CN108441442A - 一种从土壤中直接提取微生物菌种制备碳酸钙的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于微生物固化，特别涉及一种从土壤中直接提取微生物菌种制备碳酸钙的方法，包括以下步骤：步骤1，从有机质含量高的土壤中提取并分离出芽孢杆菌类菌种；步骤2，对步骤1分离出来的芽孢杆菌类菌种进行繁殖培养；步骤3，将步骤2得到的芽孢杆菌类菌液和胶凝液等体积混合，置于30℃恒温气浴培养箱中养护一段时间后，对混合液进行过滤，得到微生物诱导碳酸钙沉淀；本发明从土壤中直接提取微生物菌种制备碳酸钙，选择尿素和硫酸镍作为分离芽孢杆菌类菌种的固体选择培养基，分离效率高，将分离出的芽孢杆菌类菌种与胶凝液混合，适当条件下进行养护后，得到微生物诱导碳酸钙沉淀；该方法经济环保，操作简易且碳酸钙产率高。

Description

一种从土壤中直接提取微生物菌种制备碳酸钙的方法
技术领域
本发明属于微生物固化，特别涉及一种从土壤中直接提取微生物菌种制备碳酸钙的方法。
背景技术
生物矿化作用是一种很普遍的自然现象，几乎每一种生物都能合成矿物。其中近三分之二是钙矿，并且相当一部分具有胶结功能。它们通过其自身的生命活动，与周围环境介质之间不断发生着酶化作用，逐渐形成碳酸钙。近年来，随着土体中微生物的研究发展，土中已经存在的微生物的生命活动(主要是获取能量和碳的活动)的产物为工程所用的可能性在概念上已经取得了广泛的认可。在这样的大环境下，微生物固化技术应运而生。
所谓微生物固化就是利用土中微生物的生命活动生成的代谢产物处理砂土等散装或软弱材料，以满足工程需要。与传统的加固技术相比，微生物固化技术的过程中生物能代替了机械能，微生物新陈代谢的产物代替了化学制品，具有清洁环保、耗能低、对土体扰动小，处理均匀等优点，十分契合可持续发展的战略目标。
中国专利CN201610828703.2公开了一种利用微生物制备碳酸钙固化砂土的方法，将砂子倒入瓶中，使其均匀覆盖瓶底，然后倒入胶凝液与培养好的菌液，恒温震荡培养，之后每天定量吸取瓶中部分混合液，再添加等量的胶凝液、均匀加入少量砂子，最后持续数天后得到固化好的砂柱；但该方法的菌种的选育通常需要消耗很多的人力物力，且碳酸钙产率有待进一步提高。
发明内容
本发明解决现有技术中存在的上述技术问题，提供一种从土壤中直接提取微生物菌种制备碳酸钙的方法。
为解决上述问题，本发明的技术方案如下：
一种从土壤中直接提取微生物菌种制备碳酸钙的方法，包括以下步骤：
步骤1，从有机质含量20-30g/kg的土壤中提取并分离出芽孢杆菌类菌种；分离芽孢杆菌类菌种的固体选择培养基为尿素和硫酸镍；
步骤2，对步骤1分离出来的芽孢杆菌类菌种进行繁殖培养，采用分光光度计600nm波长测量得到芽孢杆菌类菌液的吸光度值为1.2-1.6；
步骤3，将步骤2得到的芽孢杆菌类菌液和胶凝液等体积混合，置于30℃恒温气浴培养箱中养护一段时间后，对混合液进行过滤，得到微生物诱导碳酸钙沉淀；所述胶凝液由尿素、醋酸钙和水组成，所述凝胶液中尿素的摩尔浓度为0.5-1.0mol/L，醋酸钙的摩尔浓度为0.5-1.0mol/L。
优选地，步骤1所述土壤采集自深度5-30cm内的土样，土样的保存方法为：放入灭菌的样品袋内密封保存于4℃冰箱内。
优选地，步骤1所述提取并分离出芽孢杆菌类菌种的具体方法为：
a)称取土样5g，在超净工作台内将称量好的土样倒入90ml无菌水中，充分震荡使土样呈悬液状，置室温下静置4小时，即为10-1稀释液；
