CN114134073A - 一种筛选生物抑尘剂高产菌株的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种筛选生物抑尘剂高产菌株的方法，该方法利用菌株产生抑尘剂过程的溶血特性和菌株合成抑尘剂能力两个方面进行筛选，主要包含高产菌株筛选和已筛菌株验证两个部分；通过将扩大培养后的原始菌株充分稀释，接种至血琼脂平板上培养，根据各菌株在血琼脂平板上形成的溶血环大小，定量筛选菌株并对溶血环比较大的菌株进行发酵培养，通过酸化沉淀方法将发酵培养后的生物抑尘剂提取，计量不同菌株合成最终抑尘剂产量确定最佳高产菌株。本发明依据菌株自身特性开展筛选，选取绿色环保型培养并以最终产量为评价标准，具有筛选方法简单、工艺绿色环保、筛选效率较高的优势，为生物抑尘剂制备过程中高产菌株的筛选提供了一种新方法。

Description

一种筛选生物抑尘剂高产菌株的方法
技术领域
本发明属于抑尘材料合成领域，特别涉及一种筛选生物抑尘剂高产菌株的方法。
背景技术
粉尘防治作为工业安全生产过程中重要环节，是防止粉尘爆炸事故、降低尘肺病患病、减少粉尘逸散污染环境的重要措施，对维护安全生产、保护从业人员身心健康和减少环境污染具有重要意义。湿式除尘是粉尘防治中最主要、最常用的技术手段，即以水或水溶液作为润湿、黏结或凝并粉尘的介质，抑尘剂可通过改变溶液的界面性质提高湿式除尘效率。生物抑尘剂因其润湿能力强、无毒害性且易生物降解被研发，成为新一代抑尘材料的重要发展方向。但通过微生物发酵法合成生物抑尘剂的产量受菌株自身活性的影响较大，普通的菌株难以高效产出抑尘剂，由此导致生物抑尘剂产量低、生产成本增高。因此，筛选出具有较高活性和生物抑尘剂合成能力强的菌株，成为生物抑尘剂合成工艺流程的关键。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供一种筛选生物抑尘剂高产菌株的方法，具体如下：
a.将用于合成生物抑尘剂的菌株置于活化培养基中培养，培养一段时间后，采用接种环将菌落移种至菌株生长培养基中，将菌液恒温水浴培养，使菌株充分生长；
b.利用合成抑尘剂过程的溶血特性，将经活化、生长培养基养育后具有很好活性的菌株进行转接、筛选。取少量菌液经稀释培养基逐级充分稀释，取一定量稀释后的培养基转接至血琼脂平板，使用涂布棒均匀涂布；将含有菌液的血琼脂平板恒温培养一段时间；菌株代谢产物具有一定的溶血特性，因此根据溶血环比排序，筛选出活性高的菌株并对其进行一一编号；
c.将筛选出的菌株接种至生长培养基中进行扩大培养，使其达到一定菌株数量并能够具有良好的代谢能力；将培养后的菌液取少量接种至发酵培养基中，培养一定时间后取出并置于冰箱中降温，使菌株代谢减缓；采用高速离心机使发酵后培养基固、液分离；通过向上清液中滴加浓盐酸使其酸化，得到生物抑尘剂沉淀物；取出沉淀物加入超纯水重悬，再次滴加盐酸使其酸化即可得到纯净生物抑尘剂沉淀物，取出沉淀物干燥、称重，根据不同生物抑尘剂产量确定高产菌株编号。
一种筛选生物抑尘剂高产菌株的方法，包括以下步骤：
a.菌株的活化和扩大培养：使用移液器吸取液态活化培养基0.5ml注入装有菌株的冻干管中，待其形成较为均匀的菌悬液后，移取0.2ml注入固态活化培养基中，使用涂布棒将其涂布均匀，将固态培养基放入37℃培养箱中恒温培养24-48h，待固态活化培养基中长出均匀菌落。配置菌株生长培养基用于菌株扩大培养，分装至锥形瓶中，每瓶装液量为100ml，将其在高压灭菌锅中121℃灭菌15min后取出并冷却至室温，使用一次性接种环刮去少量菌落转接至生长培养基中，各培养基中接种数量近似相同；接种后的培养基放入37℃的恒温水浴摇床中培养2d，设定转速为180r/min，使菌落生长过程中可以充分接触养料。
