CN101434908A - 产二十碳五烯酸油脂的腐霉及该油脂的发酵制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明首次发现产二十碳五烯酸油脂的腐霉(Pythium sp.)HUST－RBB12菌种CCTCC No.M208247，利用该菌种生产高产量的具有重要生理活性的二十碳五烯酸(EPA)油脂。采用本发明方法所制得的油脂含有6％～15％的二十碳五烯酸残基，且二十碳五烯酸产量高达2.1g/L，高于目前国内外已报道的微生物发酵法生产二十碳五烯酸油脂的最高产量，同时，本发明方法所制得的油脂不含有二十二碳六烯酸(DHA)残基，故有利于含EPA油脂的分离纯化和独立使用。该方法生产的二十碳五烯酸油脂的成本低、操作简单，易于实现产业化生产。
Description
技术领域
本发明涉及微生物发酵生产具有重要生理活性的多不饱和油脂的方法，具体涉及到产二十碳五烯酸油脂的腐霉及该油脂的发酵制备方法。
发明背景
二十碳五烯酸(Eicosapetaneioc Acid，简称EPA，即5，8，11，14，17-二十碳五烯酸)属于ω-3系列长链不饱和脂肪酸。分子式为C20H30O2，相对分子量为302.6。因分子中的第一个双键起始于甲基端的第三个碳原子，故属于ω-3系列不饱和脂肪酸。结构式如下：
二十碳五烯酸室温下是液体，不溶于水而易溶于无水乙醇、石油醚等有机溶剂中。
由于EPA属于ω-3系列多不饱和脂肪酸，它们和ω-6系列的脂肪酸在动物体内不能相互转化，人体能将从植物中摄取的α-亚麻酸微量地转化为EPA，满足一般人的健康需要。但是老年人、幼儿及糖尿病人则不能将α-亚麻酸有效地转化为EPA，这些人必需从食物中直接摄取EPA。
二十碳五烯酸俗称为“血管清道夫”，它具有以下几方面的生理功能：(1)抗凝血、降血脂、预防动脉硬化等心血管疾病；(2)抗炎作用；(3)抗癌作用等。因此，EPA的研究开发应用已受到世界各国科学家的关注和重视。
EPA的天然来源主要是海产的鱼类、贝类和一些海水藻类，如海狗油、海豹油、金枪鱼、沙丁鱼、白蛤等。其商业来源主要为深海鱼油，但深海鱼油中同时含有EPA和DHA，其中，EPA含量在4％-40％之间。目前，全球的深海鱼油年产量约1000吨。随着人类对自身健康要求的提高，人们对多不饱和脂肪酸的需求越来越多，尤其是随着全球人口老龄化的趋势不断发展，对含有大量EPA，而不含DHA的油脂需求量日益增多。因此，仅仅依靠鱼油资源已无法满足日益扩大的市场需求。而且鱼油腥味大，深加工成本很高。所以，深海鱼油市场价一直很高，一般人难以接受。因此，开发来源广泛、价格合理的含有大量EPA，而不含DHA的油脂新生物资源及其应用已成为全球关注的热点。
目前，已发现含有EPA的微生物种类有：真菌、海水细菌、藻类。而从真菌中培养获得EPA报道较多。目前，国外报道的EPA最高发酵产量为1.88g/L(参考文献：Shimizu S，Kawashima H.Appl Microbial Biotechnol1989，32：1-4)，国内EPA最高发酵产量仅为253.7mg/L(参考文献：杨革，王玉萍，李翔太等.多价不饱和脂肪酸发酵条件的初步研究[J].食品与发酵工业，1997，23(2)：8-13)，与国外报道的最高水平及产业化应用都存在较大差距，迫切需要通过菌种筛选和选育获得产EPA油脂的高产菌株及相应的发酵制备方法。
发明内容
本发明提供了产二十碳五烯酸油脂的腐霉及该油脂的发酵制备方法。
产二十碳五烯酸油脂的腐霉(Pythium sp.)HUST-RBB12已于2008年12月8日在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏中心地址：武汉武汉大学中国典型培养物保藏中心；邮政编码：430072；保藏编号：M208247。
本发明的腐霉HUST-RBB12菌株具有以下微生物学特性：