b)用微量移液器取处理后的土壤上清液0.5ml于装有4.5ml无菌水中的试管内，振荡，让菌液混合均匀，即为10-2稀释液；吸取10-2稀释液0.5ml，移入装有4.5ml无菌水中的试管内，振荡，让菌液混合均匀，即成10-3稀释液；连续稀释，制成10-2、10-3、10-4、10-5稀释液；
c)用移液枪吸取10-2、10-3、10-4、10-5稀释液各0.05ml，分别接种在相应编号的琼脂平板上；将涂布稀释液的平板平放于桌面上，静置10-20min使菌液渗透进培养基中，然后将培养基倒置，置于30℃恒温培养箱中培养24h；
d)在培养基中添加尿素和硫酸镍作为固体选择培养基，所述培养基中尿素的浓度为10-20g/L，硫酸镍的浓度为10-20g/L，并用涂布器在培养基表面涂布酚酞溶液，然后用接种丝蘸取培养后的菌种悬浊液在培养基表面划线接种，置30℃恒温培养箱中培养24h，最后取周围存在红色区域的菌斑作为下次纯化的菌株；如此反复纯化3次，最终得到纯化菌株。
优选地，步骤2所述芽孢杆菌类菌种进行繁殖培养所选择的培养基包括以下重量份的组分：
酵母浸膏：5份；
蛋白胨：10份；
氯化钠：10份；
尿素：10份；
磷酸二氢钾：1.4份；
磷酸氢二钠：5.3份；
硫酸镁：0.2份；
葡萄糖粉：10份；
琼脂：15份；
水：1000份；
所述培养基的pH为7。
优选地，步骤3所述混合物在30℃恒温气浴培养箱中养护时间为5天以上。
相对于现有技术，本发明的优点如下，
本发明从土壤中直接提取微生物菌种制备碳酸钙，选择尿素和硫酸镍作为分离芽孢杆菌类菌种的固体选择培养基，分离效率高，将分离出的芽孢杆菌类菌种与胶凝液混合，适当条件下进行养护后，得到微生物诱导碳酸钙沉淀；该方法经济环保，操作简易且碳酸钙产率高。
附图说明
图1为选择培养基中添加尿素(10g/L)和硫酸镍(10g/L)，采用等体积的菌液和胶凝液(配方见表2)得到的碳酸钙沉淀。
具体实施方式
实施例1：
一种从土壤中直接提取微生物菌种制备碳酸钙的方法，该方法的主要步骤：
1)采集有机质含量20-30g/kg的土样，取深度5-30cm内的土样若干，将土样放入灭菌的样品袋内密封保存于4℃冰箱内。
2)从土样中提取并分离出芽孢杆菌类菌种。
a)分别称取土样5g，在超净工作台内将称量好的土样倒入90ml无菌水中，充分震荡使土样呈悬液状，置室温下静置4小时，即为10-1稀释液。
b)用微量移液器取处理后的土壤上清液0.5ml于装有4.5ml无菌水中的试管内，振荡，让菌液混合均匀，即为10-2稀释液。吸取10-2稀释液0.5ml，移入装有4.5ml无菌水中的试管内，振荡，让菌液混合均匀，即成10-3稀释液；连续稀释，制成10-2、10-3、10-4、10-5稀释液
c)用移液枪吸取10-2、10-3、10-4、10-5稀释液各0.05ml，分别接种在相应编号的琼脂平板上。将涂布稀释液的平板平放于桌面上，静置10-20min使菌液渗透进培养基中，然后将培养基倒置，置于30℃恒温培养箱中培养24h。
d)在培养基中添加尿素(10g/L)和硫酸镍(10g/L)作为固体选择培养基，并用涂布器在培养基表面涂布酚酞溶液，然后用接种丝蘸取培养后的菌种悬浊液在培养基表面划线接种，置30℃恒温培养箱中培养24h，最后取周围存在红色区域的菌斑作为下次纯化的菌株。如此反复纯化3次，最终得到纯化菌株。
3)制备相应的培养基，配方见表1，对分离出来的芽孢杆菌类菌种进行繁殖；经过3次分离纯化得到的菌种培养36h，采用分光光度计600nm波长测量得到吸光度达到1.6。
