CN110331179B

CN110331179B - 一种生物抑尘剂的绿色合成方法

Info

Publication number: CN110331179B
Application number: CN201910676330.5A
Authority: CN
Inventors: 王和堂; 贺胜; 谢广然; 张越; 高昕玥; 武扬帆
Original assignee: China University of Mining and Technology CUMT
Current assignee: China University of Mining and Technology CUMT
Priority date: 2019-07-25
Filing date: 2019-07-25
Publication date: 2023-10-10
Anticipated expiration: 2039-07-25
Also published as: CN110331179A

Abstract

本发明提供了一种生物抑尘剂的绿色合成方法，包括菌种活化、菌种扩大培养与菌种发酵培养；其原理在于，菌种活化唤醒休眠状态的工作细菌菌株，菌种扩大培养获得数量绝对占优的工作细菌，菌种发酵培养使工作细菌以发酵Landy培养基为介质，通过次级代谢作用合成具有优异表面活性和润湿性能的表面活性素Surfactin。本发明对合成装置无极端条件耐受要求，合成方法简约，且合成的表面活性素在极低浓度下即可显著减小抑尘剂溶液与粉尘的接触角，充分提高润湿粉尘能力，且兼备绿色环保、环境友好的特点，在生产性粉尘防治领域具有广泛的适用性。

Description

一种生物抑尘剂的绿色合成方法

技术领域

本发明涉及一种抑尘剂的合成方法，尤其是一种生物抑尘剂的绿色合成方法，它利用生物手段合成表面活性素作为抑尘剂，属于生物抑尘新技术领域。

背景技术

抑尘剂（表面活性剂）防降尘技术在环保、矿业、化工、冶金、建筑等工业领域以及农业领域生产性粉尘防治中具有广阔的应用前景。例如：向清水中加入一定量的表面活性剂可以明显降低水的表面张力，提高水介质的降尘性能，使其更充分的浸润固体或润湿浮尘，抑制粉尘的产生或捕获浮尘。但是，现有的抑尘剂普遍为化学抑尘剂，该类抑尘剂使用浓度较高、造成使用成本偏高，难以规模化推广使用，并且化学抑尘剂在制备过程中会产生较多的有毒有害物质，污染环境，再者许多化学抑尘剂有一定的毒副作用和刺激性，不能满足高标准绿色抑尘的需求。针对传统抑尘剂的不足，本发明另辟蹊径、提出以生物技术绿色合成清洁高效的生物抑尘剂。目前，粉尘防治领域未见有生物抑尘剂的报道。在其他领域，虽有利用枯草芽孢杆菌合成生物表面活性剂Surfactin（表面活性素）的文献报道。如1968年,Arima等首次发现枯草芽孢杆菌株(Bacillus subtilis)产生的脂肽类表面活性剂,呈晶状,商品名为表面活性素(Surfactin)。然而，现有的表面活性素制备技术产出量较低，难以在工农业生产性粉尘防治领域推广使用。随着表面活性素合成技术的进步，有学者尝试利用基因工程等手段提高其产量，但该方法的表面活性素增产效果会随传代次数的增加而趋向弱化，不能达到稳定生产表面活性素的要求，且增加了工艺的复杂性、带来生产成本的升高。

发明内容：

针对现有技术的不足，本发明提供了一种生物抑尘剂的绿色合成方法，其技术方案如下：

一种生物抑尘剂的绿色合成方法，包括以下步骤：

a、菌种活化：向枯草芽孢杆菌冻干物中加入活化标准NB培养液，并吹打致形成NB菌悬液，取菌悬液接种活化NA平板，涂布均匀，37℃恒温培养，待着菌NA平板长出淡粉色枯草芽孢杆菌活菌菌落完成活化；

b、菌种扩大培养：筛选着菌NA平板上特征明显的淡粉色不透明粗糙状的枯草芽孢杆菌活菌菌落，刮取枯草芽孢杆菌活菌菌丝并转种至标准LB培养液中，振荡，至标准LB培养液呈浅绿色，标准LB培养液中的菌株在指定参数下摇床培养；