(1)形态学特性：
菌落在PDA培养基中菌丝为白色棉毛状，培养过程中菌落颜色无变化；菌丝无隔，孢子无色。
(2)培养学特性
在PDA培养基中，在20℃培养，该菌株生长快速，两天即可长满培养皿；
在液体种子培养基或是发酵培养基中培养时，菌丝分散良好，发酵液呈小米粥状，菌丝球直径小于5mm。
(3)生理特性
本发明的HUST-RBB12菌株是一种需氧菌，发酵培养时，在25℃显示出最佳的生长能力。作为碳源，蔗糖、大米粉水解液、麦芽糖、葡萄糖最利于HUST-RBB12的生长；而用阿拉伯糖、半乳糖作为碳源时，菌体生长缓慢。
腐霉HUST-RBB12菌株是通过以下方法得到：
(1)菌株分离纯化：取5g土样，放于盛有45ml的无菌水(带玻璃珠)的三角瓶中，振荡10分钟，将土样打匀。取0.5ml转于4.5ml无菌水中，依次稀释至10-4。取10-2，10-3，10-4三个稀释度，涂布于加入抗生素的PDA平板表面。于25℃培养至有霉菌长出，立刻挑取单菌落转接、纯化并做编号；
(2)初筛：分别挑取少量各纯化过的菌丝于小试管中，加入苏丹II与苏丹IV混合液，染色3-8分钟，用水冲洗2-5次。然后挑少量菌丝放到载玻片上，在400倍显微镜下进行镜检。菌丝体内脂肪粒被染成红色，选取脂肪粒大而多的菌株进行发酵培养。同时，对这些菌株进行斜面保种；
(3)复筛：将初筛后的菌株接至PDA斜面培养基中进行培养，温度18℃-25℃，时间3-5天，无菌操作倒入10ml无菌水，洗脱孢子，然后转接到液体培养基中，20℃-30℃，180rpm培养5天。收获湿菌体并在50℃-90℃温度进行烘干，然后研磨，从中提取油脂，甲脂化后进行气相色谱分析。将EPA产量最高的菌株命名为HUST-RBB，经生理生化鉴定和分子鉴定，最终鉴定为腐霉(Pythium sp.)，通过常规诱变育种得到一株产量更高的菌种，且产量较为稳定，命名为HUST-RBB12。
将上述HUST-RBB12菌种进行菌种活化培养，将菌种的孢子悬液进行种子培养，再将得到的种子培养液进行发酵培养，收获湿菌体，烘干研磨，从中提取二十碳五烯酸油脂。
采用自行筛选并经诱变获得的腐霉HUST-RBB12菌株，进行发酵制备二十碳五烯酸油脂。获得EPA最高产量达到2.1g/L，高于目前国内外报道的最高产量。同时，本发明方法所制得的微生物油脂不含有二十二碳六烯酸(DHA)残基，故有利于含EPA油脂的分离纯化，满足市场对含有EPA，不含有DHA的特种多不饱和油脂的广泛需求。此发明方法为EPA的产业化应用提供了新的技术支撑，具有巨大的潜在开发价值。
具体而言，本发明具有以下优点：
(1)本发明首次发现产二十碳五烯酸油脂的腐霉(Pythium sp.)，并自行经筛和诱变获得一株EPA高产菌株HUST-RBB12，为二十碳五烯酸油脂的产业化生产提供了新的微生物来源；
(2)本发明采用腐霉HUST-RBB12菌种生产高产量的具有重要生理活性的二十碳五烯酸(EPA)油脂，本发明方法所制得的油脂含有6％～15％的二十碳五烯酸残基，且二十碳五烯酸产量高达2.1g/L，高于目前国内外已报道的微生物发酵法生产二十碳五烯酸油脂的最高产量；
(3)本发明方法所制得的油脂不含有二十二碳六烯酸(DHA)残基，故有利于EPA油脂的分离纯化，满足市场对含有EPA，不含有DHA的特种多不饱和油脂的广泛需求；
(4)该二十碳五烯酸油脂的生产方法成本低、操作简单，易于实现产业化生产，具有较好的开发应用前景。
附图说明
图1为该菌种发酵后染色镜检(400倍)；
图2为菌种HUST-RBB12的菌落形态；
图3为菌株HUST-RBB12脂肪酸气相色谱分析。
具体实施方式
使用本发明提供的腐霉(Pythium sp.)HUST-RBB12菌株进行发酵培养可以制备二十碳五烯酸油脂，其发酵制备二十碳五烯酸油脂的优化方案为：
(1)将HUST-RBB12菌种进行12-48小时的菌种活化培养；