b.高产菌株初筛：经过扩大培养后的菌株数量骤增，并具有较高的活性，在菌株筛选前需将菌液进行一定程度的稀释。将配制的SCP培养基(用于稀释菌液)置于高压灭菌锅中121℃灭菌15min，然后分装至10ml试管中，每个试管装液9ml，编号1-6；使用移液器从生长培养基中抽取1ml菌液注入1号试管，反复抽吸，待混合均匀后从中抽取1ml注入2号试管中，反复抽吸，重复上述操作，直至6号试管，此时 6号试管菌液浓度被稀释为10-6。本方法是利用菌株合成抑尘剂过程的溶血特性进行的筛选，使用移液器抽取0.5ml充分稀释的菌液(6号试管中菌液)转接种至配置好的血琼脂固态培养基中，并使用涂布棒涂布均匀，将接种完成的血琼脂固体培养基放至恒温培养箱中，在37℃条件下培养24h，待血琼脂固体培养基中行成清晰、独立的圆形溶血环即可进行筛选。
根据溶血环与菌落面积比
Figure RE-GDA0003460418960000021
D——带血溶血环菌落直径；mm
d——菌落直径；mm
使用相机对血琼脂进行拍照并依据溶血环比进行排序，将照片使用图像分析软件计算、分析得出不同的溶血环比；使用一次性接种环逐一挑出RatS值较大的菌株接种至生长培养基中，在水浴摇床中37℃条件下扩大培养24h，设定摇床转速为180r/min，保持与初次扩大培养时条件一样。
c.菌株复筛验证：配制发酵培养基并分装至锥形瓶中，每瓶装液量为100ml，将锥形瓶放于高压灭菌锅中121℃条件下灭菌15min，灭菌完成后冷却至室温；使用移液器从生长培养基中吸取一定量的菌液接种至发酵培养基中，不同菌株接种量应保持相同，将接种后的发酵培养基放于37℃的水浴摇床中恒温培养 2d，摇床转速为180r/min；将培养完成后的发酵液在相对离心力为8000g的高速离心机中离心20min，使发酵液中残留的固体与液体分离；取离心后的上清液使用浓盐酸调节pH至2.0，通过酸化的方式可使溶液中抑尘剂沉淀，但pH值不能过低，否则容易破坏合成物质的结构；将酸化后的液体在相对离心力为8000g 的高速离心机中离心20min，收取沉淀物，使用超净水重悬将抑尘剂再次溶解，对溶液进行二次酸化、离心，最后收取沉淀物在50℃的恒温干燥箱中干燥，称量不同菌株合成抑尘剂的最终产量，通过对比不同抑尘剂产量确定具有最佳合成能力的菌株编号，将该菌株进行转接冷藏。
本发明具有以下几个优点：
第一，本发明关于筛选生物抑尘剂高产菌株的方法是利用菌株合成抑尘剂过程的溶血特性，采用血琼脂培养基对菌株进行培养、筛选，通过计算不同菌株的溶血环比确定优质菌株，采用定量的方法确定了不同菌株的差异性，因此具有较好的准确性。
第二，本发明采用的血琼脂培养基对菌株进行筛选，是将菌株在特定环境下进行培养，这有益于最大程度保护菌株自身性能，避免其发生突变和染菌等问题，对待培养的菌株的纯度具有较好的保障作用。
第三，本发明采用的各种培养基都来自天然提取物，自然易降解且无毒害性，形成了一种绿色环保的筛选方法；并且，此方法通过对筛选后菌株进行发酵培养，通过最终合成生物抑尘剂产量筛选验证最佳菌株，能够保障菌株的优异性。
附图说明
图1为不同菌株的RatS值，表示血琼脂平板上不同菌株计算得出的溶血环比。
具体实施方式
实施案例：筛选生物抑尘剂高产菌株
首先，配制用于活化和扩大培养菌株的培养基。配制液态活化培养基：称取牛肉膏3.00g、蛋白胨10.00g、氯化钠10.00g，加入无菌水定容至1L，调节pH至7.00，分装至2100ml锥形瓶，每瓶装液100ml，在121℃条件下灭菌15min后冷却至室温；配制固态活化培养基：称取牛肉膏3.00g、蛋白胨10.00g、氯化钠10.00g、琼脂15g，加入无菌水定容至1L，调节pH至7.00，在121℃条件下灭菌15min后冷却至50℃，将该培养基取出15ml注入空白培养皿中，待冷却10min后便可凝固成固体；配制生长培养基：酵母粉5.00g、胰蛋白胨10.00g、氯化钠10.00g、加入无菌水定容至1L，调节pH至7.00，现配现用。分装至2100ml锥形瓶，每瓶装液100ml，在121℃条件下灭菌15min后冷却至室温；
