CN103484385A - 一种高产花生四烯酸的高山被孢霉突变株及发酵方法和应用 - Google Patents
一种高产花生四烯酸的高山被孢霉突变株及发酵方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种高产花生四烯酸的高山被孢霉突变株及发酵方法和应用，将自然筛选的高山被孢霉，通过诱变处理，获得了一株高产花生四烯酸的高山被孢霉突变株200012201-12-2-2，CCTCC NO:M2013392。所获得的菌株，经长期转接，遗传性状稳，未发生变异，生物学特性典型，在镜检和发酵罐生长性状良好，利用C、N较强，生物量、产油量、产ARA量高质好，并且易于提取油脂及所需脂肪酸，通过本发明的发酵方法，花生四烯酸的产量为15.1g/L发酵液。
Description
技术领域
本发明涉及微生物技术，微生物工程和油脂工程的领域，具体涉及一种高产花生四烯酸的高山被孢霉突变株，还涉及该突变株的制备方法，还涉及该突变株的制备花生四烯酸中的应用。
技术背景
一、ARA的生理活性及市场
当今世界需解决因人口增长而带来的市场不足的难题。除增加粮油食品、肉类、蔬菜等的产量外还可通过生产人类必需且有生理活性的物质，提供人们摄食，从而减少人类对农产品的依靠，这就是在世界范围内掀起的第四代功能性食品即有效成分和生理功能清楚的功能性食品。我们研究的包括ARA、DHA、GLA等含不饱和脂肪酸（Poly unsaturated fatty acids，PUFAs）的油脂和油溶性β-carotene就是风靡世界的第四代功能性食品。尤其是1990年人们在母乳中发现了ARA和DHA两种PUFAs，这两种PUFAs是大脑中最主要的脂肪酸组成，如果加强这两种脂肪酸，将会对孕妇和新生儿有特殊的好处。ARA在人体血液、肝脏、肌肉和其它器官中，作为与磷脂结合的结构脂类作用，ARA还是PGE2、PGI2、TXA2、LTB4和LTC4等的活性生物物质的前体，这些活性物质对脂蛋白的代谢、血液流变学、血管弹性、白细胞功能和血小板激活等具有很好的调节作用，ARA对婴幼儿的神经层尤其是大脑的生长发育至关重要，在人体脑和神经细胞中，ARA占其PUFAs的40～50%，在神经末梢甚至高达70%，因而在WHO要求在婴幼儿奶制品中加入ARA。ARA作为营养强化剂、化妆品添加剂、保健品、化工原料、生物饲料和生物制药等。我国仅奶粉一项，ARA的用量就达100吨，3～5亿元。在欧美国家推出了孕妇处方中只含10%ARA。就将拥有巨大的市场。
二、ARA及其产生菌
ARA是ω-6系列多不饱和脂肪酸（PUFAs），分子式C20H32O2，其分子中含有四个双键，故亦极易氧化和酸败，稳定性欠佳。其熔点仅为-49.5℃，沸点为245℃。微生物产生的ARA为金黄色油状物，溶于醇、醚、水等。ARA在苔藓类和蕨类、沙丁鱼油中检测到，但含量极低，没有大规模开发价值。在微藻中，部分细菌也产生ARA，但产生率极低并生产较为困难。因而目前在研究和工业中应用较多的产ARA的微生物是丝状真菌，如被孢霉（Mortierella），毛霉属(Mucor)，根霉属（Rhizopus）等，尤其是高山被孢霉（M.alpina）成为工业化生产的主要菌种。
三、ARA及其安全性
3.1ARA产生菌的安全性
高山被孢霉（Mortierella alpina）属于接合菌纲毛霉目（或被孢霉目）被孢霉科被孢霉属。至今没有文献报道被孢霉属菌产生特异性毒素，研究结果表明，目前没有任何文献表明被孢霉有毒性。M.alpina正常是从温带土壤中分离，所以人体很容易处在该菌孢子的坏境中，考虑到生产人员的安全，对温血动物的变应原特别重要。据研究，结论是大部分M.alpina（尤其是ARA生产株）没有显示出对温血动物的潜在变应原性。因为ARA生产中全是液体发酵，仅有固体平板生产菌种，据我们的研究不产分生孢子和少量分生孢子的M.alpina的菌株产ARA的量高。因而生产人员和最终消费人员几乎不可能接触到孢子。从这个方面看，M.alpina的生产株不具有变应原性。
由高山被孢霉发酵生产的ARA油脂，经欧洲食品安全局（EFSA）对SUN-TGA40S ARA产品的急性毒性、慢性毒性研究。研究结果表明其是安全无毒的。中国、美国、日本等国也对M.alpina生产的ARA油脂进行安全性研究也证明是安全无毒的，我国已发布在2010年第3号文件中，公布了ARA为新资源食品。
3.2ARA油脂的安全性