c、菌种发酵培养：完成扩大培养的枯草芽孢杆菌菌种大量存在于种子液中，形成浑浊的着菌LB菌悬液，吸取着菌LB菌悬液作为LB菌悬接种液转种至标准Landy培养液中，振荡摇匀，摇床培养，发酵完成后形成浑浊的着菌Landy发酵液，酸化沉淀，重悬，抽提，形成含表面活性素分子的提取液，超声萃取，减压蒸发后即可得到有一定纯度的生物抑尘剂。

优选地，

一种生物抑尘剂的绿色合成方法，包括以下步骤：

a、菌种活化：实验所需枯草芽孢杆菌，未使用时其冻干物置于-10℃干燥环境冷冻保存（39），使用前4℃解冻，酒精灯微灼安瓿瓶（1）连接处至通红，滴无菌水致其破裂，316不锈钢平头镊子（2）打管（40）连接处，2 ml一次性注射器（3）向枯草芽孢杆菌冻干物（25）送液（41）500 μl活化标准NB培养液（26）并吹打致形成NB菌悬液（27），取菌悬液（42）200 μl NB菌悬接种液（28）接种（43）活化NA平板（30），玻璃涂布器（5）涂布（44）均匀，置于恒温培养箱（6）金属盛物架（11）上，打开电源（15）、功能设置按钮（13）使数显面板（12）显示设置温度、调节温度调节按钮（14）至37℃，打开加热开关（16），37℃恒温培养（45）12 h，待着菌NA平板（30）长出淡粉色枯草芽孢杆菌活菌菌落（31）完成活化。

b、菌种扩大培养：筛选着菌NA平板（30）上特征明显的淡粉色不透明粗糙状的枯草芽孢杆菌活菌菌落（31），无菌塑料接种环（7）刮取NA着菌平板（30）枯草芽孢杆菌活菌菌丝并转种（46）至装有标准LB培养液（32）的250 ml三角瓶（8），振荡，至标准LB培养液（32）呈浅绿色，硅胶塞封住250 ml三角瓶（8）瓶口，打开预热后装有温水的水浴式恒温旋转-振荡摇床（9）的电源开关（18），调节控温旋钮（21）至37.0℃并在数显面板（17）显示，打开加热开关（19），将装有着菌标准LB培养液（32）的250 ml三角瓶（8）固定在水浴式恒温旋转-振荡摇床（9）的金属弹簧式固定架（23）上，打开旋转开关（20），转动调速旋钮（22）至180 r/min并在数显面板（17）显示，旋转壁（24）带动250 ml三角瓶（8）旋转，标准LB培养液（32）中的菌株在指定参数下摇床（47）培养。

c、菌种发酵培养：完成扩大培养的枯草芽孢杆菌菌种大量存在于种子液中，形成浑浊的着菌LB菌悬液（33），2 ml一次性注射器（3）吸取着菌LB菌悬液（33）1300 μl 作为LB菌悬接种液（34）转种（48）至装有标准Landy培养液（35）的250 ml三角瓶（8），振荡摇匀，硅胶塞封住250 ml三角瓶（8）瓶口，水浴式恒温旋转-振荡摇床（9）中摇床（49）培养，发酵完成后形成浑浊的着菌Landy发酵液（36），酸化沉淀，重悬，甲醇抽提（50），形成含表面活性素分子（38）的提取液（37），超声萃取，减压蒸发后即可得到有一定纯度的生物抑尘剂。

本发明的原理在于，菌种活化唤醒休眠状态的工作细菌菌株，菌种扩大培养创造数量绝对占优的工作细菌，菌种发酵培养使工作细菌以发酵Landy培养基为介质，通过次级代谢作用合成具有优异表面性质和润湿性能的生物抑尘剂。