4)制备胶凝液与菌种液一起诱导菌种沉淀碳酸钙。将等体积的菌液和胶凝液(配方见表2)混合加入50ml离心管中，将离心管置于30℃恒温气浴培养箱中养护5天，对混合液进行过滤，得到微生物诱导碳酸钙沉淀产率为80％。
表1培养基配方(1000mL)
表2胶凝液配方(1000mL)
实施例2：
采用同实施例1的方法提取纯化土壤中芽孢杆菌类菌种，最终得到纯化菌株。制备如表1所示的培养基对分离出来的芽孢杆菌类菌种进行繁殖；经过3次分离纯化得到的菌种培养36h，吸光度达到1.5。最后制备胶凝液与菌种液一起诱导菌种沉淀碳酸钙。将等体积的菌液和胶凝液(配方见表3)混合加入50ml离心管中，将离心管置于30℃恒温气浴培养箱中养护5天，对混合液进行过滤，得到微生物诱导碳酸钙沉淀产率为60％。
表3胶凝液配方(1000mL)
实施例3：
采用同实施例1的方法提取纯化土壤中芽孢杆菌类菌种，不同的是在培养基中添加尿素(20g/L)和硫酸镍(20g/L)作为固体选择培养基，最终得到纯化菌株。制备如表1所示的培养基对分离出来的芽孢杆菌类菌种进行繁殖；经过3次分离纯化得到的菌种培养36h，吸光度达到1.4。最后制备胶凝液与菌种液一起诱导菌种沉淀碳酸钙。将等体积的菌液和胶凝液(配方见表2)混合加入50ml离心管中，将离心管置于30℃恒温气浴培养箱中养护5天，对混合液进行过滤，得到微生物诱导碳酸钙沉淀产率为65％。
实施例4：
采用同实施例3的方法提取纯化土壤中芽孢杆菌类菌种，最终得到纯化菌株。制备如表1所示的培养基对分离出来的芽孢杆菌类菌种进行繁殖；经过3次分离纯化得到的菌种培养36h，吸光度达到1.4。最后制备胶凝液与菌种液一起诱导菌种沉淀碳酸钙。将等体积的菌液和胶凝液(配方见表3)混合加入50ml离心管中，将离心管置于30℃恒温气浴培养箱中养护5天，对混合液进行过滤，得到微生物诱导碳酸钙沉淀产率为50％。
对比例1：
采用同实施例1的方法提取纯化土壤中芽孢杆菌类菌种，不同的是固体选择培养基中没有添加尿素和硫酸镍。制备如表1所示的培养基对分离出来的芽孢杆菌类菌种进行繁殖；经过3次分离纯化得到的菌种培养36h，吸光度达到1.2。最后制备胶凝液与菌种液一起诱导菌种沉淀碳酸钙。将等体积的菌液和胶凝液(配方见表2)混合加入50ml离心管中，将离心管置于30℃恒温气浴培养箱中养护5天，对混合液进行过滤，得到微生物诱导碳酸钙沉淀产率为20％。
对比例2：
采用同实施例1的方法提取纯化土壤中芽孢杆菌类菌种，不同的是固体选择培养基中仅添加尿素(20g/L)。制备如表1所示的培养基对分离出来的芽孢杆菌类菌种进行繁殖；经过3次分离纯化得到的菌种培养36h，吸光度达到1.1。最后制备胶凝液与菌种液一起诱导菌种沉淀碳酸钙。将等体积的菌液和胶凝液(配方见表2)混合加入50ml离心管中，将离心管置于30℃恒温气浴培养箱中养护5天，对混合液进行过滤，得到微生物诱导碳酸钙沉淀产率为25％。
对比例3：
采用同实施例1的方法提取纯化土壤中芽孢杆菌类菌种，不同的是固体选择培养基中仅添加硫酸镍(20g/L)。制备如表1所示的培养基对分离出来的芽孢杆菌类菌种进行繁殖；经过3次分离纯化得到的菌种培养36h，吸光度达到1.0。最后制备胶凝液与菌种液一起诱导菌种沉淀碳酸钙。将等体积的菌液和胶凝液(配方见表2)混合加入50ml离心管中，将离心管置于30℃恒温气浴培养箱中养护5天，对混合液进行过滤，得到微生物诱导碳酸钙沉淀产率为18％。
对比例4：