欧洲食品安全局(EFSA)[11]对SUN-TGA40S（AA含量＞40%）的进行了急性毒性研究，以单剂量2g/（kg体重）喂养五只雄性ICR小鼠，观察14天后进行解剖，试验观察中没有小鼠死亡，并且没有迹象表明SUN-TGA40S有毒性。
3.2.1慢性毒性
对SUN-TGA40S的慢性毒性亦进行了研究，对15只雄性和15只雌性Sprague-Dawley大鼠进行90天喂养试验。试验表明：体重和食物消耗没有表现出相应的临床症状和影响。血液学和临床化学分析显示，SUN-TGA40S饲料喂养的动物与含有2%大豆油饲料喂养的对照组相比，存在显著性差异。在组织病理未发生变化的情况下，我们认为所观察到的差异与SUN-TGA40S的毒性无关。
3.2.2亚慢性毒性
对Wistar大鼠进行了13周的亚慢性口服毒性评价。试验表明：对父本母本大鼠而言，SUN-TGA40S和DHA油添加与否，不影响其健康、生长和生育，对体重、生存能力和（每胎）性别比例数等的影响也不明确。研究结果表明SUN-TGA40S是安全无毒的。
3.2.3潜在变应原性
对高山被孢霉的培养基进行了ELISA法（检测限为0.1mg/kg）分析，没有发现培养基中含有的大豆粉和豆油，未检出大豆过敏原——大豆胰蛋白酶抑制剂。因此，花生四烯酸产品不具有潜在变应原性。
3.2.4基因毒性
经过花生四烯酸的Ames反向突变试验、小鼠淋巴TK＋/－基因正向突变试验和仓鼠卵巢细胞染色体畸变试验，这两种油均未表现出致突变性。
综上所述，花生四烯酸及其生产所用培养基是安全的。
四、ARA的生产技术及工艺
ARA生产技术主要包括以下三个方面的内容，现分叙之。
4.1培养基的制备和营养
丝状真菌在发酵过程中最大的困难是通气搅拌装置对菌丝体有剪切力，将菌丝体打断，我们用美国莱宁式搅拌器，它是一种推进式，既可使发酵中搅拌，又对菌丝体无多大伤害。如果培养基配制时，碳、氮原料均为可溶性物质，在发酵过程中，菌丝体形成球形颗粒状，对ARA的生物合成和累积不利，在这方面日本学者曾有报道，因而在发酵的培养基中加少许固形物质以作为碳源和氮源。所以在当今生产ARA的培养基的配制就有两大类，即加固形物质的营养培养基和可溶性的营养培养基。在ARA的培养配制中，多数学者认为碳/氮比在15～20:1为适宜。但也有研究者报道碳/氮比在20:1以上甚至50:1.因为更研究者所用碳源和氮源不尽相同及地域差异等引起的。因而ARA生产中的最适培养基配方和最佳碳/氮比还要跟自身条件和设备研究而选择好的方案。
4.2发酵工艺和条件
ARA的发酵生产工艺和条件，涉及了各个方面。如发酵罐的高径比，有无搅拌系统，通气量，溶氧高低，温度控制及变温培养，在培养中PH的调整，补充营养，以及接种量的大小，发酵过程中，菌生长优良的判定标准。最主要的是确定发酵终止时间的菌的形态及油脂累积状况。要完成上述工作内容，必须建立一套完整的发酵时的检测技术和方法。
4.3ARA的检取和纯化技术
在早期微生物油脂生产过程中，基本上参照植物油提取的工艺和技术，经过近20年的努力，已形成一套微生物油脂的提取技术，即用馏程更低温的以丁烷为主的四号溶剂油，可以在较低的温度下，将油脂从菌丝体内萃取出来，而使微生物油脂中的溶剂油很快挥发而降低了含量。另外由于低温，使ARA油脂不易氧化而保证优质。为了提高ARA在油脂中的含量，我们利用低温结晶法和尿素包合法相结合的方法，可以提高ARA在油脂中的含量，使其含量达到74.7%。
为ARA降低生产成本和提高经济利益，各国科学家在从自然界筛选高产优质的产ARA的菌株的同时，还进行着对原产ARA的菌的改良，其技术手段有物理，化学的诱变，原生质体融合或企图基因转移等高新技术来获得更高产优质的产ARA的突变株、融合株和基因株，以求简化生产工艺和技术条件，提交ARA的产量的质量。达到降低生产成本，获得更多的经济利润。
通过了解ARA生物合成及生物活性物质的转化，有两个主要反应，即碳链的增长和脱氢作用。碳链增长是供体（乙酰辅酶A或丙二酰辅酶A）上的两个碳原子被引入增加碳链长度。硬脂酸（18:0，stearate）脱氢成为油酸(18:1,oleate)，然后转化为亚油酸，亚油酸的链增长和脱氢形成了包括GLA、ARA的n-6系列和包括ALA、DHA的n-3系列。科学家们通过化学的、物理的、生物的等各种技术，对原有产ARA的菌株进行改造，以期减少或切断非ARA生物合成的支路代谢，选择抗性菌株，耐高浓度（培养基）的ARA的突变株，或提高细胞内ATP水平，有利于脂肪酸的合成和ARA的提高；以及通过增加HMP、EMP途径，使还原性辅酶I（NADPH）的数量增多，有利于ARA产量的提高；还将通过基因改造的方法脱氢酶酶解，使ARA的产量提高.根据本实验室特点和条件，我们选择了化学和物理的诱变方法,以期获得更高产优质的深黄被孢霉的突变株，并将该株用于工业化和商业化生产中，以获得更多的社会效益\生态效益和经济效益。
