CN106119323B - 一种可提高枯草菌脂肽钠产量的发酵培养方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种可提高枯草菌脂肽钠产量的发酵培养方法，其特征在于：(1)以枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）为出发菌进行种子菌培养；(2)发酵培养：按体积分数2.5~12%的接种量将步骤(1)中培养好的种子菌接入发酵培养基，所述发酵培养基由葡萄糖、海藻油和米糠蜡作为碳源，D‑谷氨酸和D‑亮氨酸的总质量浓度为3~8g/L；(3)碱化成盐：得枯草菌脂肽钠粗品。本发明制备枯草菌脂肽钠产量高，所得枯草菌脂肽钠表面活性更强。

Description

一种可提高枯草菌脂肽钠产量的发酵培养方法
技术领域
本发明属于微生物发酵技术领域，特别涉及一种可提高枯草菌脂肽钠产量的发酵培养方法。
技术背景
生物表面活性剂是由微生物所产生的一类具有表面活性的生物大分子物质，主要由微生物发酵法和酶催化法生产。与传统的化学合成的表面活性剂相比，生物表面活性剂有更强的界面活性，此外还具有无毒、能生物降解、无污染等优点。
根据化学组成和微生物来源的差异，可将生物表面活性剂分为糖脂、脂肪酸和磷脂、脂肽和脂蛋白、多聚生物表面活性剂和特殊生物表面活性剂五类。其中，枯草菌脂肽（surfactin）是一种由枯草芽孢杆菌产生的脂肽类生物表面活性剂，多以钠盐形式应用，是表面活性最强的生物表面活性剂之一，在石油工业、农业、食品和高端化妆品等行业中具有巨大的应用潜力。然而，较高的生产成本和较低的产量限制了枯草菌脂肽的工业化生产，很大程度上制约其应用范围。
目前，国内外主要采用枯草芽孢杆菌发酵法制备枯草菌脂肽。研究表明，抗菌脂肽的生物合成过程主要受发酵培养基组分和发酵条件的影响。其中，发酵培养基中碳源和氮源的选择及配比将直接影响枯草菌脂肽的产量。与此同时，接种量、温度、时间、pH等条件也会对发酵过程产生影响，成为学者们研究的热点。王帅等人以枯草芽孢杆菌G1为出发菌株，选择葡萄糖为碳源，在Landy培养基和优化后的发酵条件下，脂肽类物质（包含枯草菌脂肽）的产量可达到2.4g/L。 Vedaraman等人采用废弃煎炸葵花油、废弃煎炸米糠油分别培养，枯草菌脂肽的产量达到750mg/L和550 mg/L。Makkar等人研究了不同氨基酸对枯草菌脂肽产量的影响，结果表明，天门冬氨酸（Asp）、门冬酰胺（Asn）、缬氨酸（Val）、赖氨酸（Lys）都能使产量提高60%左右。黄翔峰等人还验证了培养基中金属离子Fe2+的加入对枯草菌脂肽合成的促进作用，当Fe2 +添加浓度为5mmol/L时，脂肽产量达到最大2.34 g / L。专利《一种枯草菌脂肽钠的制备方法》所述制备方法是通过控制菌种斜面的保藏时间，人为的控制菌体代谢，使菌体内积累大量参与代谢的酶，以提高菌体在产物生成期的代谢能力，最终枯草菌脂肽钠粗品的产量为15~25g/L。上述探究虽然能从一定程度上增加枯草菌脂肽的产量，但枯草菌脂肽的得率仍然太低，无法实现产业化生产，不能满足商业化用途。
枯草菌脂肽由肽链和脂肪烃链两部分组成，由于肽链中氨基酸种类、位置以及脂肪酸链长度的不同，枯草菌脂肽有许多同系物异构体，其中C13、C14、C15组分是其主要成分，而C15-Surfactin在同系物中生物活性最强，具有更为优异的表面活性。但在现有研究中，发酵获得的枯草菌脂肽中C15组分的含量仅为50~60%。由上所述，寻找能够提高枯草菌脂肽产量并增加C15组分含量的发酵培养方法成为科研工作者亟待解决的问题。
发明内容
本发明要解决的技术问题是，提供一种可提高枯草菌脂肽钠产量的发酵培养方法，本发明制备的枯草菌脂肽钠表面活性更强。
为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：一种可提高枯草菌脂肽钠产量的发酵培养方法，其特征在于采用以下步骤：