(2)将菌种的孢子悬液接入种子培养基进行24-72小时培养，得到种子培养液；
(3)将种子培养液转接到摇瓶培养基中，进行第一阶段摇瓶发酵培养4-8天，或转接到10L发酵罐进行第一阶段发酵罐培养4-8天；
(4)再进行3-10天第二阶段发酵培养，收获湿菌体，并在50℃-90℃温度进行烘干，然后研磨，从中提取油脂。
上述种子培养的优化方案为：用无菌水对试管中的孢子进行冲洗，然后将3-15ml洗液接入种子培养基，种子活化培养基配方：葡萄糖30-130
g/L、酵母粉2-7g/L、K2PO4 0.3-0.8g/L、NaNO3 3-8g/L，其余为自来水，pH 5.0-8.0；装液量：250ml三角瓶中装50-120ml发酵液；摇床转速100-300rpm，温度15℃-32℃，时间2-5天。
第一阶段摇瓶发酵的优化培养方案为：将3-15ml种子培养液接入装有发酵培养基，发酵培养基配方：葡萄糖30-130g/L、酵母粉2-7g/L、K2PO40.3-0.8g/L、NaNO3 3-8g/L、MgSO4 0.2-2.0g/L、CaCl2 0.2-2.0g/L，其余为自来水，pH 5.0-8.0；摇床转速100-300rpm，温度20℃-32℃，培养4-8天。第一阶段发酵罐培养方案为：将200-900ml种子培养液接入装有发酵培养基的10L发酵罐中，装液量为4-7L，发酵培养基配方：葡萄糖30-130g/L、酵母粉2-7g/L、K2PO4 0.3-0.8g/L、NaNO3 3-8g/L、MgSO4 0.2-2.0g/L、CaCl2 0.2-2.0g/L，其余为自来水，pH 5.0-8.0；搅拌转速100-300rpm，温度20℃-32℃，时间4-8天。
第二阶段摇瓶或第二阶段10L发酵罐发酵的优化培养方案为：向第一阶段发酵培养4-8天后的发酵液中，加入下列物质：乙醇20-120g/L，硝酸钾1.0-6.0g/L，氯化钙0.2-2.0g/L、pH 4.0-7.5；培养条件：温度0-18℃，时间3-10天，摇床转速或发酵罐搅拌转速：0-100rpm。
油脂提取的优化方案：将低温发酵结束后的发酵液进行抽滤，收集湿菌体，50℃-90℃烘干，然后仔细研磨，再用石油醚萃取两次，每克干菌体用5-10ml石油醚萃取，每次3-6小时，减压回收石油醚得到含EPA的油脂。
下面通过借助以下实施例将更加详细说明本发明，且以下实施例仅是说明性的，本发明并不受这些实施例的限制。
实施例1：
EPA高产菌株筛选：
(1)菌株分离纯化：取5g土样，放于盛有45ml的无菌水(带玻璃珠)的三角瓶中，振荡10分钟，将土样打匀。取0.5ml转于4.5ml无菌水中，依次稀释至10-4。取10-2，10-3，10-4三个稀释度，涂布于加入抗生素的PDA平板表面。于25℃培养至有霉菌长出，立刻挑取单菌落转接、纯化并做编号；
(2)初筛：挑取少量各纯化过的菌丝于小试管中，加入苏丹II与苏丹IV混合液，染色4分钟，用水冲洗3次。挑少量菌丝放到载玻片上，在400倍显微镜下进行镜检。菌丝体内脂肪粒被染成红色，选取脂肪粒大而多的菌株进行发酵培养。同时，对这些菌株进行斜面保种；
(3)复筛：将初筛后的菌株接至PDA斜面培养基中进行培养，温度25℃，时间3天，无菌操作倒入10ml无菌水，洗脱孢子，然后转接到液体培养基中，20℃，180rpm培养5天。收获湿菌体并在60℃温度进行烘干，然后研磨，从中提取油脂，甲脂化后进行气相色谱分析。将EPA产量最高的菌株命名为HUST-RBB，经生理生化鉴定和分子鉴定，最终鉴定为腐霉(Pythium sp.)，通过常规诱变育种得到一株产量更高的菌种，且产量较为稳定，命名为HUST-RBB12。相关实验图片见图1，图2：
实施例2：
菌种活化：将HUST-RBB12菌种接种于PDA平板培养基，20℃培养6天；PDA培养基配方为：土豆200g/L，葡萄糖20g/L，琼脂20g/L，加自来水补足到1L，121℃灭菌20分钟。