发明内容
本发明的目的在于提供了一种高山被孢霉(Mortierella alpina)的突变株，该菌株可高产花生四烯酸（ARA），该菌株已于2013年9月6日送至中国典型培养物保藏中心进行保藏，保藏编号：CCTCC NO:M2013392，分类命名：高山被孢霉200012201-12-2-2Mortierellaalpina200012201-12-2-2，地址：中国武汉武汉大学。
本发明的另一个目的在于提供了一种高山被孢霉(Mortierella alpina)的突变株的发酵方法，方法易行，简化了制备工艺和设备，适于大规模生产。
本发明还有一个目的在于提供了一种高山被孢霉(Mortierella alpina)的突变株在制备花生四烯酸中的应用。
为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：
一种高山被孢霉(Mortierella alpina)的突变株的筛选方法，步骤如下：
1、菌种
使用高山被孢霉（M.alpina）200012201株
2、菌种活化
高山被孢霉Mortierlla alpaina200012201，经三种方法活化，一种是直接将保存菌株转移植于新鲜培养基的平皿内，观察其生长；第二种是将保存的菌株稀释成悬浮液，涂布于新鲜培养基的平皿内；第三种是将保存菌种接种于装有新鲜液体培养基三角瓶中，振荡培养3～4天，再行划线或涂布分离，挑选菌落。一般情况下，高山被孢霉经长期保存后存活率较低，难于直接活化生长，故多用第三种方法，先经富集培养后再行分离挑选。所挑选的单菌落经观察和显微镜检查符合高山被孢霉典型特征和培养特性。故菌种活化后所挑选的菌种为高山被孢霉原种。
3、自然选育
将长期保存的菌种用PDA平板活化，用加入脱氧胆酸钠的PDA培养基进行单孢分离，共有三种形态的菌落：一种是典型的高山被孢霉的高山状菌丝呈白色（编号为200012201）；第二种菌丝平铺在平板内，不形成高山状，菌丝呈白色（编号为200012201-B2）；第三种菌丝平铺在平板内，菌丝成淡黄色（编号为200012201-12）。后经摇瓶发酵，三种菌都表现出优良性能。
4、菌种预处理
在菌种诱变处理时，我们选择高山被孢霉（M.alpina）200012201-12株，为简便起见，将该株简化为M12株（下同），选择生长正常良好，无塌陷老化的菌丝体，接种于培养皿或茄子瓶固体培养基中，进行扩大培养，在24～30℃培养箱中培养7天。菌丝生长正常，形成典型的高山状。在显微镜观察，菌丝初期生长粗壮一致，未见有分生孢子，培养至4天后，可见菌丝膨胀，用苏丹黑B染色镜检可见菌丝体内有着色深的颗粒，说明其产丰富的脂肪。将培养3～5天的菌丝体，制成菌悬浮液备用。
5、诱变处理
挑选长势良好的平板，送于湖北省农科院辐照中心进行60Co-γ射线辐照诱变，我们共选取3个诱变剂量，分别为1、2、3kGy，每个剂量辐照8个平板，共24个平板。即前往湖北省农科院辐照中心进行60Co辐照诱变处理。
6、突变株的筛选
用黑布将经60Co-γ射线辐照诱变处理后的平板包好拿回，放至无菌室中，在无菌操作台中分离，用无菌环挑取菌丝接于新的平板培养基上，做好编号，培养3～5天，剔除染杂菌或未长出菌体的平板，选取菌体长势良好的菌株进行复筛。复筛时观察平板的生长情况，
即获得了一种高山被孢霉(Mortierella alpina)的突变株，该菌株可高产花生四烯酸（ARA），该菌株已于2013年9月6日送至中国典型培养物保藏中心进行保藏，保藏编号：CCTCC NO:M2013392，分类命名：高山被孢霉200012201-12-2-2Mortierella alpina200012201-12-2-2，地址：中国武汉武汉大学。
6、高山被孢霉突变株扫描电镜研究
将高山被孢霉（M.alpina）200012201-12-2-2突变株，接种于PDA平板，与26℃培养3天时，挑选少许菌丝转移至新的PDA平板上，分于培养第二天、第三天、第四天、第五天、第六天、第七天的菌为扫描电镜做样品准备。