采用同实施例1的方法提取纯化土壤中芽孢杆菌类菌种，不同的是在培养基中添加纤维素粉(10g/L)和水解酪素(10g/L)作为固体选择培养基，制备如表1所示的培养基对分离出来的芽孢杆菌类菌种进行繁殖；经过3次分离纯化得到的菌种培养36h，吸光度达到1.2。最后制备胶凝液与菌种液一起诱导菌种沉淀碳酸钙。将等体积的菌液和胶凝液(配方见表2)混合加入50ml离心管中，将离心管置于30℃恒温气浴培养箱中养护5天，对混合液进行过滤，得到微生物诱导碳酸钙沉淀产率为23％。
需要说明的是上述实施例仅仅是本发明的较佳实施例，并没有用来限定本发明的保护范围，在上述基础上做出的等同替换或者替代均属于本发明的保护范围。

Claims (5)

1.一种从土壤中直接提取微生物菌种制备碳酸钙的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1，从有机质含量20-30g/kg的土壤中提取并分离出芽孢杆菌类菌种；分离芽孢杆菌类菌种的固体选择培养基为尿素和硫酸镍；
步骤2，对步骤1分离出来的芽孢杆菌类菌种进行繁殖培养，采用分光光度计600nm波长测量得到芽孢杆菌类菌液的吸光度值为1.2-1.6；
步骤3，将步骤2得到的芽孢杆菌类菌液和胶凝液等体积混合，置于30℃恒温气浴培养箱中养护一段时间后，对混合液进行过滤，得到微生物诱导碳酸钙沉淀；所述胶凝液由尿素、醋酸钙和水组成，所述凝胶液中尿素的摩尔浓度为0.5-1.0mol/L，醋酸钙的摩尔浓度为0.5-1.0mol/L。
2.如权利要求1所述的从土壤中直接提取微生物菌种制备碳酸钙的方法，其特征在于，步骤1所述土壤采集自深度5-30cm内的土样，土样的保存方法为：放入灭菌的样品袋内密封保存于4℃冰箱内。
3.如权利要求1所述的从土壤中直接提取微生物菌种制备碳酸钙的方法，其特征在于，步骤1所述提取并分离出芽孢杆菌类菌种的具体方法为：
a)称取土样5g，在超净工作台内将称量好的土样倒入90ml无菌水中，充分震荡使土样呈悬液状，置室温下静置4小时，即为10-1稀释液；
b)用微量移液器取处理后的土壤上清液0.5ml于装有4.5ml无菌水中的试管内，振荡，让菌液混合均匀，即为10-2稀释液；吸取10-2稀释液0.5ml，移入装有4.5ml无菌水中的试管内，振荡，让菌液混合均匀，即成10-3稀释液；连续稀释，制成10-2、10-3、10-4、10-5稀释液；
c)用移液枪吸取10-2、10-3、10-4、10-5稀释液各0.05ml，分别接种在相应编号的琼脂平板上；将涂布稀释液的平板平放于桌面上，静置10-20min使菌液渗透进培养基中，然后将培养基倒置，置于30℃恒温培养箱中培养24h；
d)在培养基中添加尿素和硫酸镍作为固体选择培养基，所述培养基中尿素的浓度为10-20g/L，硫酸镍的浓度为10-20g/L，并用涂布器在培养基表面涂布酚酞溶液，然后用接种丝蘸取培养后的菌种悬浊液在培养基表面划线接种，置30℃恒温培养箱中培养24h，最后取周围存在红色区域的菌斑作为下次纯化的菌株；如此反复纯化3次，最终得到纯化菌株。
4.如权利要求1所述的从土壤中直接提取微生物菌种制备碳酸钙的方法，其特征在于，步骤2所述芽孢杆菌类菌种进行繁殖培养所选择的培养基包括以下重量份的组分：
酵母浸膏：5份；
蛋白胨：10份；
氯化钠：10份；
尿素：10份；
磷酸二氢钾：1.4份；
磷酸氢二钠：5.3份；
硫酸镁：0.2份；
葡萄糖粉：10份；
琼脂：15份；
水：1000份；
所述培养基的pH为7。
5.如权利要求1所述的从土壤中直接提取微生物菌种制备碳酸钙的方法，其特征在于，步骤3所述混合物在30℃恒温气浴培养箱中养护时间为5天以上。
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