的液体培养基和发酵培养基的组成可以不相同，但都含有碳源和氮源。本发明采用的碳源是葡萄糖和木糖混合糖，比例是(5∶3)，其含量在约每升培养基30-100克。通常，在培养过程中需要另外加入碳源。这是因为微生物对碳的消耗量很大，以致于一次性加入全部碳源是不可行的。

氮源的提供通常为蛋白胨和酵母提取物，其浓度为约每升生长培养基5-20克提取物。较好的是，提供约17g/L。也可以使用其它氮源，包括玉米浸出液，大豆粉，花生粉等。氮源可以成批加入，即在培养前一次性全部加入。

本发明利用高山被孢霉发酵，能够获得很高的生物质产量，其中约含20-60％的油脂，油脂中按重量计25-70％是甘油三酯形式的ARA残基。

收获菌丝体后，经离心分离和洗涤得到的菌体，并在105℃干燥至恒重。然后选择非极性溶剂，如常规的石油醚、正己烷等来萃取含ARA的微生物油脂。

花生四烯酸的检测：准确称取0.30g菌体(或0.1g油脂)于5ml容量瓶中，加入0.5mol/L的KOH-甲醇液1ml，60℃水浴30min，其间经常振荡；向容量瓶内加入三氟化硼-甲醇溶液1ml，60℃水浴30min，其间充分振荡；冷却至室温后向容量瓶中加入1ml石油醚，充分震荡；向容量瓶中加入1ml饱和食盐水，使容量瓶内溶液更好地分层，分层后的最上层(石油醚层)即可用于气相色谱分析。准确称取0.30g菌体(或0.1g油脂)于5ml容量瓶中，加入0.5mol/L的KOH-甲醇液1ml，60℃水浴30min，其间经常振荡；向容量瓶内加入三氟化硼-甲醇溶液1ml，60℃水浴30min，其间充分振荡；冷却至室温后向容量瓶中加入1ml石油醚，充分震荡；向容量瓶中加入1ml饱和食盐水，使容量瓶内溶液更好地分层，分层后的最上层(石油醚层)即可用于气相色谱(GC)分析检测。

经过GC/MS检测，表明ARA油脂中除花生四烯酸外，还含有γ-亚麻酸、亚油酸以及花生三烯酸等多不饱和脂肪酸，其中不饱和脂肪酸所占比例接近70％。

本发明中萃取得到的油脂中含有大于40％的ARA。

气相色谱条件：岛津GC-14A气相色谱仪，C-R4A数据处理仪，毛细管柱BPX70(SGE公司)，25m×φ0.22mm×0.25μm，氢焰离子化检测器(FID)，柱温120-240℃，5℃/min程升，进样量：1.0ul，分流比：50∶1，气化室温度250℃，检测室温度250℃气相色谱条件：岛津GC-14A气相色谱仪，C-R4A数据处理仪，毛细管柱BPX70(SGE公司)，25m×φ0.22mm×0.25μm，氢焰离子化检测器(FID)，柱温120-240℃，5℃/min程升，进样量：1.0ul，分流比：50∶1，气化室温度250℃，检测室温度250℃。

附图说明

图1是本发明的发酵时间曲线图。

图2是补料分批发酵时间曲线图。

具体实施方式

例1

利用含木糖的底物发酵生产含有花生四烯酸的微生物油脂的方法，包括以下步骤：

(1)、原始菌种的活化：将高山被孢霉菌种接种到斜面培养基上在25-30℃下培养7-10天，选取菌丝和孢子生长旺盛的新鲜平板，洗脱下平板孢子，过滤得孢子悬液；斜面培养基中主要原料成分的重量百分份比为：葡萄糖2％，马铃薯浸出液20％，琼脂1.8％；

(2)、离子束诱变：将孢子悬液涂布于无菌平皿上，风干，进行脉冲式N⁺离子注入，选用N⁺离子的能量和剂量分别是10Kev和1.3×10¹⁵N⁺/cm²；然后将离子注入过的孢子悬液用无菌水洗脱后，稀释涂布于木糖筛选平板上在25-30℃下培养，挑选出能在木糖筛选平板培养基上生长且菌丝生长旺盛的的菌落，作为初筛的单菌落，将初筛的单菌落转接斜面培养，接入摇瓶发酵培养转接摇瓶发酵培养基中发酵，挑选出生物量和油脂含量高的菌种作为复筛的结果，然后对复筛的结果重复进行离子束诱变、初筛和复筛过程；