其次，使用移液器吸取液态活化培养基0.5ml注入装有枯草芽孢杆菌的冻干管中，待其形成较为均匀的菌悬液后，移取0.2ml注入固态活化培养基中，使用涂布棒将其涂布均匀，将固态培养基放入37℃培养箱中恒温培养24-48h，待固态活化培养基中长出均匀菌落。使用一次性接种环刮去少量菌落转接至生长培养基中，各培养基中接种数量近似相同；接种后的培养基放入37℃的恒温水浴摇床中培养2d，设定转速为180r/min，使菌落生长过程中可以充分接触养料。
然后，配制用于稀释菌液的SCP培养基和筛选优质菌株的血琼脂培养基。配制SCP培养基：蛋白胨 1.00g、KH2PO43.56g、Na2HPO47.23g、NaCl 4.20g，加入无菌水定容至1L，调节pH至7.00，在121℃条件下灭菌15min后冷却至室温；配制血琼脂培养基：牛肉膏3.00g、蛋白胨10.00g、NaCl 5.00g、琼脂 15.00g、加入无菌水定容至1L，调节pH至7.40-7.60，在121℃条件下灭菌15min后冷却至40℃，加入无菌羊血100ml充分混合均匀，将该培养基取出15ml注入空白培养皿中，待冷却10min后便可凝固成固体。
再者，经过扩大培养后的菌株数量骤增，并具有较高的活性，在菌株筛选前需将菌液进行一定程度的稀释。将配制的SCP培养基(用于稀释菌液)分装至10ml试管中，每个试管装液9ml，编号1-6；使用移液器从生长培养基中抽取1ml菌液注入1号试管，反复抽吸，待混合均匀后从中抽取1ml注入2号试管中，反复抽吸，重复上述操作，直至6号试管，此时6号试管菌液浓度被稀释为10-6。本方法是利用菌株合成抑尘剂过程的溶血特性进行的筛选，使用移液器抽取0.5ml充分稀释的菌液(6号试管中菌液)转接种至配置好的血琼脂固态培养基中，并使用涂布棒涂布均匀，将接种完成的血琼脂固体培养基放至恒温培养箱中，在37℃条件下培养24h，待血琼脂固体培养基中形成清晰、独立的圆形溶血环即可进行筛选；使用相机对血琼脂进行拍照，依据溶血环进行编号排序，将照片使用图像分析软件计算、分析得出不同的溶血环与菌落面积比RatS(如图1所示)；将E8、B3、A4菌株使用一次性接种环逐一挑出菌株接种至生长培养基中，在水浴摇床中37℃条件下扩大培养24h，设定摇床转速为180r/min，保持前后扩大培养时条件一样。
最后，筛选后的菌株需通过其合成生物抑尘剂能力进行筛选验证，故采用发酵法对筛选的菌株进行合成能力试验。配制发酵培养基：称取葡萄糖20.00g、L-谷氨酸5.00g、磷酸二氢钾1.00g、氯化钾0.50g、硫酸锰0.50g、硫酸镁0.005g、硫酸铜0.00016g、硫酸铁0.00015g，加入无菌水定容至1L，调节pH至7.00，分装至锥形瓶中，每瓶装液量为100ml，将锥形瓶放于高压灭菌锅中121℃条件下灭菌15min，灭菌完成后冷却至室温；使用移液器从生长培养基中吸取一定量的菌液接种至发酵培养基中，不同菌株接种量应保持相同，将接种后的发酵培养基放于37℃的水浴摇床中恒温培养2d，摇床转速为180r/min；将培养完成后的发酵液在相对离心力为8000g的高速离心机中离心20min，使发酵液中残留的固体与液体分离；取离心后的上清液使用浓盐酸调节pH至2.0，通过酸化的方式可使溶液中抑尘剂沉淀，但pH值不能过低，否则容易破坏合成物质的结构；将酸化后的液体在相对离心力为8000g的高速离心机中离心20min，收取沉淀物，使用超净水重悬将抑尘剂再次溶解，对溶液进行二次酸化、离心，最后收取沉淀物在50℃的恒温干燥箱中干燥，称量不同菌株合成抑尘剂的最终产量，通过对比不同抑尘剂产量确定具有最佳合成能力的菌株编号，将该菌株进行转接冷藏。

Claims (4)

1.一种筛选生物抑尘剂高产菌株的方法，其特征在于，它主要包含菌株初筛和复筛验证两个过程，详情如下：
a.将用于合成生物抑尘剂的菌株置于活化培养基中培养，培养一段时间后，采用接种环将菌落移种至菌株生长培养基中，将菌液恒温水浴培养，使菌株充分生长；