本发明具有如下技术效果：

本发明提供了一种权利要求的生物抑尘剂的绿色、简约合成方法，是生物表面活性剂在抑尘领域的首次运用。该发明充分利用好氧型细菌-枯草芽孢杆菌合成生物抑尘剂的能力，使其以Landy培养基为营养物质，在合理的发酵条件下高效合成生物抑尘剂。通过合理改变发酵条件，创造使表面活性素产量最大化的发酵环境，从而实现表面活性素增产，达到粉尘防治领域的技术要求，无需对发酵菌株进行基因强化，从而保持了菌株产表面活性素能力的传代稳定性。特别地，本发明仅需在温和的条件中进行，技术步骤简约，可无严苛条件要求，且合成过程中不产生有毒有害废弃物，绿色环保。

较之化学抑尘剂，本发明技术优势突出：该生物抑尘剂在极低的浓度下即可显著降低水的表面张力，对粉尘表面有很强的润湿能力，是抑尘剂研发的突破性进展。通过对本发明的方法提纯的表面活性素样品与常见化学抑尘剂同时进行润湿性能测试，主要包括表面张力测试和接触角测试，结果表明：本发明合成的表面活性素在相同质量浓度下，其表面张力较化学抑尘剂有大幅降低；润湿煤尘样品时，在相同的润湿时间下，表面活性素溶液较化学抑尘剂溶液的接触角更小，其润湿效果更明显，并且表面活性素用量更少，显著节省了使用成本。此外，本发明合成的生物抑尘剂（表面活性素）无毒无害、无刺激性。

附图说明

图1反映了本发明的生物抑尘剂的绿色合成的流程。其中，（1）-（24）标明了合成所需仪器及组成部分，（25）-（38）标明了合成过程中涉及的生化材料，序号（39）-（51）标明了合成的中间步骤及工艺参数。

图2是生物抑尘剂分子的结构示意图。其中，(a)为Surfactin分子结构示意图，（b）为Surfactin红外光谱图。

图3为生物抑尘剂与化学抑尘剂润湿性能对比图。其中，图(a)反映了不同质量浓度的化学抑尘剂和生物抑尘的表面张力。图(b)反映了相同润湿时间下，低浓度生物抑尘剂和较高浓度化学抑尘剂与煤尘的接触角；左：0.0015% Surfactin，润湿含尘煤表面30 s接触角28.76°；中：0.05% AEO，润湿含尘煤表面30 s接触角29.63°；右：清水对照，润湿含尘煤表面30 s接触角70.61°。

具体实施方式

为使本技术领域人员更直观理解本发明方案，下面结合附图和具体实施方式对本发明做进一步详细说明。

本发明涉及的容器设备包括：

5 ml防冻安瓿瓶（1）、316不锈钢平头镊子（2）、2 ml一次性注射器（3）、玻璃培养皿（4）、玻璃涂布器（5）、恒温培养箱（6）、无菌塑料接种环（7）、250 ml三角瓶（8）、水浴式恒温旋转-振荡摇床（9）、橡胶式注射器活塞（10）、恒温培养箱金属盛物架（11）及其数显面板（12）、功能设置按钮（13）、温度调节按钮（14）、电源开关（15）、加热开关（16）、水浴式恒温旋转-振荡摇床数显面板（17）及其电源开关（18）、加热开关（19）、旋转开关（20）、控温旋钮（21）、调速旋钮（22）、金属弹簧式固定架（23）、旋转壁（24）。

本发明涉及的生化材料主要包括：

枯草芽孢杆菌冻干物（25）安瓿瓶保存、500 μl活化标准NB培养液（26）、NB菌悬液（27）、200 μl NB菌悬接种液（28）、NA活化平板（29）、着菌NA平板（30）、枯草芽孢杆菌活菌菌落（31）、标准LB培养液（32）pH=7、着菌LB菌悬液（33）、1300 μl LB菌悬接种液（34）、标准Landy培养液（35）pH=8、着菌Landy发酵液（36）、含Surfactin提取液（37）、表面活性素分子（38）。