在样品台上贴上一小块导电胶，用牙签挑取或透明胶布粘取少量菌丝置于导电胶上粘住，于离子溅射仪中喷金制片，扫描电镜下观察拍照。
高山被孢霉突变株的菌丝呈管状，无色透明，菌丝发达，生长繁密，比野生型菌株的菌丝粗（野生型菌丝体直径10～20μm），培养7天后，菌丝直径达30～40μm，且菌丝呈藕节状（图1）。野生型的高山被孢霉的无性繁殖是依靠无性孢子进行的，而其无性孢子分为分生孢子、梗等等殊菌丝通过断裂成熟后分生的成年孢子，即使在光学显微镜下也能观察到许多球形和椭圆形的分生孢子。在扫描电镜下观察到许多椭圆形或瓜子形的分生孢子，但未见有接合孢子（图2）。
在扫描电镜观察下，高山被孢霉突变株的无性孢子多由气生菌丝体的顶部细胞或侧部细胞与菌丝分隔或缢缩而成，同时还发现由分生孢子梗等特殊菌丝通过断裂成熟后分生的球形分生孢子（图3），但其产生的数量极少。即使在扫描电镜下，也难于找到，而在光学显微镜下，很难发现或根本就观察不到。
高山被孢霉突变株通过接合孢子的产生进行有性繁殖，用电镜观察到高山被孢霉突变株形成很多结合孢子，其接合子呈多样化（图4）。而没有发现高山被孢霉野生型菌株产生接合孢子。
他们基本是两个邻近异质的菌丝体各向双方发生一倒枝，形成两个原配体。两个原配体膨大形成两个配子体，两配子体向隔膜消失，形成接合孢子。
在研究中发现，很少产生分生孢子的高山被孢霉突变株的ARA的产量较高，而高山被孢霉野生型菌株产生分生孢子较多，其不但产油脂低，而且产ARA更低。
在发酵过程中，氮源促进菌丝体的生长，发酵液中的氮源的量应刚好满足菌丝体繁殖所需，同时维持适当含量的碳源，作为脂肪酸合成的原料，以提高菌丝体含油量。在菌丝体生长早期，主要利用氮源，对数期后，当氮源减少，菌丝体就利用糖合成脂肪酸，此时就应向培养发酵液中补充碳源，以促进菌丝体合成脂肪酸和有利于脂肪酸的积累。
一种高山被孢霉突变株的发酵方法，其步骤是：
50L半自动发酵罐中发酵培养基装液量为30L。高山被孢霉种子液浓度达到8-12g/L时，按5-15%接种量接种于发酵罐，在24～30℃低速搅拌（50～80转/分），通气1:0.8～1.5（v/v），发酵96～150h。发酵过程中，残糖浓度低于1.5%时进行补葡萄糖，使残糖浓度到2.5-3.0%，调pH6.5。发酵结束后，菌液经离心或板框过滤收集菌丝体。
所述的发酵的培养基为：葡萄糖80g/L，玉米粉20g/L，豆粕粉20g/L，酵母浸膏2g/L，蛋白胨1g/L，KH2PO41g/L，MgSO40.1g/L，棉籽油10g/L，pH6.5。
一种高山被孢霉突变株在制备花生四烯酸中的应用，其步骤如下：
1.菌种制备
将保存的菌种经PDA培养基划线活化，挑取具有高山被孢霉典型特征的单菌落，扩大培养作为生产种子。
2.种子培养
制备液体种子培养基，灭菌。将培养好的单菌落菌种转接到液体种子培养基中扩大培养36-48h.,种子液浓度达到8-12g/L时,经检测无杂菌污染，生长正常。
3.发酵培养
制备发酵培养基，灭菌。将培养好的上述种子液按5-15%接种量接种于发酵培养基中培养。在24～30℃低速搅拌（50～80转/分），通气1:0.8～1.5（v/v），发酵96～120h。当生物量达到50g/L左右时，苏丹黑染色镜检，脂肪颗粒着色深时，放罐。
4.后处理
后处理包括菌体收集和干燥两部分。菌体收集是采取板框过滤收集菌体，干燥是采用流化床干燥技术。
5.油脂提取
油脂提取包括溶剂浸出和油脂精炼两部分。溶剂浸出采用正己烷为溶剂，按植物油常规的提取工艺和精炼工艺进行精炼。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
所获得的菌株，经长期转接，遗传性状稳，未发生变异，生物学特性典型，在镜检和发酵罐生长性状良好，利用C、N较强，生物量、产油量、产ARA量高质好，并且易于提取油脂及所需脂肪酸；所获得高山被孢霉菌株适用于多种含糖、含氮的农副产品的下脚料（水）及农副产品的固体物，这些物质不但有利于菌丝体的生长，而且使菌丝体不聚集成团球状。可以用于搅拌发酵，加大通气量和溶氧面积，使菌丝体量大、油多。
附图说明
图1为一种高山被孢霉200012201-12-2-2突变株菌丝图。
a：生长时期；b：油脂积累时期。
图2为一种高山被孢霉野生型88335和87649的分生孢子梗和成串椭圆形或瓜子性的分生孢子示意图。
图3为一种高山被孢霉200012201-12-2-2的球形分生孢子示意图。