(1) 种子菌培养：以保藏编号为CICC No. 23718的枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）为出发菌株，将保存的菌种转接至LB平板上，将其置于37℃培养箱活化24h；用接种环从新鲜斜面挑取一环接种于种子液体培养基中，于28℃，210rpm/min下摇床培养24h后作为种子菌备用；所述种子液体培养基的配方为：牛肉浸膏4.0g/L，蛋白胨12.0g/L，酵母膏6.0g/L，NaCl 3.0g/L，葡萄糖8.0g/L；所述种子液体培养基的pH为 6.5~7.2；
(2) 发酵培养：按体积分数2.5~12%的接种量将步骤(1)中培养好的种子菌接入发酵培养基，于32~40℃，100~320rpm/min下摇床培养24~60h，发酵过程中通入无菌空气，通气量为4~10m3/h，并加入0.5~2.0mol/L NaOH溶液，维持发酵液pH在6.5~7.2，发酵完成得全培养液；所述发酵培养基组成为：葡萄糖、海藻油和米糠蜡作为碳源，碳源的总质量浓度12~80g/L，所述碳源中的葡萄糖、海藻油、米糠蜡质量比为 10~15 : 1.5~3 : 0.5~1；D-谷氨酸和D-亮氨酸的总质量浓度为3~8g/L，其中D-谷氨酸与D-亮氨酸的质量比为 4~8 : 1；KH2PO4的质量浓度为2~4g/L；NH4NO3的质量浓度为2~4g/L；Na2HPO4的质量浓度为3~5g/L；MgSO4·7H2O的质量浓度为0.05~0.25g/L；FeSO4·7H2O的质量浓度为0.12~0.46g/L；CaCl2·2H2O的质量浓度为0.01~0.08g/L；EDTA-2Na的质量浓度为0.01~1.00g/L；
(3) 碱化成盐：将步骤(2)中所得全培养液，在4℃、10000rpm/min下离心10min去除菌体，得上清液，用HCl溶液调节所述上清液pH至2~3；在4℃下放置24h，离心收集沉淀物，得到枯草菌脂肽粗产物；以枯草菌脂肽粗产物 : 纯净水=1:1000~1200的质量比，将枯草菌脂肽粗产物溶于纯净水中，然后用3~5 mol/L NaOH溶液调节pH至6.5~7.2，干燥后即得枯草菌脂肽钠粗品。
进一步，所述海藻油中的顺式4，7，10，13，16，19-二十二碳六烯酸含量高于30%。
所述米糠蜡中二十八烷醇和三十烷醇的总量高于40%。
本发明的枯草菌脂肽钠粗品的产量为27.5~38.5g/L，明显高于专利文献《一种枯草菌脂肽钠的制备方法》公开的制备方法所实现的产量15~25g/L。本发明相对于现有枯草菌脂肽钠制备方法，枯草菌脂肽钠的产量有显著提升，本发明具有促进枯草菌脂肽合成的有益效果。
为进一步说明本发明取得的有益效果，本发明按实施例3所述步骤与表1所述条件，考察了氨基酸种类与Surfactin产量的关系，结果发现，与L-谷氨酸、L-亮氨酸相比，发酵培养基中D-谷氨基酸和D-亮氨酸的加入能显著增加Surfactin的产量，说明D型氨基酸能促进菌体更高效地利用碳源，并促使碳源流向Surfactin的合成。
表1 氨基酸种类对Surfactin产量的影响
本发明还按实施例3所述步骤与表2所述条件，比较了不同碳源种类及组合下，培养所得Surfactin的同系物组成。由表2、图1可知，选择单一物质为碳源时，葡萄糖碳源最利于C15-Surfactin的生成；改用质量比为5:2的葡萄糖和海藻油为碳源时，C15组分的含量有一定提升；将质量比为10 : 3 : 1的葡萄糖、海藻油、米糠蜡组合使用时，C15-Surfactin的含量得到明显提高，可见葡萄糖、海藻油、米糠蜡这种碳源组合具有显著促进活性更强的C15组分发酵的作用。
表2碳源种类对Surfactin同系物组成的影响
在上述实验条件的基础上，本发明还对比了不同碳源种类下，培养得到的枯草菌脂肽钠的表面活性。将枯草菌脂肽钠成品溶于蒸馏水，配成50 mg/L溶液，用表面张力测定仪测定溶液表面张力。结果表明，在优选条件下，采用本发明所述三种物质为碳源时，溶液的表面张力为27.2 mN·m-1 ，而采用葡萄糖和海藻油或单一的葡萄糖为碳源时，溶液的表面张力分别为31.7 mN·m-1和33.76 mN·m-1。可见，本发明选用的碳源制备得到的枯草菌脂肽钠具有更强的表面活性。