种子培养：菌种HUST-RBB12在PDA平板培养基上培养6天后，用无菌水将孢子进行悬浮，孢子液浓度为6×107个/L，然后将3ml洗液接入种子活化培养基，种子活化培养基配方为：葡萄糖30g/L、酵母粉7g/L、K2PO4 0.3g/L、NaNO3 8g/L，加自来水补足到1L，pH 5.0；装液量：250ml三角瓶中装50ml发酵液，摇床转速300rpm，温度15℃，时间5天。
第一阶段发酵培养过程：菌种活化5天后，将3ml种子培养液接入装有发酵培养基的摇瓶，发酵培养基配方为：葡萄糖30g/L、酵母粉7g/L、K2PO4 0.3g/L、NaNO3 8g/L、MgSO4 0.2g/L、CaCl2 0.2g/L，大豆油0.5g/L，加自来水补足到1L；pH 8.0，装液量：250ml三角瓶中装50ml发酵液，摇床转速100rpm，温度32℃，时间4天。
第二阶段发酵培养过程：向发酵4天后的发酵液中，加入下列物质进入第二阶段发酵培养：乙醇120g/L，硝酸钾1.0g/L，氯化钙0.2g/L；培养条件：温度18℃，时间3天，pH7.5，摇床转速：100rpm。
实验结果为：菌体干重为11.5g/L，油脂含量为2.30g/L，EPA产量为285mg/L，脂肪酸成分表1。
实施例3
菌种活化同实施例2。
种子活化：菌种HUST-RBB12在PDA平板培养基上培养6天后，用无菌水将孢子进行悬浮，孢子液浓度为4×107个/L，然后将5ml洗液接入种子活化培养基，种子活化培养基配方为：葡萄糖130g/L、酵母粉2g/L、K2PO4 0.8g/L、NaNO3 3g/L，其余为自来水，pH 8.0，装液量：250ml三角瓶中装120ml发酵液；摇床转速100rpm，温度32℃，培养2天。
第一阶段发酵培养过程：菌种活化2天后，将15ml种子培养液接入装有发酵培养基的摇瓶，发酵培养基配方为：葡萄糖130g/L、酵母粉2.0g/L、K2PO4 0.8g/L、NaNO3 3.0g/L，MgSO4 2.0g/L、CaCl2 2.0g/L，大豆油4.0g/L，其余为自来水；pH 4.0，装液量：250ml三角瓶中装120ml发酵液。发酵4天，摇床转速300rpm，温度：20℃。
第二阶段发酵培养过程：向发酵4天后的发酵液中，加入下列物质：乙醇20g/L，硝酸钾6.0g/L，氯化钙2.0g/L；温度0℃，发酵时间10天，pH 4.0，摇床转速：0rpm。
结果为菌体干重为26.5g/L，油脂含量为8.32g/L，EPA产量为666mg/L。
实施例4
菌种活化同实施例2。
种子活化：菌种HUST-RBB12在PDA平板培养基上培养6天后，用无菌水将孢子进行悬浮，孢子液浓度为5.5×107个/L，然后将5ml洗液接入种子活化培养基，种子活化培养基配方为：葡萄糖130g/L、酵母粉2g/L、K2PO4 0.8g/L、NaNO3 3g/L，其余为自来水，pH 8.0，装液量：250ml三角瓶中装70ml发酵液；摇床转速100rpm，温度32℃，培养2天。
第一阶段发酵培养过程：菌种活化2天后，将200ml种子培养液接入装有发酵培养基的发酵罐，发酵培养基配方为：葡萄糖130g/L、酵母粉2.0g/L、K2PO4 0.8g/L、NaNO3 3.0g/L，MgSO4 2.0g/L、CaCl2 2.0g/L，大豆油4.0g/L，其余为自来水；pH 4.0，装液量：10L发酵罐中装4L发酵液。发酵4天，摇床转速300rpm，温度：20℃。
第二阶段发酵培养过程：向发酵4天后的发酵液中，加入下列物质：乙醇80g/L，硝酸钾24.0g/L，氯化钙8.0g/L；温度0℃，发酵时间10天，pH 4.0，搅拌转速：0rpm。
结果为菌体干重为16.5g/L，油脂含量为5.12g/L，EPA产量为576mg/L。
实施例5
菌种活化同实施例2。