图4为一种高山被孢霉200012201-12-2-2的接合孢子示意图。
图5为一种突变株M.alpina200012201-12-2-2菌落形态示意图。
图6为一种突变株M.alpina200012201-12-2-2菌丝形态示意图。
图7为一种突变株M.alpina200012201-12-2-2菌丝体膨大部分示意图。
苏丹黑B染色
具体实施方法
在本专利的实施方案中，对具体实施步骤和技术方法，实施例对发明进步做详细说明和描述。实施例子的技术方法，涉及面较广，学科较多，主要参照了微生物学、真菌学、油脂学。食品科学等的基本理论和实施方法，同时还参照了生物技术、生物工程、生物工艺学、工业微生物学、植物病理学、发酵技术、油脂化学、油脂工艺学、食品工艺学、现代分析化学等的教材资料，国内外有关标准制定的方法，如未特别说明，本发明实施例所述的实验方案为常规技术，下面将对本专利的实施步骤、技术和方法作出详细的描述。
实施例1：
60Coγ-辐照诱变
本实验以从高山被孢霉属中分离筛选到的产ARA菌株Mortierella alpina200012201-12（简称M12，下同）作为出发菌株，采用60Co-γ射线辐照诱变育种方法，以获得了一株高山被孢霉高产突变株。具体方法如下：
首先，因该菌株很少产生分生孢子，所以选取在平板上生长良好的菌体用于诱变。对出发菌株M12进行活化处理，即将冰箱中试管斜面保藏的M12菌种，转接到平板培养基上于26℃培养5d，活化。然后，根据之前的预处理实验发现，当60Co-γ射线辐照剂量小于1kGy时，诱变效果不明显，原始菌株的性状基本没有什么改变，出现正突变的菌株概率较低，而60Co-γ射线辐照剂量大于3kGy时，诱变效果过于明显，致死率过高，存活的菌株数过少，出现正突变率的菌株概率也很低。所以，我们挑取活化后长势良好的平板，送于湖北省农科院辐照中心进行60Co-γ射线辐照诱变，共选取3个诱变剂量，分别为1、2、3kGy，每个剂量辐照8个平板，共24个平板，分别编号如下：
M12-1-1，M12-1-2，M12-1-3，M12-1-4，M12-1-5，M12-1-6，M12-1-7，M12-11-8；
M12-2-1，M12-2-2，M12-2-3，M12-2-4，M12-2-5，M12-2-6，M12-2-7，M12-2-8；
M12-3-1，M12-3-2，M12-3-3，M12-3-4，M12-3-5，M12-3-6，M12-3-7，M12-3-8。
最后，需要注意的是，出于菌种保护的考虑，在拿去湖北省农科院进行辐照处理之前，要用报纸和黑色塑料袋将待处理平板包好，避免光线照射。在辐照进行前，要将平板上的盖子拿下，以使辐照充分，辐照完成后，要将平板盖迅速盖好，用报纸和黑色塑料袋将待处理平板包好，迅速转移到实验室进行处理，以免产生原位回复突变等情况。在去和回的路途中，
也要避免颠簸，以防使平板受到损伤。
实施例2：
诱变选育
60Co-γ射线诱变结束后，用黑布将平板包裹拿回放至无菌室中，在无菌操作台中分离，用接种环挑取辐照后的菌丝接入初筛平板培养基上，每个诱变后的菌株接5个初筛平板。又因为诱变后的平板仍有可能继续生长存活，所以我们做好编号，将其和初筛平板一起放入恒温培养箱中培养，以M12-1-1为例，放入培养箱中培养的平板编号分别为M12-1-1，M12-1-1-1，M12-1-1-2，M12-1-1-3，M12-1-1-4和M12-1-1-5，其它初筛平板的编号以此类推。由于拿去辐照的平板共有24个，所以放入培养箱中培养的平板共有144个。待培养一段时间后，首先计算不同剂量下菌株的致死率。
在筛除已死亡的菌株后，观察存活菌株的平板形态，以初筛平板培养基上菌丝粗壮、生长良好等作为特征指标，含出发菌株在内，我们挑选出初筛后菌株，编号，进行复筛。将8株菌株活化培养后，转入种子培养基，2d后转入发酵培养基，发酵培养完成后，以苏丹黑B为染料染色，观察菌丝的生长状况，并与生物量、含油率和ARA产量一起共同作为复筛的指标，以得到一株性状最为优良的突变株。
将挑选出的菌株活化培养后，转入种子培养基，2d后转入发酵培养基，发酵培养完成后，以苏丹黑B为染料染色，观察菌丝的生长状况，并与生物量、含油率和ARA产量一起共同作为复筛的指标，以得到一株性状最为优良的突变株，具体如下：