b.利用菌株生成抑尘剂过程的溶血特性，将经活化、生长培养基养育后具有良好活性的菌株进行转接、筛选。取少量菌液经稀释培养基逐级充分稀释，取一定量稀释后的培养基转接至血琼脂平板，使用涂布棒均匀涂布；将含有菌液的血琼脂平板恒温培养一段时间；菌株代谢产物具有一定的溶血特性，因此根据溶血环排序并对其进行一一编号，筛选出溶血环比较大、活性高的菌株；
c.将筛选出的菌株接种至生长培养基中进行扩大培养，使其达到一定菌株数量并能够具有良好的代谢能力；将培养后的菌液取少量接种至发酵培养基中，培养一定时间后取出并置于冰箱中降温，使菌株代谢减缓；采用高速离心机使发酵后培养基固、液分离；通过向上清液中滴加浓盐酸使其酸化，得到生物抑尘剂沉淀物；取出沉淀物加入超纯水重悬，再次滴加盐酸使其酸化即可得到纯净生物抑尘剂沉淀物，取出沉淀物干燥、称重，根据不同生物抑尘剂产量确定高产菌株编号。
2.根据权利要求1所述的一种筛选生物抑尘剂高产菌株的方法，其特征在于，菌株的活化和扩大培养具体步骤如下：使用移液器吸取液态活化培养基0.5ml注入装有菌株的冻干管中，待其形成较为均匀的菌悬液后，移取0.2ml注入固态活化培养基中，使用涂布棒将其涂布均匀，将固态培养基放入37℃培养箱中恒温培养24-48h，待固态活化培养基中长出均匀菌落。配制菌株生长培养基用于菌株扩大培养，分装至锥形瓶中，每瓶装液量为100ml，将其在高压灭菌锅中121℃灭菌15min后取出并冷却至室温，使用一次性接种环刮取少量菌落转接至生长培养基中，各培养基中接种数量近似相同；接种后的培养基放入37℃的恒温水浴摇床中培养2d，设定转速为180r/min，使菌落生长过程中可以充分接触养料。
3.根据权利要求1所述的一种筛选生物抑尘剂高产菌株的方法，其特征在于，高产菌株筛选具体步骤如下：将配制的SCP培养基(用于稀释菌液)置于高压灭菌锅中121℃灭菌15min，然后分装至10ml试管中，每个试管装液9ml，编号1-6；使用移液器从生长培养基中抽取1ml菌液注入1号试管，反复抽吸，待混合均匀后从中抽取1ml注入2号试管中，反复抽吸，重复上述操作，直至6号试管，此时6号试管菌液浓度被稀释为10-6。使用移液器抽取0.5ml充分稀释的菌液(6号试管中菌液)转接种至配置好的血琼脂固态培养基中，并使用涂布棒涂布均匀，将接种完成的血琼脂固体培养基放至恒温培养箱中，在37℃条件下培养24h，待血琼脂固体培养基中行成清晰、独立的圆形溶血环即可进行筛选；使用相机对血琼脂进行拍照并依据溶血环进行排序，将照片使用图像分析软件计算、分析得出不同的溶血环比；使用一次性接种环逐一挑出菌株接种至生长培养基中，在水浴摇床中37℃条件下扩大培养24h，设定摇床转速为180r/min，保持与初次扩大培养时条件一样。
4.根据权利要求1所述的一种筛选生物抑尘剂高产菌株的方法，其特征在于，初筛菌株复筛验证的具体步骤如下：配制发酵培养基并分装至锥形瓶中，每瓶装液量为100ml，将锥形瓶放于高压灭菌锅中121℃条件下灭菌15min，灭菌完成后冷却至室温；使用移液器从生长培养基中吸取一定量的菌液接种至发酵培养基中，不同菌株接种量应保持相同，将接种后的发酵培养基放于37℃的水浴摇床中恒温培养2d，摇床转速为180r/min；将培养完成后的发酵液在相对离心力为8000g的高速离心机中离心20min，使发酵液中残留的固体与液体分离；取离心后的上清液使用浓盐酸调节pH至2.0，通过酸化的方式可使溶液中抑尘剂沉淀；将酸化后的液体在相对离心力为8000g的高速离心机中离心20min，收取沉淀物，使用超净水重悬将抑尘剂再次溶解，对溶液进行二次酸化、离心，最后收取沉淀物在50℃的恒温干燥箱中干燥，称量不同菌株合成抑尘剂的最终产量，通过对比不同抑尘剂产量确定具有最佳合成能力的菌株编号，将该菌株进行转接冷藏。
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