表3 碳源种类对Surfactin表面性能的影响
本发明提供一种可提高枯草菌脂肽钠产量的发酵培养方法。本发明的优点为：1）发酵培养过程中，D型氨基酸D-谷氨酸和D-亮氨酸的加入可提高菌体对碳源的利用率，促使碳源流向脂肽的合成，从而增加枯草菌脂肽钠的产量，与现有技术相比，产量提高，解决了现有实验室研究中枯草菌脂肽钠产量较低的技术问题，可以满足工业化大规模生产；2）采用葡萄糖、海藻油和米糠蜡三种物质作为发酵培养基的碳源，可通过控制三种碳源的质量比，显著提高同系物异构体中生物活性更高的C15组分的产量，获得表面活性更强的枯草菌脂肽钠。
附图说明
图1 为不同碳源种类对Surfactin同系物组成的影响示意图；
A为C13-Surfactin；B为C14-Surfactin；C为C15-Surfactin。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，但本发明并不局限于以下实施例。
实施例1：
一种可提高枯草菌脂肽钠产量的发酵培养方法，采用以下步骤：
(1) 种子菌培养：以Bacillus subtilis BS-37为出发菌株，将保存的菌种转接至LB平板上，将其置于37℃培养箱活化24 h；用接种环从新鲜斜面挑取一环接种于种子液体培养基中，于28 ℃，210 rpm/min下摇床培养24 h后作为种子菌备用。其中种子液体培养基的组成为：牛肉浸膏4.0 g/L，蛋白胨12.0 g/L，酵母膏6.0 g/L，NaCl 3.0 g/L，葡萄糖8.0g/L，pH 6.8。
(2) 发酵培养：按体积分数3.0%的接种量将步骤(1)中培养好的种子菌接入到添加有葡萄糖24.0 g，海藻油2.4 g，米糠蜡0.8 g，D-谷氨酸6.0 g，D-亮氨酸1.0 g的基础无机盐培养基（MMSM培养基）中（配方见表4），于34℃，180 rpm/min下摇床培养24 h，发酵过程中通入无菌空气，通气量为6 m3/h，并加入1.2 mol/L NaOH溶液，维持发酵液pH在6.8。
(3) 碱化成盐：将步骤(2)中所得全培养液，4℃、10000 rpm/min下离心10 min以去除菌体，用HCl溶液调节上清液至pH=2~3，在4℃下放置过夜后，离心收集沉淀，得到枯草菌脂肽粗产物。以枯草菌脂肽粗产物 : 纯净水=1:1080的质量比，将枯草菌脂肽粗产物溶于纯净水中，用3.2 mol/L NaOH溶液调节pH至6.8，干燥后即得枯草菌脂肽钠粗品。枯草菌脂肽钠粗品的产量为28.6 g/L。
表4 实施例1中基础无机培养基（MMSM）组成
实施例2：
一种可提高枯草菌脂肽钠产量的发酵培养方法，采用以下步骤：
(1) 种子菌培养：以Bacillus subtilis BS-37为出发菌株，将保存的菌种转接至LB平板上，将其置于37℃培养箱活化24 h；用接种环从新鲜斜面挑取一环接种于种子液体培养基中，于28℃，210 rpm/min下摇床培养24 h后作为种子菌备用。其中种子液体培养基的组成为：牛肉浸膏4.0 g/L，蛋白胨12.0 g/L，酵母膏6.0 g/L，NaCl 3.0 g/L，葡萄糖8.0g/L，pH 6.6。
(2) 发酵培养：按体积分数5.5%的接种量将步骤(1)中培养好的种子菌接入到添加有葡萄糖36.0 g，海藻油3.8 g，米糠蜡2.4 g，D-谷氨酸4.0 g，D-亮氨酸0.5 g的基础无机盐培养基（MMSM培养基）中（配方见表5），于34℃，220 rpm/min下摇床培养36 h，发酵过程中通入无菌空气，通气量为4 m3/h，并加入1.4 mol/L NaOH溶液，维持发酵液pH在6.6。