挑取活化后长势良好的平板，观察出发株与突变株在PDA平板上生长的不同形态特征，并拍照。然后，用无菌环挑取少许经活化后的菌丝，转接于种子培养基中，于26℃、180r/min的条件下，培养2d。接着，用灭过菌的破头吸管吸取10mL种子液，转接于发酵培养基中，于26℃、180r/min的条件下，培养7d。
挑取长势良好的发酵瓶菌丝体，涂片，用显微镜观察出发株与突变株的菌丝体形态上的不同特征，并拍照。拍照完成后，取一块干净的纱布，过滤已培养7d的发酵液，蒸馏水洗涤两次后，将收获的菌丝体于70℃烘干至恒重，称干重，计算生物量。干菌体研钵磨成粉末后采用Soxhlet法抽提油脂，并计算其得率。取菌体油脂0.1g加2mL3%KOH-甲醇溶液，75℃振荡15min水解。水解后，加2mL14%三氟化硼一甲醇溶液，70℃振荡2min甲酯化。然后加2mL饱和NaCl溶液分层，最后加正己烷lmL，振荡，取上清液进样，用气相色谱仪测定其ARA含量。
在以上的操作之后，我们可以比较出发株与突变株在平板形态、显微镜下菌丝体形态的不同，生物量、含油率和ARA含量的不同，确定正突变株，并且得到一株最佳的正突变株，一种高山被孢霉(Mortierella alpina)的突变株，该菌株可高产花生四烯酸（ARA），该菌株已于2013年9月6日送至中国典型培养物保藏中心进行保藏，保藏编号：CCTCC NO:M2013392，分类命名：高山被孢霉200012201-12-2-2Mortierella alpina200012201-12-2-2，地址：中国武汉武汉大学。
最后，为了确定挑选出的正突变株的遗传稳定性，我们将出发株和筛选出的突变株连续传代10次，每传代2次进行生物量、含油率和ARA产量的测定，观察稳定性，结果见表1。
表1突变株遗传稳定性试验结果
实施例3：
突变株的扫描电镜观察
将高山被孢霉突变株分别制成各培养2～7天的样品共6个样，每个样至少做5个喷涂制片，经S-3000N型和JSM-6390型扫描电镜（SEM）观察并拍摄照片。
高山被孢霉突变株的菌丝呈管状，无色透明，菌丝发达，生长繁密，比野生型菌株的菌丝粗（野生型菌丝体直径10～20μm），培养7天后，菌丝直径达30～40μm，且菌丝呈藕节状（图1）。野生型的高山被孢霉的无性繁殖是依靠无性孢子进行的，而其无性孢子分为分生孢子、梗等等殊菌丝通过断裂成熟后分生的成年孢子，即使在光学显微镜下也能观察到许多球形和椭圆形的分生孢子。在扫描电镜下观察到许多椭圆形或瓜子形的分生孢子，但未见有接合孢子（图2）。
在扫描电镜观察下，高山被孢霉突变株的无性孢子多由气生菌丝体的顶部细胞或侧部细胞与菌丝分隔或缢缩而成，同时还发现由分生孢子梗等特殊菌丝通过断裂成熟后分生的球形分生孢子（图3），但其产生的数量极少。即使在扫描电镜下，也难于找到，而在光学显微镜下，很难发现或根本就观察不到。
高山被孢霉突变株通过接合孢子的产生进行有性繁殖，用电镜观察到高山被孢霉突变株形成很多结合孢子，其接合子呈多样化（图4）。而没有发现高山被孢霉野生型菌株产生接合孢子。
他们基本是两个邻近异质的菌丝体各向双方发生一倒枝，形成两个原配体。两个原配体膨大形成两个配子体，两配子体向隔膜消失，形成接合孢子。
在研究中发现，很少产生分生孢子的高山被孢霉突变株的ARA的产量较高，而高山被孢霉野生型菌株产生分生孢子较多，其不但产油脂低，而且产ARA更低。这两者之间的关联仍需进一步研究。
实施例4：
突变株对碳、氮的利用
将M.alpina200012201-12-2-2经发酵培养，然后每24h取样，立即放入冰箱中贮存，待培养结束时一同测定生物量、糖耗、氮耗、油脂含量和ARA含量五个指标。
连续培养三个批次，按日期编号分别为20130323、20130402和20130412。
高山被孢霉发酵培养三个批次的生物量见表2，碳耗和氮耗见表3，油脂及ARA含量见表4。
表2三个批次依次的生物量及其平均值（干重）
表3连续三个批次的碳、氮耗
由表3可知，培养第1d高山被孢霉处于适应期，碳耗比较少，主要用于合成代谢系统所需的酶，辅酶和其他代谢中间产物；第2d菌体进入对数生长期，生长速率达到最大，代谢旺盛，碳耗显著增加；第3d开始，高山被孢霉进入稳定期，开始积累微生物油脂，碳耗增加速率逐渐变慢。但发酵结束时，碳的利用率为86.92%。
培养第1d氮的消耗很大，可能是由于菌丝体处于分裂间期，大量合成核酸和蛋白等物质，为进入分裂期准备生物基础；第2d开始氮耗增加缓慢，直至第5d开始，氮耗小幅下降，可能是因为菌丝体内某些酶类或其他蛋白质被降解，导致的含氮量的小幅增加；至第7d为止，氮的利用率为93.20%。