种子活化：用无菌水将在PDA平板培养基上培养6天的菌种的孢子进行冲洗，然后将洗液接入种子活化培养基，种子活化培养基配方为：葡萄糖70g/L、酵母粉4g/L、K2PO4 0.6g/L、NaNO3 4g/L，其余为自来水，pH 7.0，装液量：250ml三角瓶中装100ml发酵液；摇床转速180rpm，温度25℃，培养3天。
第一阶段发酵罐培养过程：菌种活化3天后，将200ml种子培养液接入装有发酵培养基的摇瓶，发酵培养基配方为：葡萄糖80g/L、酵母粉6g/L、K2PO4 0.7g/L、NaNO3 4g/L，MgSO4 0.6g/L、CaCl2 1.4g/L，大豆油2.0g/L，其余为自来水；pH 4.5，装液量：10L发酵罐中装4L发酵液。发酵4天，摇床转速300rpm，温度：20℃。
第二阶段发酵罐培养过程：向发酵4天后的发酵液中，加入下列物质：乙醇40g/L，硝酸钾5.0g/L，氯化钙0.6g/L；温度8℃，发酵时间8天，pH 5.0，摇床转速：40rpm。
结果为：菌体干重24.5g/L，油脂含量8.24g/L，EPA产量1045mg/L，脂肪酸成分表2。
实施例6
菌种活化同实施例2。
种子活化：用无菌水将在PDA平板培养基上培养6天的菌种的孢子进行冲洗，然后将洗液接入种子活化培养基，种子活化培养基配方为：葡萄糖110g/L、酵母粉4g/L、K2PO4 0.5g/L、NaNO3 4g/L，其余为自来水，pH5.5，装液量：250ml三角瓶中装120ml发酵液；摇床转速200rpm，温度20℃，培养3天。
第一阶段发酵培养过程：菌种活化结束，将8ml种子培养液接入装有发酵培养基的摇瓶，发酵培养基配方为：葡萄糖100g/L、酵母粉7g/L、K2PO4 0.4g/L、NaNO3 6g/L，MgSO4 0.8g/L、CaCl2 1.2g/L，大豆油4.0g/L，其余为自来水；pH 4.0，装液量：250ml三角瓶中装120ml发酵液。发酵4天，摇床转速300rpm，温度：20℃。
第二阶段发酵培养过程：向发酵4天后的发酵液中，加入下列物质：乙醇70g/L，硝酸钾6.0g/L，氯化钙1.4g/L；温度0℃，发酵时间10天，pH 4.0，摇床转速：80rpm。
结果为菌体干重为32.5g/L，油脂含量为13.12g/L，EPA产量为1210mg/L。
实施例7
菌种活化同实施例2。
种子活化：用无菌水将在PDA平板培养基上培养6天的菌种的孢子进行冲洗，然后将洗液接入种子活化培养基，种子活化培养基配方为：葡萄糖80g/L、酵母粉6g/L、K2PO4 0.6g/L、NaNO3 7g/L，其余为自来水，pH 5.0，装液量：250ml三角瓶中装90ml发酵液；摇床转速220rpm，温度20℃，培养4天。
第一阶段发酵培养过程：菌种活化结束，将8ml种子培养液接入装有发酵培养基的摇瓶，发酵培养基配方为：葡萄糖100g/L、酵母粉7g/L、K2PO4 0.6g/L、NaNO3 6g/L，MgSO4 0.5g/L、CaCl2 1.0g/L，大豆油2.0g/L，其余为自来水；pH4.5，装液量：250ml三角瓶中装80ml发酵液。发酵6天，摇床转速250rpm，温度：20℃。
第二阶段发酵培养过程：向发酵4天后的发酵液中，加入下列物质：乙醇80g/L，硝酸钾7.0g/L，氯化钙0.8g/L；温度10℃，发酵时间8天，pH5.0，摇床转速：90rpm。
结果：菌体干重36.5g/L，油脂量14.3g/L，EPA量2.1g/L，脂肪酸成分见表3，气相结果见图3。
表1.微生物油脂脂肪酸成分表
| 脂肪酸 | 百分含量 |
| 棕榈酸(16：0) | 11.7％ |
| 硬脂酸(18：0) | 5.7％ |
| 油酸(18：1) | 33.2％ |
| 亚油酸(18：2) | 18.1％ |
| α-亚麻酸(18：3) | 11.4％ |
| EPA(20：5) | 12.4％ |
| 其它 | 9.5％ |
表2.微生物油脂脂肪酸成分表
| 脂肪酸 | 百分含量 |
| 棕榈酸(16：0) | 11.5％ |