(3) 碱化成盐：将步骤(2)中所得全培养液，4℃、10000 rpm/min下离心10 min以去除菌体，用HCl溶液调节上清液至pH=2~3，在4℃下放置过夜后，离心收集沉淀，得到枯草菌脂肽粗产物。以枯草菌脂肽粗产物 : 纯净水=1:1200的质量比，将枯草菌脂肽粗产物溶于纯净水中，用3.4 mol/L NaOH溶液调节pH至6.6，干燥后即得枯草菌脂肽钠粗品。枯草菌脂肽钠粗品的产量为30.1 g/L。
表5 实施例2中基础无机培养基（MMSM）组成
实施例3：
一种可提高枯草菌脂肽钠产量的发酵培养方法，采用以下步骤：
(1) 种子菌培养：以Bacillus subtilis BS-37为出发菌株，将保存的菌种转接至LB平板上，将其置于37℃培养箱活化24 h；用接种环从新鲜斜面挑取一环接种于种子液体培养基中，于28℃，210 rpm/min下摇床培养24 h后作为种子菌备用。其中种子液体培养基的组成为：牛肉浸膏4.0 g/L，蛋白胨12.0 g/L，酵母膏6.0 g/L，NaCl 3.0 g/L，葡萄糖8.0g/L，pH 7.0。
(2) 发酵培养：按体积分数8.0%的接种量将步骤(1)中培养好的种子菌接入到添加有葡萄糖50.0 g，海藻油15.0 g，米糠蜡5.0 g，D-谷氨酸5.0 g，D-亮氨酸1.0 g的基础无机盐培养基（MMSM培养基）中（配方见表6），于36℃，280 rpm/min下摇床培养48 h，发酵过程中通入无菌空气，通气量为8 m3/h，并加入0.8 mol/L NaOH溶液，维持发酵液pH在7.0。
(3) 碱化成盐：将步骤(2)中所得全培养液，4℃、10000 rpm/min下离心10 min以去除菌体，用HCl溶液调节上清液至pH=2~3，在4℃下放置过夜后，离心收集沉淀，得到枯草菌脂肽粗产物。以枯草菌脂肽粗产物 : 纯净水=1:1040的质量比，将枯草菌脂肽粗产物溶于纯净水中，用3.8 mol/L NaOH溶液调节pH至7.0，干燥后即得枯草菌脂肽钠粗品。枯草菌脂肽钠粗品的产量为36.5 g/L。
表6 实施例3中基础无机培养基（MMSM）组成
实施例4：
一种可提高枯草菌脂肽钠产量的发酵培养方法，采用以下步骤：
(1) 种子菌培养：以Bacillus subtilis BS-37为出发菌株，将保存的菌种转接至LB平板上，将其置于37℃培养箱活化24 h；用接种环从新鲜斜面挑取一环接种于种子液体培养基中，于28℃，210 rpm/min下摇床培养24 h后作为种子菌备用。其中种子液体培养基的组成为：牛肉浸膏4.0 g/L，蛋白胨12.0 g/L，酵母膏6.0 g/L，NaCl 3.0 g/L，葡萄糖8.0g/L，pH 6.9。
(2) 发酵培养：按体积分数10.0%的接种量将步骤(1)中培养好的种子菌接入到添加有葡萄糖60.0 g，海藻油10.0 g，米糠蜡6.0 g，D-谷氨酸3.2 g，D-亮氨酸0.8 g的基础无机盐培养基（MMSM培养基）中（配方见表7），于38℃，120 rpm/min下摇床培养60 h，发酵过程中通入无菌空气，通气量为7 m3/h，并加入1.8 mol/L NaOH溶液，维持发酵液pH在6.9。
(3) 碱化成盐：将步骤(2)中所得全培养液，4℃、10000 rpm/min下离心10 min以去除菌体，用HCl溶液调节上清液至pH=2~3，在4℃下放置过夜后，离心收集沉淀，得到枯草菌脂肽粗产物。以枯草菌脂肽粗产物 : 纯净水=1:1120的质量比，将枯草菌脂肽粗产物溶于纯净水中，用4.4 mol/L NaOH溶液调节pH至6.9，干燥后即得枯草菌脂肽钠粗品。枯草菌脂肽钠粗品的产量为31.9 g/L。
表7 实施例4中基础无机培养基（MMSM）组成
实施例5：
一种可提高枯草菌脂肽钠产量的发酵培养方法，采用以下步骤：
(1) 种子菌培养：以Bacillus subtilis BS-37为出发菌株，将保存的菌种转接至LB平板上，将其置于37℃培养箱活化24 h；用接种环从新鲜斜面挑取一环接种于种子液体培养基中，于28℃，210 rpm/min下摇床培养24 h后作为种子菌备用。其中种子液体培养基的组成为：牛肉浸膏4.0 g/L，蛋白胨12.0 g/L，酵母膏6.0 g/L，NaCl 3.0 g/L，葡萄糖8.0g/L，pH 6.9。