其中，

枯草芽孢杆菌系枯草芽孢杆菌标准菌株BNCC 189983，购自北纳生物科技有限公司；

标准Landy培养液，自制，配方为(/L)：一水合葡萄糖C₆H₁₂O_6·H₂O 21.99933 g、L-谷氨酸C₅H₉NO₄5.00000 g、KH₂PO₄1.00000 g、KCl 0.50000 g、MgSO₄0.50000 g、MnSO_4·H₂O0.00559 g、CuSO_4·5H₂O 0.00025 g、FeSO_4·7H₂O 0.00027 g，pH=7.00；

标准NB培养液，自制，配方为(/L)：牛肉膏3.00000 g、蛋白胨10.00000 g、氯化钠10.00000 g，pH=7.00；

标准LB培养液，自制，配方为(/L)：酵母粉5.00000 g、胰蛋白胨10.00000 g、氯化钠10.00000 g，pH=7.00。

本发明涉及的操作及要求说明如下：

冷冻保存（-10℃干燥环境）；

打管（敲击安瓿瓶上下连接处致其破裂）；

送液（推送500 μl活化标准NB培养液并吹打）；

取菌悬液（吸取200 μl NB菌悬接种液）；

接种（推送NB菌悬液至NA平板）；

涂布（涂布器均匀涂布菌悬接种液）；

恒温培养（37℃培养12h）；

转种（NA着菌平板菌落用接种环刮取菌丝一环转种标准LB培养液）；

摇床（LB种子液37℃/180 rpm摇床2 d）；

转种（取着菌LB菌悬液1.3 ml转种标准Landy培养液）；

摇床（Landy发酵液37.6℃/220 rpm摇床2 d）；

抽提；

润湿能力测试：将生物抑尘剂配置成15-20 mg/L溶液，在含尘介质表面进行接触角测试，验证其润湿能力。

如图1所示，本发明的生物抑尘剂的绿色合成方法，包括如下步骤：

首先，需要对工作细菌进行活化和扩大培养，以保证其具有足够的表面活性素合成能力，工作细菌未使用时其冻干物置于-10℃干燥环境冷冻保存39，使用前4℃解冻，用酒精灯微灼安瓿瓶1连接处至其通红，并滴无菌水致连接处破裂，316不锈钢平头镊子2打管40连接处，用2 ml一次性注射器3向枯草芽孢杆菌冻干物2送液41，推送500 μl活化标准NB培养液26并吹打致形成均匀分布的NB菌悬液27，取菌悬液42，接种43菌悬接NB 200 μl种液28至活化NA平板30，用玻璃涂布器涂布44均匀后，置于恒温培养箱6金属盛物架11上，打开电源15、功能设置按钮13使数显面板12显示设置温度、调节温度调节按钮14至37℃，打开加热开关16，37℃恒温培养45时间12 h，待着菌NA平板30长出淡粉色枯草芽孢杆菌活菌菌落31，用无菌塑料接种环7刮取NA着菌平板30枯草芽孢杆菌活菌菌丝并转种46至装有标准LB培养液32的250 ml三角瓶8，充分振荡，至标准LB培养液32呈浅绿色，硅胶塞封住250 ml三角瓶8瓶口，打开预热后装有温水的水浴式恒温旋转-振荡摇床9的电源开关18，调节控温旋钮21至37.0℃并在数显面板17上显示，打开加热开关19，将装有着菌标准LB培养液32的250 ml三角瓶8固定在水浴式恒温旋转-振荡摇床9的金属弹簧式固定架23上，打开旋转开关20，转动调速旋钮22至180 r/min并在数显面板17显示，旋转壁24带动250 ml三角瓶8旋转，标准LB培养液32中的菌株在指定参数下摇床47培养。