(3)、液体培养：将离子束诱变、筛选过的菌种于PH值为8的500ml的液体培养基中在28-30℃，摇床转度为180-230rpm下培养18-24小时，液体培养基中主要原料组分的重量百分比为：葡萄糖5％、木糖3％、蛋白胨0.7％、豆粕1％；

(4)、扩大培养：将液体培养后的菌种以10％的比例(种子培养基与发酵罐内发酵培养基的比例)接种于5L发酵罐中的发酵培养基中在30℃下培养10-12天，发酵罐的通气量为1.0-1.5L/min，搅拌速度为400-500转/分，PH值为7.5-8.5，发酵培养基中主要原料组分的重量百分比为：葡萄糖5％、木糖3％、蛋白胨0.7％、豆粕1％；

(5)、菌丝体的油脂提取：将扩大培养后得到的菌丝体进行收集，然后进行离心、洗涤、100-110℃干燥、石油醚萃取得成品。

研究了不同原料参数和投料量对产品产率的影响：

1、高效利用混合糖发酵菌株的诱变和筛选：

取菌丝和孢子生长旺盛的新鲜平板一个，用10ml无菌水洗下平板孢子，用双层无菌纱布过滤得到无菌丝体的孢子悬液，取约10⁴-10⁵个/ml孢子悬液0.1ml均匀涂布于无菌平皿，风干。10Kev氮离子不同剂量进行注入。注入后样品的稀释、分离、培养及筛选：用1ml无菌水洗涤注入后的样品，将洗脱液适当稀释或不稀释，取0.1ml均匀涂布于木糖筛选培养基上，28℃培养，挑取单菌落进行初筛、复筛。结果如下表所示：最终确定了低能离子束诱变能量和剂量为10Kev和1.3×10¹⁵N⁺/cm²：

不同低能离子束能量和剂量诱变与存活率关系

2、混合糖为碳源的发酵工艺：

在总糖浓度为8％(葡萄糖/木糖为5/3，w/w)时，培养温度28℃，起始pH 8.0，接种量8％，装液量30％，蛋白胨0.76％，豆粕1％的条件下摇瓶一次性发酵，油脂积累量、生物量和木糖利用率分别是10.05g/L、27.4g/L和84.33％；混合糖发酵时间曲线见图1；

3、补料分批发酵对生物量和油脂积累的影响：

初始投混合糖4％，在第4天和第7天分别补2％的混合糖，由图2(补料分批发酵时间曲线)可见，第9天生物量和油脂积累量都达到最高，发酵时间缩短为9天。

例2

利用含木糖的底物发酵生产含有花生四烯酸的微生物油脂的方法，其特征在于：包括以下步骤：

(1)、原始菌种的活化：将高山被孢霉菌种接种到斜面培养基上在25-30℃下培养7-10天，选取菌丝和孢子生长旺盛的新鲜平板，洗脱下平板孢子，过滤得孢子悬液；所述的斜面培养基中主要原料成分的重量百分份比为：葡萄糖1.5-2.5％，马铃薯浸出液18-22％，琼脂1.5-2％。

(2)、离子束诱变：将孢子悬液涂布于无菌平皿上，风干，进行脉冲式N⁺离子注入，选用N⁺离子的能量和剂量分别是10Kev和1.3×10¹⁵N⁺/cm²；然后将离子注入过的孢子悬液用无菌水洗脱后，稀释涂布于木糖筛选平板培养基上在25-30℃下培养，挑选出能在木糖筛选平板培养基上生长且菌丝生长旺盛的的菌落，作为初筛的单菌落，将初筛的单菌落转接斜面培养，接入摇瓶发酵培养转接摇瓶发酵培养基中发酵，挑选出生物量和油脂含量高的菌种作为复筛的结果，然后对复筛的结果重复进行离子束诱变、初筛和复筛过程；所述的木糖筛选平板培养基中主要组分的重量百分含量为：木糖2％，蛋白胨0.5％，酵母膏1.0％，基质蒸馏水，pH8.0，28℃；

(3)、液体培养：将离子束诱变、筛选过的菌种于PH值为7.5-8.5液体培养基中在28-30℃下培养18-24小时，液体培养基中主要原料组分的重量百分比为：葡萄糖4-6％、木糖2-5％、蛋白胨0.5-1％、豆粕0.5-1.5％，基质蒸馏水；所述的液体培养的摇床转度为180-230rpm，PH值为8，优选的液体培养基中主要原料组分的重量百分比为：葡萄糖5％、木糖3％、蛋白胨0.7％、豆粕1％；