| 硬脂酸(18：0) | 5.7％ |
| 油酸(18：1) | 33.2％ |
| 亚油酸(18：2) | 18.1％ |
| α-亚麻酸(18：3) | 11.4％ |
| EPA(20：5) | 12.7％ |
| 其它 | 9.4％ |
表3.微生物油脂脂肪酸成分表
| 脂肪酸 | 百分含量 |
| 棕榈酸(16：0) | 10.5％ |
| 硬脂酸(18：0) | 5.9％ |
| 油酸(18：1) | 32.9％ |
| 亚油酸(18：2) | 16.8％ |
| α-亚麻酸(18：3) | 11.2％ |
| EPA(20：5) | 14.7％ |
| 其它 | 8.0％ |
Claims (7)
1、产二十碳五烯酸油脂的腐霉(Pythium sp.)HUST-RBB12 CCTCCNo.M208247。
2、一种二十碳五烯酸油脂的发酵制备方法，将HUST-RBB12菌种进行菌种活化培养，将菌种的孢子悬液进行种子培养，再将得到的种子培养液进行发酵培养，收获湿菌体，烘干研磨，从中提取油脂。
3、根据权利要求2所述的发酵制备方法，其特征在于：
(1)将HUST-RBB12菌种进行12-48小时的菌种活化培养；
(2)将菌种的孢子悬液接入种子培养基进行24-72小时培养，得到种子培养液；
(3)将种子培养液转接到摇瓶培养基中，进行第一阶段摇瓶发酵培养4-8天，或转接到10L发酵罐进行第一阶段发酵罐培养4-8天；
(4)再进行3-10天第二阶段发酵培养，收获湿菌体，并在50℃-90℃温度进行烘干，然后研磨，从中提取油脂。
4、根据权利要求3所述的发酵制备方法，其特征在于：种子培养过程为：用无菌水对试管中的孢子进行冲洗，然后将3-15ml洗液接入种子培养基，种子活化培养基配方：葡萄糖30-130g/L、酵母粉2-7g/L、K2PO40.3-0.8g/L、NaNO3 3-8g/L，其余为自来水，pH 5.0-8.0；装液量：250ml三角瓶中装50-120ml发酵液；摇床转速100-300rpm，温度15℃-32℃，时间2-5天。
5、根据权利要求3或4所述的发酵制备方法，其特征在于：第一阶段摇瓶发酵培养过程为：将3-15ml种子培养液接入装有发酵培养基，发酵培养基配方：葡萄糖30-130g/L、酵母粉2-7g/L、K2PO40.3-0.8g/L、NaNO33-8g/L、MgSO4 0.2-2.0g/L、CaCl2 0.2-2.0g/L，其余为自来水，pH 5.0-8.0；摇床转速100-300rpm，温度20℃-32℃，培养4-8天；第一阶段发酵罐培养过程为：将200-900ml种子培养液接入装有发酵培养基的10L发酵罐中，装液量为4-7L，发酵培养基配方：葡萄糖30-130g/L、酵母粉2-7g/L、K2PO4 0.3-0.8g/L、NaNO3 3-8g/L、MgSO4 0.2-2.0g/L、CaCl2 0.2-2.0g/L，其余为自来水，pH 5.0-8.0；搅拌转速100-300rpm，温度20℃-32℃，时间4-8天。
6、根据权利要求3或4所述的发酵制备方法，其特征在于：第二阶段摇瓶或第二阶段10L发酵罐发酵培养过程为：向第一阶段发酵培养4-8天后的发酵液中，加入下列物质：乙醇20-120g/L，硝酸钾1.0-6.0g/L，氯化钙0.2-2.0g/L、pH 4.0-7.5；培养条件：温度0-18℃，时间3-10天，摇床转速或发酵罐搅拌转速：0-100rpm。
7、根据权利要求3或4所述的发酵制备方法，其特征在于：步骤(4)中，油脂的提取方法：将低温发酵结束后的发酵液进行抽滤，收集湿菌体，50℃-90℃烘干，然后仔细研磨，再用石油醚萃取两次，每克干菌体用5-10ml石油醚萃取，每次3-6小时，减压回收石油醚得到含EPA的油脂。
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