当工作细菌数量扩大到一定规模即可开始发酵生产生物抑尘剂，此时，完成扩大培养的枯草芽孢杆菌菌种大量存在于种子液中，形成浑浊的着菌LB菌悬液33，用2 ml一次性注射器3吸取1300 μl着菌LB菌悬液33作为LB菌悬接种液34，转种48至装有标准Landy培养液35的250ml三角瓶8，振荡摇匀，硅胶塞封住250 ml三角瓶8瓶口，水浴式恒温旋转-振荡摇床9中摇床49培养，发酵完成后形成浑浊的着菌Landy发酵液36，酸化沉淀，重悬，甲醇抽提50，形成含表面活性素分子38的提取液37，超声萃取，减压蒸发后即可得到有一定纯度的生物抑尘剂。

Surfactin的分子结构及其表征如图2所示，其中，图2(a)显示Surfactin的分子结构，图2(b)为Surfactin的红外光谱图，反映了该物质的红外吸收特征。

提纯完毕后，测试提取样品的润湿能力，将生物抑尘剂配置成15-20 mg/L溶液，进行润湿性能测试51，以验证其润湿能力。

润湿性能测试结果表明，本发明合成的表面活性素在相同质量浓度下，相对于传统化学抑尘剂其表面张力大幅度降低。润湿含尘固体时，在相同的润湿时间下，低浓度浓度表面活性素溶液略低于高浓度化学抑尘剂溶液的接触角，表明表面活性素不仅具有更优异的润湿能力，如附图3(a)、(b)所示，并且表面活性素用量更少，节约了使用成本。

图3生物抑尘剂化学抑尘剂润湿性能对比图，(a)反映了不同质量浓度的化学抑尘剂和生物抑尘的表面张力，(b)反映了相同润湿时间下，低浓度生物抑尘剂Surfactin和高浓度普通化学抑尘剂在含尘固体表面的接触角。图3反映了该发明合成的生物抑尘剂相较于传统化学抑尘剂在抑尘领域的优势。

此外，本发明仅需改变发酵的外部环境即可实现表面活性素增产，达到降尘领域的使用要求，无需对发酵菌株进行基因强化，从而保持了菌株产表面活性素能力的传代稳定性。

虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明的精神基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims

1.一种生物抑尘剂在抑尘中的应用，其特征在于，所述生物抑尘剂的绿色合成方法包括以下步骤：

a、菌种活化：向枯草芽孢杆菌冻干物中加入500μl活化标准NB培养液，并使用一次性注射器吹打致形成NB菌悬液，取菌悬液200μl接种至活化NA平板，使用玻璃涂布器涂布均匀，置于恒温培养箱中37℃恒温培养12h，待着菌NA平板长出淡粉色枯草芽孢杆菌活菌菌落完成活化；

b、菌种扩大培养：筛选着菌NA平板上特征明显的淡粉色不透明粗糙状的枯草芽孢杆菌活菌菌落，刮取枯草芽孢杆菌活菌菌丝并转种至标准LB培养液中，振荡，至标准LB培养液呈浅绿色，将装有着菌标准LB培养液的三角瓶固定在水浴式恒温旋转-震荡摇床的金属弹簧式固定架上；调整转速至180r/min，温度为37℃，恒温震荡培养2d；

c、生物抑尘剂的发酵合成与制备：完成扩大培养的枯草芽孢杆菌菌种大量存在于种子液中，形成浑浊的着菌LB菌悬液，使用一次性注射器吸取着菌LB菌悬液1.3ml作为LB菌悬接种液转种至装有标准Landy培养液的三角瓶中，并移至水浴式恒温旋转-震荡摇床，在恒定温度37.6℃和转速220r/min条件下培养2d；发酵完成后形成浑浊的着菌Landy发酵液，酸化沉淀，重悬，抽提，形成含表面活性素分子的提取液，超声萃取，减压蒸发后即可得到粉体；取一定量粉体加入纯净水，混合搅拌均匀制备浓度为15-20mg/L的生物抑尘剂。