(4)、扩大培养：将液体培养后的菌种接种于发酵罐中的发酵培养基中在28-30℃下培养10-12天，发酵培养基中原料组分的重量百分比为：葡萄糖4-6％、木糖2-5％、蛋白胨0.5-1％、豆粕0.5-1.5％，基质为蒸馏水；

(5)、菌丝体的油脂提取：将扩大培养后得到的菌丝体进行收集，然后进行离心、洗涤、100-110℃干燥、萃取得成品。

所述的扩大培养是将液体培养后的菌种以8-12％的比例接种于发酵罐中，发酵罐的通气量为1.0-1.5L/min，搅拌速度为400-500转/分，发酵罐内PH值为7.5-8.5，温度为28℃，时间为10-12天，发酵培养基中主要原料组分的重量百分比为：葡萄糖5％、木糖3％、蛋白胨0.7％、豆粕1％，基质为蒸馏水，发酵培养基的PH值为7.5-8.5，温度为28℃；

所述的生产含有花生四烯酸的微生物油脂的方法，其特征在于：所述的木糖选用含有五碳糖的木质纤维素水解糖；所述的油脂的萃取选用石油醚、正己烷。

本发明各种培养基的基质一般均为蒸馏水。

Claims (4)

1.利用含木糖的底物发酵生产含有花生四烯酸的微生物油脂的方法，其特征在于：包括以下步骤：

(1)、原始菌种的活化：将高山被孢霉菌种接种到斜面培养基上在25-30℃下培养7-10天，选取菌丝和孢子生长旺盛的新鲜平板，洗脱下平板孢子，过滤得孢子悬液；

(2)、离子束诱变：将孢子悬液涂布于无菌平皿上，风干，进行脉冲式N⁺离子注入，选用N⁺离子的能量和剂量分别是10Kev和1.3×10¹⁵N⁺/cm²；然后将离子注入过的孢子悬液用无菌水洗脱后，稀释涂布于木糖筛选平板培养基上在25-30℃下培养，挑选出能在木糖筛选平板培养基上生长且菌丝生长旺盛的的菌落，作为初筛的单菌落，将初筛的单菌落转接斜面培养，接入摇瓶发酵培养转接摇瓶发酵培养基中发酵，挑选出生物量和油脂含量高的菌种作为复筛的结果，然后对复筛的结果重复进行离子束诱变、初筛和复筛过程；所述的木糖筛选平板培养基中主要组分的重量百分含量为：木糖2％，蛋白胨0.5％，酵母膏1.0％，基质蒸馏水，pH8.0，28℃；

(3)、液体培养：将离子束诱变、筛选过的菌种于PH值为7.5-8.5液体培养基中在28-30℃下培养18-24小时，液体培养基中主要原料组分的重量百分比为：葡萄糖4-6％、木糖2-5％、蛋白胨0.5-1％、豆粕0.5-1.5％，基质蒸馏水；

(4)、扩大培养：将液体培养后的菌种接种于发酵罐中的发酵培养基中在28-30℃下培养10-12天，发酵培养基中原料组分的重量百分比为：葡萄糖4-6％、木糖2-5％、蛋白胨0.5-1％、豆粕0.5-1.5％，基质为蒸馏水；

(5)、菌丝体的油脂提取：将扩大培养后得到的菌丝体进行收集，然后进行离心、洗涤、100-110℃干燥、萃取得成品。

2.根据权利要求1所述的生产含有花生四烯酸的微生物油脂的方法，其特征在于：所述的斜面培养基中主要原料成分的重量百分份比为：葡萄糖1.5-2.5％，马铃薯浸出液18-22％，琼脂1.5-2％。

3.根据权利要求1所述的生产含有花生四烯酸的微生物油脂的方法，其特征在于：所述的液体培养的摇床转度为180-230rpm，PH值为8，液体培养基中主要原料组分的重量百分比为：葡萄糖5％、木糖3％、蛋白胨0.7％、豆粕1％；所述的扩大培养是将液体培养后的菌种以8-12％的比例接种于发酵罐中，发酵罐的通气量为1.0-1.5L/min，搅拌速度为400-500转/分，发酵罐内PH值为7.5-8.5，温度为28℃，时间为10-12天，发酵培养基中主要原料组分的重量百分比为：葡萄糖5％、木糖3％、蛋白胨0.7％、豆粕1％，基质为蒸馏水，发酵培养基的PH值为7.5-8.5，温度为28℃。

4.根据权利要求1所述的生产含有花生四烯酸的微生物油脂的方法，其特征在于：所述的木糖选用含有五碳糖的木质纤维素水解糖；所述的油脂的萃取选用石油醚、正己烷。

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