(2) 发酵培养：按体积分数11.5%的接种量将步骤(1)中培养好的种子菌接入到添加有葡萄糖55.0 g，海藻油16.2 g，米糠蜡5.6 g，D-谷氨酸4.0 g，D-亮氨酸1.0 g的基础无机盐培养基（MMSM培养基）中（配方见表8），于36℃，240 rpm/min下摇床培养48 h，发酵过程中通入无菌空气，通气量为8 m3/h，并加入1.8 mol/L NaOH溶液，维持发酵液pH在6.9。
(3) 碱化成盐：将步骤(2)中所得全培养液，4℃、10000 rpm/min下离心10 min以去除菌体，用HCl溶液调节上清液至pH=2~3，在4℃下放置过夜后，离心收集沉淀，得到枯草菌脂肽粗产物。以枯草菌脂肽粗产物 : 纯净水=1:1160的质量比，将枯草菌脂肽粗产物溶于纯净水中，用3.8 mol/L NaOH溶液调节pH至6.9，干燥后即得枯草菌脂肽钠粗品。枯草菌脂肽钠粗品的产量为34.2 g/L。
表8 实施例5中基础无机培养基（MMSM）组成

Claims (3)

1.一种提高枯草菌脂肽钠产量的发酵培养方法，其特征在于采用以下步骤：
(1) 种子菌培养：以保藏编号为CICC No. 23718的枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）为出发菌株，将保存的菌种转接至LB平板上，将其置于37℃培养箱活化24h；用接种环从新鲜斜面挑取一环接种于种子液体培养基中，于28℃，210rpm下摇床培养24h后作为种子菌备用；所述种子液体培养基的配方为：牛肉浸膏4.0g/L，蛋白胨12.0g/L，酵母膏6.0g/L，NaCl 3.0g/L，葡萄糖8.0g/L；所述种子液体培养基的pH为 6.5~7.2；
(2) 发酵培养：按体积分数2.5~12%的接种量将步骤(1)中培养好的种子菌接入发酵培养基，于32~40℃，100~320rpm下摇床培养24~60h，发酵过程中通入无菌空气，通气量为4~10m3/h，并加入0.5~2.0mol/L NaOH溶液，维持发酵液pH在6.5~7.2，发酵完成得全培养液；所述发酵培养基组成为：葡萄糖、海藻油和米糠蜡作为碳源，碳源的总质量浓度12~80g/L，所述碳源中的葡萄糖、海藻油、米糠蜡质量比为 10~15 : 1.5~3 : 0.5~1；D-谷氨酸和D-亮氨酸的总质量浓度为3~8g/L，其中D-谷氨酸与D-亮氨酸的质量比为 4~8 : 1；KH2PO4 的质量浓度为2~4g/L；NH4NO3的质量浓度为2~4g/L；Na2HPO4的质量浓度为3~5g/L；MgSO4·7H2O的质量浓度为0.05~0.25g/L；FeSO4·7H2O的质量浓度为0.12~0.46g/L；CaCl2·2H2O的质量浓度为0.01~0.08g/L；EDTA-2Na的质量浓度为0.01~1.00g/L；
(3) 碱化成盐：将步骤(2)中所得全培养液，在4℃、10000rpm下离心10min去除菌体，得上清液，用HCl溶液调节所述上清液pH至2~3；在4℃下放置24h，离心收集沉淀物，得到枯草菌脂肽粗产物；以枯草菌脂肽粗产物 : 纯净水=1:1000~1200的质量比，将枯草菌脂肽粗产物溶于纯净水中，然后用3~5 mol/L NaOH溶液调节pH至6.5~7.2，干燥后即得枯草菌脂肽钠粗品。
2.根据权利要求1所述的提高枯草菌脂肽钠产量的发酵培养方法，其特征在于：所述海藻油中的顺式4，7，10，13，16，19-二十二碳六烯酸含量高于30%。
3.根据权利要求1所述的提高枯草菌脂肽钠产量的发酵培养方法，其特征在于：所述米糠蜡中二十八烷醇和三十烷醇的总量高于40%。
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