表4连续三个批次的油脂及ARA含量
由表4可以看出，因第1d高山被孢霉处于适应期，主要合成代谢系统所需的酶，辅酶和其他代谢中间产物；培养1d之后直至第7d油脂含量快速持续增加，可能的原因是，菌株在适应培养之后，菌丝体迅速生长繁殖，氮源大幅消耗，菌丝体开始大量积累次级代谢产物。
本研究通过对M.alpina200012201-12-2-2菌株连续三个批次（20130323、20130402和20130412）的发酵产生ARA的生物量（干重）、碳耗、氮耗、油脂含量和花生四烯酸含量的研究。发酵7d后，糖耗为86.92%、氮耗为93.20%，油脂含量为18.15g/（L发酵液）和花生四烯酸含量为7.90g/（L发酵液），与国内类似研究相比，处于优势地位。总的来说，碳和氮的利用率比较高，但还有提升的空间，分析原因，可能是摇床发酵培养条件的限制，高山被孢霉菌体利用营养未达到最佳时期，故使次级代谢产物亦受到影响。
实施例5：
突变株的培养基优化
突变株Mortierella alpina200012201-12-2-2在PDA平板上培养3d，挑取少量菌丝，接入种子摇瓶中，培养12h-3d，再按10%的接种量接入发酵摇瓶中培养。发酵培养基按表5的组分和含量配制。
表5单因素试验因素与水平
根据发酵的生物量、油脂量及ARA含量的测试，获得葡萄糖浓度应保持在约6%、玉米粉浓度约1%时、豆粕粉约1%、酵母浸膏约0.1%、磷酸二氢钾约0.1%、硫酸镁约0.01%。
为了进一步的了解培养基的组分和含量对突变株油脂积累的影响，在上述实验的基础上，选择豆粕粉、酵母浸膏、磷酸二氢钾和硫酸镁六个因素作为正交试验因素，各取3个水平，以生物量、油脂含量和ARA含量为考察指标，采用数据分析软件SPSSv16.0设计L27（313）正交试验进一步优化各因素，正交因素水平表见表6。实验结果见表7。综上所述，高山被孢霉发酵产生ARA的最佳培养基组成为A3B3C2D3E2F2，葡萄糖8%，玉米粉1.5%，豆粕粉1%，酵母浸膏0.15%，KH2PO40.1%和MgSO40.01%。
表6正交试验设计的因素和水平
表7L27（313）正交试验各组合的生物量、油脂含量和ARA含量
注：A－葡萄糖，B－玉米粉，C－豆粕粉，D－酵母浸膏，E－KH2PO4，F－MgSO4，G－空白项
确定了该菌株的发酵培养基为葡萄糖80g/L，玉米粉15g/L，豆粕粉10g/L，酵母浸膏1.5g/L，KH2PO41g/L，MgSO40.1g/L，pH6.5。在此基础上，进行摇床发酵实验，生物量达到41.40g/L，油脂含量17.54g/L，ARA含量为8.03g/L。
实施例6：
在50L发酵罐中突变株发酵生产ARA
用PDA生长5d的新鲜高山被孢霉突变株200012201-12-2-2平皿菌丝，切块接入一级种子培养基中，
所述的一级种子培养基为：葡萄糖60g/L、豆粕粉（粉碎，100目）2g/L、酵母膏1g/L、蛋白胨0.5g/L、玉米淀粉5g/L、KH2PO40.5g/L，MgSO40.1g/L。
先将豆粕粉、玉米粉糊化（煮沸30min）,然后与其它组分混匀，装入500ml三角瓶中，115℃灭菌30min。每瓶接种约2cm2琼脂菌丝体，在28～30℃,180r/min～200r/min培养24～3106h。见菌丝挂壁，培养液粘稠，接入预先灭菌的50L发酵罐，罐内装发酵培养液32L，接种量10%～12%。在发酵中采用差温培养及补料培养，在培养中，每间隔48h取样，测pH、苏丹黑B染色镜检、测生物量、含油量和ARA含量。
所述的发酵培养基为：葡萄糖80g/L，玉米粉15g/L，豆粕粉10g/L，酵母浸膏1.5g/L，KH2PO41g/L，MgSO40.1g/L，pH6.5。
高山被孢霉200012201-12-2-2菌株在50L罐中发酵的pH值、碳、氮消耗如表8所示。从表8中看出，从0d至2d pH缓慢下降，以后基本保持平稳；培养基中C/N从开始（0d）、2d、4d至放罐时分别为14.1～14.6、15.5～16.5、18.3～20.0、16.7～18.0的值；碳耗从2d、4d和放罐时分别为53.0%～53.9%、78.5%～82.7%和92.2%～93.1%，碳的利用较好；氮耗2d、4d和放罐时分别为57.8%～60.0%、83.1%～86.7%和93.3%～94.4%，氮的利用率较高，但如在培养中不补糖，残碳会更低，碳的利用率会更高。
表8200012201-12-2-2菌株发酵生长中的pH值，碳、氮消耗值的变化
高山被孢霉200012201-12-2-2菌株，在50L发酵罐中发酵的苏丹黑B染色镜检（表9）、生物量、含油率和ARA含量见表10。从表9-10中可以看出：高山被孢霉200012201-12-2-2菌株在不同的发酵生长期间的苏丹黑B染色镜检，菌体内的着色颗粒多少和大小有明显的区别，在放罐时菌体内有许多着色颗粒并连成片，说明脂肪酸多，见图5-图7；高山被孢霉200012201-12-2-2菌株在发酵5.8～6.7d放罐时，生物量平均达49.2g/L发酵液，含油重平均达26.9g/L发酵液，含油率平均54.5%，含ARA47.7%，则每升发酵液达到12.9g ARA。这些指标在工业生产中，由于通气量增大，并且有搅拌，可以提高氧的利用率，以及调控菌体生长与积累油脂的关系，其生物量、含油率、ARA产量还有较大的增加空间。因而，该菌种需进行工业化中试，使之较快些投入生产，获得显著的经济效益。
从而确定了该菌株在50L发酵罐中发酵的培养基为葡萄糖80g/L，玉米粉20g/L，豆粕粉20g/L，酵母浸膏2g/L，蛋白胨1g/L，KH2PO41g/L，MgSO40.1g/L，棉籽油10g/L，pH6.5，装液量30L。种子液浓度达到10g/L左右时，按10%接种量接种于50L半自动发酵罐，在28℃低速搅拌（50转/分），通气1:1（v/v），发酵140h。发酵过程中，残糖浓度低于1.5%时进行补葡萄糖，使残糖浓度到2.5-3.0%和调pH6.5。发酵结束后，菌液经离心或板框过滤收集菌丝体，50～60℃干燥。在此条件下，ARA产量可达15.1g/L发酵液。
表9200012201-12-2-2菌株发酵苏丹黑B染色镜检情况
表10突变株发酵试验各指标检测结果
实施例7：
油脂提取和精炼
实施例6中的发酵液成熟后，经过滤、菌体洗涤，滤饼进行低温干燥，得到含水量8%左右的干菌体4.4Kg。用3L正己烷在60℃条件下浸泡干菌体8小时，获得混合油，再将溶剂蒸发回收得到菌油2.4Kg，.菌油中含ARA48%，过氧化值38meq/Kg，酸价6，为合格粗油。粗油再经过油脂精炼工艺，以降低油脂的色泽及过氧化值、酸价等指标，脱去不良气味，得到成品菌油2.1Kg.
实施例8：
突变株产花生四烯酸油脂的纯化
用低温结晶法可将ARA油脂纯化，ARA纯度可达74.7%。
具体步骤为：称20g含49.3%ARA的毛油于圆底烧瓶中，加入4%（w/v）NaOH-C2H5OH溶液2ml，水浴加热回流皂化；冷至室温，将未皂化物弃去；收集已皂化的ARA油脂。采用90%乙醇，与已皂化的ARA油脂按1：2（v/v）混合，–18℃放置4h，取出后过滤，收集滤液，旋蒸，得到含ARA74.7%的油脂13.7g。
Claims (4)
1.一种高山被孢霉突变株，其特征在于：高山被孢霉（Mortierella alpina ）200012201-12-2-2，CCTCC NO: M2013392。
2.权利要求1所述高山被孢霉突变株的发酵培养基，其配方为：葡萄糖80 g/L，玉米粉15 g/L，豆粕粉10 g/L，酵母浸膏1.5 g/L，KH2PO4 1 g/L， MgSO4 0.1 g/L，pH 6.5。
3.权利要求1所述高山被孢霉突变株的发酵方法，其步骤为：
50L半自动发酵罐中发酵培养基的装液量为30L，高山被孢霉种子液浓度达到8-12g/L时，按5-15%接种量接种于发酵罐，在24~30℃，50~80转/分进行搅拌，通气1:0.8~1.5，发酵96~150h；发酵过程中，残糖浓度低于1.5%时进行补葡萄糖，使残糖浓度到2.5-3.0%，调pH6.5；
所述的发酵的培养基为：葡萄糖80 g/L，玉米粉20 g/L，豆粕粉20 g/L，酵母浸膏2 g/L，蛋白胨1 g/L， KH2PO4 1 g/L， MgSO4 0.1 g/L，棉籽油10g/L， pH 6.5。
4.权利要求1所述高山被孢霉突变株的制备花生四烯酸中的应用。
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| CN101709297A (zh) * | 2009-11-25 | 2010-05-19 | 南京工业大学 | 一种花生四烯酸产生菌高山被孢霉的诱变筛选方法 |
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